JP2005118045A - 新規なグリコシダーゼの単離及び組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】選択されたグリコシド結合を開裂し得る実質的に純粋なグリコシダーゼとして、Xanthomonasから単離されたグリコシダーゼ及び組換えグリコシダーゼが開示されている。単離された酵素の基質特異性は、GlcNacβ1−X、Galα1−3R、Galα1−6R、Galβ1−3R、Fucα1−2R、Fucα1−3R、Fucα1−4R、Manα1−2R、Manα1−3R、Manα1−6R、Manβ1−4R、Xylβ1−2R及びGlcβ1−4Rから同定され、糖質基質中のグリコシド結合を選択的に開裂する能力及び修飾された糖質を形成する能力の改良が得られる。
【選択図】なし
Description
実際、糖質は、グリコシド結合によって共有結合して分枝状及び直鎖状の高分子を形成する一連の単糖類から成り多糖類として知られる重合体として存在する。更に、多糖類、またはより一般的にオリゴ糖類は、タンパク質または脂質のような高分子に結合して糖タンパク質または糖脂質を形成し得る。天然に産する多糖類と違って、タンパク質または脂質と結合したオリゴ糖類は、単糖類の比較的小さいサブセットから成る。
糖タンパク質は、タンパク質との結合に従って2つのグループに大別される。ムチン型オリゴ糖、プロテオグリカン型、コラーゲン型及びエクステンシン型のようなO−グリコシル結合したオリゴ糖は、L−セリンまたはL−トレオニンのヒドロキシル酸素に結合している。N−グリコシル結合したオリゴ糖は、一般にはAsn−Xaa−Ser/Thr(Xaaは任意のアミノ酸)の形態のトリペプチド中のアスパラギンのアミド窒素に結合している。N−結合したオリゴ糖は更に、高マンノース型、複合体型及びハイブリッド型の3つのサブグループに分類される。N−結合したオリゴ糖は多くの場合分枝状であり、分枝は一般にマンノース残基またはN−アセチルグルコサミン残基で生じる。これらの分枝状構造は、分枝が2つの場合にはバイアンテナリーと呼ばれており、分枝が3つの場合にはトリアンテナリーと呼ばれている。
オリゴ糖は、グリコシダーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼとして知られる細胞中の酵素系によって合成される。典型的には、オリゴ糖が脂質キャリアーに集合し、グリコシル化されるタンパク質内部の適当なアミノ酸に転移される。次いで、グリコシダーゼによる切断及びグリコシルトランスフェラーゼに媒介される合成が生じ、個々の単糖または予め集成されたオリゴ糖ユニットが除去または付加される。更に、通常は加水分解酵素であるエキソグリコシダーゼが合成機能におけるトランスフェラーゼとして作用するときは微視的可逆性が生じ得る(Ichikawaら,1992,Anal.Biochem.202:215−238)。いくつかの場合には、単糖の除去によって、次の鎖合成を容易にするようなコンホメーション変化が生じる(Camirandら,ch.,1992)。他の理論によって解釈できる可能性も否定はしないが、1種類のタンパク質のグリコシル化パターンが細胞内多様性を示す原因の1つは、任意の単一細胞中に種々の量及び種類の可用なグリコシダーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼが存在することにあると考えられる。
オリゴ糖の正しい合成及び分解が生物に対して重要であることは、糖質構造の誤ったプロセシングを生じる1つの欠損グリコシダーゼに起因する疾患の存在によって証明された。上記に引用した例では、糖タンパク質の誤ったプロセシングを生じるフコシダーゼの欠如が疾患の原因となっている。他の例としては、主要なリソソーム性α−マンノシダーゼ活性が顕著に欠損しているヒトα−マンノシド症がある(Gasperiら,1992,J.of Biol.Chem.267:9706−9712)。異常オリゴ糖構造は癌にも関連を有している(Sanoら,1992,J.Biol.Chem.267:1522−1527)。
(microheterogeneity)の原因及び関連を理解するために、オリゴ糖の配列及び結合を分析する迅速で簡単な方法が有用であろう。
糖質構造の既存の分析方法は複雑な多段階手順に依存している。これらの手順としては、質量分析、NMR、高速原子衝撃、複合クロマトグラフィー法(高圧液体クロマトグラフィー、気相クロマトグラフィー、イオン交換及び逆相クロマトグラフィー)、複合化学反応系(メチル化分析、過ヨウ素酸塩酸化及び種々の加水分解反応)などの方法があり、これらはいずれもオリゴ糖の配列及びそれらのグリコシド結合の特徴を決定するために種々の組み合わせで使用されている。各方法は糖質構造に関していくつかの断片的情報を与えるが、各々が欠点を有している。例えば、高速原子衝撃は(Dell 1987,Advances inCarbohydrate Chemistry and Biochemistry 45:19−73)、大きさ及び配列に関するいくつかのデータを与えるが、結合位置またはアノマー配置に関する情報を与えない。NMRは糖質を分析するための最も強力なツールであるが(Vliegenthartら,1983 Advances in Carbohydrate Chemistry 41:209−375)、比較的感度が鈍く大量の分析液を要する。これらの方法は、Spellman 1990,Anal.Chem.62:1714−1722;Leeら,1990,Applied Biochem. and Biotech.23:53−80;Geisow 1992,Bio/technology 10:277−280;Kobata 1984に概説されている。上記手順の多くは高価な装置を必要としており、またそれらの操作にはかなりの技術的熟練及び技術的支援が必要なので、それらの使用は少数の専門研究機関に限定される。
多段階分析の一段階を構成する糖質分析の種々の段階で酵素が使用されている。これらの酵素は、結合タンパク質のグリカン部分とアミノ酸(普通はアスパラギン)との間を開裂する能力を有するグリコアミダーゼである。エンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼは双方ともヒドロラーゼであり、糖質構造の内部(エンド)または分子の非還元末端の末端単糖(エキソ)でグリコシド結合を開裂する能力を有するのでこのように呼ばれているが、これらは極めて重要である。
(1)エキソグリコシダーゼ調製物が他の夾雑エキソグリコシダーゼ不純物を含み、その結果として消化結果が不明瞭になること、及び、
(2)特定のグリコシド結合に対するエキソグリコシダーゼの特異性が欠如していること、がある。特性決定されたグリコシダーゼは多数の結合を認識し、いくつかの結合が他の結合よりも優先的に認識されると考えられている。従って、所与のグリコシダーゼが優先度を有している1つの結合を同定するのが望ましい。
少数のエキソグリコシダーゼは市販されている(表1参照)。更に、上記のような種々の生物から多数のエキソグリコシダーゼが単離された。配列決定に有用であることか分かっているエキソグリコシダーゼの部分的リストは、Linhardtら,1992の国際特許出願公告WO/92/02816に提示されている。エキソグリコシダーゼの追加リストは、Haughland,1993の国際特許出願公告WO/93/04074に提示されている。グリコシダーゼに関する包括的な概説は、Conzelmanら,1987,Advances in Enzymology 60:89;Flowersら,1979,Advances in Enzymology48:29;Kobata 1979,Anal.Biochem.100:1−14に提示されている。
本発明の目的は、同定された基質特異性を有する実質的に純粋な新規なグリコシダーゼに対する要望を満足させる組成物及び方法を提供することである。
本発明の上記の特徴は、以下の記載、添付の請求の範囲及び添付図面より更に十分に理解されよう。
本文及び請求の範囲において、グリコシダーゼの「基質特異性」とは、特定の単糖またはオリゴ糖を認識し、糖質構造中に位置する特有のグリコシド結合を開裂するグリコシダーゼの能力と定義される。
本発明の好ましい実施態様の1つは、グリコシダーゼ反応の消化産物を迅速、簡単及び正確に決定する方法である。基質を標識し、グリコシド活性を測定するために適当なマーカーを選択した。迅速かつ再現的な分離方法を用いて反応生成物を検出した。アッセイ方法は十分な感度を有しており、夾雑酵素活性の検出(図7)、系列希釈による酵素力価の測定(図3)、単一及び多数のグリコシド結合に対する1種類の酵素の相対的親和性の測定(実施例4、図2、4−11)が可能であることが判明した。
グリコシダーゼ活性を測定するためにいくつかの酵素標識方法が存在する。例えば以下の標識を使用し得る。
(b)蛍光標識オリゴ糖類。還元性アミン化によってオリゴ糖を蛍光アミンで標識する方法が可用である。このような蛍光アミンの例としては、7−アミノ−メチルクマリン(AMC)(Prahashら,1983,Anal.Biochem.128:41−46)、2−アミノピリジン(Reinholdら,1983,J.Carbohydr.Chem 2(1):1−18、p−アミノアセトフェノン、p−アミノ安息香酸エチルエステル及びアニリン(Wangら,1984,Anal.Biochem.141:360−361)、並びに、Klock(1993)の国際特許出願WO93/05076、Haugland(1993)の国際特許出願(WO93/04077)及びWO93/04074に参照によって含まれる他のアミンがある。
(c)放射性標識オリゴ糖類。複合オリゴ糖の構造決定に
