JP3134999B2 - ヒトのインフルエンザを診断する方法ならびにそれに使われる４位修飾の発色性ｎ―アセチルノイラミン酸基質 - Google Patents
ヒトのインフルエンザを診断する方法ならびにそれに使われる４位修飾の発色性ｎ―アセチルノイラミン酸基質Info
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、ヒトのインフルエンザに対する診断テスト
に関する。さらに詳細には、本発明は、ヒトのインフル
エンザのノイラミニダーゼ（NA）酵素活性の検出による
インフルエンザの診断に有用な、発色性（chromogeni
c）の基質に関する。
に関する。さらに詳細には、本発明は、ヒトのインフル
エンザのノイラミニダーゼ（NA）酵素活性の検出による
インフルエンザの診断に有用な、発色性（chromogeni
c）の基質に関する。
発明の背景 インフルエンザウイルスは、平均すると米国内だけで
も年間30−50百万人に感染する。インフルエンザ流行の
疫学的研究は、全人口では25％および学齢期の子供では
もっと高率になる感染の発生を推定している。研究者ら
は、感染した人の半数までが、身体の具合いが悪いため
に医師を訪ねていると推定している。1986年に、疾病管
理センター（the Center for Disease Control）（CD
C）は、インフルエンザ流行がこれまでの28年間のうち1
8年で10、000人以上の死亡者に結び付いていると推定し
た。CDCの研究は、米国におけり死亡の第５番目の原因
としてインフルエンザを指摘している。インフルエンザ
ＡおよびＢの表面糖タンパク質の抗原性変異がその絶え
間ない流行の原因となっている。
も年間30−50百万人に感染する。インフルエンザ流行の
疫学的研究は、全人口では25％および学齢期の子供では
もっと高率になる感染の発生を推定している。研究者ら
は、感染した人の半数までが、身体の具合いが悪いため
に医師を訪ねていると推定している。1986年に、疾病管
理センター（the Center for Disease Control）（CD
C）は、インフルエンザ流行がこれまでの28年間のうち1
8年で10、000人以上の死亡者に結び付いていると推定し
た。CDCの研究は、米国におけり死亡の第５番目の原因
としてインフルエンザを指摘している。インフルエンザ
ＡおよびＢの表面糖タンパク質の抗原性変異がその絶え
間ない流行の原因となっている。
インフルエンザウイルスは、NA活性を持つ表面糖タン
パク質を有している。これらの糖タンパク質は、ウイル
ス、細菌、マイコプラズマおよび動物組織に見られるノ
イラミニダーゼファミリーの一員である。それらは、ア
ルファ−ケトシド結合されたＮ−アセチルノイラミン酸
（Neu5Ac;以前は「NANA」と呼ばれていた）を含む基質
を加水分解する。ウイルスでは、NAは典型的には５−10
％のウイルスタンパク質を構成し、そしてエンベロープ
上のマッシュルーム状スパイクとして存在している。ウ
イルスのNAは、酵素の触媒部位を含む親水性領域および
ウイルスに酵素を固定するようにウイルスのエンベロー
プに挿入される疎水領域から構成されている。
パク質を有している。これらの糖タンパク質は、ウイル
ス、細菌、マイコプラズマおよび動物組織に見られるノ
イラミニダーゼファミリーの一員である。それらは、ア
ルファ−ケトシド結合されたＮ−アセチルノイラミン酸
（Neu5Ac;以前は「NANA」と呼ばれていた）を含む基質
を加水分解する。ウイルスでは、NAは典型的には５−10
％のウイルスタンパク質を構成し、そしてエンベロープ
上のマッシュルーム状スパイクとして存在している。ウ
イルスのNAは、酵素の触媒部位を含む親水性領域および
ウイルスに酵素を固定するようにウイルスのエンベロー
プに挿入される疎水領域から構成されている。
NA活性の種々のアッセイが、文献中に記載されてい
る。Santer,U.V.ら、Biochimica et Biophysica Acta 5
23:435−442（1978）は、基質として２−（３−メトキ
シフェニル）−Ｎ−アセチル−アルファ−Ｄ−ノイラミ
ン酸および酵素的に放出されるメトキシフェノールを測
定するために、酸化剤の存在下で４−アミノアンチピリ
ンを用いたNAの比色分析を記載している。Myers,R.W.
