JP2666060B2 - Ｎ−アセチルキトオリゴ糖誘導体の製造法 - Google Patents
Ｎ−アセチルキトオリゴ糖誘導体の製造法Info
- Publication number
- JP2666060B2 JP2666060B2 JP17545187A JP17545187A JP2666060B2 JP 2666060 B2 JP2666060 B2 JP 2666060B2 JP 17545187 A JP17545187 A JP 17545187A JP 17545187 A JP17545187 A JP 17545187A JP 2666060 B2 JP2666060 B2 JP 2666060B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- acetylchitooligosaccharide
- derivative
- acetyl
- enzyme
- producing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖誘導体の製造方
法に関し、さらに詳しく言えば、親水性有機溶媒存在下
で、酵素の糖転移反応を利用する工程からなるＮ−アセ
チルキトオリゴ糖誘導体の新規な製造方法に関するもの
である。 Ｎ−アセチルキトオリゴ糖誘導体は、臨床検査薬にお
けるリゾチームやβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ
の活性測定基質としてきわめて有用な物質であり、本発
明は、このような有用物質を簡便でしかも効率良く生産
する方法を提供するものである。 〔従来の技術〕 リゾチームの活性測定用基質として有用なＮ−アセチ
ルキトオリゴ糖誘導体としては、例えば、Ｐ−ニトロフ
ェニル テトラ−Ｎ−アセチル−β−キトテトラオシ
ド、Ｐ−ニトロフェニル ペンタ−Ｎ−アセチル−キト
ペンタオシド、3,4−ジニトロフェニル テトラ−Ｎ−
アセチル−β−キトテトラオシド、４−メチルウンベリ
フェリル テトラ−Ｎ−アセチル−β−キトテトラオシ
ドなど、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖にアグリコンとして
発色団が結合した誘導体がある。従来、このようなＮ−
アセチルキトオリゴ糖誘導体の製造は、Ｎ−アセチルキ
トオリゴ糖やキトサンオリゴ糖を、まず、ペルアセチル
誘導体とした後、還元末端をハロゲン化し、つぎに、水
酸基を有する発色団と反応させ、アグリコンの結合した
ペルアセチルキトオリゴ糖誘導体を得、これを脱Ｏ−ア
セチル化する方法が知られている。 また、酵素の糖転移反応を利用する方法としては、ジ
オキサンのようなアプロティックな溶媒と水との混合溶
媒系中でリゾチームを用い、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖
と各種単糖のニトロフェニル誘導体からＮ−アセチルキ
トオリゴ糖誘導体を得る方法などが報告されている。
（Bioorganic Chemistry Vol.6,p483−509（1977）;Bio
chemistry Vol.7,p3281−3289（1968）） 〔発明が解決しようとする問題点〕 Ｎ−アセチルキトオリゴ糖誘導体の製造を化学的合成
法によって行う場合、操作が複雑であることや効率が悪
いなどの欠点があり、また従来の酵素法では、使用して
いる有機溶媒が特殊で、しかも反応生成物の収率が低い
などの欠点を有している。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らは、これら従来法の欠点を克服するため種
々検討した結果、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖とＮ−アセ
チルグルコサミンのＯ−グリコシル誘導体を混合溶解
し、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖に対して加水分解能を有
する酵素を親水性アルコール存在下で作用させることに
より、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖誘導体が容易にしかも
効率良く生産でき、またα体、β体を自由に選択できる
ことを見出し、本発明を完成するに至った。一般的に
は、親水性アルコール存在下で糖転移反応を行うとアル
コリシスが起こり、アルコールのアルキル基が転移する
ことが知られており、試みられていなかった。 即ち、本発明は、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖誘導体の
新規な製造法に関するもので、以下本発明をさらに具体
的に説明する。 本発明に使用するＮ−アセチルキトオリゴ糖は、カ
ニ、エビの甲羅から調整したキチンを部分加水分解して
得たものである。 その調整法の一例を示すと、カニ甲羅を希塩酸処理に
よって脱灰後、希アルカリ処理で除タンパクして得たキ
チンに濃塩酸を加え、40℃で３時間部分加水分解する。
得られた分解物を水酸化ナトリウムで中和後、残渣を吸
引濾過して除去し濾液を活性炭カラムに展開し、エタノ
ール０〜50％の直線濃度勾配法で溶出し、ジ−Ｎ−アセ
チルキトビオースからヘキサ−Ｎ−アセチルキトヘキサ
オースまでのＮ−アセチルキトオリゴ糖を分離すること
が出来る。 本発明で用いる酵素は、キチンを加水分解する酵素で
あれば何れを用いても良い。例えば、市販卵白リゾチー
ム、市販キチナーゼ、などを用いることが出来る。反応
溶液中の親水性アルコールは、メタノール、エタノー
ル、ｎ−プロパノール、イソプタノール、ｎ−ブタノー
ル、イソブタノールのうち一種類または二種類以上を用
いることができ、親水性アルコールは、20％〜80％、好
ましくは30％〜70％濃度になるように水を加え調整す
る。 反応に用いるＮ−アセチルキトオリゴ糖の量は、反応
溶液の飽和濃度が好ましく、またＯ−グリコシル誘導体
の量は、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖に対し１〜５モル当
量、好ましくは３〜５モル当量である。 反応温度及び、pHは使用する酵素の至適温度、至適pH
付近で作用させる。 反応時間は、使用する酵素の種類、酵素量及び反応温
度によって異なるが、通常は２〜120時間で、好ましく
は12〜72時間である。 酵素反応を、加熱、または濃縮乾固、等により停止さ
せ、カラムクトマトグラフィー溶媒抽出、等によって分
画し、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖誘導体が得られる。 以下に、本発明の実施例について更に具体的に説明す
るが、かかる説明によって本発明が何ら限定されないこ
とは勿論である。 〔実施例１〕 Ｐ−ニトロフェニル ペンタ−Ｎ−アセチル−β−キト
ペンタオシド及びＰ−ニトロフェニル テトラ−Ｎ−ア
セチル−β−キトテトラオシドの調製法 ペンタ−Ｎ−アセチル−β−キトペンタオース1g（0.