使用される種々の分析方法ではオリゴ糖の還元末端をNaB3H4で化学量論的に放射性標識した(Youngら,1971,Biochemistry 10:3457;Tyrco 1981,Anal.Biochem.118:278−283;Wellsら,1981,Anal.Biochem.110:397−406)。代替方法ではトリチウム標識オリゴ糖類を使用する(Yamashitaら,1980,J.Biol.Chem.255(12):5635−5642;Fukuda 1985,Biochemistry24:2154−2163)。
(1種以上の)標識基質をグリコシダーゼと反応させ、反応生成物が得られた場合には、この反応生成物を適当な分離方法を用いて特性決定した。オリゴ糖と単糖との分離方法には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、濾紙電気泳動、下降式濾紙クロマトグラフィー、毛細管電気泳動、TLC及びHPLCがある。標識基質の特性が分離技術の選択をある程度決定する。例えば、Jackson(Biochem.J.1990,270:705−713)は、フルオロフォア8−アミノナフタレン−1,3,6トリスルホン酸(ANTS)を用いてオリゴ糖及び短い多糖類の還元末端の共有結合的標識を要する方法を記載した。このフルオロフォアは、ラベルによって付与されるイオン電荷が電界中でのオリゴ糖の分離を容易にするのでポリアクリルアミドゲル電気泳動による分離に好適であった。この方法は実際、少量の材料を用いて単一の単糖から26残基のポリマーまでの種々の大きさの分子を単一ゲル上で解明することが可能であった。残念なことに、基質の還元末端を比較的大きい荷電マーカーで標識する必要があるため、エキソグリコシダーゼ反応が妨害され得る。Linhardt(国際特許出願公告WO92/02816)は、オリゴ糖を配列決定するためにJacksonの方法と同様の方法を記載した。この方法では、複合糖質から遊離されたオリゴ糖成分の還元末端に負の電荷をもつ蛍光基を付加し、次いで、細管式動的篩分け(capillary dynamic sieving)電気泳動によってポリアクリルアミドゲル上の種々のオリゴ糖を分離する必要がある。この方法の修正方法が最近O'Neil(AAAS会議,1993年8月)及びHiggins(AAAS会議,1993年8月)によって報告された。上記方法の欠点は手順がコスト高なことである。
本発明の特定実施態様は、グリコシダーゼのスクリーニング及び特性決定方法である。一連のグリコシダーゼを産生する確率の高い生物を選択する。この方法では、生物の粗調製物からのグリコシダーゼ加水分解産物を、所定の長さ、組成及び二次構造を有する標識オリゴ糖基質または誘導体化した単糖類を用いて分析する。次いで、グリコシダーゼを単離し、更に特性決定し、それらの基質特異性を更に定義する。
本発明の1つの実施態様は、食物資源として糖質を選択的に利用する生物が新規なグリコシダーゼのソースを提供するという認識である。この特徴は表3及び表4に例示されている。これらの表においては、Xanthomonas及びBacillusの種々の菌株の細胞抽出物を、実施例2に記載のようなクマリン標識オリゴ糖群を基質として用いてスクリーニングした。反応生成物をTLCによって同定した。細胞抽出物以外に、細胞調製物から収集した培地をグリコシダーゼ活性に基づいてスクリーニングしてもよい。
本発明のランダムスクリーニング方法によって同定し、次いで単離し、精製し、選択基質に対して更にスクリーニングしたグリコシダーゼを、酵素の組換え形態を調製するために、部分または完全タンパク質配列及びDNAコーディング配列を与えるタンパク質配列決定によって更に特性決定し得る。本発明の1つの実施態様においては、クローンを同定し単離するために、グリコシダーゼをクローニングし、組換えクローンをスクリーニングする方法が記載されている(実施例5)。特定のグリコシダーゼを発現する生物だけが利用し得る特定の食物資源上で組換えライブラリーを増殖させることによって組換えクローンの単離効率を更に改良し得る。このようなスクリーニング基質の実例としてはパントテン酸に結合した二糖(実施例5参照)またはオリゴ糖がある。更に、既知のDNA配列を有するクローン化グリコシダーゼの入手が可能になったので、これらのDNA配列の遺伝子操作を行うことによって改変された基質特異性を有する突然変異酵素を形成し得る。
粗抽出物中の酵素活性の同定に引き続いて、本発明では、(Xanthomonas由来のグリコシダーゼについて)実施例3でより十分に記載された当業界で公知の方法によってグリコシダーゼの単離及び精製を行う。グリコシダーゼの単離及び精製後、基質特異性によって更に進んだ酵素のキャラクタリゼーションを行った(図4〜11)。また、表5及び実施例4に記載したように反応の補因子を決定し最適pHも確認した。
本発明の1つの実施態様においては、同定された基質特異性を有する実質的に純粋な多くの単離グリコシダーゼと迅速で簡単な反応生成物同定アッセイとを組み合わせることによって以下の目的に適う改良方法が提供される。
0.25〜1mgのオリゴ糖(Accurate Chemical and Scientific Corp.,Westbury,NY;Sigma Chemical,St.Louis,MO;Pfanstiehl Labs,Waukegan,IL;及びV−Labs Inc.,Covington,Laから商品として得られるか、または、Carbohydrate Analysis:A Practical Approach(1986)Eds.Chaplin,M.F.Kennedy,J.F.(IRL Press Limited,England) pp.150−151から参照によって本明細書に含まれる方法に従って単離される)。
スクリーニングアッセイ用細胞抽出物の調製
0.1〜0.5gの細胞ペーストを解凍し、3倍容のバッファA"(20mMのTris−HCl,pH7.5、50mMのNaCl、1mMのEDTA)に懸濁させた。細胞懸濁液を短時間音波処理し、エッペンドルフ微量遠心管に入れて14,000rpmで4℃で10分間遠心した。
1〜5μlの細菌細胞抽出物または細胞増殖培地または部分精製した抽出物を、50mMのクエン酸ナトリウムバッファ(種々のpH及び補因子、表5参照)中に1ナノモルのAMC−標識基質を含む10μlの反応混合物に添加した。反応物を37℃で5分間〜20時間の期間インキュベートした。2〜3μlの反応物を後述するようなシリカゲルTLCプレートにバンドとして滴下した。37℃、1時間でオリゴ糖基質から1ナノモルの末端単糖を遊離させるために必要な酵素の量を酵素1単位と定義した。
2〜3μl(=0.25ナノモルの基質)のグリコシダーゼ消化反応物をガラス裏面をもつシリカゲル60TLCプレート(0.25mm厚、20×20cm)に緻密なバンド(0.5cm幅のレーン)として滴下した。温風ガン(温度70℃以下)でバンドを完全に乾燥させた。オリゴ糖の大きさに基づく種々の割合のイソプロパノール:エタノール:H2O混合物(表1)中で溶媒前縁が10cm移動するまでTLCプレートを展開させた。手持ち型の314nm紫外線ランプでバンドを可視化した。この方法を用いると最も少ない場合で0.1ナノモルの消化産物を検出できた。
Xanthomonas manihotisの発酵
1g/lの酵母エキス、2g/lのトリプトン、6g/lのリン酸ナトリウム(二塩基性)、3g/lのリン酸カリウム(一塩基性)、0.5g/lのNaCl、1g/lの塩化アンモニウム、2g/lのグルコース、1mMの塩化カルシウム、1mMの硫酸マグネシウムから成る培地でXanthomonas manihotis菌NEB257株(ATCC#49764)を増殖させた。細胞を30℃で通気及び撹拌しながら後期対数増殖期までインキュベートした。細胞を遠心分離によって採取し−70℃で凍結保存した。
以後のすべての手順を氷上または4℃で行った。上記で得られた254gの細胞ペーストを2倍容のバッファA(20mMのTris−HCl(pH7.5)、50mMのNaCl、0.1mMのEDTA)に懸濁させた。細胞懸濁液をGaulinホモジナイザー(M−15モデル)に12,000psiで2回通した。Sharples連続遠心機で溶菌液を1,300gで40分間遠心した。500mlの上清が得られた。
疎水性及び電荷に従って酵素を分画する一連の分離方法を利用することによって粗細胞抽出物からグリコシダーゼを分離及び精製した。表5に記載の条件を用い実施例2に記載の方法に従って酵素を検定した。
α1−2フコシダーゼ活性を含有する上記のDEAE Sepharoseプール(300ml)に、40gの硫酸アンモニウムを穏やかに撹拌しながら最終濃度1Mまで添加した。次いで、バッファBで平衡させたPhenyl Sepharoseカラム(1.6×15cm)にプールを導入した。カラムを60mlのバッファBで洗浄し、次いで、120mlのバッファBと0.001Mだけの(NH4
)2SO4を含有する120mlのバッファBとによって形成された硫酸アンモニウムの漸減直線勾配で処理した。画分(4ml)を流速2ml/分で収集した。画分のα1−2フコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、0.001Mの(NH4)2SO4で溶出させた。バッファC(20mMの酢酸ナトリウムH5.2、0.1mMのEDTA)に一夜透析後、プールした酵素を、バッファCで平衡させたS−Sepharose(1.0×10cm)カラムに充填した。カラムを20mlのバッファCで洗浄した。カラム通過物と洗浄液とを収集し、酵素活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークはカラム洗浄液中で検出された。バッファAに一夜透析後、洗浄液を、バッファAで平衡させたMono Q HR5/5(1ml)カラムに充填した。カラムを2mlのバッファAで洗浄し、次いで、40mlのバッファAと0.6MのNaClを含有する40mlのバッファAとによって形成されたNaClの直線勾配で処理した。画分(1.5ml)を流速1ml/分で収集し、α1−2フコシダーゼ活性を検定した。酵素活性のピークをプールし、カラムから0.05−0.15MのNaClに溶出させた。バッファAに一夜透析後、ナトリウムアジドを0.02%まで添加し、酵素を4℃で保存した。粗抽出物の精製後に収量1,500単位の実質的に純粋な酵素が得られた。
