DE69029276T2 - Verfahren zur diagnostizierung von menschlicher grippe und in position 4 modifizierte chromogene n-acetylneuraminsäure substrate zur verwendung in diesen verfahren - Google Patents

Verfahren zur diagnostizierung von menschlicher grippe und in position 4 modifizierte chromogene n-acetylneuraminsäure substrate zur verwendung in diesen verfahren

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Description

    Fachgebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft diagnostische Tests auf Grippeinfektionen beim Menschen. Genauer gesagt betrifft sie chromogene Substrate, die zur Diagnose der Grippe durch den Nachweis der enzymatischen Aktivität der Human-Influenza- Neuraminidase (NA) nützlich sind.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Alleine in den Vereinigten Staaten von Amerika ist der Grippevirus jährlich für durchschnittlich 30-50 Millionen Infektionen verantwortlich. In epidemiologischen Untersuchungen der Grippeepidemien wird das Auftreten der Infektion in der Allgemeinbevolkerung auf 25% und bei Schulkindern noch höher geschätzt. Die Forscher schätzen, daß nahezu die Hälfte der infizierten Personen aufgrund der Erkrankung einen Arzt aufsuchen. Im Jahr 1986 schätzte das Center for Disease Control (CDC), daß Grippeepidemien mit einem Überschuß an Todesfällen von 10.000 oder mehr in 18 der vorangegangenen 28 Jahre verbunden waren. Die Untersuchungen des CDC weisen darauf hin, daß Grippe die fünfthäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten ist. Für die fortgesetzten Epidemien verantwortlich sind antigene Variationen der Oberflächen-Glycoproteine von Influenza A und B.
  • Grippeviren weisen Oberflächen-Olycoproteine auf, die eine NA-Aktivität zeigen. Diese Glycoproteine sind Angehörige einer Familie der Neuraminidasen, die in Viren, Bakterien, Mycoplasmata und tierischen Geweben zu finden sind. Sie hydrolysieren Substrate, die alpha-ketosidisch verknüpfte N-Acetylneuraminsaure (Neu5Ac; früher als "NANA" bezeichnet) enthalten. Bei Viren macht NA gewöhnlich 5-10% des Virusproteins aus und ist als pilzförmige Zacke an der Hülle angesiedelt. Virus-NA setzt sich aus einer hydrophilen Fläche zusammen, welche die katalytische Stelle des Enzyms umfaßt, und einer hydrophoben Fläche, die in die Virushülle eingelagert ist und eine Haftung des Enzyms am Virus schafft.
  • Verschiedene Analysemethoden für die NA-Aktivität sind in der Literatur beschrieben. Santer, U.V., et al., Biochimica et Biophysica Acta 523:435-442 (1978) beschreibt eine kolorimetrischen Assay für NA unter Verwendung von 2-(3-Methoxyphenyl)-N-acetyl-alpha-D-Neuraminsäure als einem Substrat und 4-Aminoantipyrin in Gegenwart eines Oxidationsmittels zur Messung des enzymatisch freigesetzten Methoxyphenols. Myers, R.N., et al., Analytical Biochemistry 101:166-174 (1980), beschreibt die Verwendung des 4-Methylumbelliferyl-alpha-ketosids von Neu5Ac bei einer fluorimetrischen Assay für NA. Dieses chromogene Derivat von Neu5Ac wurde ebenfalls bei Untersuchungen der NA-Aktivität von Grippeviren verwendet von Yolken, R.H., et al., J. Infectious Diseases 142:516-523 (1980); Clinical Chemistry 27:1490-1498 (1981); und Reviews of Infectious Diseases 4:35-68 (1982); und von Kiyotani et al., Hiroshima J. Medical Sciences 33:287-292 (1984); Zbl Bakt Hyg A260-273-285 (1985); Microbiol. Immun. 31:1131-1135 (1987). Obschon diese früheren NA-Assays zur Verfügung stehen, diagnostizieren die Mediziner derzeit jedoch eine Grippe nach immer auf der Basis der Symptomatologie. Dies ist teilweise auf die Tatsache zurückzuführen, daß diese früheren Assays kompliziert waren und/oder eine Gerätschaft erforderten, wie sie in einer Klinikausstattung gewöhnlich nicht zu finden ist. Ein weiterer Mangel dieser früheren Assays ist, daß sie nicht zur Unterscheidung zwischen den Grippetypen in der Lage waren. Dieses Vermögen ist aber besonders wichtig, damit Arzte die geeignete Chemotherapie und/oder unterstützende Therapie zur Bekämpfung dieser Infektion verschreiben können.