967m mol）とＰ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−
Ｄ−グリコサミニド 1.32g（3.845m mol）を0.1M酢酸緩
衝液（pH5.6）−メタノール（1:1）200mlに溶解させ
る。 これに卵白リゾチーム（６回結晶、生化学工業社製）
4.2mg添加し30℃で反応させた。72時間後、0.2Mホウ酸
緩衝液（pH9.8）を加えて反応を停止させ、反応液を濃
縮した後、トーヨーパールHW−40カラムを用いて分画し
て、Ｐ−ニトロフェニル ペンタ−Ｎ−アセチル−β−
キトペンタオシドを150mg（0.13m mol）と、Ｐ−ニトロ
フェニル テトラ−Ｎ−アセチル−β−キトテトラオシ
ド100mg（1.0m mol）を得た。 〔実施例２〕 Ｐ−ニトロフェニル トリ−Ｎ−アセチル−β−キトト
リシオドの調製。 テトラ−Ｎ−アセチルキトテトラオース1g（1.2m mo
l）と、Ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−
グルコサミニド0.42g（1.2m mol）を、85mlの0.01Mリン
酸緩衝液（pH5.6）−メタノール（1:1）に溶解させる。 これに、Nocardia orientalis IFO 12806が生産する
キチナーゼをキチナーゼ活性として8.5U添加し、30℃で
15時間反応させた。反応液を濃縮乾固しトーヨーパール
HW−40カラムを用いて分画して、Ｐ−ニトロフェニル
トリ−Ｎ−アセチル−β−キトトリオシド 91mg（0.12
m mol）を得た。 キチナーゼ活性 コロイダルキチンを基質として50℃、pH5.6で、１分
間に１μモルのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンに相当
する還元糖を生成する酵素量を1Uとする。
法に関し、さらに詳しく言えば、親水性有機溶媒存在下
で、酵素の糖転移反応を利用する工程からなるＮ−アセ
チルキトオリゴ糖誘導体の新規な製造方法に関するもの
である。 Ｎ−アセチルキトオリゴ糖誘導体は、臨床検査薬にお
けるリゾチームやβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ
の活性測定基質としてきわめて有用な物質であり、本発
明は、このような有用物質を簡便でしかも効率良く生産
する方法を提供するものである。 〔従来の技術〕 リゾチームの活性測定用基質として有用なＮ−アセチ
ルキトオリゴ糖誘導体としては、例えば、Ｐ−ニトロフ
ェニル テトラ−Ｎ−アセチル−β−キトテトラオシ
ド、Ｐ−ニトロフェニル ペンタ−Ｎ−アセチル−キト
ペンタオシド、3,4−ジニトロフェニル テトラ−Ｎ−
アセチル−β−キトテトラオシド、４−メチルウンベリ
フェリル テトラ−Ｎ−アセチル−β−キトテトラオシ
ドなど、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖にアグリコンとして
発色団が結合した誘導体がある。従来、このようなＮ−
アセチルキトオリゴ糖誘導体の製造は、Ｎ−アセチルキ
トオリゴ糖やキトサンオリゴ糖を、まず、ペルアセチル
誘導体とした後、還元末端をハロゲン化し、つぎに、水
酸基を有する発色団と反応させ、アグリコンの結合した
ペルアセチルキトオリゴ糖誘導体を得、これを脱Ｏ−ア
セチル化する方法が知られている。 また、酵素の糖転移反応を利用する方法としては、ジ
オキサンのようなアプロティックな溶媒と水との混合溶
媒系中でリゾチームを用い、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖
と各種単糖のニトロフェニル誘導体からＮ−アセチルキ
トオリゴ糖誘導体を得る方法などが報告されている。
（Bioorganic Chemistry Vol.6,p483−509（1977）;Bio