β−N−アセチルグルコサミニダーゼとα1−6マンノシダーゼの双方の活性を含む上記の酵素プール(130ml)をバッファAに一夜透析した。透析後、酵素プールを、バッファAで平衡させたQ−Sepharoseカラム(1.6×15cm)に導入した。カラムを60mlのバッファAで洗浄し、次いで、120mlのバッファAと1MのNaClを含有する120mlのバッファAとによって形成されたNaClの直線勾配で処理した。画分(4ml)を流速2ml/分で収集した。カラム通過物を収集し、β−GlcNAcアーゼ及びα1−6マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。Q−Sepharoseカラム通過物中でα1−6マンノシダーゼ活性だけが検出された。この酵素を以下のC項に記載の手順で更に精製した。Q−Sepharoseカラムから得られた画分のβGlcNAcアーゼ活性を上記の手順で検定した。β−N−アセチルグルコサミニダーゼ活性のピークをプールし、カラムから0.15−0.3MのNaClに溶出させた。バッファAに一夜透析後、酵素プールを、バッファAで平衡させたHeparin−TSK(3ml)カラムに導入した。カラムを6mlのバッファAで洗浄し、次いで、45mlのバッファAと0.6MのNaClを含有する45mlのバッファAとによって形成されたNaClの直線勾配で処理した。画分(1.5ml)を流速1ml/分で収集し、βGlcNAcアーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、カラムから0.25−0.3MのNaClに溶出させた。バッファAに一夜透析後、ナトリウムアジドを0.02%まで添加し、酵素を4℃で保存した。粗抽出物の精製後に収量30,000単位の実質的に純粋な酵素が得られた。
上記のB項に記載のQ−Sepharose通過物を、バッファD(20mMのリン酸カリウムpH6.0、10mMのNaCl、0.1mMのEDTA)に一夜透析した。透析後、通過物を、バッファDで平衡させたS−Sepharoseカラム(1.6×12cm)に導入した。カラムを40mlのバッファDで洗浄し、次いで、80mlのバッファDと0.6MのNaClを含有する80mlのバッファDとによって形成されたNaClの直線勾配で処理した。画分(2.5ml)を流速2ml/分で収集し、α1−6マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、0.15−0.3MのNaClに溶出させた。バッファE(20mMのTris−HCl,pH7.5、10mMのNaCl、0.1mMのEDTA)に一夜透析後、酵素プールを、バッファEで平衡させたHeparin−TSK(3ml)カラムに導入した。カラムを6mlのバッファEで洗浄し、次いで、45mlのバッファEと0.6MのNaClを含有する45mlのバッファEとによって形成されたNaClの直線勾配で処理した。画分(1.5ml)を流速1ml/分で収集し、α1−6マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、0.15−0.2MのNaClに溶出させた。バッファAに一夜透析後、ナトリウムアジドを0.02%まで添加し、酵素を4℃で保存した。上記プロトコルを用いて収量200,000単位の実質的に純粋な酵素が得られた。
α1−3,6ガラクトシダーゼを含有する上記のHeparinプールをバッファDに一夜透析した。透析後、酵素プールを、バッファDで平衡させたS−Sepharoseカラム(1.6×12cm)に導入した。カラムを40mlのバッファDで洗浄し、次いで、80mlのバッファDと0.6MのNaClを含有する80mlのバッファDとによって形成されたNaClの直線勾配で処理した。画分(3ml)を流速1ml/分で収集し、α1−3,6ガラクトシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、0.25−0.35MのNaClに溶出させた。バッファAに一夜透析後、酵素プールを、バッファAで平衡させたHeparin−TSK(3ml)カラムに導入した。カラムを6mlのバッファAで洗浄し、次いで、45mlのバッファAと1MのNaClを含有する45mlのバッファAとによって形成されたNaClの直線勾配で処理した。画分(1.5ml)を流速1ml/分で収集し、α1−3,6ガラクトシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素ピークをプールし、0.15−0.25MのNaClに溶出させた。バッファAに一夜透析後、ナトリウムアジドを0.02%まで添加し、酵素を4℃で保存した。上記プロトコルを用いて収量67,500単位の実質的に純粋な酵素が得られた。
β1−3>>4ガラクトシダーゼ及びα1−2,3マンノシダーゼの双方の活性を含有する上記のPhenyl SepharoseプールをバッファDに一夜透析した。透析後、プールを、バッファDで平衡させたS−Sepharoseカラム(1.0×10cm)に導入した。カラムを20mlのバッファDで洗浄し、次いで、50mlのバッファDと0.6MのNaClを含有する50mlのバッファDとによって形成されたNaClの直線勾配で処理した。カラム通過物を収集し、β1−3>>4ガラクトシダーゼ及びα1−2,3マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。S−Sepharoseカラム通過物中でα1−2,3マンノシダーゼ活性だけが検出された。
α1−2,3マンノシダーゼ活性を含有する上記のS−Sepharoseカラム通過物をバッファEに一夜透析した。透析後、通過物を、バッファEで平衡させたQ−Sepharoseカラム(1.0×10cm)に導入した。カラム通過物を収集し、α1−2,3マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークはカラム通過物中で検出された。通過物を次に、バッファEで平衡させたHeparin Sepharose CL−6Bカラム(1.0×10cm)に導入した。通過物を収集し、検定すると、酵素活性のピークを含むことが判明した。通過物を次に、バッファEで平衡させたMono Q HR10/10(8ml)カラムに充填した。カラム通過物と洗浄液とを収集し、α1−2,3マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。Mono Qカラム洗浄液が酵素活性のピークを含むことが判明した。4.36gの硫酸アンモニウムを穏やかに撹拌しながら洗浄液に最終濃度1Mまで添加した。洗浄液を、バッファBで平衡させたPhenyl Sepharoseカラム(1.0×10cm)に導入した。カラムを20mlのバッファBで洗浄し、次いで、1Mから0.001Mまで漸減する硫酸アンモニウムを含有する50mlのバッファBによって形成された硫酸アンモニウムの漸減直線勾配で処理した。画分(2ml)を流速2ml/分で収集し、α1−2,3マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、0.55−0.3Mの(NH4)2SO4に溶出させた。バッファDに一夜透析後、酵素プールを、バッファDで平衡させたPoly−Cat A(3ml)カラムに導入した。通過物を収集し、α1−2,3マンノシダーゼ活性を検定した。カラム通過物が酵素活性のピークを含むことが判明した。4.62gの硫酸アンモニウムを穏やかに撹拌しながら最終濃度1Mまで通過物に添加した。通過物を次に、バッファBで平衡させたPhenyl Superose HR10/10(8ml)カラムに導入した。カラムを20mlのバッファBで洗浄し、次いで、50mlのバッファDと0.001Mだけの(NH4)2SO41Mを含有する50mlのバッファBとによって形成された硫酸アンモニウムの漸減直線勾配で処理した。画分(1.5ml)を流速1ml/分で収集し、α1−2,3マンノシダーゼ活性を検定した。酵素活性のピークをプールし、0.65−0.5Mの(NH4)2SO4に溶出させた。バッファEに一夜透析後、ナトリウムアジドを0.02%まで添加し、酵素を4℃で保存した。上記プロトコルを用いて収量4,000単位が得られた。
β−グルコシダーゼ活性を含有する上記のPhenylSepharoseプールをバッファDに一夜透析した。透析後、プールを、バッファDで平衡させたS−Sepharoseカラム(1.0×10cm)に導入した。カラムを20mlのバッファDで洗浄し、次いで、50mlのバッファDと0.6MのNaClを含有する50mlのバッファDとによって形成されたNaClの直線勾配で処理した。画分(1ml)を流速1ml/分で収集し、β−グルコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、0.1−0.1MのNaClに溶出させた。バッファDに一夜透析後、酵素プールをMono S HR5/5(1ml)カラムに導入した。カラムを2mlのバッファDで洗浄し、次いで、20mlのバッファDと0.6MのNaClを含有する20mlのバッファDとによって形成されたNaClの直線勾配で処理した。画分(1ml)を流速1ml/分で収集し、β−グルコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、0.05−0.1MのNaClに溶出させた。バッファAに一夜透析後、酵素プールを、バッファAで平衡させたHeparin−TSK(3ml)カラムに導入した。カラム通過物及び洗浄液を収集し、βグルコシダーゼ活性を上記の手順で検定し、洗浄液が酵素活性のピークを含むことを検出した。洗浄液をバッファAに一夜透析した。ナトリウムアジドを0.02%まで添加し、酵素を4℃で保存した。粗抽出物の精製後に500単位の収量が得られた。