ら、Analytical Biochemistry 101:166−174（1980）
は、NAの蛍光定量分析へのNeu5Acの４−メチルウンベリ
フェリル−アルファ−ケトシドの使用を記載している。
このNeu5Acの発色性誘導体はまた、Yolken,R.H.ら、J.I
nfectious Diseases 142:5116−523（1980）;Clinical
Chemistry 27:1490p1498（1981）；および、Reviews of
Infectious Diseases 4:35−68（1982）；およびKiyot
aniら、Hiroshima J.Medical Sciences 33y287−292（1
984）;Zbl Bakt Hyg A260−273−285（1985）;Microbio
l.Immun.31:1131−1135（1987）、によってインフルエ
ンザウイルスのNA活性の研究にも用いられた。しかしな
がら、これらの従来のNAアッセイが利用可能であるにも
関わらず、現在まだ医者たちはもっぱら症候に基づいて
インフルエンザを診断している。これは幾分は、これら
の従来のアッセイが複雑であり、そして／あるいは病院
設備には典型的には見られない器具を必要とするという
事実に起因している。これらの従来のアッセイの他の欠
点は、これらのアッセイがインフルエンザ型の間を識別
し得ないことである。その能力は、感染と戦うための適
切な化学療法および／あるいは支持療法を医者たちが処
方し得るために特に重要なことである。
る。Santer,U.V.ら、Biochimica et Biophysica Acta 5
23:435−442（1978）は、基質として２−（３−メトキ
シフェニル）−Ｎ−アセチル−アルファ−Ｄ−ノイラミ
ン酸および酵素的に放出されるメトキシフェノールを測
定するために、酸化剤の存在下で４−アミノアンチピリ
ンを用いたNAの比色分析を記載している。Myers,R.W.
ら、Analytical Biochemistry 101:166−174（1980）
は、NAの蛍光定量分析へのNeu5Acの４−メチルウンベリ
フェリル−アルファ−ケトシドの使用を記載している。
このNeu5Acの発色性誘導体はまた、Yolken,R.H.ら、J.I
nfectious Diseases 142:5116−523（1980）;Clinical
Chemistry 27:1490p1498（1981）；および、Reviews of
Infectious Diseases 4:35−68（1982）；およびKiyot
aniら、Hiroshima J.Medical Sciences 33y287−292（1
984）;Zbl Bakt Hyg A260−273−285（1985）;Microbio
l.Immun.31:1131−1135（1987）、によってインフルエ
ンザウイルスのNA活性の研究にも用いられた。しかしな
がら、これらの従来のNAアッセイが利用可能であるにも
関わらず、現在まだ医者たちはもっぱら症候に基づいて
インフルエンザを診断している。これは幾分は、これら
の従来のアッセイが複雑であり、そして／あるいは病院
設備には典型的には見られない器具を必要とするという
事実に起因している。これらの従来のアッセイの他の欠
点は、これらのアッセイがインフルエンザ型の間を識別
し得ないことである。その能力は、感染と戦うための適
切な化学療法および／あるいは支持療法を医者たちが処
方し得るために特に重要なことである。
従来の研究者たちは、Neu5Acの化学構造とその非イン
フルエンザのNAに対する基質としての生物学的機能との
間の関連を研究してきた。Gross,H.J.ら、Biochemistry
27:4279（1988）は、３種の異なる細菌NA群（C.perfri
ngens,A.ureafaciens,およびV.cholera）に対する基質
としてのＮ− アセチル−４−エピ−Ｄ−ノイラミン酸
のベンジル−アルファ−グリコシド類を調べ、そして反
応性に優位な相異を見いだした。22時間後、C.perfring
ensのNAは、その基質の100％を切り離したが、一方、A.