chemistry Vol.7,p3281−3289（1968）） 〔発明が解決しようとする問題点〕 Ｎ−アセチルキトオリゴ糖誘導体の製造を化学的合成
法によって行う場合、操作が複雑であることや効率が悪
いなどの欠点があり、また従来の酵素法では、使用して
いる有機溶媒が特殊で、しかも反応生成物の収率が低い
などの欠点を有している。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らは、これら従来法の欠点を克服するため種
々検討した結果、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖とＮ−アセ
チルグルコサミンのＯ−グリコシル誘導体を混合溶解
し、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖に対して加水分解能を有
する酵素を親水性アルコール存在下で作用させることに
より、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖誘導体が容易にしかも
効率良く生産でき、またα体、β体を自由に選択できる
ことを見出し、本発明を完成するに至った。一般的に
は、親水性アルコール存在下で糖転移反応を行うとアル
コリシスが起こり、アルコールのアルキル基が転移する
ことが知られており、試みられていなかった。 即ち、本発明は、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖誘導体の
新規な製造法に関するもので、以下本発明をさらに具体
的に説明する。 本発明に使用するＮ−アセチルキトオリゴ糖は、カ
ニ、エビの甲羅から調整したキチンを部分加水分解して
得たものである。 その調整法の一例を示すと、カニ甲羅を希塩酸処理に
よって脱灰後、希アルカリ処理で除タンパクして得たキ
チンに濃塩酸を加え、40℃で３時間部分加水分解する。
得られた分解物を水酸化ナトリウムで中和後、残渣を吸
引濾過して除去し濾液を活性炭カラムに展開し、エタノ
ール０〜50％の直線濃度勾配法で溶出し、ジ−Ｎ−アセ
チルキトビオースからヘキサ−Ｎ−アセチルキトヘキサ
オースまでのＮ−アセチルキトオリゴ糖を分離すること
が出来る。 本発明で用いる酵素は、キチンを加水分解する酵素で
あれば何れを用いても良い。例えば、市販卵白リゾチー
ム、市販キチナーゼ、などを用いることが出来る。反応
溶液中の親水性アルコールは、メタノール、エタノー
ル、ｎ−プロパノール、イソプタノール、ｎ−ブタノー
ル、イソブタノールのうち一種類または二種類以上を用
いることができ、親水性アルコールは、20％〜80％、好
ましくは30％〜70％濃度になるように水を加え調整す
る。 反応に用いるＮ−アセチルキトオリゴ糖の量は、反応
溶液の飽和濃度が好ましく、またＯ−グリコシル誘導体
の量は、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖に対し１〜５モル当
量、好ましくは３〜５モル当量である。 反応温度及び、pHは使用する酵素の至適温度、至適pH
付近で作用させる。 反応時間は、使用する酵素の種類、酵素量及び反応温
度によって異なるが、通常は２〜120時間で、好ましく
は12〜72時間である。 酵素反応を、加熱、または濃縮乾固、等により停止さ
せ、カラムクトマトグラフィー溶媒抽出、等によって分
画し、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖誘導体が得られる。 以下に、本発明の実施例について更に具体的に説明す
るが、かかる説明によって本発明が何ら限定されないこ
とは勿論である。 〔実施例１〕 Ｐ−ニトロフェニル ペンタ−Ｎ−アセチル−β−キト
ペンタオシド及びＰ−ニトロフェニル テトラ−Ｎ−ア
セチル−β−キトテトラオシドの調製法 ペンタ−Ｎ−アセチル−β−キトペンタオース1g（0.