α1−3,4フコシダーゼ活性を含有する上記のPhenyl Sepharose洗浄液をバッファCに透析した。透析後の洗浄液を、バッファCで平衡させたS−Sepharoseカラム(1.0×10cm)に導入した。カラムを20mlのバッファCで洗浄し、次いで、50mlのバッファCと0.6MのNaClを含有する50mlのバッファCとによって形成されたNaClの直線勾配で処理した。画分(2ml)を流速2ml/分で収集し、α1−3,4フコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、0.15−0.25MのNaClに溶出させた。バッファCに一夜透析後、酵素プールを、バッファCで平衡させたMono S HR5/5(1ml)カラムに導入した。カラムを2mlのバッファCで洗浄し、次いで、35mlのバッファCと0.6MのNaClを含有する35mlのバッファCとによって形成されたNaClの直線勾配で処理した。画分(1ml)を流速1ml/分で収集し、α1−3,4フコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、0.25−0.35MのNaClに溶出させた。バッファAに一夜透析後、酵素プールを、バッファAで平衡させたHeparin−TSK(3ml)カラムに導入した。カラム通過物を収集し、α1−3,4フコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。通過物が酵素活性のピークを含むことが判明した。1.19gの硫酸アンモニウムを穏やかに撹拌しながら最終濃度1.5Mの(NH4)2SO4となるまで通過物に添加した。通過物を次に、バッファF(20mMのTris−HCl,pH7.5、1.5Mの硫酸アンモニウム、0.1mMのEDTA)で平衡させたPhenyl Superose HR10/10(8ml)カラムに導入した。カラムを20mlのバッファFで洗浄し、次いで、50mlのバッファFと0.002Mだけの(NH4)2SO4を含有する50mlのバッファFとによって形成された硫酸アンモニウムの漸減直線勾配で処理した。画分(1.5ml)を流速1ml/分で収集し、α1−3,4フコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、0.6−0.5Mの(NH4)2SO4に溶出させた。バッファAに一夜透析後、ナトリウムアジドを0.02%まで添加し、酵素を4℃で保存した。粗抽出物の精製後に60,000単位の収量が得られた。
上記で得られた280gの細胞抽出物を3倍容のバッファA'(20mMのTris−HCl,pH7.5、50mMのNaCl、1mMのEDTA)に懸濁させた。細胞懸濁液をGaulinホモジナイザー(M−15モデル)に12,000psigで2回通した。溶菌液をSharples連続遠心機で13,000gで40分間遠心した。700mlの上清が得られた。
A.フコシダーゼ
α1−3,4フコシダーゼ(I)及びα1−2フコシダーゼ(II)に対する反応条件を最適にした。50mMのクエン酸ナトリウムpH6.0中の1.0ナノモルの基質を酵素で消化した(2単位のα−フコシダーゼII(図4、レーン2)、100単位のα−フコシダーゼI(図4、レーン3)、2単位のα−フコシダーゼI(図4、レーン5、6、9、10)、20単位のα−フコシダーゼII(図4、レーン7、11)、及び、2単位のβ−ガラクトシダーゼ(図4、レーン6、10)(ウシ睾丸、BMB))。(1単位は、37℃、1時間でオリゴ糖から1ナノモルの末端糖を遊離するために必要な酵素の量と定義される)。補因子は全く不要であることが判明した。インキュベーションを37℃で4時間及び24時間行った。4時間後、Xanthomonas manihotisのフコシダーゼによる基質の消化が完了していた。活性の弱いβ−ガラクトシダーゼによる消化が完了できるようにインキュベーションを24時間まで延長した。
Xanthomonas manihotisから上記のごとく精製した10単位のβ−N−アセチルグルコサミニダーゼ(β−GlcNAcase)は、50mMのクエン酸ナトリウムpH4.5中で補因子の非存在下に0.5〜1ナノモルの基質と反応することが判明した。pH4〜6のpH範囲で酵素は同様に活性であった。インキュベーションを37℃で4時間行った。
ND=検出不能
10mMのPNP基質、25μlの反応容量を使用し、75μlの0.2Mホウ酸ナトリウムpH9.8で反応を停止させ、得られた吸光度をOD400で測定した。
*Xanthomonas manihotisから精製した50NEB単位の酵素をPNPβGalNAcに対して検定した。(一夜インキュベートした場合であっても、PNP−GalNAcに対する測定可能な活性は検出できなかった)。
直鎖状構造に対する特異性
クマリン標識オリゴ糖を用いXanthomonas manihotisから単離した3種の酵素の基質特異性を試験した。基質を表8に示し、開裂を(+)によって記録する。この表を導いたTLCデータを図10に示す。TLCに示されたマーカーは、二糖、四糖及び六糖から成るオリゴ糖混合物である。レーン1、7及び11は非消化の基質である。
図11に示すように、基質213及び216に対するα−マンノシダーゼIのインキュベーション(2時間)は、この酵素が分枝状構造を開裂し得ることを証明した。レーン2及び8は2個のマンノース残基の除去を示す。インキュベーションを更に継続(20時間)すると、第2の対の分枝状マンノースが除去された(レーン13、19)。この消化は部分的であり、その理由は還元末端の隣接標識マンノースの負の作用にあると考えられるが、天然産オリゴ糖基質の第2の分枝が開裂されていたと考えることもできる。
図9に示すように、α1−3,6ガラクトシダーゼはGalα1−3R及びGalα1−6R結合(レーン3、6及び9)を優先的に開裂する。5mMのCaCl2を補充した50mMのクエン酸ナトリウムpH6.0中の1ナノモルの基質に10単位の酵素を添加し37℃で2時間インキュベートしたときに、基質109(Galα1−3Galβ1−3GlcNAc−Co)から1つの単糖が遊離したことがレーン3に示されており、また、基質181(Galα1−6Glcα1−2Fru−Co)から単糖開裂産物が得られたことが示されている。対照的に、酵素の量を10単位に比べて100単位に増加しインキュベーション時間を2時間に比べて20時間に延長したときであっても酵素が基質193(Galα1−4Galβ1−43Gal−Co)を開裂しないことがレーン5に示されている。これらの結果は、コーヒー豆(BMB)に由来の市販のα−ガラクトシダーゼと対照的である。コーヒー豆のα−ガラクトシダーゼはレーン6に示すように基質193のGalα1−4R結合を容易に開裂する。対照レーン1、4及び7は酵素非添加の非消化基質を示す。マーカーは二糖、四糖及び六糖を含む。
E.β1−3>>4ガラクトシダーゼ
図8に示すように、β1−3>>4ガラクトシダーゼはGalβ1−3R結合を優先的に開裂する。レーン2は、50mMのクエン酸ナトリウムpH4.5中の1ナノモルの基質に1単位の酵素を添加し37℃で2時間インキュベートしたときに基質167(Galβ1−3GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc−Co)から少なくとも1つの単糖が遊離されることを示す。対照的に、酵素の濃度を1単位に比べて100単位に増加したときに酵素が基質202(Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc−Co)を部分的にしか開裂しないことがレーン6に示されている。これらの結果は、ニワトリ肝臓(cl)及びウシ睾丸(bt)に由来の市販のβ−ガラクトシダーゼと対照的であり、これらの酵素はいずれも基質167及び202を同様に十分に切断する(レーン3、4、7及び8)。レーン1及び5は酵素非添加の非消化基質対照を示す。
図12に示すように、Xanthomonas manihotisに由来の粗抽出物は少なくともGlcβ1−4R結合に特異性を有することが判明した。50mMのクエン酸ナトリウムpH4.5及び5mMのCaCl2中に1ナノモルの基質を含むインキュベーション混合物中で37℃で2時間の酵素消化を行った。酵素を種々の濃度で使用した。次いで、反応混合物をTLCプレートに滴下した。酵素非添加の基質を陰性対照として添加し、更に、基質とβGlcNAcアーゼとから成る陽性対照(レーン7)、及び、基質とβ−ガラクトシダーゼ(ウシ睾丸)とから成る陽性対照(レーン10)を添加した。レーン2、4、6及び9は夫々、1単位のβ−ガラクトシダーゼ(β−Glcアーゼ)を179(Glcβ1−4Glcβ1−4Glc−Co)と混合した場合、5単位のβ−Glcアーゼを180(Glcα1−4Glcα1−4Glc−Co)と混合した場合、5単位のβ−Glcアーゼを118(GlcNAcβ1−4GlcNAcβ1−4GlcNAc−Co)と混合した場合、及び、5単位のβ−Glcアーゼを202(Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc−Co)と混合した場合の反応生成物を示す。試験した4種の基質のうちで末端Glcβ1−4結合を含む基質179だけがβ−Glcアーゼによって開裂された。
