JPH03236788A - 酵素法による配糖体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、酵素法による配糖体の製造方法に関し、詳し
くは、医薬品や生分解性の界面活性剤などとして有用な
高級アルコール類の配糖体を収率良く得ることのできる
製造方法を提供せんとするものである。

〔従来の技術］ 配糖体は、天然界に各種存在している。例えば、ジギト
キシンのように医薬品として使用されているものや生体
膜物質として重要なスフィンゴ糖脂質などがよく知られ
ている。しかし、天然物からの抽出法では、その製造工
程が長くなり、収率も低い。一方、化学合成法では、目
的とする配糖体が定量的に得られるが、反応の選択性、
立体特異性が低く、反応の煩雑さなどから工業的実施が
困難なことが多い。一方、酵素法は、反応が選択的、立
体特異的であり、しかも１段階で完結するから好ましい
。特に、この酵素法は、水溶性基質の配糖体化において
は優れた方法である。しかし、難水溶性基質に対しては
、反応溶液中で十分な基質の濃度が得られず収率が低い
という問題点があった。この点を克服するために、有機
溶媒を加えて基質の溶解性を上げることが行なわれてい
るが、酵素活性が大幅に低下し、それでも基質の濃度を
十分に上げることが困難であった。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明者は、化学合成法よりも優れているところの多い
酵素法において、その欠点である難水溶性基質の溶解性
を向上させ、しかも酵素の活性をあまり阻害させずに、
難水溶性基質の配糖体を収率良く得ることを課題とした
。

［課題を解決するための手段］ 本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究した結果
、従来から行われている有機溶媒の使用よりも、界面活
性剤を用いる方が優れていることを見いだし、それによ
り難水溶性基質の配糖体を収率良く得ることができ、本
発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、糖供与体、難水溶性基質及び界面
活性剤の三成分を緩衝溶液中に分散させたものに、酵素
を加えて糖転移反応を起こさせることを特徴とする酵素
法による配糖体の製造方法に関するものである。好まし
い態様としては、糖供与体がグリコシド結合をもつ化合
物からなり、難水溶性基質が置換または未置換の脂肪族
あるいは脂環族のアルコールで炭素数６〜４０の第一級
、第二級あるいは第三級のアルコールのいずれかからな
り、界面活性剤が難水溶性基質を緩衝溶液中に分散させ
るのに十分な能力を持つものからなり、酵素がα−およ
び／またはβ−グリコシダーゼからなる酵素法による配
糖体の製造方法である。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明で用いる糖供与体とは、その構造中にグリコシド
結合をもつ化合物であり、例えば、α−および／または
β−アリールグリコシド、三糖類、オリゴ糖類であり、
具体的にはフェニル−α−Ｄ−グルコシド、フェニル−
β−Ｄ−ガラクトシド、マルトース、ラクトース、ラフ
ィノース、マルトテトラオースなどが挙げられる。その
使用量としては、アリールグリコシド類では難水溶性基
質の１〜１００倍で、好ましくは１〜２０倍を用い、三
糖類、オリゴ糖類では１〜１００倍で、好ましくは１０
〜３０倍を用いるのが良い。糖供与体の使用量は、少な
すぎると目的とするグリコシドの生成量が少なくなり、
過剰だと酵素反応を阻害する。

本発明で配糖体化に供される難水溶性基質とは、置換ま
たは未置換の脂肪族あるいは脂環族のアルコールで炭素
数６〜４０の第一級、第二級あるいは第三級アルコール
であり、具体的にはオクタツール、フェニルペンタノー
ル、モノグリセライド、ジグリセライド、サリシルアル
コール、コレステロールなどを挙げることができる。そ
の使用濃度としては、反応溶液全体の１〜２０％であり
、良好な分散状態を得る濃度として１〜５％程度が好ま
しい。

本発明に用いる界面活性剤としては、いかなる種類のも
のでも良いが、使用する酵素の活性をあまり阻害しない
もの、好ましくは２０％以上の活性を発現できれば良い
。具体的にはポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポ
リオキシエチレンアルキルエステル；ポリオキシエチレ
ンポリオキシプロピレンエーテルなどの非イオン界面活
性剤、アルキル硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステ
ル塩、アルキルアンモニウム塩、フオスフアチジルコリ
ンなどのイオン性界面活性剤が挙げられる。その使用濃
度としては、難水溶性基質を緩衝溶液中に一番よく分散
させる量が好ましく、例えば濁度の一番小さくなるｍ度
に設定すると良い。

本発明で用いる酵素とは、α−および／またはβ−グリ
コシダーゼであり、いかなる起源のものでもよいが、工
業的使用の見地からいえば微生物起源のものが望ましい
。具体的には、アスベルギルス・オリゼー（ＡＳｐｅｒ
ｐｉｌｌｕＳ　０ｒＶＺａｅ）、エシェリキア◆コリー
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）などから得られ
るα−および／またはβ−グリコシダーゼなどが挙げら
れる。好ましい使用量としては、使用する糖供与体１ミ
リモルに対して１０〜１　、０００ユニット程度が適当
であり、この酵素量によって反応時間が決められる。す
なわち、酵素量が少ないと反応時間が長くなり、逆に多
いと短くなる。

次に、本発明の酵素法による配糖体の製造方法の概略を
示す。

糖供与体０．１〜５０部と難水溶性基質０．５〜１０部
を、界面活性剤０．１〜１０部を含む緩衝溶液９０部（
使用する酵素に最適なｐ口に調整した：例えばアスペル
ギルス・オリゼー由来の酵素ではｐＨ４，０〜６．０、
エシェリキア・コリー由来の酵素では　０口６．０〜８
．０）に分散溶解した。この場合、界面活性剤量は難水
溶性基質を分散溶解するのに必要な最低量が望ましい。

例えば、フェニルペンタノールを基質とした場合フェニ
ルペンタノール４部にドデシル硫酸ナトリウム２．４部
程度が最適である。これにグリコシダーゼ１００〜１０
，０００ユニツトを分散させた緩衝溶液１０部を加えて
激しく攪拌して反応を開始させる。反応温度は酵素の安
定な範囲でよいが、反応効率等を考えた場合２０〜６０
℃に設定するのが望ましい。反応終了後、反応液を沸ｌ
ｌ！湯浴中で加熱し又はエタノール４００部を加えて酵
素を失活させ遠心分離又は濾過により不溶物を除いた（
高濃度の糖供与体を用いた場合、エタノール等の有機溶
媒を添加すると析出してくるので、ここで濾過しておく
と以下の精製が簡単になる〉。これを濃縮し、シリカゲ
ルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的とする配
糖体を得る。

以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。

［実施例］ 実施例　１ ラクトース２４９、ドデシル硫酸ナトリウム２．４ｇ、
オクタツール４．０ｇを９９ｍＭの０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐロア、０）に分散させ、これにエシェリキア・コ
リー由来のβ−ガラクトシダーゼ１ｒｒｌ（シグマ社製
５．０００−１１ニット／ｍ１）を加え、５０℃で攪拌
下６００分間反応せた。

これにエタノール４００ｍＮを加えて、酵素を失活させ
、過剰のラクトースと共に沈澱させた。

孔径０．４５μｍのフィルターで不溶物を除き、減圧濃
縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し
、オクチル−β−Ｄ−ガラクトシド１，１００■（収率
１２．２％〉を得た。

比較例　１ ラクトース２４９を６９ｒｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（
ｐロア、０）に溶解し、３０ｒｒｌのアセトニトリルを
加えた。これにオクタツール４．０ｇを添加して分散さ
せた。次に、エシェリキア・コリー由来のβ−ガラクト
シダーゼ１ｍＮ（シグマ社製５．０ＯＯｔ　ニット／ｍ
１）を加え、５０℃で攪拌下６００分間反応せた。これ
にエタノール４００ｍｊ！を加えて、酵素を失活させ、
過剰のラクトースと共に沈澱させた。孔径０．４５μｍ
のフィルターで不溶物を除き、減圧濃縮し、シリカゲル
カラムクロマトグラフィーにて精製し、オクチル−β−
Ｄ−ガラクトシド２００＃ｌＪＦ〈収率２．２％〉を得
た。

配糖体の収率は、本発明の界面活性剤を含む実施例１の
場合１２．２％であり、比較対照のための有機溶剤を含
む比較例１の場合２．２％であった。従って、本発明の
方が約５．５倍大きいことがわかる。

実施例　２ ０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド１．２ｇ、
ドデシル硫酸ナトリウム０．８ｇ、フェニルペンタノー
ル２゜０９を９０ｒｒ＋Ｊの０．１Ｍ酢酸緩衝液（０口
５．０）に分散溶解し、これに７スペルギルス・オリゼ
ー由来のβ−ガラクトシダーゼ１００ａｙ　（シグマ社
製６．１ユニット／Ｒｇ）を上記酢酸緩衝液１０ｍＭに
溶解したものを加え、４０℃で攪拌下１５分間反応させ
た。これにエタノール４００ｍ　Ｎを加えて、酵素を失
活させ、沈澱させた。孔径０．４５μｍのフィルターで
酵素を除き、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグ
ラフィーにて精製し、フェニルベンチルーβ−Ｄ−ガラ
クトシドｓｏａｌｌ１ｇ（収率１５．１％）を得た。

実施例　３ マルトース２４９、ポリオキシエチレンラウリルエーテ
ル（平均付加モル数６＞　　４．０９、グリセロールモ
ノラウレート４．０９をｇ□ｍｎの０．１Ｍ酢酸！ｌｌ
ｊ液（ｐＨ５，０）に分散させ、これに酵母由来のα−
グルコシダーゼ５０１Ｒ５Ｆ（バイオザイム　ラボラト
リーズ社製１３３ユニツト／ａｙ）を上記酢酸緩衝液１
０ｍｊ！に溶解したものを加え、２５℃で攪拌下３０分
間反応させた。

これにアセトニトリル４００ｍ　ｊ！を加えて、酵素を
失活させ、過剰のマルトースと共に沈澱させた。孔径０
．４５μｍのフィルターで不溶物を除き、減圧濃縮し、
シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、モノ
ラウロイルグリセリル−β−Ｄ−グルコシド５００＃Ｆ
（収率７．９％）を得た。

［発明の効果］ 本発明によれば、界面活性剤存在下で難水溶性基質と糖
供与体とを分散溶解させ、これに酵素を作用させること
により、−段階で難水溶性基質の配糖体を効率良く製造
することが可能となった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）糖供与体、難水溶性基質及び界面活性剤の三成分を
   緩衝溶液中に分散させたものに、酵素を加えて糖転移反
   応を起こさせることを特徴とする酵素法による配糖体の
   製造方法。２）糖供与体が、グリコシド結合を持つ化合
   物からなる請求項１）記載の酵素法による配糖体の製造
   方法。 ３）難水溶性基質が、置換又は未置換の脂肪族あるいは
   脂環族のアルコールで炭素数６〜４０の第一級、第二級
   あるいは第三級のアルコールのいずれかからなる請求項
   １）記載の酵素法による配糖法の製造方法。 ４）界面活性剤が、難水溶性基質を緩衝溶液中に分散さ
   せるのに十分な能力を持つものからなる請求項１）記載
   の酵素法による配糖体の製造方法。 ５）酵素が、α−および／またはβ−グリコシダーゼか
   らなる請求項１）記載の酵素法による配糖体の製造方法
   。