ureafciens,およびV.choleraのNAはそれぞれその基質の
たった50％および11％を切り離した。Kimら、J.Am.Che
m.Soc.110:6481−6486（1988）は、Neu5Acアルドラーゼ
に受け入れられる基質の構造状の特徴、そのNeu5Acの合
成への使用、および２−デオキシ誘導体へのその化学変
換を記載し、そしてさらに、研究がその２−デオキシ誘
導体の生物学的活性を測定するべき進展中であることを
報告した。Brossmerら、Helv.Chim.Acta.69:2127（198
6）;Glycoconjugates 4:145（1987）は、４デオキシNeu
5Acのメチル−アルファ−グリコシドが家禽ペストのウ
イルスNeu5Acに対するよい基質であったが、しかし上述
した３種の細菌のNA群に対してはそうでないことを報告
した。さらに、Schauer,R.ら、Eur.J.Biochem.106:531
（1980）は、４−メトキシNeu5Acが家禽ペストのウイル
スNAに対する優れた基質であったが、しかしV.cholera
のNAに対してはそうでないことを報告した。４−デオキ
シNeu5Acの４−メチルウンベリフェリル誘導体もまた、
文献に記載されている（Helv.Chim.Acta.69:1927（198
6））。Zbiralら、Monatsheft fur Chemie 119:127p141
（1988）は、７−および８−デオキシNeu5Acおよび4,7
−ジデオキシNeu5Acの合成を記載した。Zbiralら、Lieb
igs Ann Chem 119:127p141（1989）は、７−エピ、８−
エピ、7,8−ビス−エピ、８−デオキシ、９−デオキシ
および4,7−ジデオキシNeu5Acの４−メチルウンベリフ
ェリル−２−αグルコシドの合成を記載し、そしてV.ch
olera由来のシアリダーゼの阻害剤としてのそれらの化
合物の反応を研究した。
フルエンザのNAに対する基質としての生物学的機能との
間の関連を研究してきた。Gross,H.J.ら、Biochemistry
27:4279（1988）は、３種の異なる細菌NA群（C.perfri
ngens,A.ureafaciens,およびV.cholera）に対する基質
としてのＮ− アセチル−４−エピ−Ｄ−ノイラミン酸
のベンジル−アルファ−グリコシド類を調べ、そして反
応性に優位な相異を見いだした。22時間後、C.perfring
ensのNAは、その基質の100％を切り離したが、一方、A.
ureafciens,およびV.choleraのNAはそれぞれその基質の
たった50％および11％を切り離した。Kimら、J.Am.Che
m.Soc.110:6481−6486（1988）は、Neu5Acアルドラーゼ
に受け入れられる基質の構造状の特徴、そのNeu5Acの合
成への使用、および２−デオキシ誘導体へのその化学変
換を記載し、そしてさらに、研究がその２−デオキシ誘
導体の生物学的活性を測定するべき進展中であることを
報告した。Brossmerら、Helv.Chim.Acta.69:2127（198
6）;Glycoconjugates 4:145（1987）は、４デオキシNeu
5Acのメチル−アルファ−グリコシドが家禽ペストのウ
イルスNeu5Acに対するよい基質であったが、しかし上述
した３種の細菌のNA群に対してはそうでないことを報告
した。さらに、Schauer,R.ら、Eur.J.Biochem.106:531
（1980）は、４−メトキシNeu5Acが家禽ペストのウイル
スNAに対する優れた基質であったが、しかしV.cholera
のNAに対してはそうでないことを報告した。４−デオキ
シNeu5Acの４−メチルウンベリフェリル誘導体もまた、
文献に記載されている（Helv.Chim.Acta.69:1927（198
6））。Zbiralら、Monatsheft fur Chemie 119:127p141
（1988）は、７−および８−デオキシNeu5Acおよび4,7
−ジデオキシNeu5Acの合成を記載した。Zbiralら、Lieb
igs Ann Chem 119:127p141（1989）は、７−エピ、８−
エピ、7,8−ビス−エピ、８−デオキシ、９−デオキシ
および4,7−ジデオキシNeu5Acの４−メチルウンベリフ
ェリル−２−αグルコシドの合成を記載し、そしてV.ch
olera由来のシアリダーゼの阻害剤としてのそれらの化
合物の反応を研究した。
出願人は、４位修飾のNeu5Acとヒトのインフルエンザ
NAとの反応性について、いかなる先行する報告も知らな
い。
NAとの反応性について、いかなる先行する報告も知らな
い。
発明の開示 本発明の一つの面は、その活性を有することが疑われ
る臨床試料中のヒトインフルエンザのノイラミニダーゼ