天然産グリコシダーゼのソースとしてXanthomonasを用いるエキソグリコシダーゼ遺伝子のクローニング方法を記載する。しかしながらこの方法は、このソースだけでなく、上記の手順で少なくとも1種類のグリコシダーゼを検出できると判断された任意の生物に応用できる。
Xanthomonas manihotisのDNAを作製するために、1gの細胞ペーストを5mlの0.1MのTris−HCl、0.1MのEDTA,pH7.6中で30分間穏やかに撹拌することによって再懸濁させた。上清を各3.0mlの2つのアリコートに分割した。0.1MのTris−HCl、0.1MのEDTA,pH7.6中の1.7mg/mlのリゾチーム3.5mlを各アリコートに添加し、夫々を37℃で15分間インキュベートした。SDSを1%まで添加し、プロテイナーゼKを0.13mg/mlまで添加し、次いでアリコートを37℃で1時間インキュベートした。10%SDSと8%サルコシルとの溶液0.4mlを各々に添加し、インキュベーションを55℃で2時間継続した。次いで、2つのアリコートを一緒にし、DNAバッファ(10mMのTris−HCl、1mMのEDTA,pH8.0)を4回交換しながら24時間透析した。透析したDNA溶液を次に、塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度遠心の準備として、DNAバッファで総量を40mlに増量し、次いでDNA溶液を各20mlの2つのアリコートに分け、各アリコートに20gの塩化セシウムと0.2mlの5mg/ml臭化エチジウムとを添加した。DNA溶液を44,000rpmで48時間遠心し、得られたDNAのバンドを注射器及び18ゲージ針で採取した。氷冷し水で飽和した等容量のN−ブタノールで4回抽出することによって臭化エチジウムを除去した。透析によって塩化セシウムを除去した。次に、NaClを0.5Mまで添加し、上部に0.55倍容のイソプロピルアルコールを重層させることによってDNAを沈殿させた。沈殿したDNAをガラス棒に巻取った。2mlの10mMのTris、1mMのEDTA,pH8.0中でDNAを最終濃度約76μg/mlまで溶解した。
精製DNAをSau3AIで開裂し部分消化するために、100mMのBis Trisプロパン−HCl,pH7.0、10mMのMgCl2、100mMのNaCl、1mMのジチオトレイトールバッファ中で76μg/mlの濃度の124μlのDNAを、100μg/mlのBSAによって処理し、、400μlのアリコートと各200μlの4つのアリコートとに分割した。400μlの管に2単位のSau3AIを添加して、DNA4.75μgあたり1単位の酵素が含まれる濃度にした。第1の管から取り出した200μlを第2の管に移して4.75mgあたり0.5単位のSau3AIが含まれる濃度にし、以後同様にして、継続する管が直前の管の半量のSau3AIを含むようにした。管を37℃で15分間インキュベートし、72℃で15分間熱処理し、次いでTris−ホウ酸塩−EDTAバッファ中の0.7%アガロースゲル中で電気泳動処理した。DEAEアニオン交換濾紙に2時間電気泳動させることによって約9〜2kbの大きさを有するDNAフラグメントを収集した。濾紙を0.1MのNaCl、10mMのTris,pH8.0及び1mMのEDTAを含む150μlのバッファで2回洗浄した。次いで、濾紙を1.0MのNaCl、10mMのTris,pH8.0及び1mMのEDTAを含む75μlのバッファで4回洗浄することによって濾紙からDNAを溶出させた。得られたDNAフラグメント含有溶液を、300μlのフェノール/クロロホルムで抽出し、300μlのクロロホルムで抽出し、ドライアイス/エタノール浴に15分間入れることによって1mlの無水エタノールで沈殿させた。DNAを14Krpmで5分間ペレット化した。ペレットを70%エタノールで洗浄し、風乾し、10mMのTris,pH8及び1mMのEDTAの最終容量10μlに再懸濁させた。精製フラグメントを以下の段階3に記載の手順で使用した。
フラグメント化したDNAを以下の手順でpUC19に結合させた。3μgのSau3AIで部分消化したXanthomonas manihotisのDNA(10μl)を、1.5μgのBamHI開裂し脱リン酸化したpUC19(1μl)と混合した。4μlの10×結合バッファ(500mMのTris,pH7.5、100mMのMgCl2、100mMのDTT、5mMのATP)を添加し、更に25μlの滅菌蒸留水を加えて最終濃度39μlとした。1μlの濃縮T4 DNAリガーゼ(2×106U/ml)を添加し、混合物を37℃で2時間インキュベートした。Millipore VS 0.025μMフィルターを用いた滴下透析によって10μlの結合混合物を脱イオン化した。次いで、DNAを大腸菌ED8767に電気穿孔させた。電気穿孔の準備として1リットルの大腸菌細胞をLブイヨン中でKlett50−80まで増殖させた。細胞を氷上で15〜30分間冷却し、次いで低温下で4,000rpmで15分間ペレット化した。ペレットを氷冷滅菌水で2回及び10%グリセロールで1回洗浄した。洗浄したペレットを1〜2mlの10%グリセロール中で最終濃度3×1010細胞/mlまで再懸濁させた。必要になるまで細胞を100μlのアリコートとして−70℃で凍結保存した。準備した細胞にDNAを電気穿孔するために、細胞を静かに解凍し氷に載せた。40μlの細胞を結合及び透析した10μlのDNAと混合した。混合物を低温の0.2cm電気穿孔キュベットに導入した。12.5kv/cmの電気パルスを4〜5ミリ秒の時定数でDNA細胞混合物に印加した。大腸菌を直ちに1mlのLブイヨンで希釈し、37℃で30分間増殖させ、選択培地を含む150mmのL寒天プレート上で平板培養した。37℃で一夜インキュベーション後、エキソグリコシダーゼを発現するクローンを以下の手順でスクリーニングした。
エキソグリコシダーゼ活性を発現するクローンをスクリーニングするために、異なる3種の色素産生指示基質を使用した。色素産生基質の1つとして、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−B−D−ガラクトピラノシド(X−gal)を使用した。この基質を50μg/mlの濃度で、形質転換細胞を平板培養する前の選択寒天培地に添加した。X−galを含む寒天プレート上で増殖するβ−ガラクトシダーゼ発現コロニーは青色を呈するであろう。この手順でスクリーニングした9×104個のコロニーのうちで、1つのコロニーだけが青色を呈した。また、エキソグリコシダーゼ活性をスクリーニングするための色素産生基質として4−メチルウンベリフェリル(4−MU)基質も使用した。これらの基質は、コロニー形成後に1μg/mlの濃度で選択プレートの表面に噴霧してもよく、または1.5%寒天に添加しコロニー含有選択プレートに重層させてもよい。噴霧または重層後に、活性エキソグリコシダーゼを産生するコロニーを、長波紫外光(366nm)でコロニーを観察することによって同定した。この実験では、4−MU基質の混合物を1.5%寒天に添加して重層させた。混合物としては、4−MU−N−アセチル−β−D−グルコサミニド、4−MU−β−D−マンノピラノシド、4−MU−α−D−グルコシド、4−MU−β−D−グルコシド、4−MU−α−D−ガラクトシドを使用した。これらの基質の1つを開裂し得る活性β−N−アセチルグルコサミニダーゼ、β−マンノシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼまたはα−ガラクトシダーゼを産生するコロニーはUV光下で青色の蛍光を発するであろう。これらの基質を用いてスクリーニングした2×104個のコロニーから、8つの蛍光コロニーを単離した。3つの単離コロニーはα−ガラクトシダーゼを産生し、2つはβ−グルコシダーゼを産生し、1つはβ−N−アセチルグルコサミニダーゼを産生し、残りの2つは、夫々の4−MU基質開裂能力及び夫々のp−ニトロフェニル基質開裂能力から判断して検出可能なエキソグリコシダーゼ活性を有していなかった。
: オリゴ糖のAMC−標識
基質は、Accurate Chemical and Scientific Corp.(Westbury,N
Y),Pfanstiehl Labs(Waukega,IL),V−Labs,Inc.,(Covington,LA)から購入するか、または、Carbohydrate Analysis:A Practical Approach(1986)Eds.Chaplin,M.F.KennedyJ.F.(IRL Press Limited,England)pp.150−151)から参照によって本明細書に含まれる方法に従って単離した。調製用シリカゲル60プレート(1,000μm厚、20×20cm)はEM Science(Gibbstown,NJ)から得られた。7−アミノメチルクマリン(AMC)はEastman Kodak(Rochester,NY)から得られた。西洋ワサビペルオキシダーゼはSigma Chemical Company(St.Louis,MO)から購入した。
Fガラス裏面をもたないシリカゲル60のTLCプレートをEM Science(Gibbstown,NH)から購入した。p−ニトロフェニルグリコピラノシドをSigma Chemical Co.(St.Louis,MO)から購入した。対照グリコシダーゼは、Boehringer Mannheim(Indianapolis,IN)、Oxford GlycoSystems(Rosedale,NY)またはSeikagaku(Rockville,MD)から得られた。カラム及びクロマトグラフィー試薬は、Pharmacia(Piscataway,NY)またはTosoHaas(Montgomeryville,PA)から購入した。
細胞ペースト(0.1〜0.5g)を解凍し、3倍容のバッファA'(20mMのTris−HCl[pH7.5]、50mMのNaCl、1mMのNa2EDTA)に懸濁させた。短時間の音波処理後、細胞懸濁液をエッペンドルフ微量遠心管で14,000rpmで4℃で10分間遠心した。
細胞抽出物、細胞増殖培地または部分精製抽出物のグリコシダーゼ活性を、50mMのクエン酸ナトリウムpH5.5(種々のpH及び補因子、表5参照)中の1ナノモルのAMC−標識オリゴ糖を含む10μlの混合物に1〜5μl添加することによって検定した。37℃で5分〜20時間の範囲の期間インキュベーション後、反応物を後述するようにTLCによって分析した。β−キシロシダーゼ活性の最終収量を定量するために、50mMのクエン酸ナトリウムpH4.5中のXylβ1−4Xylβ1−4Xylβ1−4Xyl−Coを基質として使用した。37℃、1時間でオリゴ糖基質から1ナノモルの末端キシロースを遊離するために必要な酵素の量を1単位のβ−キシロシダーゼと定義する。β−マンノシダーゼ活性の最終収量を定量するために、100μg/mlのウシ血清アルブミンを補充した50mMのクエン酸ナトリウムpH5.5中のManβ1−4Manβ1−4Man−Coを基質として使用した。30℃、1時間でオリゴ糖基質から1ナノモルの末端マンノースを遊離するために必要な酵素の量を1単位のβ−マンノシダーゼと定義する。
ガラス裏面をもつシリカゲルTLCプレート上に少量のグリコシダーゼ消化反応物(2〜3μl)を緻密なバンドとして滴下した。バンドを温風ガン(温度70℃以下)で完全に乾燥した。イソプロパノール:エタノール:H2O(2.5:1.0:0.5、v:v:v)中で溶媒前縁が10cm移動するまでプレートを展開させた。クロマトグラフィー処理後、原点の近傍に残存するAMC−基質、及び、移動相と共に上方に泳動した加水分解産物を、314nmのUVランプで可視化した。非消化の二糖(Galβ1−4GlcNAc−Co)、四糖(Galβ1−3GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc−Co)及び六糖(Galβ1−4GlcNAcβ1−6[Galβ1−4GlcNAcβ1−3]Galβ1−4Glc−Co)のマーカーを対照として用いた。非消化の基質も対照として用いた。
エキソグリコシダーゼは典型的には、p−ニトロフェニルグリコピラノシドのような誘導体化された単糖を基質として同定及び精製された(Hayward,A.C.(1977)J.Appl.Bacteriol.43:407−411)。これらの基質は、特異的単糖をそのアノマー性と共に認識し得る酵素の能力に関する情報を与える。しかしながら、単糖は第2の糖に結合せずむしろ色素産生マーカーに結合するので、酵素の結合特異性に関する情報は全く得られない。単糖誘導体を開裂し得るグリコシダーゼはしばしば、糖残基がオリゴ糖の一部であるときに糖残基を加水分解できない(Talbot,G. & Sygusch,J.(1990)Appl.Environ.Microbiol.56:3505−3510)。
Xanthomonas holcicolaの発酵
Xanthomonas holcicola菌NEB121株(ATCC#13461)を、10g/lのトリプトン、5g/lの酵母エキス、5g/lのNaCl及び0.3g/lのNaOHから成る培地中で増殖させた。細胞を通気及び撹拌を伴って後期対数増殖期までインキュベートした。細胞を遠心によって採取し、−70℃で凍結保存した。
以後の手順はすべて氷上または4℃で行った。上記で得られた細胞ペースト(191g)を2倍容のバッファA(20mMのTris−HCl[pH7.5]、50mMのNaCl、0.1mMのNa2EDTA)に懸濁させた。細胞懸濁液をGaulinホモジナイザー(M−15モデル)に12,000psiで2回通した。溶菌液をSharples連続遠心管で1,300gで40分間遠心した。565mlの上清が得られた。
酵素を疎水性及び電荷に従って分画する一連の分離方法を使用して、粗細胞抽出物からグリコシダーゼを分離及び精製した。表5に記載の条件を用い実施例7に記載の方法に従って酵素を検定した。
上記の酵素プールをバッファAに2時間透析し、次いでバッファAで平衡させたQ−Sepharoseカラム(1.6×12cm)に導入した。酵素活性を含有するカラム通過物を、バッファC(20mMのリン酸カリウム[pH6.0]、25mMのNaCl、0.1mMのNa2EDTA)に2時間透析し、バッファCで平衡させたS−Sepharoseカラム(1.0×10cm)に導入した。カラムを20mlのバッファCで洗浄し、次いで、150mlのバッファC中のNaClの直線勾配(0.025−0.95M)で処理した(流速1ml/分;2mlの画分)。酵素は0.4−0.55Mに溶出し、プールした画分をバッファAに2時間透析した。透析後、プールをバッファAで平衡させたHeparin−TSK(3ml)カラムに充填した。カラムを6mlのバッファAで洗浄し、次いで90mlのバッファA中のNaClの直線勾配(0.05−0.95M)で処理した(流速1ml/分;1ml画分)。酵素活性は0.2−0.3Mに溶出し、プールした画分をバッファAに一夜透析した。ナトリウムアジドを0.02%まで添加し、次いで酵素を4℃で保存した。4,000単位の収量の実質的に純粋な酵素が得られた。
B.β−マンノシダーゼ
(NH4)2SO4(66g)をカラム通過物(500ml)に最終濃度1Mの(NH4)2SO4となるまで添加し、バッファB(20mMのTris−HCl[pH7.5]、0.95Mの(NH4)2SO4、0.1mMのNa2EDTA)で平衡させたPhenyl Sepharoseカラム(1.6×15cm)に導入した。カラムを160mlのバッファBで洗浄し、次いで800mlのバッファB中の(NH4)2SO4の漸減直線勾配(0.095−0.001M)で処理した。酵素が0.9−0.7Mに溶出し、プールした画分をバッファCに4時間透析した。プールした酵素を、バッファCで平衡させたS−Sepharoseカラム(1.0×10cm)に充填した。カラムを20mMのバッファCで洗浄し、次いで150mlのバッファC中のNaClの直線勾配(0.025−0.95M)で処理した(流速1ml/分、2ml画分)。プールした酵素をバッファD(20mMのTris−HCl[pH7.5]、25mMのNaCl、0.1mM
のNa2EDTA)に4時間透析し、次いでバッファDで平衡させたMono Q HR5/5(1ml)のカラムに導入した。活性はカラム通過物中で検出された。0.8gの(NH4)2SO4を通過物に添加し、次いで、バッファBで平衡させたPhenyl Superose HR10/10(8ml)カラムに導入した。活性はカラム通過物中で検出された。0.8gの(NH4)2SO4を最終濃度1.5Mに添加し、次いで、バッファE(20mMのTris−HCl[pH7.5]、2.0Mの(NH4)2SO4、0.1mMのN
a2EDTA)で平衡させたPhenyl Superose HR10/10カラムに導入した。カラムを10mlのバッファEで洗浄し、次いで100mlのバッファE中の(NH4)2SO4の漸減直線勾配(2.0−0.02M)で処理した(流速1ml/分、1.5ml画分)。酵素活性は1.0−0.85Mに溶出し、プールした画分をCentriprep濃縮装置(Amicon,Inc.Beverly,Massachusetts)を用いて1mlに濃縮した。濃縮した酵素をバッファAに一夜透析した。ナトリウムアジド(0.2%)及びBSA(0.1mg/ml)を添加し、酵素を4℃で保存した。500単位の収量の実質的に純粋な酵素が得られた。
A.β−キシロシダーゼ
図16は、Xanthomonas holcicolaから単離されたβ−キシロシダーゼが、AMC−基質300:Manα1−6(Manα1−4)(Xy1β1−2)(Manβ1−4GlcNAcβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc−Co(レーン1−4)、及び、264:Xy1β1−4Xy1β1−4Xy1β−4−Co(レーン5及び6)を開裂する能力を示す。5mMのCaCl2を補充した50mMのクエン酸ナトリウムpH6.0中に1ナノモルのAMC−基質300(レーン3及び4)を含むか、または、50mMのクエン酸ナトリウムpH4.5中に1ナノモルのAMC−基質264(レーン6)を含む10μlの反応混合物に5単位のβ−キシロシダーゼを添加した。β1−3キシロシル結合がβ−キシロシダーゼによって加水分解されるいくつかの反応物は、X.manihotisから単離された2単位のα1−2,3マンノシダーゼ(実施例4)を含んでいた(レーン2及び4)。非消化の基質を対照として用いた(レーン1及び5)。二糖191:Galα1−3Gal−Co及び四糖202:Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc−Coをマーカー(M)として用いた。反応物を37℃で2時間インキュベートし、次いで実施例2に記載の手順でTLCによって分析した。図16に示すように、β−キシロシダーゼは反応物にα1−2,3マンノシダーゼが含まれているときにのみ(レーン2及び3)AMC−基質300のβ1−2結合を開裂した(レーン3)。α−マンノシダーゼ非含有でインキュベートしたときは開裂が全く観察されなかった(レーン4)。β−キシロシダーゼはまたAMC−基質264のβ1−4結合を開裂した。
図17は、β−マンノシダーゼがAMC−基質259:Man1−4Man1−4Man−Co(レーン1及び2)、及び、300:Manα1−6(Manα1−4)(Xy1β1−2)Manβ1−4GlcNAcβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc−Co(レーン3−8)を開裂する能力を示す。50mMのクエン酸ナトリウムpH5.5中に1ナノモルのAMC−基質259(レーン2)を含むかまたは5mMのCaCal2を補充した50mMのクエン酸ナトリウムpH6.0中に1ナノモルのAMC−基質300(レーン7及び8)を含む10μlの反応混合物に2.5単位のβ−マンノシダーゼを添加した。β1−4マンノシル結合がβ−マンノシダーゼによって加水分解されるいくつかの反応物は、X.manihotis(実施例4)から単離された2単位のα1−2,3マンノシダーゼ(レーン4−7)、X.holcicola(上記)から単離された2単位のβ−キシロシダーゼ(レーン5−7)、X.manihotis(実施例4)から単離された10単位のα1−6マンノシダーゼ(レーン6及び7)を含んでいた。非消化基質を対照として用いた(レーン1及び3)。二糖191:Galα1−3Gal−Co及び四糖202:Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc−Coをマーカー(M)として用いた。反応物を30℃で2時間インキュベートし、次いで実施例2に記載の手順でTLCによって分析した。図17に示すように、β−マンノシダーゼは、反応物にα1−2,3マンノシダーゼ、β−キシロシダーゼ及びα1−6マンノシダーゼが含まれているときにのみAMC−基質300のβ1−4結合を開裂した(レーン7)。これらの酵素を伴わずにインキュベートしたときは開裂が全く観察されなかった(レーン8)。β−マンノシダーゼはまたAMC−基質259のβ1−4結合を開裂した(レーン2)。
Xanthomonas oryzaeの発酵
Xanthomonas oryzae菌NEB416株をDifco栄養ブイヨンで増殖させた。通気及び撹拌を伴って細胞を30℃で後期対数増殖期までインキュベートした。細胞を遠心分離によって採取し、−70℃で凍結保存した。
100リットルの発酵物から得られた378gのXanthomonas oryzae細胞からβ−マンノシダーゼ及びβ−キシロシダーゼを精製した。細胞を1,144mlのバッファA(20mMのTris,pH7.5、50mMのNaCl及び1mMのEDTA)に再懸濁させ、Gaulinプレスを通すことによって溶解した。Sharples遠心管中の遠心分離によって細胞破片を除去した。上清をバッファAで平衡させたDEAE−Sepharose FFカラム(5.0×16.0cm)に通した。カラムを1,500mlのバッファAで洗浄した。DEAEカラムの通過物と洗浄液の最初の500mlとを収集し、バッファAで平衡させたHeparin Sepharose CL6Bカラム(2.5×29.0cm)に充填した。Heparin−Sepharoseカラムを750mlのバッファAで洗浄した。β−マンノシダーゼを精製するために、Heparin−Sepharoseカラムから収集した通過物及び洗浄液(2,300ml)に1,203gの硫酸アンモニウムをゆっくりと添加し、硫酸アンモニウムの濃度を80%飽和にした。沈殿物を撹拌しながら4℃で一夜インキュベートした。15,000×gで20分間遠心分離することによって沈殿物を収集した。ペレットを350mlのバッファAに再懸濁させ、1Mの硫酸アンモニウムを含有するバッファB(20mMのTris,pH7.5及び1mMのEDTA)に一夜透析した。透析後に残存する沈殿物を15,000×gで20分間遠心分離することによって完全に除去した。次のカラムがオーバーロードにならないように、上清(270ml)を2組に分け、以後は等しく処理した。135mlの上清を、1Mの硫酸アンモニウムを含有するバッファBで平衡させたPhenyl−Sepharose 6高速流(low sub)カラム(2.5×29cm)に充填した。Phenyl−Sepharoseカラムを、1Mの硫酸アンモニウムを含有する1,000mlのバッファBで洗浄した。1M−0.05Mの硫酸アンモニウムの漸減直線勾配でカラムからβ−マンノシダーゼを溶出させた。14mlの画分を流速2ml/分で収集し、活性を検定した。0.6−0.5M硫酸アンモニウムに溶出する活性のピークをプールし、バッファC(20mMのKPO4,pH6.0、0.1mMのEDTA及び10mMのNaCl)に透析し、バッファCで平衡させたSP−Sepharoseカラム(1.5×10cm)に充填した。カラムを80mlのバッファCで洗浄し、酵素を0.01−0.95MのNaCl直線勾配でカラムから溶出させた。3mlの画分を流速1ml/分で収集した。0.15〜0.13Mに溶出する活性のピークをプールし、1Mの硫酸アンモニウムを含有するバッファBに4時間透析した。透析したプールを1Mの硫酸アンモニウムを含有するバッファBで平衡させたPhenyl−Superose HR10/10カラムに充填した。1Mの硫酸アンモニウムを含有するバッファBでカラムを洗浄し、酵素を1M−0.05Mの硫酸アンモニウムの漸減直線勾配でカラムから溶出させた。1.5mlの画分を流速1ml/分で収集し、活性を検定した。0.7−0.6Mの硫酸アンモニウムに溶出する活性のピークをプールし、0.02%のナトリウムアジドを含有するバッファAに透析し、酵素を4℃で保存した。実質的に純粋なβ−マンノシダーゼの収量は1.2×103単位であった。
Xanthomonas oryzaeから上記の手順で精製した10単位のβ−マンノシダーゼは、50mMのクエン酸ナトリウムバッファpH5.4中で補因子の非存在下に0.5ナノモルの基質(Manβ1−4Manβ1−4Man−Coと反応することが判明した。酵素は4.5〜6.0のpH範囲で同様に活性であった。37℃で1時間インキュベーションを実施した。
1.DNA精製:Xanthomonas oryzaeのDNAを調製するために、1gの細胞ペーストを3mlの0.3Mショ糖、25mMのTris(pH8.0)、25mMのEDTA及び2mg/mlのリゾチームに再懸濁させた。懸濁液を37℃で10分間インキュベートした。インキュベーション後、4mlの2×Kirbyミックス[2gのトリイソプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウム、12gの2−アミノ−サリチル酸ナトリウム、5mlの2MのTris−HCl,pH8、6mlのフェノール(Tris,pH8.0で中和)]を細胞懸濁液に添加し、渦流ミキサーで1分間撹拌した。中和フェノールとクロロホルムとの1:1混合物(フェノール/クロロホルム)8mlを管に添加し、混合物を15分間撹拌した。細胞溶解液を12,000×gで10分間遠心処理した。水相を3mlのフェノール/クロロホルムを入れた新しい管に移し、渦流ミキサーで15秒間撹拌した。懸濁液を12,000×gで10分間遠心した。上方の相を新しい管に移し、1/10倍容の3Mの酢酸ナトリウムと等容量のイソプロパノールとを管に添加した。管を倒立させて管の内容物を混合した。DNAの凝塊をシールしたパスツールピペットで管から取り出し、10mlの70%エタノールを入れた管に移した。DNAを一度洗浄し、5mlのTE(10mMのTris,pH8.0及び1mMのEDTA)に溶解し、RNアーゼを最終濃度40mg/mlに添加した。DNAを37℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、1.5mlのフェノール/クロロホルムを15秒間渦流させることによってDNA溶液と混合した。懸濁液を12,000×gで10分間遠心し、水相を新しい管に移した。1/10倍容の3Mの酢酸ナトリウムと等容量のイソプロパノールとを水相に添加した。DNAの凝塊をシールしたパスツールピペットで管から取り出し、10mlの70%エタノールを入れた管に移した。DNAを一度洗浄し、2mlのTEに溶解させた。
2.部分消化:精製したDNAをSau3AIで開裂して以下のごとく部分消化した。10mMのBis Tris Propane−HCl,pH7.0、10mMのMgC
l2、100mMのNaCl、1mMのジチオトレイトールバッファ中に76μg/mlの125μlのDNAを100μg/mlのBSAと共に含む溶液を、400μlのアリコートと4つの200μlのアリコートとに分割した。400μlの管に2単位のSau3AIを添加し、4.75μgのDNAあたり1単位の酵素が含まれるようにした。第1の管から200μlを取り出して第2の管に移し、4.75μgあたり0.5単位のSau3AIが含まれるようにし、以後同様にして、連続する管の各々が直前の管の半量のSau3AIを含むようにした。管を37℃で15分間インキュベートし、72℃で15分間熱処理し、次いで、Tris−Borate−EDTAバッファ中の0.7%アガロースゲルで電気泳動にかけた。DEAEアニオン交換濾紙に2時間電気泳動させることによって約9〔2kb範囲の大きさのDNAフラグメントを収集した。0.1MのNaCl、10mMのTris,pH8.0及び1mMのEDTAを含む150μlのバッファ中で濾紙を2回洗浄した。次いで、1.0MのNaCl、10mMのTris,pH8.0及び1mMのEDTAを含む75μlのバッファ中で濾紙を4回洗浄することによって濾紙からDNAを溶出させた。得られたDNAフラグメント含有溶液を300μlのフェノール/クロロホルムで抽出し、次いで300μlのクロロホルムで抽出し、ドライアイス/エタノール浴に15分間入れることによって1mlの無水エタノールで沈殿させた。DNAを14Krpmで5分間ペレット化した。ペレットを70%エタノールで洗浄し、風乾し、最終容量10μlの10mMのTris,pH8及び1mMのEDTAに再懸濁させた。精製したフラグメントを以下の段階3で使用した。
3.結合:フラグメント化したDNAを以下の手順でpUC19に結合した。Sau3AIで部分消化した3μgのXanthomonas oryzae DNA(10μl)を、1.5μgのBamHI開裂し脱リン酸化したpUC19(1μl)と混合した。4μlの10×結合ミックス(500mMのTris,pH7.5、100mMのMgCl2、100mMのDTT、5mMのATP)を添加し、更に25μlの滅菌蒸留水を添加して最終容量を39μlとした。1μlの濃縮T4 DNAリガーゼ(2×106U/ml)を添加し、混合物を37℃で2時間インキュベートした。10μlの結合物をMillipore VS 0.025μMフィルターを用いて滴下透析することによって脱イオン化した。次に、DNAを大腸菌ED8767に電気穿孔した。電気穿孔の準備として1リットルの大腸菌細胞をLブイヨン中でKlett50−80まで増殖させた。細胞を氷上で15〜30分間冷却し、次いで低温下で4,000rpmで15分間ペレット化した。ペレットを氷冷滅菌水中で2回及び10%グリセロール中で1回洗浄した。洗浄したペレットを1〜2mlの10%グリセロールに最終細胞濃度3×1010細胞/mlに再懸濁させた。必要になるまで細胞を100μlのアリコートにして−70℃で凍結した。準備した細胞にDNAを電気穿孔するために、細胞を静かに解凍し、氷に載せた。40μlの細胞と10μlの結合及び透析したDNAとを混合した。混合物を低温の0.2cmの電気穿孔キュベットに入れた。時定数4〜5ミリ秒で12.5kV/cmの電気パルスをDNA細胞混合物に印加した。大腸菌を直ちに1mlのLブイヨンに希釈し、37℃で30分間増殖させ、選択培地を含む150mmのL寒天プレートで平板培養した。37℃で一夜インキュベーション後、β−マンノシダーゼを発現するクローンを以下の手順でスクリーニングした。
4.β−マンノシダーゼクローンのスクリーニング。パラ−ニトロフェニル糖のような合成基質を開裂し得るβ−マンノシダーゼを発現するクローンをスクリーニングするために、先ず、色素産生基質4−メチルウンベリフェリル(4−MU)β−D−マンノピラノシドを試験した。この基質を1.5%寒天に添加し、コロニーを含む選択プレートに重層した。重層後、長波紫外光(366nm)でコロニーを観察することによって活性β−マンノシダーゼを産生するコロニーを同定し得る。この実験では2×104コロニーをこの基質を用いてスクリーニングしたが、蛍光コロニーは単離されなかった。この方法でクローンが全く単離されなかったので、他の方法を使用しなければならなかった。X.oryzaeのβ−マンノシダーゼを発現するクローンをスクリーニングするために、分画平板培養培地を使用した。使用した培地はラクトースを利用できない炭素ソースとして大腸菌突然変異体(lac−)をスクリーニングするために使用したEMB寒天の変種である。旧来のEMB寒天はラクトースと2種類の指示色素、エオシンイエロー及びメチレンブルーを含む。ラクトースを発酵させ得る大腸菌の菌株(lac+)をEMB寒天で増殖させたときに、コロニーは暗紫色から黒色を呈するが、lac−大腸菌コロニーはラクトース発酵能力がないので白色である。β−マンノシダーゼを発現するクローンをスクリーニングするために、ライブラリー(上記)を100mgのカルベニシリン、0.4gのエオシンイエロー、0.065gのメチレンブルー及び1gのα−マンノビオースを培地1リットルあたりに含むM9最小培地に約30,000cfu/mlの濃度で平板培養した。二糖マンノビオース(マンノースβ−1−4マンノース)は、マンノビオースを宿主によって発酵させられるマンノースに開裂するクローン化したβ−マンノシダーゼを発現しなければ大腸菌によって炭素ソースとして利用されない。プレートを37℃で7日間インキュベートした。15,000cfuの平板培養コロニーのうちの2つのコロニーが、暗赤色を呈した。これらのコロニーを採取し、100μg/mlのアンピシリンを含有するLB寒天上で単離コロニーとして画線培養し、37℃で増殖させた。単離コロニーをアンピシリン含有の5mlのLBに採取し、37℃で6時間増殖させた。2つの試験コロニーのうちで、一方からの粗抽出物はβ−マンノシダーゼ活性を示した。アンピシリン含有LBに採取し37℃で18時間増殖させた単離コロニーから調製した粗抽出物はβ−マンノシダーゼ活性を全く示さなかった。この方法は、合成基質を開裂しないかまたは大腸菌中で不安定な他のグリコシダーゼ(Xanthomonas manihotisからのエキソ−α1−6マンノシダーゼ及びエキソ−α1−2,3−マンノシダーゼ)を単離するために使用された。以下の制約だけが存在する。(1)エキソ−グリコシダーゼが存在しなければ宿主は二糖、三糖またはオリゴ糖を利用できない。(2)エキソ−グリコシダーゼによって遊離された糖は大腸菌が利用できる唯一の炭素ソースでなければならない。(3)エキソ−グリコシダーゼを発現する宿主を増殖させる寒天ベースに十分な量で添加できる量の糖基質を入手しなければならない。
Claims (3)
- 細菌細胞ライセート中におけるグリコシダーゼの存在をスクリーニングする方法であって、
(a)宿主細胞のライセートを得、
(b)一組の標識オリゴ糖基質と共に該ライセートをインキュベートし、
(c)一組の基質のうちいずれの標識オリゴ糖基質が切断されるかを特定し、
(d)工程(c)よりグリコシダーゼを同定する段階を含む前記方法。 - 工程(c)が更に
(i)グリコシダーゼを単離、精製し、
(ii)単離したグリコシダーゼを同一のまたは更なる一組の標識オリゴ糖基質とともにインキュベートし、いずれの基質が切断されるかを特定し、
(iii)精製されたグリコシダーゼを基質特異性で特徴付ける段階を含む請求項1に記載の方法。 - 同定または精製されたグリコシダーゼが炭水化物中の特定のタイプのグリコシド結合を選択的に切断する請求項1または2に記載の方法。
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ES2182703B1 (es) * | 2001-06-18 | 2004-06-01 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | Un procedimiento enzimatico para obtener 4-0-b-d-galactopiranosil-d-xilosa, 4-o-b-d-galactopiranosil-d-xilosa obtenida de acuerdo con el pr cedimiento, composiciones que la contienen y su uso en la evaluacion de la lactasa intestinal. |
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WO2012158932A2 (en) * | 2011-05-18 | 2012-11-22 | University Of Massachusetts | REMOVAL OF α-GAL EPITOPES FROM THERAPEUTIC GLYCOPROTEINS FOR AVOIDING INTERACTION WITH THE ANTI-GAL ANTIBODY |
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DE3326546A1 (de) * | 1983-07-22 | 1985-02-07 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V., 8000 München | Verfahren zur kontinuierlichen enzymatischen herstellung von gluconsaeure oder ihren derivaten und sorbit und/oder mannit |
DE3801005A1 (de) * | 1988-01-15 | 1989-07-27 | Roehm Gmbh | Verfahren zur herstellung eines macerierenden aspergillus-enzyms |
EP0494178B1 (en) * | 1989-09-27 | 1996-05-08 | Astroscan Limited | Analysis of carbohydrates |
US5284558A (en) * | 1990-07-27 | 1994-02-08 | University Of Iowa Research Foundation | Electrophoresis-based sequencing of oligosaccharides |
US5242805A (en) * | 1991-08-23 | 1993-09-07 | Molecular Probes, Inc. | Long wavelength lipophilic fluorogenic glycosidase substrates |
WO1993005076A1 (en) * | 1991-08-30 | 1993-03-18 | Glyko, Inc. | Fluorophore assisted derivatization analysis of carbohydrates |
US5258295A (en) * | 1992-02-25 | 1993-11-02 | Glyko, Inc. | Fluorophore-assisted cloning analysis |
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