DE60208063T2 - Chromogenischen enzymsubstraten und verfahren zum nachweis von beta-d-ribofuranosidase-wirksamkeit - Google Patents

Chromogenischen enzymsubstraten und verfahren zum nachweis von beta-d-ribofuranosidase-wirksamkeit Download PDF

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Description

  • Diese Erfindung betrifft chromogene Enzymsubstrate.
  • Indikator-Enzymsubstrate umfassen einen durch Enzym abspaltbaren Teil (z.B. ein Monosaccharyl) und einen Teil, der einen nachweisbaren Indikator bei einer Spaltung bildet (z.B. eine chromogene oder fluorogene Gruppe). Eine große Zahl von Enzymsubstraten auf Glycosid-Basis ist bekannt und wird in großem Umfang in der Mikrobiologie, Molekularbiologie und auf anderen Gebieten verwendet. Glycoside von vielen verschiedenen Kohlenhydraten sind synthetisiert und für Nachweiszwecke verwendet worden. Die Enzyme, die durch diese Glycoside nachgewiesen werden, sind häufig Gruppen-spezifisch (d.h. zeigen relativ wenig Spezifität gegenüber einem Teil des Substrats, auf das sie einwirken), und deshalb kann eine große Vielfalt von Aglyconen (d.h. Indikator-Teilen) toleriert werden. So sind im Fall vom β-Galactosidase viele verschiedene β-Galactoside beim Nachweis derselben verwendet worden. Beispiele umfassen o-Nitrophenyl-, p-Nitrophenyl-, Indoxyl-(5-Brom-4-chlor-3-indolyl und 6-Chlor-3-indolyl), 4-Methylumbelliferyl-, 2-Naphthyl-, 6-Brom-2-naphthyl-, Cyclohexenoäsculetin(CHE), Alizarin-, Naphthol-ASBI- und Phenyl-β-D-galactoside. Glycoside, die Glucuronsäure-, Glucose-, Galactose-, Mannose-, Fucose-, Arabinose-, N-Acetylglucosamin-, N-Acetylgalactosamin-, Sialinsäure-, Xylose- und Cellobiose-Kohlenhydrat-Einheiten enthalten, befinden sich unter denjenigen, auf die man am häufigsten in Enzymsubstrat-Anwendungen trifft. Viele von diesen, wie β-D-Glucuronide, α- und β-D-Galactopyranoside und α- und β-D-Glucopyranoside haben eine weit verbreitete Verwendung bei der Identifizierung und Zählung von Bakterien auf Gebieten wie der klinischen, Nahrungsmittel-, Veterinär-, Umwelt- und Wassermikrobiologie gefunden. Derzeit sind zahlreiche kommerzielle Medien und Testkits verfügbar, die Enzymsubstrate enthalten, welche die Anwesenheit von Bakterien, Hefe und anderen Mikroorganismen durch Erzeugung von gefärbten Kolonien oder Lösungen zeigen.
  • Die WO-A-03/035897, welche das gleiche Prioritätsdatum wie die vorliegende Anmeldung hat, beschreibt die Synthese gewisser β-D-Ribofuranosid-Derivate als chromogene Substrate für den Nachweis einer β-D-Ribofuranosidase-Aktivität durch die Erzeugung von unlöslichen gefärbten Niederschlägen, die aus dem Aglycon-Teil nach enzymatischer Spaltung gebildet werden. Die β-D-Ribofuranosidase-Aktivität ist eine Enzymaktivität, die β-D-Ribofuranosyl-Gruppen abspalten kann. Die WO-A-03/035897 erläutert die Nützlichkeit des Nachweises einer β-D-Ribofuranosidase-Aktivität in der diagnostischen Mikrobiologie. Ein Merkmal von vielen der beispielhaft angeführten Moleküle, die in der WO-A-03/035897 beschrieben sind, ist, dass die Aglycone Derivate von Brenzkatechin sind. Diese Substrate können bequem in festen Medien, wie Medien auf Agar-Basis, verwendet werden. Durch Einschluss eines Eisensalzes, wie Eisen(III)-ammoniumcitrat, in das Medium erzeugen diese Substrate braune oder schwarze unlösliche Niederschläge, die klar die Stelle der enzymatischen Aktivität anzeigen. Dies ist bei der Unterscheidung von Mikroben oder anderen Einheiten, die β-D-Ribofuranosidase-Aktivität besitzen, von jenen nützlich, bei denen dies nicht der Fall ist. Ein Nachteil des sehr intensiven dunkelbraunen oder schwarzen Niederschlags, der durch Substrate wie 3',4'-Dihydroxyflavon-4'-β-D-ribofuranosid erzeugt wird, wenn er bei diagnostisch ausreichenden Konzentrationen verwendet wird, ist, dass er die Farbe maskieren kann, die durch ein weiteres chromogenes Substrat erzeugt wird, das demselben Medium für den Nachweis einer unterschiedlichen Enzymaktivität einverleibt ist. Der Fachmann kann leicht verstehen, dass dies unter gewissen Umständen beim Versuch, nützliche diagnostische Medien zu entwickeln, die von der Sichtbarmachung anderer Enzymaktivitäten zu und gleichzeitig mit der β-D-Ribofuranosidase-Aktivität abhängen, ein Nachteil ist.
  • Indoxylglycoside von verschiedenen Monosacchariden sind mitgeteilt worden und sind kommerziell leicht erhältlich. Zum Beispiel beschreibt die WO-A-99/50438 verschiedene Indoxylglycoside, einschließlich N-Methylindoxylglycosiden. Indoxylglycoside sind als chromogene Enzymsubstrate gut etabliert, und sie haben eine breite Verwendung in der diagnostischen Mikrobiologie gefunden, einschließlich ihrer Verwendung in festen Medien [M. Manafi, Int. J. Food Microbiol., 31, 45, (1996)]. Diese Substrate liefern nach enzymatischer Spaltung unlösliche gefärbte Niederschläge. Der gefärbte Niederschlag ist hauptsächlich von zwei Molekülen des abgespaltenen Aglycons Indoxyl abgeleitet, die sich über einen oxidativen Prozess unter Bildung eines Indigo-Farbstoffs vereinigen [S. Cotson und S. J. Holt, Proc. Roy. Soc. B, 148, 506, (1958)].
  • Obwohl die genau beobachteten Farben der unlöslichen Niederschläge abhängig von den genauen Bedingungen, unter denen sie erzeugt werden, leicht variieren können und beispielsweise durch andere Komponenten, die in den Medien vorliegen, beeinflusst werden können, kann die Farbe des Niederschlags, die durch die hauptsächlichen Indoxyl-Einheiten verliehen wird, welche üblicherweise in der diagnostischen Mikrobiologie verwendet werden, ungefähr wie folgt beschrieben werden:
    Indoxyl Farbe
    5-Brom-4-chlorindoxyl grün
    5-Bromindoxyl dunkelblau
    Indoxyl blau
    5-Brom-6-chlorindoxyl magenta
    6-Chlorindoxyl rosarot
  • Durch Wahl der Farben dieser Niederschläge, die ausreichend kontrastieren, ist es möglich, diagnostische Medien zu entwerfen, die zwei Enzymaktivitäten gleichzeitig nachweisen, indem zwei oder mehr verschiedene Indoxyl-Substrate verwendet werden, in denen sowohl die Indoxyl- als auch die Kohlenhydrat- oder durch Enzym abspaltbare Einheit in jedem Substrat verschieden ist. Medien dieser Art sind beschrieben worden [J. N. Roth und W. J. Ferguson, US-A-5,210,022 (1993); D. G. Flowers und M. Sternfeld, US-A-5,364,767 (1994)]. Ein interessantes Merkmal bei Medien, die verschiedene Indoxyl-Substrate enthalten, ist, dass Kombinationen von Farben gebildet werden können, wenn zwei der aufzusuchenden Enzymaktivitäten in der gleichen Einheit vorliegen, und dies kann dazu beitragen, ein selektiveres Nachweissystem für die untersuchten Mikroben zu erreichen.
  • Der Stand der Technik enthält mehrere Beispiele für die chemische Synthese von Indoxylglycosiden. Alle diese mitgeteilten Beispiele verwenden peracylierte Zuckerhalogenide als Glycosyl-Donor oder im Fall von Glucoroniden das äquivalente Methyltriacetylglucoronylbromid [K. Yoshida et al., Anal. Biochem., 58, 77, (1974); K. Yoshida et al., Chem. Pharm. Bull., 32, 1759, (1975); A. N. Ley et al., Can. J. Microbiol., 34, 690, (1988); S. Wolfe und R. J. Bowers, EP-A-02847525A2, (1988)]. Der Glycosyl-Akzeptor ist entweder ein 1-Acetylindoxyl-Derivat der allgemeinen Formel (I) oder in einem Beispiel 3-Acetyl-5-brom-4-chlorindoxyl
    Figure 00040001
    (1) V1-3 = H oder Halogen, V4 = H oder CO2Me
  • Die meisten dieser Verfahren sind Basen-geförderte Glycosylierungen und können deshalb als der Klasse der Glycosylierung vom Michael-Typ (Reaktion in Alkohol) oder von ihrer von Mannich entwickelten Abwandlung (Reaktion in Aceton/Wasser) angehörig angesehen werden. Die erste Synthese eines Indoxylglycosids, Indoxyl-β-D-glycopyranosid (Pflanzen-Indican), wurde von Robertson 1927 mitgeteilt [A. Robertson, J. Chem. Soc., 1937, (1927)], der Bedingungen vom Mannich-Typ verwendete. Er konnte 1-Acetylindoxyl (I, V = H) mit Acetobromglucose unter Verwendung von Kaliumhydroxid in wässrigem Aceton kondensieren, um das peracetylierte Indoxylglucosid-Zwischenprodukt herzustellen. Die Deacetylierung lieferte das gesuchte Indoxyl-β-D-glucopyranosid. Jedoch bevorzugte er einen anderen Weg zum peracetylierten Zwischenprodukt, wobei er die damalige Schwierigkeit bei der Herstellung von 1-Acetylindoxyl als einen Grund dafür nannte. Sein alternativer Weg beinhaltete die Kondensation von Methylindoxyl-2-carboxylat (I, V1-3 = H, V4 = CO2Me) mit Acetobromglucose, ebenfalls mit Hilfe von Kaliumhydroxid in wässrigem Aceton. Jedoch waren mehrere weitere Schritte erforderlich, bevor das gewünschte Endprodukt erhalten werden konnte, und zwar wegen des Erfordernisses, den Indol-Kern an Position 2 zu decarboxylieren, ein Prozess, der die forcierenden Bedingungen des Erwärmens mit Natriumacetat in Acetanhydrid bei 160°C beinhaltet. Der Weg, der die Kupplung eines geschützten Zuckerhalogenids mit dem geeigneten Methylindoxyl-2-carboxylat beinhaltete, hatte wenig weitere Anwendung gefunden [A. Robertson und R. B. Waters, J. Chem. Soc., 72, (1931); Ley et al., oben; S. Wolfe und R. J. Bowers, oben]. Der schnellere Weg, der durch die direkte Kupplung von 1-Acetylindoxylen mit einem vollständig acetylierten Zuckerhalogenid (am häufigsten dem Acetobromzucker) bereitgestellt wird, war das übliche Verfahren der Wahl. Dies vermeidet das Erfordernis für einen Decarboxylierungsschritt. Die erforderlichen 1-Acetylindoxyle (1, V4 = H) sind leicht durch Verfahren erhältlich, die von Holt und Sadler entwickelt wurden [S. J. Holt et al., J. Chem. Soc., 1217, (1958); vgl. S. J. Holt und P. W. Sadler, Proc. Roy. Soc. B, 148, 481, (1958)]. Nach Kuppeln von 1-Acetylindoxylen mit einem peracylierten Zuckerhalogenid liefert eine Schutzgruppenentfernung vom Zemplen-Typ (Natriummethanolat in Methanol) das Endprodukt Indoxylglycosid. Diese Vorgehensweise wurde von Anderson und Leaback [F. B. Anderson und D. Leaback, Tetrahedron, 12, 236 (1961)] für die Synthese von drei Glycosiden auf 5-Brom-3-indolyl-Basis gewählt. In einem ihrer Beispiele wurde 1-Acetyl-5-bromindoxyl (1, V2 = Br, V1, V3, V4 = H) mit Acetobromgalactose mittels Verwendung von Natriumhydroxid in wässrigem Aceton gekuppelt. Nach Gewinnung des peracetylierten Zwischenprodukts wurde das Endprodukt direkt nach Schutzgruppenentfernung mit methanolischem Natriummethanolat und Aufarbeitung erhalten. Die Synthese eines 5-Brom-3-indolyldisaccharids aus dem Acetobromzucker mittels der Bedingungen von Anderson und Leaback ist kürzlich mitgeteilt wurden [S. Kaneko et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 741, (2000)]. Der Bereich von halogenierten Indoxylmonosacchariden wurde weiter von Horwitz und Mitarbeitern ausgedehnt [J. P. Horwitz et al., J. Med. Chem., 7, 574, (1964)]. In einer Synthese von diesen Forschern wurde 1-Acetyl-5-brom-4-chlorindoxyl (X-OH) (I, V1 = Cl, V2 = Br V3-4 = H) mit Acetobromgalactose unter den von Anderson und Leaback verwendeten Bedingungen gekuppelt. Nach Schutzgruppenentfernung des peracetylierten Indoxylgalactosids erhielten sie 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal). X-Gal ist derzeit das verbreitetste Indoxylglycosid, das in der diagnostischen Mikrobiologie sowie auf anderen Gebieten, wie der Molekularbiologie, verwendet wird. In derselben Veröffentlichung verwendeten Horwitz und Mitarbeiter auch 3-Acetyl-5-brom-5-chlorindoxyl [S. J. Holt und P. W. Sadler, oben] als Zwischenprodukt. Unter Verwendung dieses Reaktanten war es notwendig, die 3-Acetylgruppe mit Natrium in Methanol zu entfernen, um das Indoxylnatrium-Salz in situ vor der Behandlung desselben mit Acetobromglucose zu erzeugen. Da die Bedingungen der Reaktion auch zu der Entfernung aller anderer Acetyl-Schutzgruppen führte, wurde das vollständig von Schutzgruppen befreite Glycosid, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucopyranosid (X-Glucosid) in einem einzigen Schritt geliefert. Jedoch weist dieser Weg drei deutliche Nachteile auf. Zuerst sind 3-Acetylindoxyle schwieriger herzustellen als 1-Acetylindoxyle. Zweitens erschwert ihre sehr verringerte Stabilität die Arbeit mit denselben sehr. Drittens gibt es, da die Reaktion eine "Eintopf"-Reaktion ist und die Ausbeute gering ist, eine beträchtliche Menge an hoch gefärbtem Rückstand, der entfernt werden muss, bevor das Produkt nützlich als Enzymsubstrat verwendet werden kann, und dies ist im präparativen Maßstab sehr mühsam zufriedenstellend zu erreichen.
  • In jüngerer Zeit berichteten Berlin und Sauer [W. Berlin und B. Sauer, Anal. Biochem., 243, 171, (1996)] über Schwierigkeiten mit der Basen-geförderten Reaktion zwischen 1-Acetyl-5-bromindoxyl (I, V2 = Br, V1, V3, V4 = H) und einem Perbenzoylarabinofuranosylbromid. Jedoch konnten sie eine erfolgreiche Glycosylierungsreaktion unter Verwendung von Silbertriflat als Katalysator in Dichlormethan erhalten. Diese Bedingungen stellen eine Abwandlung der klassichen Koenigs-Knorr-Reaktion dar [K. Toshima und K. Tatsuta, Chem. Rev., 93, 1503, (1993)].
  • Vor der vorliegenden Erfindung sind Indoxyl-Derivate von β-D-Ribofuranosiden nicht beschrieben worden.
  • Ein erster Aspekt dieser Erfindung stellt ein Indoxyl-β-D-ribofuranosid der Formel II
    Figure 00070001
    in der R1-4 unabhängig H, Halogenid, Nitro oder C1-6-Alkylgruppen sind und R5 für H, C1-6-Alkyl oder Aralkyl steht, oder ein substituiertes Derivat oder einen Ester des Indoxyl-β-D-ribofuranosids bereit.
  • Ein zweiter Aspekt dieser Erfindung stellt ein Verfahren zur Erzeugung eines Indoxyl-β-D-ribofuranosids gemäß dem ersten Aspekt dieser Erfindung bereit, umfassend a) In-Kontakt-Bringen eines geschützten β-D-Ribofuranosyltrichloracetimidats mit einer Verbindung der Formel III
    Figure 00070002
    in der R1-4 unabhängig H, Halogenid, Nitro oder C1-6-Alkylgruppen sind und T5 Acyl, Trialkylsilyl oder andere Schutzgruppen ist, in Anwesenheit eines Katalysators, um ein geschütztes Indoxyl-β-D-ribofuranosid zu bilden; und b) Entfernen der Schutzgruppen.
  • Schutzgruppen sind Einheiten, die an reaktiven Hydroxylgruppen an β-D-Ribofuranosyl oder dem Indoxyl-Stickstoff angebracht sind, um zu verhindern, dass Reaktionen stattfinden, die nicht erforderlich sind. Die am üblichsten verwendete Schutzgruppe ist Acetyl.
  • Ein dritter Aspekt dieser Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis von β-D-Ribofuranosidase-Aktivität in einer Probe bereit, welches umfasst:
    • a) In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Indoxyl-β-D-ribofuranosid gemäß dem ersten Aspekt dieser Erfindung, wobei das Indoxyl-β-D-ribofuranosid eine β-D-Ribofuranosyl-Einheit und eine Indoxyl-Einheit umfasst, wobei die β-D-Ribofuranosyl-Einheit durch β-D-Ribofuranosidase von der Indoxyl-Einheit abspaltbar ist, was die Indoxyl-Einheit zurücklässt, die eine gefärbte Verbindung bildet; und
    • b) Schließen, ob β-D-Ribofuranosidase-Aktivität anwesend ist, durch Nachweisen, ob eine gefärbte Verbindung aus der Indoxyl-Einheit gebildet ist.
  • Gemäß einem vierten Aspekt dieser Erfindung wird ein Kit bereitgestellt, welches umfasst
    • a) ein Indoxyl-β-D-ribofuranosid gemäß dem ersten Aspekt dieser Erfindung und
    • b) eine Komponente zur Verwendung bei der Erzeugung eines mikrobiellen Wachstumsmediums.
  • Gemäß einem fünften Aspekt dieser Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die ein Indoxyl-β-D-ribofuranosid gemäß dem ersten Aspekt dieser Erfindung und eine weitere Komponente umfasst.
  • Nach Spaltung durch β-D-Ribofuranosidase würde die Indoxyl-Einheit von Indoxyl-β-D-ribofuranosiden einen Bereich von gefärbten Verbindungen erzeugen, wie oben angegeben, die von jenen verschieden sind, die sich durch die in der WO-A-03/035897 beispielhaft angeführten, von Brenzkatechin abgeleiteten β-D-Ribofuranosiden ergeben. Weiter ist es, anders als bei Verbindungen wie jenen, die aus 3',4'-Dihydroxyflavon-4'-β-D-ribofuranosid in einem Eisensalz enthaltenden Medium gebildet werden, nicht wahrscheinlich, dass die gefärbte Verbindung, die von Indoxyl-β-D-ribofuranosiden nach enzymatischer Spaltung erzeugt wird, vollständig die Farbe maskiert, die von einem verschiedenen Enzymsubstrat erzeugt wird (wie die farbigen Verbindungen, die von einem verschiedenen Indoxyl-Teil erzeugt werden, der an einen anderen Zucker oder eine andere durch Enzym abspaltbare Gruppe gebunden ist), welches dem Medium für die Sichtbarmachung einer unterschiedlichen Enzymaktivität einverleibt ist. Darüber hinaus wird es in Betracht gezogen, dass einige neue chromogene Medien der vorliegenden Erfindung es ermöglichen würden, dass das Vorliegen von β-D-Ribofuranosidase-Aktivität durch die Verwendung eines chromogenen β-D-Ribofuranosids nachgewiesen würde, welches durch eine zweite, stärker gefärbte Verbindung maskiert wird, die von einer verschiedenen Enzymaktivität in der gleichen Probe nach deren Einwirkung auf ein zweites chromogenes Enzymsubstrat freigesetzt wird. Der Fachmann erkennt, dass dies unter gewissen Umständen einen Vorteil darstellt, wenn man versucht, nützliche diagnostische Medien zu entwickeln, die von der Sichtbarmachung anderer Enzymaktivitäten zusätzlich zur β-D-Ribofuranosidase-Aktivität abhängen. Es wurde deshalb erwogen, dass die Synthese von Indoxyl-β-D-ribofuranosiden und deren Anwendung als chromogene Enzymsubstrate zu jener der β-D-Ribofuranosiden auf Brenzkatechin-Basis, die beispielhaft in der WO-A-03/036897 angeführt sind, komplementär sind und deshalb die derzeitigen Beschränkungen beim Entwurf neuer chromogener Medien überwinden, in denen der Nachweis der β-D-Ribofuranosidase-Aktivität kritisch ist.
  • Indoxyl-β-D-ribofuranoside der vorliegenden Erfindung werden durch die vorstehende Formel II definiert. Es wird im Allgemeinen vorgezogen, dass die Positionen R1 bis R4 H, C1-6-Alkyl oder Halogenid sind und dass die Halogenide im Allgemeinen Brom oder Chlor sind. R5 kann C1-6-Alkyl oder Aralkyl, wie Benzyl, sein, ist aber im Allgemeinen H oder Methyl. Speziell bevorzugte Indoxyl-Teile sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 5-Brom-4-chlor-3-indolyl (auch als X bezeichnet), 5-Brom-6-chlor-3-indolyl, 5-Brom-3-indolyl, 6-Chlor-3-indolyl, 3-Indolyl, 4-Chlor-3-indolyl, 6-Brom-3-indolyl, 6-Fluor-3-indolyl, 5,7-Dibrom-3-indolyl, 4,5-Dichlor-3-indolyl, 5-Nitro-3-indolyl, 1-Methyl-3-indolyl, 5-Brom-4-chlor-1-methyl-3-indolyl, 5-Brom-6-chlor-1-methyl-3-indolyl, 5-Brom-1-methyl-3-indolyl, 6-Chlor-1-methyl-3-indolyl, 4-Chlor-1-methyl-3-indolyl, 6-Brom-1-methyl-3-indolyl, 6-Fluor-1-methyl-3-indolyl, 5,7-Dibrom-1-methyl-3-indolyl, 5,6-Dibrom-3-indolyl, 5,6-Dibrom-1-methyl-3-indolyl und 5-Nitro-1-methyl-3-indolyl und 4,5-Dichlor-1-methyl-3-indolyl.
  • Der zweite Aspekt dieser Erfindung stellt ein Verfahren zur Erzeugung von Indoxyl-β-D-ribofuranosiden bereit und wurde nach längeren und in die Tiefe gehenden Untersuchungen entwickelt, die vom Erfinder durchgeführt wurden.
  • Um Verbindungen der Erfindung bereitzustellen, wurde zuerst versucht, die Kupplung von 1-Acetyl-5-brom-4-chlorindoxyl (X-OH) (1-Acetyl-5-brom-4-chlorindol-3-ol) mit Acetobrom- oder Acetochlorribofuranose unter den Bedingungen, die von Andersen und Leaback (oben) zur Herstellung von 5-Brom-3-indolylglycosiden und von Horwitz und Mitarbeitern (oben) zur Herstellung von X-Gal verwendet wurden, zu versuchen, wobei das Zielmolekül der vorliegenden Erfindung demgemäß 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-ribofuranosid (X-β-D-Ribofuranosid) ist. So wurden entweder Acetobromribofuranose oder die etwas stabilere Acetochlorribofuranose [N. Zinner, Chem. Ber., 83, 153, (1950)] (beide aus kommerziell erhältlichen β-D-Ribofuranosetetraacetat hergestellt) und X-OH mit der geeigneten Menge an Natrium- oder Kaliumhydroxid in wässrigem Aceton behandelt. Die Analyse der Reaktionen mittels DSC (bezüglich des Auftretens eines neuen UV-aktiven Produkts) und, falls zutreffend, durch Isolieren irgendwelcher gebildeten neuen Produkte durch Säulenchromatographie auf Kieselgel C60, gefolgt von NMR-Analyse, zeigte, dass keine der Reaktionen das erwartete geschützte Indoxylribofuranosid-Zwischenprodukt erzeugte.
  • Die Ribosylierung wurde dann unter Verwendung des Tribenzoyl-D-ribofuranosylbromids [S. Hanessian und A. G. Pernet, Can. J. Chem., 52, 1280, (1974)] und -chlorids [H. M. Kissman et al., J. Amer. Chem. Soc., 77, 18, (1955)] versucht. Nichtsdestoweniger wurde auch in diesen Reaktionen keine Produktbildung beobachtet. Aufgrund des Versagens, X-OH unter dem Einfluss von entweder Kalium- oder Natriumhydroxid an ein peracyliertes Ribofuranosylhalogenid zu kuppeln, suchte man nach einem alternativen Glycosylierungsverfahren unter Verwendung dieser Halogenide. Die Koenigs-Knorr-Reaktion unter Verwendung geschützter Zuckerhalogenide ist ein häufig verwendetes Verfahren, um O-Glycoside zu konstruieren, und ist in der Indoxyl-Reihe bereits angewendet worden [W. Berlin und P. Sauer, oben]. Ursprünglich unter Verwendung von Silbersalzen als sowohl Katalysator als auch Halogenid-Akzeptor entwickelt [W. Koenigs und E. Knorr, Chem. Ber., 34, 957, (1901)], ist der Bereich der Reaktion im Laufe der Jahre durch die Verwendung von anderen Metallkatalysatoren ausgedehnt worden [K. Toshima und K. Tatsuta, oben]. Mehrere derselben wurden während der Arbeit an der vorliegenden Erfindung mit den oben erwähnten Peracetyl- und Perbenzoylribofuranosylhalogeniden untersucht. Unter Verwendung der Lösungsmittel Acetonitril, Chloroform, Dichlormethan, Diethylether, Dimethylformamid, Nitromethan oder Pyridin wurden die folgenden Glycosylierungs-Katalysatoren versucht, alle ohne Erfolg: Silber(I)-carbonat, Silber(I)-cyanid, Silber(I)-oxid, Silber(I)-nitrat, Silber(I)-triflat, Cadmiumcarbonat, Quecksilber(II)-bromid, Quecksilber(II)-chlorid und Quecksilber(II)-oxid.
  • Das Versagen der Koenigs-Knorr-Reaktion, das gewünschte Glycosid zu erzeugen, führte zu der Bewertung anderer Glycosylierungsverfahren, welche nicht die Anwesenheit eines Glycosylhalogenids im Schlüssel-Kupplungsschritt beinhalteten. Die Verwendung von 1-O-acylierten Glycosyl-Donatoren in Glycosylierungen (Helferich-Reaktion) wurde zuerst 1933 demonstriert [B. Helferich und E. Schmitz-Hillebrecht, Chem. Ber., 66, 378, (1933)]. Diese Reaktion beinhaltet häufig das Erwärmen eines peracylierten Zuckers mit einem Aglycon in Anwesenheit eines Lewis-Säure-Aktivators, wie p-Toluolsulfonsäure (PTSA) oder Zinkchlorid [E. M. Montgomery, N. K. Richtmyer und C. S. Hudson, J. Amer. Chem. Soc., 64, 690, (1942)]. Das Erwärmen von β-D-Ribofuranosetetraacetat und von X-OH mit beiden dieser Aktivatoren erzeugte nicht das gewünschte Produkt. Seit den anfänglichen Experimenten von Helferich und Mitarbeitern wurde der Bereich der Helferich-Reaktion weiter durch die Verwendung von anderen Katalysatoren und durch Durchführung der Reaktion in organischen Lösungsmitteln ausgedehnt. In der Tat ist die Ribofuranosylierung von aromatischen Verbindungen unter Verwendung von peracylierten β-D-Ribofuranosen in organischen Lösungsmitteln mit Bortrifluoriddiethyletherat als Katalysator mitgeteilt worden [L. Kalvoda, Coll. Czech. Chem. Comm., 38, 1679, (1973) und die WO-A-03/03589]. Jedoch ergab der Einsatz von X-OH anstelle der aromatischen Verbindungen, die in diesen Beispielen verwendet wurden, kein Ribosid. Zusätzliche Helferich-Reaktionen wurden in Acetonitril, Chloroform, Dichlormethan, 1,2-Dichlorethan, Diethylether und Nitromethan mit entweder β-D-Ribofuranosetetraacetat, 1-O-Acetyl-β-D-ribofuranosetribenzoat oder 1-p-Nitrobenzoyl-β-D-ribofuranosetribenzoat und den folgenden Lewis-Säure-Katalysatoren: Aluminiumtrichlorid, Bortrifluoriddiethyletherat, Eisen(III)-chlorid, Zinn(IV)-chlorid, TMS-Triflat und PTSA versucht. Keine Reaktion war erfolgreich.
  • Thioglycoside haben sich als vielseitige Glycosyl-Donatoren erwiesen [K. Toshima und K. Tatsuta, oben]. Ein Reagens, das für eine Ribosylierung als geeignet angesehen wurde, Phenylthio-β-D-ribofuranosid, wurde bequem aus β-D-Ribofuranosetetraacetat und Thiophenol hergestellt [G. Kim et al., Tetr. Lettr. 34, 7627, (1993)]. Die Behandlung dieses Thioglycosids und von X-OH mit entweder Quecksilber(II)-chlorid oder Quecksilber(II)-sulfat als Aktivator in Dichlormethan oder Nitromethan induzierte keinerlei Ribosid-Bildung. Crich und Smith haben kürzlich ein Glycosylierungs-Verfahren auf der Grundlage von Thioglycosiden entwickelt, das sowohl mild ist als auch auf einen Bereich von Aglyconen angewendet worden ist [D. Crich und M. Smith, J. Amer. Chem. Soc., 123, 9015, (2001)]. Die Crich-Glycosylierung beinhaltet die Behandlung des geeigneten Thioglycosids und Glycosyl-Akzeptors mit 1-Benzolsulfinylpiperidin (BSP) und Trifluormethansulfonsäureanhydrid (Tf2O) in Dichlormethan bei niedriger Temperatur (–60°C) entweder mit oder ohne die gehinderte Base 2,4,6-Tri-tertbutylpyrimidin (TTBP). Als diese Bedingungen auf Phenylthio-β-D-ribofuranosid und XOH angewendet wurden, wurde keine Reaktion beobachtet, weder mit noch ohne Anwesenheit von TTBP.
  • Noch ein weiterer Zugang zu Glycosiden, der kein 1-Halogenid-Zwischenprodukt in der Schlüssel-Glycosylierungsstufe beinhaltet, ist das Trichloracetimidat-Verfahren von Schmidt [R. R. Schmidt, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 25, 212 (1986)]. Ribofuranosyltrichloracetimidate sind als Ribofuranosyl-Donatoren in Glycosid-Synthesen verwendet worden [I. Chiu Machado et al., J. Carbohydr. Chem, 13, 465, (1994)]. Der geeignetste Donor für die Kupplung mit X-OH wäre ein peracyliertes Ribofuranosyltrichloracetimidat. Dies ist der Fall, da alle Acylgruppen an dem geschützten gekuppelten Produkt bequem in einem Schritt durch das Zemplen-Verfahren entfernt werden könnten, wie es für andere Indoxylglycoside beschrieben wurde. Die Synthese von zwei peracylierten Ribofuranosyltrichloracetimidaten ist von Verez-Bencomo und Mitarbeitern beschrieben worden [I. Chiu-Machado et al., J. Carbohydr. Chem., 14, 551, (1995)]. Peracetyliertes D-Ribofuranosyltrichloracetimidat, erhalten als anomere Mischung, wurde von ihnen erfolgreich verwendet, um β-D-Ribofuranoside zu erzeugen, obwohl sie dessen Verwendung nicht mit aromatischen Aglyconen mitteilten. Der Ausgangspunkt ihrer Synthese dieses Ribosyl-Donors war Methyl-2,3,5-tri-O-acetyl-β-D-ribofuranosid. Dieses wird durch Acetylierung von Methyl-β-D-ribofuranosid mit Acetanhydrid hergestellt [S. J. Angyal et al., Carbohydr. Res., 157, 83, (1986)]. Methyl-β-D-ribofuranosid wird selbst bequem aus Ribose hergestellt [R.Barker und H. G. Fletcher Jr., J. Org. Chem, 26, 4605, (1961)]. Die Umsetzung des peracetylierten D-Ribofuranosyltrichloracetimidats mit X-OH in Dichlormethan bei Umgebungstemperatur unter Verwendung von TMS-Triflat als Katalysator lieferte neues Material, das auf DSC UV-aktiv war. Die Abtrennung dieses Materials von anderen Verbindungen mittels Säulenchromatographie auf Kieselgel C60, gefolgt von Aufarbeitung, hatte die Isolierung des gewünschten X- β-D-Ribofuranosidperacetats zum Ergebnis, das im Wesentlichen frei von jeglichen bedeutenden Verunreinigungen war. Die Deacetylierung mit einer katalytischen Menge an Natriummethanolat in Methanol, gefolgt vom Verdampfen des Lösungsmittels und Digerieren des Festkörpers, ergab X-β-D-Ribofuranosid als Festkörper mit einer Reinheit mittels HPLC von etwa 96%. [HPLC-Bedingungen: Säule: Chromosphere 250 mm × 4,6 mm C18-Umkehrphasen-Kieselgel, 5 μm (ChromosExpress, Macclesfield, UK); Lösungsmittel: Methanol/Wasser 1:1 Vol./Vol., 1 ml/min Durchfluss; Nachweis, UV bei 290 nm; Beladung, 1 mg Produkt in 1 g Lösungsmittel, 20 μl Injektion; Laufzeit, 30 min; Retentionszeit etwa 17 Minuten].
  • Das in dem zweiten Aspekt dieser Erfindung beschriebene Verfahren wird im Allgemeinen so durchgeführt, dass Schritt a) in einem organischen Lösungsmittel stattfindet.
  • Das Verfahren dieser Erfindung wird im Allgemeinen so durchgeführt, dass der Katalysator von Schritt a) eine Lewis-Säure ist.
  • Es wird bevorzugt, dass das Verfahren dieser Erfindung so durchgeführt wird, dass das geschützte β-D-Ribofuranosyltrichloracetimidat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2,3,5-Tri-O-acetyl-β-D-ribofuranosyltrichloracetimidat und 2,3,5-Tri-O-benzoyl-β-D-ribofuranosyltrichloracetimidat.
  • Wie oben beschrieben, kann es sich bei T5 in der Formel III um Acyl, eine Trialkylsilyl-Schutzgruppe oder eine andere Schutzgruppe handeln. Die nützlichsten Trialkylsilyl-Schutzgruppen sind Trimethylsilyl, t-Butyldimethylsilyl, Triethylsilyl und Triisopropylsilyl. Die bevorzugte Schutzgruppe an T5 ist Acetyl oder Trimethylsilyl. Wenn die Schutzgruppen während des Schritts b) entfernt werden, kann T5 in R5 überführt werden. Dies kann das Verfahren sein, dem gefolgt wird, wenn T5 Acetyl ist und R5 für H steht. Alternativ kann keine Änderung stattfinden, und T5 und R5 sind identisch. In einer weiteren Ausführungsform kann T5 in einem getrennten Schritt modifiziert werden, um R5 zu erzeugen. Zum Beispiel kann nach Schritt a) das Zwischenprodukt eine Acetylgruppe an T5 aufweisen, die selektiv deacetyliert wird, und eine anschließende Reaktion am Indoxyl-N erzeugt R5. Eine weitere Schutzgruppenentfernung findet statt, Schritt b), bevor das Indoxyl-β-D-ribofuranosid erzeugt wird.
  • Wie oben beschrieben, stellt der dritte Aspekt dieser Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von β-D-Ribofuranosidase-Aktivität in einer Probe bereit.
  • In diesem Aspekt der Erfindung kann auch ein vorläufiger Schritt vorliegen, in dem die Probe, die Zellen, gewöhnlich mikrobielle Zellen, enthält, in oder auf einem Medium gezüchtet wird.
  • In einer alternativen Ausführungsform kann das Verfahren auch den Nachweis einer zweiten Enzymaktivität in der Probe umfassen, und in Schritt a) wird die Probe zusätzlich mit einem zweiten Enzymsubstrat in Kontakt gebracht, das eine durch Enzym abspaltbare Einheit, bei der es sich nicht um β-D-Ribofuranosyl handelt, und eine Indikator-Einheit umfasst, die nicht mit jener des Indoxyl-β-D-ribofuranosids identisch ist, wobei die durch Enzym abspaltbare Einheit durch die zweite Enzymaktivität abspaltbar ist, die die Indikator-Einheit freisetzt, welche eine zweite nachweisbare Verbindung bildet; und
    • c) Schließen, ob die zweite Enzymaktivität in der Probe vorliegt, durch Nachweisen, ob eine zweite nachweisbare Verbindung aus der Indikator-Einheit des zweiten Enzymsubstrats gebildet ist.
  • Das zweite Enzymsubstrat umfasst eine Indikator-Einheit, die im Allgemeinen eine chromogene Einheit ist, aber auch eine fluorogene Einheit sein kann. Es wird bevorzugt, dass das zweite Enzymsubstrat eine durch Enzym abspaltbare Einheit umfasst, bei der es sich um eine Zucker-Einheit oder ein Phosphat oder einen Ester, wie ein Caprylat, handelt.
  • Im Verfahren des dritten Aspekts dieser Erfindung kann die Probe lebende Zellen, wie Bakterien oder andere Prokaryoten, Pilze, eukaryotische Organismen, Zellkulturen oder alternativ Zellextrakte umfassen.
  • Es wird bevorzugt, dass die Nachweisverfahren dieser Erfindung mit der Probe auf einem festen Medium stattfinden und dass die farbigen Verbindungen oder erzeugten Verbindungen unlöslich sind.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung umfasst das Verfahren des dritten Aspekts dieser Erfindung ein festes Medium, das ein Indoxyl-β-D-ribofuranosid der vorliegenden Erfindung umfasst.
  • In einer Ausführungsform des Verfahrens wird die farbige Verbindung, die aus dem Indoxyl-Teil des Indoxyl-β-D-ribofuranosids gebildet wird, gleichzeitig mit einer farbigen Verbindung sichtbar gemacht, die aus einer chromogenen Einheit des zweiten Enzymsubstrats gebildet ist.
  • In einer alternativen Ausführungsform maskiert eine farbige Verbindung, die aus der chromogenen Einheit des zweiten Enzymsubstrats gebildet ist, die farbige Verbindung, die aus der Indoxyl-Einheit des Indoxyl-β-D-ribofuranosidase-Substrats gebildet ist.
  • In einer alternativen Ausführungsform des dritten Aspekts dieser Erfindung liegt die Probe in einem flüssigen mikrobiellen Wachstumsmedium vor.
  • Der vierte Aspekt dieser Erfindung, wie oben beschrieben, stellt ein Kit zur Durchführung eines Nachweises unter Verwendung eines Indoxyl-β-D-ribofuranosids der vorliegenden Erfindung bereit. Es wird bevorzugt, dass die Komponente zur Verwendung bei der Erzeugung eines Mediums zur Erzeugung eines festen mikrobiellen Wachstumsmediums dient.
  • Gemäß einem fünften Aspekt der Erfindung, wie oben beschrieben, ist die andere Komponente in der Zusammensetzung eine Komponente von festen Medien. Alternativ kann es sich bei der anderen Komponente um ein weiteres chromogenes Enzymsubstrat handeln. Eine Zusammensetzung dieser Erfindung kann eine Mehrzahl von anderen Komponenten umfassen, die ausreichen, um ein Nachweismedium zu bilden, das in dieser Erfindung nützlich ist.
  • Die vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele erläutert.
  • Beispiel 1 Synthese von 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-ribofuranosid (X-β-D-Ribofuranosid)
  • Die Reaktion wurde in einem 500 ml-Zweihalskolben durchgeführt, der mit einem Magnetrührer ausgestattet war.
  • Zu einer Mischung von 2,3,5-Tri-O-acetyl-α/β-D-ribofuranosyltrichloracetimid [I. Chiu-Machado et al., (1995), oben] (145,0 g) und 3 Å-Molekularsieben (2,0 g) in trockenem Dichlormethan (300 ml) wurde trockenes X-OH (82,9 g) gegeben, und die ganze Mischung wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. TMS-Triflat (8 ml) wurde dann mittels einer Spritze in einer Portion dazugegeben, und man ließ die Reaktion 1 Stunde bei Raumtemperatur rühren. Die Mischung wurde dann in Dichlormethan (3 l) gegossen und mit 1 M Natriumhydroxid (4 × 2 l) gewaschen. Die organische Schicht wurde abgetrennt, durch Celite filtriert und im Vakuum auf ein geringes Volumen (etwa 1 l) konzentriert. Die organische Schicht wurde dann weiter mit 1 M Natriumhydroxid (6 × 1 l) und deionisiertem Wasser (1 l) gewaschen. Nach Trocknen (Magnesiumsulfat) wurde sie durch Celite filtriert und im Vakuum konzentriert, was rohes geschütztes Produkt als dunkelbraunen Festkörper lieferte (87,4 g).
  • Der dunkelbraune Festkörper wurde mittels DSC überprüft, und man fand, dass er zwei Hauptprodukte mit Rf-Werten von etwa 0,37 (das geschützte β-Ribofuranosid) und 0,43 enthielt [Kieselgel-Platten, 60/80 Petrolether, Ethylacetat 1:1 Vol./Vol. UV bei 254 nm]. Flashchromatographie des Rohprodukts auf Kieselgel C60 (600 g) unter Verwendung von 60/80 Petrolether/Ethylacetat/Triethylamin 1:1:0,05 Vol./Vol.Nol. als Elutionslösungsmittel ergab das geschützte Produkt als braunes Öl (55 g). Das Öl war hauptsächlich eine Mischung des X-β-D-Ribofuranosidtetraacetats und der Verunreinigung mit Rf 0,43. Dieses Öl wurde in warmem Methanol (30 ml) aufgenommen, und nach Stehenlassen bei Umgebungstemperatur bildete sich ein Niederschlag. Nach 16 Stunden wurde der cremefarbene Niederschlag, der nahezu vollständig aus Material mit dem Rf-Wert von 0,43 bestand, durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde bei etwa 40°C im Vakuum konzentriert, was X-β-D-Ribofuranosidtetraacetat als braunes Öl lieferte (33,6 g).
  • X-β-D-Ribofuranosidtetraacetat (30 g) wurde in Methanol (200 ml) gelöst, und 5 ml einer Natriummethanolat-Lösung (hergestellt aus 1 g Natrium in 20 ml Methanol) wurden dazugetropft, bis die Lösung pH 10 erreichte. Die Lösung wurde 90 min bei Raumtemperatur stehen gelassen, dann im Vakuum zu einem braunen teerartigen Öl konzentriert. Das Öl wurde in Aceton (500 ml) digeriert. Ein grauer Festkörper fiel aus, und dieser wurde durch Vakuumfiltration entfernt. Der Festkörper wurde verworfen, und das Filtrat wurde im Vakuum zu einem braunen Öl (19,3 g) konzentriert. Das Öl wurde mit Methanol (80 ml) digeriert, und das Produkt fiel als hellblauer Festkörper auf, der durch Filtration entfernt wurde (2,57 g). Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert und mit Methanol (30 ml) digeriert, wodurch man eine zweite Fraktion als hellen cremefarbenen Festkörper erhielt, der ebenfalls durch Filtration gewonnen wurde (4,04 g). Beide Fraktionen wurden vereinigt und mit kalten Aceton (etwa 20 ml) gewaschen, gefolgt von Filtration, um die Titelverbindung als weißen Festkörper zu gewinnen (etwa 2,5 g).
  • Beispiel 2 Vergleich der Eigenschaften von Substraten für β-D-Ribofuranosidase
  • Die folgenden Medien wurden erzeugt, um die Nützlichkeit der Verbindungen der vorliegenden Erfindung zu demonstrieren. Medium A (Komponenten pro Liter)
    Columbia-Agar (Oxoid) 40 g
    5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-ribofuranosid (auch als X-β-D-Ribofuranosid bekannt, eine Verbindung dieser Erfindung) 80 mg
    6-Chlor-3-indolyl-β-D-glucopyranosid 200 mg
    Medium B (Komponenten pro Liter)
    Columbia-Agar (Oxoid) 40 g
    3',4'-Dihydroxyflavon-4'-β-D-ribofuranosid 300 mg
    6-Chlor-3-indolyl-β-D-glucopyranosid 200 mg
    Eisen(III)-ammoniumcitrat 500 mg
    Medium C (Komponenten pro Liter)
    Columbia-Agar (Oxoid) 40 mg
    5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-ribofuranosid (X-β-D-Ribofuranosid) 80 mg
    3,4-Cyclohexenoäsculetin-β-D-galactopyranosid 300 mg
    Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid 30 mg
    Eisen(III)-ammoniumcitrat 500 mg
    Medium D (Komponenten pro Liter)
    Columbia-Agar (Oxoid) 40 g
    5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-ribofuranosid (X-β-D-Ribofuranosid) 80 mg
    3',4'-Dihydroxy-3-methoxyflavon-4'-β-D-galactopyranosid 300 mg
    Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid 30 mg
    Eisen(III)-ammoniumcitrat 500 mg
    Medium E (Komponenten pro Liter)
    Columbia-Agar (Oxoid) 40 g
    5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-ribofuranosid (X-β-D-Ribofuranosid) 80 mg
    Medium F (Komponenten pro Liter)
    Columbia-Agar (Oxoid) 40 g
    3',4'-Dihydroxyflavon-4'-β-D-ribofuranosid 300 mg
    Eisen(III)-ammoniumcitrat 500 mg
  • Die in den Medien B, D und F verwendeten Flavon-Derivate wurden synthetisiert, wie es in der WO-A-03/035897 beschrieben ist.
  • Alle Komponenten wurden in 1 Liter deionisiertes Wasser gegeben und 10 Minuten bei 116°C autoklaviert. Kulturplatten wurden bei 50°C aus geschmolzenem Agar hergestellt und getrocknet. Verschiedene Kontrollstämme mit bekannten enzymatischen Eigenschaften wurden unter Verwendung eines Densitometers in einer Suspension von etwa 108 cfu/ml hergestellt. 10 μl dieser Suspension wurden auf jede der verschiedenen Arten von Medien geimpft und über Nacht bei 37°C inkubiert. Das Kulturaussehen der verschiedenen getesteten Stämme ist in Tabelle 1 gezeigt.
  • Figure 00210001
  • Die oben beschriebene Analyse zeigt, dass, als X-β-D-Ribofuranosid (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-ribofuranosid) mit rosarotem Glucosid (6-Chlor-3-indolyl-β-D-glucopyranosid) getestet wurde, Stämme, die sowohl β-D-Ribofuranosidase als auch β-Glucosidase erzeugten, eine Mischung von Farben aufgrund der Hydrolyse von beiden chromogenen Substraten erzeugten (siehe die Ergebnisse des Mediums A). Derartige Kolonien waren klar von jenen unterscheidbar, die nur eines oder keines der beiden Substrate hydrolysierten.
  • Diese Eigenschaft von X-β-D-Ribofuranosid wird von 3',4'-Dihydroxyflavon-4'-β-D-ribofuranosid nicht gezeigt, da das Eisen-Chelat von 3',4'-Dihydroxyflavon die Anwesenheit jeder β-Glucosidase-Aktivität maskiert (siehe die Ergebnisse des Mediums B). Genau wie diese Glucosidase-Reaktion maskiert werden kann, kann die Hydrolyse von X-β-D-Ribofuranosid selbst durch andere chelatisierende Chromogene maskiert werden. Zum Beispiel zeigen die Ergebnisse aus den Medien C und D, dass die Hydrolyse von X-β-D-Ribofuranosid maskiert werden kann, wenn entweder 3,4-Cyclohexenoäsculetin-β-D-galactopyranosid oder 3',4'-Dihydroxy-3-methoxyflavon-4'-β-D-galactopyranosid in dem Medium anwesend ist.
  • Die oben für X-β-D-Ribofuranosid demonstrierten Ergebnisse zeigen die drei Vorteile der vorliegenden Erfindung. Erstens weisen die Indoxyl-β-D-ribofuranoside dieser Erfindung die Fähigkeit auf, β-D-Ribofuranosidase-Aktivität mit hoher Empfindlichkeit und geringen Substratkonzentrationen nachzuweisen. Zweitens können die Indoxyl-β-D-ribofuranoside dieser Erfindung gleichzeitig mit anderen Indoxyl-Substraten verwendet werden, um ein Medium zu erzeugen, auf dem eine Mehrzahl von Farben erzeugt werden kann.
  • Drittens können die Indoxyl-β-D-ribofuranoside dieser Erfindung auch gleichzeitig mit Substraten auf der Basis von Chelatisierung verwendet werden, die einen Indikator erzeugen, der den farbigen Niederschlag maskieren kann, der nach der β-D-Ribofuranosidase-Aktivität aus den Indoxyl-Teilen erzeugt wird.

Claims (22)

  1. Indoxyl-β-D-ribofuranosid der Formel II
    Figure 00230001
    in der R1-4 unabhängig H, Halogenid, Nitro oder C1-6-Alkyl sind und R5 für H, C1-6-Alkyl oder Aralkyl steht, oder ein substituiertes Derivat des Indoxyl-β-D-ribofuranosids.
  2. Indoxyl-Verbindung nach Anspruch 1, in der der Indoxyl-Teil ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 5-Brom-4-chlor-3-indolyl, 5-Brom-6-chlor-3-indolyl, 5-Brom-3-indolyl, 6-Chlor-3-indolyl, 3-Indoxyl, 4-Chlor-3-indolyl, 6-Brom-3-indolyl, 6-Fluor-3-indolyl, 5,7-Dibrom-3-indolyl, 4,5-Dichlor-3-indolyl, 5-Nitro-3-indolyl, 1-Methyl-3-indolyl, 5-Brom-4-chlor-1-methyl-3-indolyl, 5-Brom-6-chlor-1-methyl-3-indolyl, 5-Brom-1-methyl-3-indolyl, 6-Chlor-1-methyl-3-indolyl, 4-Chlor-1-methyl-3-indolyl, 6-Brom-1-methyl-3-indolyl, 6-Fluor-1-methyl-3-indolyl, 5,7-Dibrom-1-methyl-3-indolyl, 5,6-Dibrom-3-indolyl, 5,6-Dibrom-1-methyl-3-indolyl und 5-Nitro-1-methyl-3-indolyl und 4,5-Dichlor-1-methyl-3-indolyl, bevorzugt 5-Brom-4-chlor-3-indolyl.
  3. Verfahren zur Herstellung eines Indoxyl-β-D-ribofuranosids gemäß irgendeinem vorangehenden Anspruch, umfassend: a) In-Kontakt-Bringen eines geschützten β-D-Ribofuranosyltrichloracetimidats mit einer Verbindung der Formel (III)
    Figure 00240001
    in der R1-4 unabhängig H, Nalogenid, Nitro oder C1-6-Alkyl sind und T5 Acyl oder Trialkylsilyl oder andere Schutzgruppen darstellt, in Anwesenheit eines Katalysators, um ein geschütztes Indoxyl-β-D-ribofuranosid zu bilden; und b) Entfernen der Schutzgruppen.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, in dem T5 eine Acetyl- oder eine Trimethylsilylgruppe ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, welches zusätzlich Zwischenschritte zwischen Schritt a) und Schritt b) umfasst, um T5 in R5 zu überführen.
  6. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 3 bis 5, in dem das geschützte β-D-Ribofuranosyltrichloracetimidat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2,3,5-Tri-O-acetyl-β-D-ribofuranosyltrichloracetimidat und 2,3,5-Tri-O-benzoyl-β-D-ribofuranosyltrichloracetimidat.
  7. Verfahren zum Nachweis von β-D-Ribofuranosidase-Aktivität in einer Probe, umfassend: a) In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Indoxyl-β-D-ribofuranosid gemäß Anspruch 1 oder 2; wobei das Indoxyl-β-D-ribofuranosid eine β-D-Ribofuranosyl-Einheit und eine Indoxyl-Einheit umfasst, wobei die β-D-Ribofuranosyl-Einheit durch β-D-Ribofuranosidase von der Indoxyl-Einheit abgespalten werden kann, was die Indoxyl-Einheit freisetzt, die eine gefärbte Verbindung bildet; und b) Schlussfolgern, ob β-D-Ribofuranosidase-Aktivität vorliegt, durch Nachweisen, ob eine gefärbte Verbindung aus der Indoxyl-Einheit gebildet wird.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, welches einen Vorläuferschritt des Züchtens der Probe in oder auf einem Medium umfasst.
  9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, in dem auch eine zweite Enzym-Aktivität in der Probe nachzuweisen ist, wobei in Schritt a) die Probe zusätzlich mit einem zweiten Enzym-Substrat in Kontakt gebracht wird, das eine durch ein Enzym abspaltbare Einheit, die nicht β-D-Ribofuranosyl ist, und eine Indikator-Einheit umfasst, die nicht mit derjenigen des Indoxyl-β-D-ribofuranosids identisch ist, wobei die durch ein Enzym abspaltbare Einheit durch die zweite Enzym-Aktivität abspaltbar ist, welche die Indikator-Einheit freisetzt, die eine zweite nachweisbare Verbindung bildet; und das Verfahren umfasst: c) Schlussfolgern, ob die zweite Enzym-Aktivität in der Probe anwesend ist, durch Nachweisen, ob eine zweite nachweisbare Verbindung aus der Indikator-Einheit des zweiten Enzym-Substrats gebildet wird.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, in dem die Indikator-Einheit des zweiten Enzym-Substrats eine chromogene Einheit ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 9, in dem die Indikator-Einheit des zweiten Enzym-Substrats eine fluorogene Einheit ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 9, in dem die durch ein Enzym abspaltbare Einheit des zweiten Enzym-Substrats eine Zucker-Einheit, ein Phosphat oder ein Ester, vorzugsweise ein Caprylat, ist.
  13. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 7 bis 12, in dem die Probe auf einem festen mikrobiellen Wachstumsmedium vorliegt und die gefärbte(n) Verbindung oder Verbindungen unlöslich sind.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, in dem das Indoxyl-β-D-ribofuranosid in dem festen Medium vorliegt.
  15. Verfahren nach Anspruch 10, in dem die in Schritt c) gebildete gefärbte Verbindung die in Schritt b) gebildete gefärbte Verbindung maskiert.
  16. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 7 bis 12 oder 15, in dem die Probe in einem flüssigen Medium vorliegt.
  17. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 7 bis 16, in dem die Probe bakteriellen Ursprungs ist.
  18. Testsatz, umfassend a) ein Indoxyl-β-D-ribofuranosid nach Anspruch 1 oder 2; und b) eine Komponente zur Verwendung bei der Erzeugung eines mikrobiellen Wachstumsmediums.
  19. Testsatz nach Anspruch 18, in dem die Komponente zur Verwendung bei der Erzeugung eines Mediums zur Erzeugung eines festen Mediums dient.
  20. Zusammensetzung, umfassend ein Indoxyl-β-D-ribofuranosid nach Anspruch 1 oder 2 und eine weitere Komponente.
  21. Zusammensetzung nach Anspruch 20, in der die andere Komponente eine Komponente eines festen mikrobiellen Mediums ist.
  22. Zusammensetzung nach Anspruch 20, in der die andere Komponente ein weiteres Enzym-Substrat ist.
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