  • In früheren Arbeiten wurde die Beziehung zwischen der chemischen Struktur von Neu5Ac und seiner biologischen Funktion als einem Substrat für nicht-grippale NA untersucht. Gross, H.J., et al., Biochemistry 27:4279 (1988), untersuchte Benzyl-alpha-glycoside von N-Acetyl-4-epi-D-Neuraminsäure als einem Substrat für drei verschiedene bakterielle NAs (C. perfringens, A. ureafaciens und V. cholera) und stellte signifikante Unterschiede bei der Reaktivität fest. Nach 22 Std. spaltete die C. perfringens-NA 100% des Substrats, wohingegen die A. ureafaciens- und V. cholera-NAs lediglich 50% bzw. 11% des Substrats spalteten. Kim et al., J. Am. Chem. Soc. 110:6481-6486 (1988) beschrieb die strukturellen Eigenschaften von durch Neu5Ac-Aldolase akzeptierten Substraten, ihre Verwendung bei der Synthese von Neu5Ac und ihre chemische Umwandlung zu den 2-Desoxy-Derivaten, und berichtete außerdem, daß die Untersuchungen zur Bestimmung der biologischen Aktivität der 2-Desoxy-Derivate im Fortschreiten seien. Brossmer et al., Helv. Chim. Acta 69:2127 (1986); Glycoconjugates 4:145 (1987) berichtete, daß das Methyl-alphaglycosid von 4-Desoxy-Neu5Ac ein gutes Substrat für Geflügelpestvirus-Neu5Ac, doch nicht für die drei obenerwähnten bakteriellen NAs darstellt. Außerdem berichtete Schauer, R., et al., Eur. J. Biochem. 106:531 (1980), daß 4-Methoxy-Neu5Ac ein ausgezeichnetes Substrat für Geflügelpestvirus-NA, doch nicht für V. cholera-NA darstellt. Das 4-Methylumbelliferyl-Derivat von 4-Desoxy-Neu5Ac ist ebenfalls in der Literatur beschrieben (Helv. Chim. Acta. 69:1927 (1986)). Zbiral et al., Monatsheft für Chemie 119: 127-141 (1988) beschrieb die Synthese von 7- und 8-Desoxy-Neu5Ac und 4,7-Didesoxy-Neu5Ac. Zbiral et al., Liebigs Ann Chem 119:127-141 (1989) beschrieb die Synthese der 4-Methylumbelliferyl-2-A-Glycoside von 7-epi-, 8-epi-, 7,8-bis-epi-, 8-Desoxy-, 9-Desoxy- und 4,7-Didesoxy-Neu5Ac und untersuchte das Verhalten dieser Verbindungen als Inhibitoren der Sialidase von V. cholera.
  • Der Anmelder ist sich keiner bisherigen Berichte über die Reaktivität der 4-modifizierten Neu5Acs mit Human-Influenza-NA bewußt.
    • Beschreibung der Erfindung
  • Eine Ausführungsform der Erfindung besteht in einem Verfahren zum Nachweis der Human-Influenza-Neuraminidase-Aktivität in einer klinischen Probe, bei der Verdacht auf eine solche Aktivität besteht, umfassend:
  • (a) das Inkubieren der Probe mit einem chromogenenm modifizierten N-Acetylneuraminsäure-Substrat der Formel:
  • worin Ac für Acetyl steht, R für Wasserstoff, Fluor oder Methoxy steht und X für eine chromogene Gruppe steht, die eine unterschiedliche Farbe zeigt, wenn sie vom Substrat oder einem Salz dieses Substrats abgespalten wird; und
  • (b) das Nachweisen der Neuraminidase-Aktivität durch Beobachten, ob das Probe-Substrat-Gemisch diese Farbe nach Schritt (a) zeigt.
  • Eine andere Ausführungsform der Erfindung besteht in einem Verfahren zum selektiven Nachweis eines spezifischen Typs (z.B. A oder B) der Human-Influenza-Neuraminidase-Aktivität in einer klinischen Probe, bei der Verdacht auf eine Human- Influenza-Neuraminidase-Aktivität besteht, gegenüber der Aktivität, die andere Typen der Human-Influenza-Neuraminidase zeigen, umfassend:
  • (a) das Inkubieren der Probe mit einem chromogenen, modifizierten N-Acetylneuraminsäure-Substrat der Formel:
  • worin Ac für Acetyl steht, R für Wasserstoff, Fluor oder Methoxy steht und X für eine chromogene Gruppe steht, die eine unterschiedliche Farbe zeigt, wenn sie vom Substrat oder einem Salz dieses Substrats abgespalten wird;
  • (b) das Beobachten der Farbe, die das Probe-Substrat-Gemisch nach Schritt (a) zeigt; und
  • (c) das Vergleichen dieser Farbe mit Farben, wie sie von Aktivitäts-Standardproben der Human-Influenza-Neuraminidase dieses spezifischen Typs und anderer Typen der Human- Influenza-Neuraminidase auf diesem Substrat gezeigt werden.
  • Ein weitere Ausführungsform der Erfindung besteht in einem chromogenen, modifizierten Neu5Ac-Substrat, das nützlich ist zum Nachweis der Human-Influenza-Neuraminidase-Aktivität in einer klinischen Probe, bei der Verdacht auf eine solche Aktivität besteht, wobei dieses Substrat die Formel aufweist:
  • worin Ac für Acetyl steht, R für Methoxy oder Fluor steht und X für eine chromogene Gruppe steht, die eine unterschiedliche Farbe zeigt, wenn sie vom Substrat und Salzen dieses Substrats abgespalten wird.
  • Noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht in einem chromogenen Substrat, das nützlich ist zum Nachweis der Human-Influenza-Neuraminidase-Aktivität in einer klinischen Probe, bei der Verdacht auf eine solche Aktivität besteht, wobei dieses Substrat die Formel aufweist:
  • worin Ac für Acetyl steht, R Wasserstoff ist und X eine chromogene Gruppe ist, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus 3-Cyanoumbelliferyl, 2- oder 4-Nitrophenyl, 3-Resorufin, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl, 4-Nitrophenylazophenyl, 4-Nitrophenylazoresorcinyl, 3-Methoxyphenyl, 3-Dimethylaminophenyl, 4-Chlor-1-naphthyl und 6-Brom-2-naphthyl und Salzen dieses Substrats.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • In den Zeichnungen ist:
  • Abbildung 1 ein schematisches Diagramm zur Veranschaulichung des in Beispiel 1 beschriebenen Syntheseverfahrens.
  • Abbildung 2 ein schematisches Diagramm zur Veranschaulichung des in Beispiel 2 beschriebenen Syntheseverfahrens.
  • Abbildung 3 ein schematisches Diagramm zur Veranschaulichung des in Beispiel 3 beschriebenen Syntheseverfahrens.
  • Abbildung 4 ein schematisches Diagramm zur Veranschaulichung des in Beispiel 14 beschriebenen Syntheseverfahrens.
  • Abbildung 5 ein schematisches Diagramm zur Veranschaulichung des in Beispiel 5 beschriebenen Syntheseverfahrens.
  • Abbildung 6 ein schematisches Diagramm zur Veranschaulichung des in Beispiel 6 beschriebenen Syntheseverfahrens.
    • Durchführungsweise der Erfindung
  • Die chromogenen, modifizierten N-Acetylneuraminsäure-Substrate der Erfindung und die Verfahren unter Verwendung dieser Substrate sind zum Nachweis der Human-Influenza-Neuraminidase- Aktivität in klinischen Proben oder Präparaten und zur Bestimmung des Typs der in der Probe vorhandenen Human- Influenza-Neuraminidase nützlich. Demgemäß sind diese Substrate und Verfahren zur generellen Diagnose einer Grippeinfektion als auch des Typs der bei dem menschlichen Patient, von dem die Probe stammt, vorliegenden Grippeinfektion nützlich. In diesem Zusammenhang soll der Begriff "Grippe" eine Influenza des Typs A bzw. B und Parainfluenza des Typs 1, 2 bzw. 3 umfassen. Der Begriff "selektiv nachweisen" zielt auf die Nachweisbarkeit der NA-Aktivität eines Typs des Influenzavirus gegenüber der Aktivität anderer Typen des Influenzavirus.
  • Bei den bei der Erfindung zu untersuchenden klinischen Proben handelt es sich gewöhnlich um pharyngeale, nasopharyngeale oder respiratorische Sekretionen, die von einem an Grippe erkrankten Patienten als Spülungs-, Abstrich- oder Auswurfproben erhalten werden. Die Spülungs-, Abstrich- oder Auswurfprobe wird vor dem Mischen mit dem Substrat vorzugsweise mit einer wässrigen Pufferlösung kombiniert, die einen Stabilisator enthält. Die Pufferlösung enthält einen Puffer, der den pH-Wert bei etwa 4 bis 7, vorzugsweise 5,5 bis 6,5, hält, wahlweise etwa 0,1 bis 10 Gew.-% nichtionisches Detergens, eine kleine Menge (1-20 mM) Erdalkalimetall-Kation (Ca, Mg, vorzugsweise Ca) und eine ausreichende Menge eines Stabilisators, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alditolen, einfachen Zuckern und Disaccharid-Zuckern, um die Wärmestabilität des NA in der Probe zu erhöhen. Das Volumen der mit der Probe kombinierten Pufferlösung beträgt normalerweise 0,1 bis 2 ml.
  • Der Puffer kann organisch oder anorganisch sein. Beispiele geeigneter Puffer sind herkömmliche Puffer aus organischen Säuren und deren Salzen, wie etwa Beispiel Citratpuffer (z.B. Mononatriumcitrat-Dinatriumcitrat-Gemisch, Zitronensäure- Trinatriumcitrat-Gemisch, Zitronensäure-Mononatriumcitrat- Gemisch etc.), Acetatpuffer (z.B. Essigsäure-Natriumacetat- Gemisch), Succinatpuffer (z.B. Bernsteinsäure- Mononatriumsuccinat-Gemisch, Bernsteinsäure-Natriumhydroxid- Gemisch, Bernsteinsäure-Dinatriumsuccinat-Gemisch etc.), Tartratpuffer (z.B. Weinsäure-Tartrat-Gemisch, Weinsäure- Kaliumtartrat-Gemisch, Weinsäure-Natriumhydroxid-Gemisch etc.), Fumaratpuffer (z.B. Fumarsäure-Mononatriumfumarat- Gemisch, Fumarsäure-Dinatriumfumarat-Gemisch, Mononatri umfumaratsäure-Dinatriumfumarat-Gemisch), Gluconatpuffer (z.B. Gluconsäure-Natriumgluconat-Gemisch, Gluconsäure-Natriumhydroxid-Gemisch, Gluconsäure- Kaliumgluconat-Gemisch etc.) Oxalatpuffer (z.B. Oxalsäure- Natriumoxalat-Gemisch, Oxalsäure-Natriumhydroxid-Gemisch, Oxalsäure-Kaliumoxalat-Gernisch etc.), Lactatpuffer (z.B. Milchsäure-Natriumlactat-Gemisch, Milchsäure-Natriumlactat- Gemisch, Milchsäure-Natriumhydroxid-Gemisch, Milchsäure- Kaliumlactat-Gemisch etc.), Acetatpuffer (z.B. Essigsäure- Natriumacetat-Gemisch, Essigsäure-Natriumhydroxid-Gemisch etc.), Malatpuffer (z.B. D,L-Äpfelsäure-Dinatriummalat- Gemisch), Phosphatpuffer (z.B. Mononatriumphosphat- Dinatriumphosphat-Gemisch, Mononatriumphosphat- Natriumhydroxid-Gemisch, Trinatriumphosphat-Salzsäure-Gemisch etc.), 2-(N-morpholin)ethansulfonsäure, [Bis-(2-hydroxyethyl)- imino]tris(hydroxymethyl)methan, N-2-Acetamidoiminodiessigsäure, 1,3-Bis[tris(hydroxymethyl)methylamino]- propan, Piperazin-N,NA-bis(2-ethansulfonsaure), N-2-Acetamido-2-aminoethansulfonsäure, 3-(N-Morpholin)-2-hydroxypropansulfonsäure, N-N-Bis-(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure, 3-(N-morpholin)propansulfonsäure, 2-[Tris(hydroxymethyl)- methylamino]ethansulfonsäure, N-2-Hydroxyethylpiperazin-NA-2- ethansulfonsäure, 3-{[Tris(hydroxymethyl)methyl]amino}-2- hydroxypropansulfonsaure.
  • Beispiele für die nichtionischen Detergentia, die in der Pufferlösung nützlich sind, umfassen die Pluronics, zum Beispiel Polysorbat 20 oder Polysorbat 80, Triton X-100, NP-40 und Alkylglucoside, wie zum Beispiel C&sub8;-C&sub9;- Alkylglucosid. Das Detergens ist ein wahlweiser Bestandteil und erleichtert die Freisetzung der NA aus der Virushülle. "Triton" ist ein Warenzeichen.
  • Beispiele für die Stabilisatoren, die in der Pufferlösung verwendet werden, sind trihydrische oder höhere Alditole, zum Beispiel Glycerin, Erythritol, Arabitol, Xylitol, Sorbitol, Mannitol, die einfachen Zucker Glucose und Fructose und das Disaccharid Sucrose. Diese polyhydrischen Zuckeralkohole und die einfachen und Disaccharid-Zucker können einzeln oder kombiniert verwendet werden. Um die Aktivität der Neuraminidase-enthaltenden Viren zu stabilisieren, werden die Alditole oder einfachen Zucker und Disaccharide der Flüssigzubereitung/Trägersystem in einer Menge von 0,2 M bis 2,1 M, und bevorzugt von 0,6 M bis 2,0 M, zugegeben.
  • Ist die Probe mit der Pufferlösung vermischt, so kann sie über längere Zeiträume bei vorzugsweise 2ºC bis 8ºC ohne wesentlichen Verlust an NA-Aktivität gelagert werden.
  • Bei dem Substrat, das mit der gepufferten, stabilisierten Probe kombiniert wird, handelt es sich um ein chromogenes Neu5Ac-Derivat, das in der 4-Position modifiziert ist, indem die Hydroxylgruppe an dieser Position entfernt und die Hydroxylgruppe durch Fluor oder der Wasserstoff der Hydroxylgruppe durch eine niedere Alkylgruppe ersetzt wird. Diese Substrate können durch die folgende chemische Formel dargestellt werden:
  • worin R, X und Ac wie zuvor definiert sind. X steht vorzugsweise für 4-Methylumbelliferyl, 3-Cyanoumbelliferyl, 2-Nitrophenyl, 4-Nitrophenyl, 3-Resorufin, 5-Brom-4-chlor-3- indolyl, Nitrophenylazophenyl, Nitrophenylazoresorcinyl, 3-Methoxyphenyl, 3-Dimethylaminophenyl, 4-Chlor-1-naphthyl oder 6-Brom-2-naphthyl. Einfache Salze dieser Substrate, zum Beispiel die Na-, K- und NH&sub4;+-Salze, können ebenfalls verwendet werden.
  • Wie hierin verwendet, soll der Begriff "chromogen" ohne Einschränkung Moleküle umfassen, die Fluoreszenz zeigen. Der Begriff "Farbe" soll ebenfalls ohne Einschränkung Fluoreszenz umfassen.
  • Beispiele für 4-modifizierte, chromogene Neu5Ac-Derivate, die in den Bereich der obigen Formel fallen, sind 4-Methylumbelliferyl-4-desoxy-N-acetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 3-Cyanoumbelliferyl-4-desoxy-N-acetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 2-Nitrophenyl-4-desoxy-N-acetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 4-Nitrophenyl-4-desoxy-N-acetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 3-Resorufin-4-desoxy-N-acetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-4-desoxy-N-acetylneuraminsäure-alphaketosid, 2-[4-(4-Nitrophenylazo)phenyl]-4-desoxy-N- acetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 2-[4-(4-Nitrophenylazo)- resorcinyl 1 -4-desoxy-N-acetylneuraminsäure-alpha-ketosid, A-Methoxyphenyl-4-desoxy-N-acetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 3-Dimethylaminophenyl-4-desoxy-N-acetylneuraminsäure-alpha- ketosid, 4-Chlor-1-naphthyl-4-desoxy-N-acetylneuraminsäurealpha-ketosid, 6-Brom-2-naphthyl-4-desoxy-N-acetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 4-Methylumbelliferyl-4-methoxy-N- acetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 2-Nitrophenyl-4-methoxy-N- acetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 4-Nitrophenyl-4-methoxy-N- acetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 3-Cyanoumbelliferyl-4- methoxy-N-acetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 3-Resorufin-4- methoxy-N-acetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 5-Brom-4-chlor-3- indolyl-4-methoxy-N-acetylneuraminsäure-alphaAketosid, 2-[4- (4-Nitrophenylazo)phenyl]-4-methoxy-N-acetylneuraminsäure alpha-ketosid, 2-[4-(4-Nitrophenylazo)resorcinyl]-4-methoxy-N- acetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 3-Methoxyphenyl-4-methoxy- N-acetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 3-Dimethylaminophenyl-4- methoxy-N-acetylneuraminsäure-alphaAketosid, 6-Brom-2- naphthyl-4-methoxy-N-acetylneuraminsäureAalphaAketosid, 4-Chlor-1-naphthyl-4-methoxy-N-acetylneuraminsäure-alphaketosid, 4-Methylumbelliferyl-4-fluor-N-acetylneuraminsäure- alpha-ketosid, 2-Nitrophenyl-4-fluor-N-acetylneuraminsäure- alpha-ketosido 4-Nitrophenyl-4-fluor-N-acetylneuraminsäure- alpha-ketosid, 3-Cyanoumbelliferyl-4-fluor-N-acetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 3-Resorufin-4-fluor-N-acetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-4-fluor-N- acetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 2-[14-(4-Nitrophenylazo)- phenyl]-4-fluor-acetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 2-[4-(4- Nitrophenylazo)resorcinyl]-4-fluor-N-acetylneuraminsäure- alpha-ketosid, 3AMethoxyphenyl-4-fluor-N-acetylneuraminsäurealpha-ketosid, 3ADimethylaminophenyl-4-fluor-N-acetylneuraminsäure-alpha-ketosid, 14-Chlor-1-naphthyl-4-fluor-N-acetylneuraminsäure-alpha-ketosid und 6-Brom-2-naphthyl-4-fluor-N- acetylneuraminsäure-alpha-ketosid.
  • Die oben beschriebenen Neu5Ac-Derivate werden allgemein durch Schützen der funktionellen Gruppen des Neu5Ac an den 1-, 2-, 7-, 8- und 9-Positionen, Modifizieren der 4-Position wie angegeben, Entfernen des Schutzes an den 1-, 2-, 7-, 8- und 9- Positionen und Kuppeln des 4-modifizierten Neu5Ac mit dem Chromogen hergestellt. Einzelheiten zu diesen Reaktionen sind in den untenstehenden Beispielen wiedergegeben.
  • Das Substrat wird der gepufferten, stabilisierten Probe normalerweise in Mengen im Bereich von 0,05 mM bis 0,5 mM zugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur bis physiologischer Temperatur (d.h0 etwa 22ºC bis 37ºC) über einen ausreichend langen Zeitraum hinweg inkubiert, um eine Reaktion jeglicher in der Probe vorhandener NA mit dem Substrat zu ermöglichen. Dieser Zeitraum liegt normalerweise im Bereich von 20 bis 120 Minuten, noch üblicher 30 bis 60 Minuten Zeigt die Probe eine NA-Aktivität, so wird die chromogene Gruppe vom Substrat abgespalten, woraufhin das freigesetzte Chromogen dem Gemisch eine charakteristische Farbe verleiht. Da die Substrate der Erfindung eine unterschiedliche Reaktivität auf die verschiedenen Human- Influenza-NAs zeigen kann, läßt sich der spezifische Typ von Influenzainfektion durch Vergleich der Farbe des Probengemischs mit der Farbe von Standardproben der Reaktionsgemische für jeden Typ von Influenza-NA vergleichen.
  • So kann beispielsweise Influenza A von Influenza B auf der Grundlage der Substrat-Reaktivität mit den NAs dieser Influenzaviren unterschieden werden. In der folgenden Tabelle sind die Farben angegeben, die bei Reaktion der NA mit einem modifizierten Neu5Ac und Freisetzung des Chromogens erzeugt werden.
  • Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung eine einfache und schnelle Methode für die selektive Diagnose einer Grippe bereit, die in der Klinik oder ärztlichen Praxis durchgeführt werden kann und es dem Arzt ermöglicht, die geeignete Therapie zur Behandlung der Infektion und/oder die geeignete prophylaktische Behandlung an Personen im engen Kontakt mit dem infizierten Patienten zu verschreiben.
  • Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, wobei die Erfindung durch diese Beispiele in keinster Weise eingeschränkt werden soll.
    • Beispiele 1. Synthese von 14-Desoxy-Neu5Ac
  • Das Reaktionsschema für diese Synthese ist in Abbildung 1 gezeigt.
  • Neu5Ac (500 mg) in 100 ml Methanol und 1,25 g Dowex -50W (H&spplus;) werden unter Rücklauf 20 Std. lang erhitzt und mit Entfärbungskohle behandelt, um das Methylestermethylketosid von Neu5Ac (Neu5Ac-MEMK) zu liefern. "Dowex" ist ein Warenzeichen. Dem Ketosid in Trockenaceton (über Molekularsieben getrocknet) wird katalytisches p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat zugegeben und die Reaktion 4 Std. lang bei Raumtemperatur (RT) gerührt. Die Neutralisation mit Dowex -1 (Acetatform) und die Lösungsmittelverdampfung ergeben 8,9-Isopropyliden-Neu5Ac- methylestermethylketosid. Das 14-Mesylat-8,9-isopropyliden- Neu5Ac-methylestermethylketosid wird durch Behandlung mit Methansulfonylchlorid in Methylenchlorid und 1,5 Aquivalenten Triethylamin bei 0ºC über 30 Min. hinweg erhalten. Das Mesylat wird dann mit Natriumiodid in Aceton oder Methylethylketon behandelt und auf ca. 100ºC in einer verschlossenen Reaktionsphiole erhitzt, um die 4-Iod-Verbindung herzustellen. Die anschließende Hydrierung über Palladium auf Kohlenstoff liefert das 4-Desoxy-Molekül. Die Schutzentfernung wird durch Behandlung zunächst mit Natriumhydroxid und dann mit verdünntem HCL/Dowex 50W (H&spplus;) erreicht, wodurch 4-Desoxy-N- acetylneuraminsäure erhalten wird.
    • 2. Synthese von 2-(p-Nitrophenyl)-4-desoxy-Neu5Ac
  • Das Reaktionsschema für diese Synthese ist in Abbildung 2 gezeigt.
  • Das 4-Desoxy-Neu5Ac aus Beispiel 1 wird zum entsprechenden Methylester durch Rühren bei Raumtemperatur (RT) mit Trifluoressigsäure in Methanol umgewandelt. Das Methylester wird dann mit einer Überschußmenge an Acetylchlorid über Nacht behandelt, um das vollständig acetylierte 2-Chlor-4-desoxy- Neu5Ac-methylester zu erhalten. Diese Zwischenform wird dann mit dem Natriumsalz des para-Nitrophenol in Dimethylformamid (DMF) bei RT 2 Std. lang behandelt. Das gekuppelte chromogene 4-Desoxy-Neu5Ac wird dann durch Behandlung mit Natriummethoxid in Methanol (1 Std.), gefolgt durch Behandlung mit Natriumhydroxid (2 Std.), entschützt, um das Natriumsalz der 2-(p-Nitrophenyl)-4-desoxy-N-acetylneuraminsäure herzustellen.
    • 3. Synthese von 4-Methoxy-Neu5Ac
  • Das Reaktionsschema für diese Synthese ist in Abbildung 3 gezeigt.
  • Neu5Ac-MEMK wird mit 1 AAq. tert-Butyldimethylsilyl-(TBDMS)- Chlorid, Imidazol und einer katalytischen Menge an 4-Dimethylaminopyridin bei 65ºC behandelt, um 9-O-TBDMS-Neu5Ac-MEMK zu erhalten. Die Behandlung dieser Verbindung mit Aceton und einer katalytischen Menge an p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat bei RT ergibt 9-O-TBDMS-7,8-isopropyliden-Neu5Ac-MEMK. Die Behandlung mit Diazomethan/Trifluorborat in Ether bei 0ºC ergibt das entsprechende 4-Methoxy-Derivat. Diese Verbindung wird durch Behandlung mit Natriumhydroxid, gefolgt von Tetrabutylammoniumfluorid in THF, und schließlich durch Behandlung mit verdünntem HCl/Dowex 50W (H&spplus;) vollständig entschützt, um 4-Methoxy-N-acetylneuraminsäure zu erhalten.
    • Synthese von 2-(p-Nitrophenyl)-4-methoxy-Neu5Ac
  • Das Reaktionsschema für diese Synthese ist in Abbildung 4 gezeigt.
  • Das 9-TBDMS-7,8-Isopropyliden-geschützte 4-Methoxy-Neu5Ac-MEMK wird mit Toluolsulfonsäure, gefolgt durch Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran, entschützt. Diese Zwischenform wird dann mit einer Überschußmenge Acetylchlorid über Nacht behandelt, wodurch das vollständig acetylierte 2-Chlor-4- methoxy-Neu5Ac-methylester erhalten wird. Die Kupplung mit dem Natriumsalz des Nitrophenol-Chromogens wird in Trocken-DMF bei RT über 2 Std. hinweg vorgenommen. Schutzentfernung und Deprotonisierung werden durch Behandlung mit Natriummethoxid in Methanol, gefolgt durch Behandlung mit Natriumhydroxid, bewirkt, wodurch 2-(p-Nitrophenyl)-14-methoxy-N-acetylneuraminsäure, Natriumsalz, erhalten wird.
    • 5. Synthese von 4-Fluor-Neu5Ac
  • Das Reaktionsschema für diese Synthese ist in Abbildung 5 gezeigt.
  • Neu5Ac (500 mg) in 100 ml Methanol und 1,25 g Dowex -50W (H&spplus;) werden unter Rücklauf 20 Std. lang erhitzt und mit Entfärbungskohle behandelt, um das Methylestermethylketosid von Neu5Ac (Neu5Ac-MEMK) zu liefern. Dem Ketosid in Trockenaceton (über Molekularsieben getrocknet) wird katalytisches p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat zugegeben und die Reaktion 4 Stdo lang bei Raumtemperatur (RT) gerührt. Die Neutralisation mit Dowex -1 (Acetatform) und die Lösungsmittelverdampfung ergeben 8,9-Isopropyliden-Neu5Ac- methylestermethylketosid. Diese Verbindung wird dann selektiv zum 4-Keto-Derivat mit entweder Pyridiniumdichromat (PDC) oder Rutheniumtetraoxid mit 4-Angstrom-Molekularsieben in Tetrahydrofuran oxidiert. Eine milde Reduktion mit Boran- Ammoniak in Tetrahydrofuran liefert den invertierten 4-Alkohol, der dann zum 4-Fluorid (bei Umkehrung der Konfiguration) mit Diethylaminoschwefeltrifluorid (DAST) umgewandelt werden kann. Die Schutzentfernung wird durch Behandlung zunächst mit Natriumhydroxid und dann mit verdünntem HCL/Dowex -50W (H&spplus;) erreicht, wodurch 4-Fluor-N- acetylneuraminsäure erhalten wird.
    • 6. Synthese von 2-(4-Chlor-1-naphthyl)-4-fluor-Neu5Ac
  • Das Reaktionsschema für diese Synthese ist in Abbildung 6 gezeigt.
  • Das 4-Fluor-Neu5Ac aus Beispiel 5 wird zu seinem Methylester durch Behandlung in Methanol mit Trifluoressigsäure umgewandelt. Die Reaktion in einer Überschußmenge Acetylchlorid acetyliert die freien Alkoholgruppen und bewirkt gleichzeitig die Umwandlung zum Glycosylchlorid. Das Natriumsalz des 4-Chlor-1-naphthol (4-CN) wurde mit 1 Äquivalent NaOH in Wasser hergestellt. Die Reaktion des Glycosylchlorids in Chloroform mit dieser wässrigen 4-CN- Lösung (2,5 Äquivalente) in Gegenwart von Benzyltriethylammoniumchlorid (Phasentransfer-Reagens) liefert die gekuppelte chromogene Verbindung. Die Schutzentfernung bei den Acetaten und der Methylestergruppe wird durch Behandlung mit Natriummethoxid und Natriumhydroxid erreicht, was das Natriumsalz von 2-(4-chlor-1-naphthyl)-4-fluor-Neu5Ac ergibt.
    • 7. Enzymatische Untersuchung von 4-Desoxy-Neu5Ac
  • 50 µl einer Influenzavirus-Lösung wurden mit einem Reaktionsgemisch gemischt, das 50 µl des Substrats 4-Methylumbelliferyl-Neu5Ac in verschiedenen Konzentrationen im submillimolaren bis millimolaren Bereich, 150 µl des Inhibitors 4-Desoxy-Neu5Ac in verschiedenen Konzentrationen im submillimolaren bis millimolaren Bereich und 50 µl an 100 mM CaCl&sub2; enthielt. Alle Lösungen wurden in 50 mM Natriumacetatpuffer, pH 5,9, zu einem Endvolumen von 500 µl hergestellt. Nach der Inkubation bei 37ºC über 15 bis 30 Minuten hinweg (abhängig vom Virusstamm) wurde die Reaktion durch Zugabe von 500 µl an 1 M Tris, pH 9,0, mit 1,33% Ethanol abgebrochen. Die Fluoreszenz-Intensität wurde bei einer Anregungswellenlänge von 360 nm und einer Emissions- Wellenlänge von 450 nm mit einem Fluoreszenz-Spektrophotometer (Hitachi Modell 3010) gemessen. 4-Methylumbelliferon in 1 M Tris, pH 9,0, mit 1,33% Ethanol diente als Referenzsubstanz. Die Enzym-Aktivität wurde als mM von Neu5Ac, freigesetzt pro Minute pro 50 µl Virus ausgedrückt. Ein Diagramm von 1/v vs. 1/[S] für verschiedene Konzentrationen des Substrats und Inhibitors ergab eine typische kompetitive Inhibition. Der Auftrag der Steigungen aus dem 1/v vs. 1/[S]-Diagramm versus der Inhibitor-Konzentration ermöglichte die Errechnung des Ki für 4-Desoxy-Neu5Ac wie folgt:
  • (Das native Substrat Neu5Ac wies einen Ki =0,626 mM auf, wenn der Influenza-A-(H1N1)-Virus verwendet wurde.)
  • Der Ki für 4-Desoxy-Neu5Ac gibt sowohl an, wie die Verbindung mit dem Enzym wechselwirkt, als auch bei welcher Rate es wechselwirkt. Allgemein ist der Grad der Inhibition bei jeglichem gegebenen Substrat und Inhibitor-Konzentration umso größer, je niedriger der Ki ist. Auch eine modifizierte Verbindung ist erwünscht, die mit einem Enzym in ähnlicher Weise wie die native Verbindung ohne Beeinträchtigung ihrer Verwendbarkeit als Substrat wechselwirken kann. Der Ki gibt einen ersten Hinweis auf die Wechselwirkung der Verbindung mit dem Enzym.
  • Abwandlungen der oben beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung, die den Fachleuten im Bereich der organischen Chemie, Virologie, Biochemie, medizinischen Diagnostik und verwandten Gebieten ersichtlich sein werden, sollen in den Rahmen der folgenden Ansprüche fallen.

Claims (15)

1. Verfahren zum Nachweis der humanen Influenza-Neuraminidase- Aktivität in einer klinischen Probe, bei der Verdacht auf eine solche Aktivität besteht, umfassend:
(a) das Inkubieren der Probe mit einem chromogen modifizierten N-Acetylneuraminsäure-Substrat der Formel:
worin Ac fur Acetyl steht, R fur Wasserstoff, Fluor oder Methoxy steht und X fur eine chromogene Gruppe steht die eine unterschiedliche Farbe zeigt, wenn sie vom Substrat oder einem Salz dieses Substrats abgespalten wird; und
(b) das Nachweisen der Neuraminidase-Aktivität durch Beobachten, ob das Probe-Substrat-Gemisch diese Farbe nach Schritt (a) zeigt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die klinische Probe eine pharyngeale, nasopharyngeale oder respiratorische Sekretion ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, Aorin R für Wasserstoff steht und X gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 14-Methylumbelliferyl, 3-Cyanoumbelliferyl, 2-Nitrophenyl, 14-Nitrophenyl, A-Resorufin, 5-Brom-14-chlor-3-indolyl, 14-Nitrophenylazophenyl, 14-Nitrophenylazoresorcinyl, 3-Methoxyphenyl, 3-Dimethylaminophenyl, 4-Chlor-1-naphthyl und 6-Brom-2-naphthyl.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin R für Fluor steht und X gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 4-Methylumbelliferyl, 3-Cyanoumbelliferyl, 2-Nitrophenyl, 4-Nitrophenyl, 3-Resorufin, 5-Brom-14-chlor-3-indolyl, 14-Nitrophenylazophenyl, 14-Nitrophenylazoresorcinyl, 3-Methoxyphenyl, 3-Dimethylaminophenyl, 4-Chlor-1-naphthyl und 6-Brom-2-naphthyl.
50 Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin R für Methoxy steht und X gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 4-Methylumbelliferyl, 3-Cyanoumbelliferyl, 2-Nitrophenyl, 4-Nitrophenyl, 3-Resorufin, 5-Brom-14-chlor-3-indolyl, 14-Nitrophenylazophenyll 4-Nitrophenylazoresorcinyl, 3-Methoxyphenyl, 3-Dimethylaminophenyl, 4-Chlor-1-naphthyl und 6-Brom-2-naphthyl.
6. Verfahren zum selektiven Nachweis einer spezifischen Art der humanen Influenza-Neuraminidase-Aktivität in einer klinischen Probe, bei der Verdacht auf eine humane Influenza- NeurAmiflidA3iA-Aktivität besteht, umfassend:
(a) das Inkubieren der Probe mit einem chromogen modifizierten N-Acetylneuraminsäure-Substrat der Formel: worin Ac für Acetyl steht, R für Wasserstoff, Fluor oder Methoxy steht und X für eine chromogene Gruppe steht, die eine unterschiedliche Farbe zeigt, wenn sie vom Substrat oder einem Salz dieses Substrats abgespalten wird; und
(b) das Beobachten der Farbe, die das Probe-Substrat-Gemisch nach Schritt (a) zeigt; und
(c) das Vergleichen dieser Farbe mit Farben, wie sie von Aktivitäts-Standardwerten der humanen Influenza-Neuraminidase dieser spezifischen Art und anderer Arten der humanen Influenza-Neuraminidase auf diesem Substrat gezeigt werden.
7. Verfahren nach Anspruch 6, worin die spezifische Art der humanen Influenza-Neuraminidase-Aktivität eine humane Influenza-A-Neuraminidase-Aktivität, eine humane Influenza-B- Neuraminidase-Aktivität oder eine Parainfluenza-Neuraminidase- Aktivität ist.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, worin die klinische Probe eine pharyngeale, nasopharyngeale oder respiratorische Sekretion ist.
9. Verfahren nach Anspruch 6, 7 oder 8, worin R für Wasserstoff steht und X gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 4-Methylumbelliferyl A-Cyanoumbelliferyl, 2-Nitrophenyl, 4-Nitrophenyl, A-Resorufin, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl, 4-Nitrophenylazophenyl, 14-Nitrophenylazoresorcinyl, 3-Methoxyphenyl, 3-Dimethylaminophenyl, 14-Chlor-1-naphthyl und 6-Brom-2-naphthyl.
10. Verfahren nach Anspruch 6, 7 oder 8, worin R für Fluor steht und X gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 4-Methylumbelliferyl, 3-Cyanoumbelliferylg 2-Nitrophenyl, 4-Nitrophenyl, 3-Resorufin, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl, 4-Nitrophenylazophenyl, 14-Nitrophenylazoresorcinyl, 3-Methoxyphenyl, 3-Dimethylaminophenyl, 4-Chlor-1-naphthyl und 6-Brom-2-naphthyl.
11. Verfahren nach Anspruch 6, 7 oder 8, worin R für Methoxy steht und X gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 4-Methylumbelliferyl, 3-Cyanoumbelliferyl, 2-Nitrophenyl, 4-Nitrophenyl, 3-Resorufin, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl, 4-Nitrophenylazophenyl, 14-Nitrophenylazoresorcinyl, 3-Methoxyphenyl, 3-Dimethylaminophenyl, 4-Chlor-1-naphthyl und 6-Brom-2-naphthyl.
12. Chromogenes Substrat, das nützlich ist zum Nachweis der humanen Influenza-Neuraminidase-Aktivität in einer klinischen Probe, bei der Verdacht auf eine solche Aktivität besteht, wobei dieses Substrat die Formel aufweist:
worin Ac für Acetyl steht, R für Methoxy oder Fluor steht und X eine chromogene Gruppe ist, die eine unterschiedliche Farbe zeigt, wenn sie vom Substrat und Salzen dieses Substrats abgespalten wird.
13. Chromogenes Substrat nach Anspruch 12, worin R für Methoxy steht und die chromogene Gruppe gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 14-Methylumbelliferyl, 3-Cyanoumbelliferyl, 2- oder 4-Nitrophenyl, 3-Resorufin, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl, 4-Nitrophenylazophenyl, 4-Nitrophenylazoresorcinyl, 3-Methoxyphenyl, 3-Dimethylaminophenyl, 4-Chlor-1-naphthyl und 6-Brom-2-naphthyl.
14. Chromogenes Substrat nach Anspruch 12, worin R für Fluor steht und die chromogene Gruppe gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 4-Methylumbelliferyl, 3-Cyanoumbelliferyl, 2- oder 4-Nitrophenyl, A-Resorufin, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl, 4-Nitrophenylazophenyl, 4-Nitrophenylazoresorcinyl, 3-Methoxyphenyl, 3-Dimethylaminophenyl, 4-Chlor-1-naphthyl und 6-Brom-2-naphthyl.
15. Chromogenes Substrat, das nützlich ist zum Nachweis der humanen Influenza-Neuraminidase-Aktivität in einer klinischen Probe, bei der Verdacht auf eine solche Aktivität besteht, wobei dieses Substrat die Formel aufweist:
worin Ac für Acetyl steht, R Wasserstoff ist und X eine chromogene Gruppe ist, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus 3-Cyanoumbelliferyl, 2- oder 4-Nitrophenyl, 3-Resorufin, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl, 4-Nitrophenylazophenyl, 4-Nitrophenylazoresorcinyl, 3-Methoxyphenyl, 3-Dimethylaminophenyl, 4-Chlor-1-naphthyl und 6-Brom-2- naphthyl und Salzen dieses Substrats.
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