967m mol）とＰ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−
Ｄ−グリコサミニド 1.32g（3.845m mol）を0.1M酢酸緩
衝液（pH5.6）−メタノール（1:1）200mlに溶解させ
る。 これに卵白リゾチーム（６回結晶、生化学工業社製）
4.2mg添加し30℃で反応させた。72時間後、0.2Mホウ酸
緩衝液（pH9.8）を加えて反応を停止させ、反応液を濃
縮した後、トーヨーパールHW−40カラムを用いて分画し
て、Ｐ−ニトロフェニル ペンタ−Ｎ−アセチル−β−
キトペンタオシドを150mg（0.13m mol）と、Ｐ−ニトロ
フェニル テトラ−Ｎ−アセチル−β−キトテトラオシ
ド100mg（1.0m mol）を得た。 〔実施例２〕 Ｐ−ニトロフェニル トリ−Ｎ−アセチル−β−キトト
リシオドの調製。 テトラ−Ｎ−アセチルキトテトラオース1g（1.2m mo
l）と、Ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−
グルコサミニド0.42g（1.2m mol）を、85mlの0.01Mリン
酸緩衝液（pH5.6）−メタノール（1:1）に溶解させる。 これに、Nocardia orientalis IFO 12806が生産する
キチナーゼをキチナーゼ活性として8.5U添加し、30℃で
15時間反応させた。反応液を濃縮乾固しトーヨーパール
HW−40カラムを用いて分画して、Ｐ−ニトロフェニル
トリ−Ｎ−アセチル−β−キトトリオシド 91mg（0.12
m mol）を得た。 キチナーゼ活性 コロイダルキチンを基質として50℃、pH5.6で、１分
間に１μモルのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンに相当
する還元糖を生成する酵素量を1Uとする。
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．Ｎ−アセチルキトオリゴ糖と、Ｎ−アセチルグルコ
サミンのＯ−グリコシル誘導体である、水酸基を有する
芳香族化合物のＰ−ニトロフェノールを混合溶解し、Ｎ
−アセチルキトオリゴ糖に対して、加水分解能を有する
酵素を親水性アルコール存在下で作用させることを特徴
とするＮ−アセチルキトオリゴ糖誘導体の製造法。 ２．酵素が、リゾチーム、キチナーゼである特許請求の
範囲（１）項記載の方法。 ３．親水性アルコールが、メタノール、エタノール、ｎ
−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、
イソブタノールのうち一種類または二種類以上を用いる
特許請求の範囲（１）項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17545187A JP2666060B2 (ja) | 1987-07-14 | 1987-07-14 | Ｎ−アセチルキトオリゴ糖誘導体の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17545187A JP2666060B2 (ja) | 1987-07-14 | 1987-07-14 | Ｎ−アセチルキトオリゴ糖誘導体の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6420093A JPS6420093A (en) | 1989-01-24 |
| JP2666060B2 true JP2666060B2 (ja) | 1997-10-22 |
Family
ID=15996303
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17545187A Expired - Fee Related JP2666060B2 (ja) | 1987-07-14 | 1987-07-14 | Ｎ−アセチルキトオリゴ糖誘導体の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2666060B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114075254B (zh) * | 2020-08-21 | 2024-01-30 | 佛山市海力盈生物科技有限公司 | 一类壳寡糖衍生物杀线剂及其制备方法和应用 |
-
1987
- 1987-07-14 JP JP17545187A patent/JP2666060B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6420093A (en) | 1989-01-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1591532B1 (en) | Process for producing sugar chain asparagine derivative | |
| JPH0533037B2 (ja) | ||
| JP2666060B2 (ja) | Ｎ−アセチルキトオリゴ糖誘導体の製造法 | |
| US5612203A (en) | Process for producing saccharides | |
| JPH0430276B2 (ja) | ||
| JPH0662852A (ja) | フコイダン分解酵素 | |
| JP2949509B2 (ja) | シアリルラクトース | |
| JP2608751B2 (ja) | 高級ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法 | |
| JP2992830B2 (ja) | 新規β―グルクロニダーゼ | |
| JP3045509B2 (ja) | マンノース含有オリゴ糖の製造法 | |
| JP3124356B2 (ja) | デキストランの製造法 | |
| JPH0759587A (ja) | 糖質又は複合糖質の製造方法 | |
| JPH03236788A (ja) | 酵素法による配糖体の製造方法 | |
| JP2866157B2 (ja) | セロオリゴ糖の製造方法 | |
| JP3062591B2 (ja) | ｐ−ニトロフェニル ２−アセチルアミノ−４−Ｏ−（２−アミノ−２−デオキシ−β−Ｄ −グルコピラノシル）−２−デオキシ−β−Ｄ −グルコピラノシドおよびその塩並びにその製造法 | |
| JPH05244975A (ja) | アルキルグリコシドの製造方法 | |
| JPH0646953B2 (ja) | 高級ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法 | |
| JP3630378B2 (ja) | ガラクトシルグリセロール類の製造方法 | |
| JPH05244976A (ja) | シアル酸結合を有する化合物の製造法 | |
| JPH03151891A (ja) | シアル酸含有化合物の製造法 | |
| JP4599505B2 (ja) | Ｎ−アセチル−β−ヘキソサミニド誘導体の製造方法 | |
| JP3070709B2 (ja) | マルトオリゴ糖誘導体の製造法 | |
| JPH0762027B2 (ja) | 新規リゾチ−ム活性測定基質 | |
| JPH01139592A (ja) | イソプリメベロースの製造方法 | |
| JPH0625275A (ja) | 糖転移反応によって得られた糖脂質 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |