JPH05244976A

JPH05244976A - シアル酸結合を有する化合物の製造法

Info

Publication number: JPH05244976A
Application number: JP4082868A
Authority: JP
Inventors: Yoshihiro Ikeuchi; 義弘池内; Sakanori Shukke; 栄記出家
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1992-03-04
Filing date: 1992-03-04
Publication date: 1993-09-24
Anticipated expiration: 2016-01-15
Also published as: JP3123617B2

Abstract

(57)【要約】【構成】シアル酸のＯ−グリコシド結合体及びシアル
酸受容体の共存下でノイラミニダーゼを作用させてＯ−
グリコシド結合体のシアル酸をシアル酸受容体に転位さ
せてシアル酸結合を有する化合物を製造する方法。【効果】シアル酸結合を有する化合物を反応副生成物
を生ずることなく効率よく有利に得ることができる。得
られるシアル酸結合を有する化合物は生理活性があり、
医薬、機能性食品あるいは化学試薬として利用される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ノイラミニダーゼの転
移反応を利用してシアル酸結合を有する化合物を製造す
る方法に関する。

【０００２】

【従来の技術と問題点】シアル酸は複合糖質糖鎖の非還
元末端に通常見いだされる酸性糖質である。その骨格
は、ノイラミン酸のＮーアセチル体あるいはＮ−グリコ
リル体であり、その他に骨格の水酸基の内１カ所〜数カ
所がＯ−アセチル化されたものも十数種見いだされてお
り、現在シアル酸と言うと、これら誘導体の総称とされ
ている。シアル酸結合化合物としては、糖タンパク質あ
るいは糖脂質等の複合糖質が知られており、これらのも
のは、糖鎖にシアル酸が付加することによって、細胞間
認識や生体防御機構、異物認識の際に重要な役割を担っ
ていることが知られている。また、シアル酸には、この
他にも、インフルエンザウイルスのレセプター活性や、
糖鎖含有血中成分の血中半減期の制御等の活性が知られ
ており、近年益々研究が盛んになってきている。

【０００３】これらシアル酸を有する化合物を得る方法
としては、天然物を精製するのが最も一般的である。し
かしながら、天然のシアル酸結合化合物の精製には非常
なる困難を伴う。これは、シアル酸の結合様式（α−グ
リコシド結合）が、分離の際の条件、特に酸性条件にお
いて不安定であること、シアル酸のＯ−アセチル基が、
アルカリ条件においても不安定であること等に起因して
いる。また、シアル酸結合化合物の良好な原材料として
知られている、牛脳、人乳、人血等は、入手量にもかな
りの制約を受ける。また、有機化学的手法を用いた合成
研究も行われているが、多段階の複雑な工程を要する
上、合成の過程で生成する副生成物、例えば、目的とし
ないα−グリコシド体あるいはβ−グリコシド体等の除
去が、困難であり、かつ目的物の収率も非常に低いとい
う問題がある。シアル酸ヌクレオチド（ＣＭＰ−シアル
酸）とシアル酸転移酵素を用いる方法も提唱されている
が、双方の原料ともに高価であったりあるいは入手困難
であったりする。このように、シアル酸結合化合物を容
易に且つ安価に調製することは従来の技術では困難であ
った。

【０００４】一方、ノイラミニダーゼの機能としては、
従来、シアル酸結合化合物、すなわち、シアロ糖蛋白
質、シアロオリゴ糖、ガングリオシド等から、加水分解
反応によりシアル酸を遊離することのみが知られていた
が、近年、ある条件下で、この加水分解反応の逆反応を
も触媒することが見いだされた。この知見をもとに、加
水分解の逆反応によってシアル酸結合化合物を合成する
という報告がある（公開特許公報平３ー１５１８９
１）。しかし、ノイラミニダーゼが、シアル酸結合化合
物を加水分解する際に、他の化合物へシアル酸を転移す
る性質を持つという報告は未だになされていない。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、かかる状況
に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、容易に調製できる、シ
アル酸のＯ−グリコシド結合体と、シアル酸受容体を含
む溶液にノイラミニダーゼを作用させることにより、Ｏ
−グリコシド結合体からシアル酸受容体にシアル酸が転
移して、目的のシアル酸結合体を合成することができる
ことを初めて見いだした。この知見によると、シアル酸
の０−グリコシド結合体がノイラミニダーゼによって加
水分解を受ける際に、結合の開裂によって生成するエネ
ルギーが、同時にシアル酸とシアル酸受容体との新たな
結合の生成に転用されるため、非常に効率よくシアル酸
の転移が進行する。

【０００６】シアル酸供給源として用いるＯ−グリコシ
ド結合体は、天然界から公知の方法で精製されたるもの
が使用できるし、また、それが精製途中のものであって
も、あるいは粗製のものであっても、使用可能であるこ
とを見いだした。すなわち、この方法では、天然には遊
離の形ではほとんど存在しないシアル酸を遊離させ、そ
の後に精製して純品にするという手間を省けることにな
る。

【０００７】遊離のシアル酸が容易に入手可能な場合
は、このＯ−グリコシド結合体は良く知られた方法で、
簡便には１段階で合成でき、通常は精製途中でも使用可
能であることも見いだし、さらに、シアル酸にＯ−グリ
コシド結合させる化合物をあらかじめ選択することによ
り、シアル酸受容体やノイラミニダーゼとの親和性をコ
ントロールすることが出来、ひいては、収率を向上させ
ることが出来ることをも見いだして、本発明を完成し
た。

【０００８】すなわち本発明は、シアル酸供給源として
の、シアル酸のＯ−グリコシド結合体とシアル酸受容体
を含む混液に、ノイラミニダーゼを作用させ、ノイラミ
ニダーゼの転移反応を利用することを特徴とするシアル
酸含有化合物の製造法にかかわる。

【０００９】以下に本発明を詳細に説明する。本発明で
使用するシアル酸のＯ−グリコシド結合体（以下、シア
ル酸供与体という）は、特に限定されないが、天然から
公知の方法で精製されるものがそのまま利用できる。た
とえば、チーズホエーから精製されるグリコマクロペプ
チドのほか、ウシ初乳から精製されるシアリルラクトー
スや、変異大腸菌から精製されるコロミン酸等は良いシ
アル酸供与体となる。これら化合物の純品は原料として
はやや高価なものもあるが、本発明者の知見によると、
これら化合物は必ずしも純品である必要はなく、粗製あ
るいは精製途中のものも使用することができるので、シ
アル酸供与体としては、原材料の純度、コスト、目的物
の付加価値、使用製品において要求される目的物の純度
等を考慮して、上記天然物や、以下に述べる簡便な合成
物の中から目的に合った原料を選択すれば良い。

【００１０】原料として遊離のシアル酸を用いる場合
は、公知の方法、すなわち酸触媒によるフィッシャー法
によってアルコールあるいはフェノールからＯ−グリコ
シド結合体が合成できる（例えば、R. Kuhn 等, Cem. B
er., 99, 611(1966)）。触媒に用いる酸については特に
限定はされないが、塩化水素等のように反応後速やかに
留去できるものや、硫酸等のように二価の金属イオンと
塩を作ることで系外に除けるもの、あるいはDowex 50型
等の陽イオン交換樹脂を用いると便利である。この方法
では原理的にαーグリコシド及びβ−グリコシドが生成
し、また、ノイラミニダーゼはα−グリコシド結合のみ
を分解する事が知られているが、本発明者の得た知見に
よると、これらを分離した後にα体のみを反応に供した
場合に比べて、このα−グリコシド体及びβ−グルコシ
ド体の混合物をそのまま反応に供した場合も、さほど収
率に変化は無いことが見いだされたため、１段階の簡便
な操作でシアル酸供与体の合成が完了出来ることがわか
った。また、必要があれば、マインドル等の方法を利用
して、４段階で収率良くα−グリコシド体を合成するこ
とも出来る(P. Meindl等, Mh. Chem., 96, 802(1966))
。

【００１１】本発明におけるシアル酸供与体には、上記
したようなシアリルラクトースばかりではなく、シアル
酸と次のi)〜vi) のいずれかの化合物との結合体が用い
られる。 i)フェノール性水酸基を有する芳香族環式化合物、ii)
水酸基を有するヘテロ環化合物、iii)アルキルアルコー
ル性水酸基を有する化合物、iv) 単糖あるいは二糖以上
のオリゴ糖質、v)複合糖質糖鎖を有する化合物及びvi)
コロミン酸。

【００１２】ノイラミニダーゼに関しては特に限定され
ないが、例えば、アリスロバクター・ウレファシエンス
(Arthrobacter ureafaciens)、クロストリジウム・パー
フリンゲンス(Clostridium perfringens) 、ビブリオ・
コレラ(Vibrio cholerae) 等細菌起源のものなどを用い
ることができる。

【００１３】シアル酸の受容体としては水酸基を保有
し、シアル酸を結合出来るものであれば特に限定されな
い。例えば、糖類であれば、ガラクトース、ガラクトサ
ミンをはじめとして、グルコース、フコースなどの単糖
類、ラクトース、マルトース、キトビオース等の二糖類
から、ガラクトシルラクトースなどの三糖類、そして、
それ以上のオリゴ糖にも広く利用できるし、また、例え
ば、糖タンパク質や糖脂質などの複合糖質をそのまま用
いてその糖鎖部分にシアル酸を付与することもできる。
この際用いる複合糖質にも特に制限は無いが、例えば、
糖タンパク質であれば、アシアロムチンやアシアロラク
トフェリンなどのアシアロ糖タンパク質が挙げられる。
ここで、アシアロとは、シアル酸結合化合物からシアル
酸が除かれたものであることを表す接頭語である。糖脂
質においても特に限定はされないが、アシアロガングリ
オシド、ガングリオシドのほか、グルコシルセラミド、
ガラクトシルセラミド等の中性糖脂質も使用できる。

【００１４】また、シアル酸受容体の純度も、調製した
シアル酸結合化合物の利用目的によっては、要求されな
い場合がある。例えばレンネットチーズホエーの濃縮液
から、シアリルラクトースを調製する場合に本発明を利
用すると、このレンネットチーズホエー濃縮液には、シ
アル酸供与体としてはシアル酸結合糖鎖を持つグリコマ
クロペプチドが十分量含まれているし、シアル酸受容体
のラクトースはほぼ固形分の７０％を占めているので、
本発明者の知見によれば、ｐＨを調整後ノイラミニダー
ゼを添加するだけで反応が行える。反応終了後、シアリ
ルラクトースを精製してもよいが、本品の調製の目的
が、例えばシアリルラクトースを強化したペットフード
や食品である場合には、精製を行う必要がない。

【００１５】本発明の転移反応は、シアル酸供与体とシ
アル酸受容体を含む溶液に、ノイラミニダーゼを加えて
行われる。シアル酸供与体とシアル酸受容体の濃度は、
それぞれ０．１容量％から飽和量まで広い範囲で選択さ
れる。通常はシアル酸受容体の濃度を飽和に近づける方
が効率が良く好ましいが、それ以下の濃度でも差し支え
はない。

【００１６】シアル酸受容体として複合糖質を用いる際
には、糖鎖以外の、タンパク質や脂質部分が疎水性のた
め、溶解度の小さい場合がある。この場合には、反応液
に有機溶媒を加えたり、界面活性剤を加えることによっ
て収率が向上する。添加する有機溶媒に特に制限は無い
が、例えば、ジエチルエーテルやジオキサンのようなエ
ーテル類、アセトン等のケトン類、酢酸エチルなどのエ
ステル類、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、メ
タノール、エタノール等の低級アルコール類等の他、ジ
メチルフォルムアミド、アセトニトリル、ジメチルスル
フォキシド等が挙げられる。界面活性剤にも特に制限は
無いが、例えば、タウロデオキシコール酸等の胆汁酸系
のものや、ドデシル硫酸ナトリウム、脂肪酸ナトリウム
等のイオン性のもの、またはトリトンＸ−１００のよう
な非イオン性のもの等が挙げられる。これらの添加量に
も特に制限はないが、有機溶媒は、通常反応液１ｍｌに
対し、0.1 〜3.5 ｍｌ程度を添加する。界面活性剤を用
いる場合は、反応液に対し、0.01〜10重量％になるよう
に添加する。

【００１７】また、硫酸アンモニウムを0.05〜5.0 重量
％になるように添加することにより、反応を効率よく進
行させ得ることがある。この他、シアル酸供与体におい
てシアル酸と結合する化合物を選択することによっても
反応の収率を向上させることができる。すなわち、使用
するノイラミニダーゼ自身及び、活性中心近傍の疎水
性、反応液の疎水性、イオン強度並びにシアル酸受容体
の疎水性を考慮して、シアル酸と結合する化合物の疎水
性やかさ高さを適宜選択して用いることにより、シアル
酸供与体の、反応液や酵素、ならびに受容体への親和性
が向上し、反応の収率を向上できるのが本発明の大きな
利点である。

【００１８】Ｏ−グリコシド結合体は前述の方法で容易
に合成出来るが、前記目的の為にシアル酸と結合させる
化合物を選択するのが有利である。シアル酸と結合させ
る化合物は特に限定されないが、例えばメタノール、エ
タノール等の低級アルコール類等に代表されるアルキル
アルコール基を分子内に有する化合物や、フェノール、
ナフトール誘導体等のように分子内にフェノール性水酸
基を持つ化合物の中から置換基の極性やかさ高さを考慮
して適宜選択すると、収率の向上につながる。

【００１９】反応液に使用する緩衝液は、ｐＨが３〜１
１程度のものであれば特に制限は無く、公知のものが使
用できる。濃度も特に制限は無いが、通常１０〜５００
ｍＭの範囲で使用する。ノイラミニダーゼの使用量は、
反応液１ｍｌ当たり通常０．００１〜１００Ｕの間で適
宜選択する。ここで、ノイラミニダーゼの１単位（１
Ｕ）とは、シアリルラクトースから１分間に１マイクロ
モルのＮ−アセチルノイラミン酸を遊離する酵素量とす
る。反応温度は、通常２５℃〜５５℃で行われる。

【００２０】本発明の方法によって調製されたシアル酸
結合を有する化合物は、公知の方法、例えばシリカゲル
カラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマト
グラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー等によ
って精製できる。また、前述のように、さほど精製を必
要としない場合はそのまま使用することができる。この
ように、本発明においては、ノイラミニダーゼの転移反
応によって、効率よくシアル酸含有化合物を合成でき
る。以下に実施例を挙げて、本発明を更に詳しく説明す
る。

【００２１】

【実施例】

実施例１（１）シアル酸メチルグリコシドの調製１リットルの脱水メタノールにシアル酸５０ｇを懸濁
し、撹拌しつつ４９ｇの濃硫酸を適下した。反応液を５
時間加熱還流した後氷冷し、撹拌しつつ１Ｎの水酸化バ
リウム溶液を適下して反応液のｐＨを１０に調整し、室
温にてさらに１時間撹拌した。１Ｎの硫酸でｐＨを１．
５に調整した後少量の活性炭を上澄みが脱色されるま
で、撹拌しながら加えた。生じた硫酸バリウムと活性炭
を濾別除去し、濾液を少量まで減圧濃縮し、冷所に静置
すると、目的のシアル酸メチルグリコシド４９．５ｇが
白色針状結晶として得られた。この結晶にはα−グリコ
シドとβ−グリコシドが３：２の比で含まれていた。

【００２２】（２）シアリルラクトースの調製実施例１の方法で調製したシアル酸メチルグリコシド
２．０ｇを、１０ｍｌの脱イオン水に懸濁し、氷冷しつ
つ１Ｎ−ＮａＯＨを適下してｐＨを５．０に調整した。
この時点で、結晶は完全に溶解して均一な溶液になっ
た。この溶液をラクトースの３５重量％溶液１００ｇに
加え、さらに、１Ｍ−酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１０ｍ
ｌ及びジメチルスルフォキシド１５ｍｌを加えた。これ
にノイラミニダーゼ４０Ｕを加え、３７℃で１５時間反
応させた後１００℃で５分間加熱処理して反応を停止さ
せた。不溶部を濾別除去した反応液に対して、ダウケミ
カル社製Ｄｏｗｅｘ１ｘ４（蟻酸型）カラムによるイ
オン交換クロマトグラフィーを行い、シアル酸、シアル
酸メチルグリコシド、及び新たな生成物の３つの画分を
得た。新たな生成物の画分を凍結乾燥し、白色粉末８９
０ｍｇを得た。この粉末をノイラミニダーゼで分解し、
下記の条件で薄層クロマトグラフィーを行った。薄層プレート；メルク社製ＨＰＴＬＣプレート展開溶媒； n-プロパノール：濃アンモニア水：
水＝１２０：２．５：５７．５発色試薬；レゾルシン塩酸試薬

【００２３】分解産物からは、標準品のラクトースとシ
アル酸にそれぞれＲｆ値が一致する２つのスポットが検
出された。分解産物と、ラクトース及びシアル酸の標準
溶液とを同時に展開し、デンシトメトリーによる比較定
量を行うことにより、、分解産物にはシアル酸とラクト
ースが１：１のモル比で含まれていることがわかった。
さらに、分解産物中のシアル酸量をチオバルビツール酸
法で、ラクトース量をベリンガー・マンハイム山之内
（株）社製の酵素法によるラクトース測定キットで測定
しても、同様にシアル酸とラクトースのモル比は１：１
であった。なお、分解前の粉末には遊離のシアル酸及び
遊離のラクトースは含まれていなかった。以上の結果か
ら、得られた白色粉末がシアリルラクトースであること
が確認された。純度は９８％であった。

【００２４】実施例２（１）シアル酸ベンジルグリコシドの調製メタノールの代わりにベンジルアルコールを使用する以
外は実施例１と全く同じ操作で、シアル酸ベンジルグリ
コシドを白色針状結晶として得た。この結晶にはα−グ
リコシドとβ−グリコシドが３：２の比で含まれてい
た。

【００２５】（２）ガングリオシドアナログの調製実施例２で調製したシアル酸ベンジルグリコシド１．５
ｇを実施例１（２）と同様に３ｍｌの脱イオン水に懸濁
し、１Ｎ−ＮａＯＨでｐＨを６．０に調整して基質を溶
解した。これとは別に、牛乳由来のグルコシルセラミド
（Ｇｌｃβ１→１Ｃｅｒ）０．５ｇを、２％ードデシル
硫酸ナトリウム溶液５０ｍｌに懸濁し、１００ｍＭ−酢
酸緩衝液（ｐＨ６．０）４０ｍｌを加え、さらに１０ｍ
ｌのジオキサンを加えて均一な溶液とした。撹拌下で両
溶液を混合し、ノイラミニダーゼ２０Ｕを加えて３７℃
で２０時間反応させた後１００℃で５分間加熱処理して
酵素反応を停止させた。反応液を濃縮乾固し、クロロホ
ルム−メタノール（１／１）で抽出し、ファルマシア社
製ＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｄｅｘＡ−２５（酢酸型）カ
ラムによるイオン交換クロマトグラフィーによって、反
応物を単離し、脱塩後凍結乾燥を行って、白色粉末１１
６ｍｇを得た。この粉末をノイラミニダーゼで分解し、
下記の条件で薄層クロマトグラフィーを行った。薄層プレート；メルク社製ＨＰＴＬＣプレート展開溶媒；クロロホルム：メタノール：水＝６
０：３５：８発色試薬；レゾルシン塩酸試薬

【００２６】デンシトメトリーによる定量によると、こ
の分解物には、シアル酸と、原料のグルコシルセラミド
が１：１のモル比で含まれていた。白色粉末を酸分解し
た後実施例２と同様に糖組成を分析すると、この分解物
には、シアル酸とグルコースが１：１のモル比で含まれ
ていた。（グルコース含量は、和光純薬（株）製の酵素
法によるグルコース測定キットで測定した。）このこと
から、生成物は、ガングリオシドのアナログ体である、
シアリルグルコシルセラミドであることが確認された。
純度は９７％であった。

【００２７】実施例３シアリルラクトース含量を増量したホエー粉の調製１リットルのレンネットチーズホエー濃縮液（ｐＨ５．
０，４０Ｂｒｉｘ）に、ノイラミニダーゼ４０Ｕを加
え、２０時間反応させた後ｐＨを７．０に調整し８０℃
で１０分間加熱処理して反応を停止させた。反応液を凍
結乾燥して、調製粉４５０ｇを得た。また、同一の濃縮
液１ｌにあらかじめ失活したノイラミニダーゼを加え
て、同一の操作を行って得た対照粉、及び原料液をその
まま凍結乾燥した原料粉も調製した。これらの粉末の固
形あたりのシアリルラクトース量を比較した。（表１参
照）

【００２８】

【表１】調製粉では、原料粉、対照粉に比べて、シアリルラクト
ース量が２倍以上に増加していた。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】シアル酸のＯ−グリゴシド結合体及びシ
アル酸受容体の共存下で、ノイラミニダーゼを作用させ
シアル酸をシアル酸受容体に転移させることを特徴とす
るシアル酸結合を有する化合物の製造法。
【請求項２】シアル酸受容体が、糖類、糖脂質類、及
びタンパク質類からなる群から選択された化合物である
請求項１記載の製造法。
【請求項３】糖類が、単糖、二糖及び三糖から十糖ま
でのオリゴ糖からなる群から選択された糖類である請求
項２記載の製造法。
【請求項４】糖脂質類が、ガングリオシド類である請
求項２記載の製造法。
【請求項５】ガングリオシド類が、アシアロガングリ
オシド、モノガングリオシド及びポリガングリオシドか
らなる群から選択されたガングリオシド類である請求項
４記載の製造法。
【請求項６】タンパク質類がアシアロ糖タンパク質で
ある請求項２記載の製造法。
【請求項７】シアル酸のＯ−グリゴシド結合体が、シ
アル酸と次のi)〜vi) のいずれかの化合物との結合体で
ある請求項１記載の製造法。 i) フェノール性水酸基を有する芳香族環式化合物。 ii) 水酸基を有するヘテロ環化合物。 iii)アルキルアルコール性水酸基を有する化合物。 iv) 単糖あるいは二糖以上のオリゴ糖質。 v) 複合糖質糖鎖を有する化合物。及び vi) コロミン酸。