活性を検出する方法であって、 （ａ）該試料を、下式の発色性に改変されたＮ−アセチ
ルノイラミン酸基質と共にインキュベートする工程： ここでAcはアセチルを表し、Ｒは水素、フッ素またはメ
トキシを表し、およびＸは、該基質または該基質の塩か
ら解裂されると異なる色を示す、発色性基を表す；およ
び （ｂ）工程（ａ）の後に該試料−基質混合物が該色を示
すか否かを観察することにより、ノイラミニダーゼ活性
を検出する工程； を包含する、方法である。
る臨床試料中のヒトインフルエンザのノイラミニダーゼ
活性を検出する方法であって、 （ａ）該試料を、下式の発色性に改変されたＮ−アセチ
ルノイラミン酸基質と共にインキュベートする工程： ここでAcはアセチルを表し、Ｒは水素、フッ素またはメ
トキシを表し、およびＸは、該基質または該基質の塩か
ら解裂されると異なる色を示す、発色性基を表す；およ
び （ｂ）工程（ａ）の後に該試料−基質混合物が該色を示
すか否かを観察することにより、ノイラミニダーゼ活性
を検出する工程； を包含する、方法である。
本発明の他の面は、ヒトインフルエンザノイラミニダ
ーゼ活性を有することが疑われる臨床試料中の、ヒトイ
ンフルエンザのノイラミニダーゼ活性の特定の型（例え
ばＡまたはＢ）を、ヒトインフルエンザノイラミニダー
ゼの他の型が示す活性から選択的に検出する方法であっ
て、 （ａ）該試料を、下式の発色性に改変されたＮ−アセチ
ルノイラミン酸基質と共にインキュベートする工程： ここでAcはアセチルを表し、Ｒは水素、フッ素またはメ
トキシを表し、およびＸは、該基質または該基質の塩か
ら解裂されると異なる色を示す、発色性基を表す； （ｂ）工程（ａ）の後に該試料−基質混合物が示す該色
を観察し；および （ｃ）該色を、該基質に対して該特定の型のヒトインフ
ルエンザノイラミニダーゼおよび他の型のヒトインフル
エンザノイラミニダーゼの活性標準が示す色と、比較す
る工程； を包含する、方法である。
ーゼ活性を有することが疑われる臨床試料中の、ヒトイ
ンフルエンザのノイラミニダーゼ活性の特定の型（例え
ばＡまたはＢ）を、ヒトインフルエンザノイラミニダー
ゼの他の型が示す活性から選択的に検出する方法であっ
て、 （ａ）該試料を、下式の発色性に改変されたＮ−アセチ
ルノイラミン酸基質と共にインキュベートする工程： ここでAcはアセチルを表し、Ｒは水素、フッ素またはメ
トキシを表し、およびＸは、該基質または該基質の塩か
ら解裂されると異なる色を示す、発色性基を表す； （ｂ）工程（ａ）の後に該試料−基質混合物が示す該色
を観察し；および （ｃ）該色を、該基質に対して該特定の型のヒトインフ
ルエンザノイラミニダーゼおよび他の型のヒトインフル
エンザノイラミニダーゼの活性標準が示す色と、比較す
る工程； を包含する、方法である。
本発明のさらに他の面は、その活性を有することが疑
われる臨床試料中の、ヒトインフルエンザのノイラミニ
ダーゼ活性を検出するのに有用な、改変されたNeu5Ac発
色性気質および該基質の塩であり、該基質は下式を有す
る： ここでAcはアセチルを表し、Ｒはメトキシまたはフッ素
であり、およびＸは、該基質または該基質の塩から解裂
されると、異なる色を示す、発色性基である。
われる臨床試料中の、ヒトインフルエンザのノイラミニ
ダーゼ活性を検出するのに有用な、改変されたNeu5Ac発
色性気質および該基質の塩であり、該基質は下式を有す
る： ここでAcはアセチルを表し、Ｒはメトキシまたはフッ素
であり、およびＸは、該基質または該基質の塩から解裂
されると、異なる色を示す、発色性基である。
本発明のさらに他の面は、その活性を有することが疑
われる臨床試料中に、ヒトインフルエンザのノイラミニ
ダーゼ活性を検出するのに有用な、下式を有する発色性
基質、および該基質の塩である： ここでAcはアセチルを表し、Ｒは水素であり、およびＸ
は、３−シアノウンベリフェリル、２−ニトロフェニ
ル、４−ニトロフェニル、３−レゾルフィン、５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル、４−ニトロフェニル
アゾフェニル、４−ニトロフェニルアゾレゾルシニル、
３−メトキシフェニル、３−ジメチルアミノフェニル、
４−クロロ−１−ナフチル、および６−ブロモ−２−ナ
フチルからなる群から選択される。
われる臨床試料中に、ヒトインフルエンザのノイラミニ
ダーゼ活性を検出するのに有用な、下式を有する発色性
基質、および該基質の塩である： ここでAcはアセチルを表し、Ｒは水素であり、およびＸ
は、３−シアノウンベリフェリル、２−ニトロフェニ
ル、４−ニトロフェニル、３−レゾルフィン、５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル、４−ニトロフェニル
アゾフェニル、４−ニトロフェニルアゾレゾルシニル、
３−メトキシフェニル、３−ジメチルアミノフェニル、
４−クロロ−１−ナフチル、および６−ブロモ−２−ナ
フチルからなる群から選択される。
図面の簡単な説明 図面において： 図１は、実施例１に記載された合成過程を示すスキー
ム図である。
ム図である。
図２は、実施例２に記載された合成過程を示すスキー
ム図である。
ム図である。
図３は、実施例３に記載された合成過程を示すスキー
ム図である。
ム図である。
図４は、実施例４に記載された合成過程を示すスキー
ム図である。
ム図である。
図５は、実施例５に記載された合成過程を示すスキー
ム図である。
ム図である。
図６は、実施例６に記載された合成過程を示すスキー
ム図である。
ム図である。
発明の実施態様 本発明の発色性に修飾されたＮ−アセチルノイラミン
酸基質類およびそれらを用いる方法は、臨床試料あるい
は標本中のヒトインフルエンザのノイラミニダーゼ活性
を検出すること、およびその試料中に存在するヒトイン
フルエンザのノイラミニダーゼの型を識別することに有
効である。従って、これらの基質および方法は、その臨
床試料を採取した患者に存在する、インフルエンザの感
染型、およびインフルエンザ感染を一般的に診断するの
に有用である。これに関して、用語「インフルエンザ」
は、インフルエンザＡおよびＢ型およびパラインフルエ
ンザ１、２および３型を含むことを意味する。用語「選
択的検出」は、ある型のインフルエンザウイルスのNA活
性を他の型のインフルエンザウイルスの活性と比較して
検出する能力を意味する。
酸基質類およびそれらを用いる方法は、臨床試料あるい
は標本中のヒトインフルエンザのノイラミニダーゼ活性
を検出すること、およびその試料中に存在するヒトイン
フルエンザのノイラミニダーゼの型を識別することに有
効である。従って、これらの基質および方法は、その臨
床試料を採取した患者に存在する、インフルエンザの感
染型、およびインフルエンザ感染を一般的に診断するの
に有用である。これに関して、用語「インフルエンザ」
は、インフルエンザＡおよびＢ型およびパラインフルエ
ンザ１、２および３型を含むことを意味する。用語「選
択的検出」は、ある型のインフルエンザウイルスのNA活
性を他の型のインフルエンザウイルスの活性と比較して
検出する能力を意味する。
本発明でテストされる臨床試料は、典型的には、イン
フルエンザに罹患している患者から、洗浄液、綿棒ある
い吐き出した標本として採取した咽頭、鼻咽頭あるいは
呼吸器の分泌物である。この洗浄液、吐き出したものあ
るいは綿棒は、好ましくは、基質と混合する前に、安定
化剤を含む水性緩衝液と混ぜ合わせる。この緩衝液は、
pH9を４から７、好ましくは5.5から6.5までに維持する
緩衝剤、さらに必要に応じて重量で約0.1％から10％ま
での非イオン性界面活性剤、少量（１−20mΜ）のアル
カリ土類金属陽イオン（Ca、Mg、好ましくはCa）、およ
び試料中のNAの温度安定性を促進するようなアルジトー
ル、単糖類および二糖類からなる群から選択される十分
な量の安定剤を含む。標本と混ぜ合わせる緩衝液の量
は、通常は0.1から2mlである。
フルエンザに罹患している患者から、洗浄液、綿棒ある
い吐き出した標本として採取した咽頭、鼻咽頭あるいは
呼吸器の分泌物である。この洗浄液、吐き出したものあ
るいは綿棒は、好ましくは、基質と混合する前に、安定
化剤を含む水性緩衝液と混ぜ合わせる。この緩衝液は、
pH9を４から７、好ましくは5.5から6.5までに維持する
緩衝剤、さらに必要に応じて重量で約0.1％から10％ま
での非イオン性界面活性剤、少量（１−20mΜ）のアル
カリ土類金属陽イオン（Ca、Mg、好ましくはCa）、およ
び試料中のNAの温度安定性を促進するようなアルジトー
ル、単糖類および二糖類からなる群から選択される十分
な量の安定剤を含む。標本と混ぜ合わせる緩衝液の量
は、通常は0.1から2mlである。
緩衝液は、有機あるいは無機のどちらでもよい。好適
な緩衝液の例は、以下のような有機酸類およびその塩類
の通常の緩衝液である。例えば、クエン酸緩衝液（例え
ば、クエン酸モノナトリウム−クエン酸２ナトリウム混
合物、クエン酸−クエン酸３ナトリウム混合物、クエン
酸−クエン酸モノナトリウム混合物、など）、酢酸緩衝
液（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物）、コハク酸
緩衝液（例えば、コハク酸−コハク酸モノナトリウム混
合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−
コハク酸２ナトリウム混合物、など）、酒石酸緩衝液
（例えば、酒石酸−酒石酸塩混合物、酒石酸−酒石酸カ
リウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物、な
ど）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸−フマル酸モ
ノナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸２ナトリウム
混合物、フマル酸モノナトリウム−フマル酸２ナトリウ
ム混合物）、グルコン酸緩衝液（例えば、グルコン酸−
グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナト
リウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合
物、など）、シュウ酸緩衝液（例えば、シュウ酸−シュ
ウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混
合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物、など）、乳
酸緩衝液（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸
−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合
物、など）、酢酸緩衝液（例えば、酢酸−酢酸ナトリウ
ム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物、など）、マ
レイン酸緩衝液（例えば、D,L−マレイン酸−マレイン
酸２ナトリウム混合物）、リン酸緩衝液（例えば、リン
酸モノナトリウム−リン酸２ナトリウム混合物、リン酸
モノナトリウム−水酸化ナトリウム混合物、リン酸３ナ
トリウム−塩酸混合物、など）、２−（Ｎ−モルホリ
ノ）エタンスルホン酸、［ビス−（２−ヒドロキシエチ
ル）イミノ］トリス（ヒドロキシメチル）メタン、Ｎ−
２−アセトアミドイミノ２酢酸、1,3−ビス［トリス
（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン、ピペラ
ジン−N,N′−ビス（２−エタンスルホン酸）、Ｎ−２
−アセトアミド−２−アミノエタンスルホン酸、３−
（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン
酸、Ｎ−Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）２−アミノ
エタンスルホン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンス
ルホン酸、２−［トリス（ヒドロキシメチル）メチルア
ミノ］エタンスルホン酸、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピ
ペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸、３−｛［トリ
ス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝−２−ヒドロ
キシプロパンスルホン酸である。
な緩衝液の例は、以下のような有機酸類およびその塩類
の通常の緩衝液である。例えば、クエン酸緩衝液（例え
ば、クエン酸モノナトリウム−クエン酸２ナトリウム混
合物、クエン酸−クエン酸３ナトリウム混合物、クエン
酸−クエン酸モノナトリウム混合物、など）、酢酸緩衝
液（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物）、コハク酸
緩衝液（例えば、コハク酸−コハク酸モノナトリウム混
合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−
コハク酸２ナトリウム混合物、など）、酒石酸緩衝液
（例えば、酒石酸−酒石酸塩混合物、酒石酸−酒石酸カ
リウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物、な
ど）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸−フマル酸モ
ノナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸２ナトリウム
混合物、フマル酸モノナトリウム−フマル酸２ナトリウ
ム混合物）、グルコン酸緩衝液（例えば、グルコン酸−
グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナト
リウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合
物、など）、シュウ酸緩衝液（例えば、シュウ酸−シュ
ウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混
合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物、など）、乳
酸緩衝液（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸
−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合
物、など）、酢酸緩衝液（例えば、酢酸−酢酸ナトリウ
ム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物、など）、マ
レイン酸緩衝液（例えば、D,L−マレイン酸−マレイン
酸２ナトリウム混合物）、リン酸緩衝液（例えば、リン
酸モノナトリウム−リン酸２ナトリウム混合物、リン酸
モノナトリウム−水酸化ナトリウム混合物、リン酸３ナ
トリウム−塩酸混合物、など）、２−（Ｎ−モルホリ
ノ）エタンスルホン酸、［ビス−（２−ヒドロキシエチ
ル）イミノ］トリス（ヒドロキシメチル）メタン、Ｎ−
２−アセトアミドイミノ２酢酸、1,3−ビス［トリス
（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン、ピペラ
ジン−N,N′−ビス（２−エタンスルホン酸）、Ｎ−２
−アセトアミド−２−アミノエタンスルホン酸、３−
（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン
酸、Ｎ−Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）２−アミノ
エタンスルホン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンス
ルホン酸、２−［トリス（ヒドロキシメチル）メチルア
ミノ］エタンスルホン酸、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピ
ペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸、３−｛［トリ
ス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝−２−ヒドロ
キシプロパンスルホン酸である。
緩衝液中に有用な非イオン性界面活性剤の例は、プル
ロニクス（Pluronics）、例えばポリソルベイト（Pulys
orbate）20あるいはポリソルベイト80、トライトンＸ−
100、NP−40、およびC8−C9アルキルグルコシドのよう
なアルキルグルコシド類である。界面活性剤は、付加的
な成分であり、そしてウイルスエンベロープからのNAの
遊離を促進する。
ロニクス（Pluronics）、例えばポリソルベイト（Pulys
orbate）20あるいはポリソルベイト80、トライトンＸ−
100、NP−40、およびC8−C9アルキルグルコシドのよう
なアルキルグルコシド類である。界面活性剤は、付加的
な成分であり、そしてウイルスエンベロープからのNAの
遊離を促進する。
緩衝液中で使われる安定剤の例は、グリセリン、エリ
トリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトー
ル、マンニトールのような三価あるいはそれ以上のアル
ジトール類、単糖類のグルコースおよびフルクトースお
よび二糖類のスクロースである。これらの多価の糖アル
コール、および単糖および二糖類は、単独であるいは組
み合わせで使われ得る。ノイラミニダーゼ含有のウイル
スの活性を安定化させるために、アルジトール類あるい
は単糖類および二糖類が、0.2Μから2.1Μまで、好まし
くは0.6Μから2.0Μまでの量で液体の処方／賦形剤系に
加えられる。
トリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトー
ル、マンニトールのような三価あるいはそれ以上のアル
ジトール類、単糖類のグルコースおよびフルクトースお
よび二糖類のスクロースである。これらの多価の糖アル
コール、および単糖および二糖類は、単独であるいは組
み合わせで使われ得る。ノイラミニダーゼ含有のウイル
スの活性を安定化させるために、アルジトール類あるい
は単糖類および二糖類が、0.2Μから2.1Μまで、好まし
くは0.6Μから2.0Μまでの量で液体の処方／賦形剤系に
加えられる。
一旦緩衝液と混合させると、試料は長い期間、好まし
くは２℃から８℃で有意なNA活性を減少なしに貯蔵され
得る。
くは２℃から８℃で有意なNA活性を減少なしに貯蔵され
得る。
緩衝・安定化された標本と混ぜ合わされる基質は、発
色性のNeu5Ac誘導体であり、この誘導体は、４位の位置
のヒドロキシル基の除去、ヒドロキシル基とフッ素の置
換、あるいはヒドロキシル基の水素と低級アルキル基と
の置換によって修飾されている。これらの基質は、以下
の化学構造式で表され得る： Ｒ、ＸおよびAcは、前記に同じである。好ましくは、Ｘ
は４−メチルウンベリフェリル、３−シアノウンベリフ
ェリル、２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、３
−レゾルフィン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル、ニトロフェニルアゾフェニル、ニトロフェニルア
ゾレゾルシニル、３−メトキシフェニル、３−ジメチル
アミノフェニル、４−クロロ−１−ナフチル、あるいは
６−ブロモ−２−ナフチルを表す。これらの基質のNa、
ＫおよびNH4 +塩類のような単純な塩類もまた使用され得
る。
色性のNeu5Ac誘導体であり、この誘導体は、４位の位置
のヒドロキシル基の除去、ヒドロキシル基とフッ素の置
換、あるいはヒドロキシル基の水素と低級アルキル基と
の置換によって修飾されている。これらの基質は、以下
の化学構造式で表され得る： Ｒ、ＸおよびAcは、前記に同じである。好ましくは、Ｘ
は４−メチルウンベリフェリル、３−シアノウンベリフ
ェリル、２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、３
−レゾルフィン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル、ニトロフェニルアゾフェニル、ニトロフェニルア
ゾレゾルシニル、３−メトキシフェニル、３−ジメチル
アミノフェニル、４−クロロ−１−ナフチル、あるいは
６−ブロモ−２−ナフチルを表す。これらの基質のNa、
ＫおよびNH4 +塩類のような単純な塩類もまた使用され得
る。
本願中で使用される用語「発色体」は、これらに限定
されないか、蛍光を出す分子を含むことを意図してい
る。用語「色」は、同様にこれらに限定されないか、蛍
光を含むことを意図している。
されないか、蛍光を出す分子を含むことを意図してい
る。用語「色」は、同様にこれらに限定されないか、蛍
光を含むことを意図している。
上記の構造内に属する４位修飾の発色性Neu5Ac誘導体
の例は、４−メチルウンベリフェリル−４−デオキシ−
Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、３−シアノ
ウンベリフェリル−４−デオキシ−Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸−α−ケトシド、２−ニトロフェニル−４−デオ
キシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、４−
ニトロフェニル−４−デオキシ−Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸−α−ケトシド、３−レゾルフィン−４−デオキシ
−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル−４−デオキシ−Ｎ−
アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、２−［４−（４
−ニトロフェニルアゾ）フェニル］−４−デオキシ−Ｎ
−アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、２−［４−
（４−ニトロフェニルアゾ）レゾルシニル］−４−デオ
キシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、３−
メトキシフェニル−４−デオキシ−Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸−α−ケトシド、３−ジメチルアミノフェニル−
４−デオキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシ
ド、４−クロロ−１−ナフチル−４−デオキシ−Ｎ−ア
セチルノイラミン酸−α−ケトシド、６−ブロモ−２−
ナフチル−４−デオキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−
α−ケトシド、４−メチルウンベリフェリル−４−メト
キシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、２−
ニトロフェニル−４−メトキシ−Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸−α−ケトシド、４−ニトロフェニル−４−メトキ
シ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、３−シ
アノウンベリフェリル−４−メトキシ−Ｎ−アセチルノ
イラミン酸−α−ケトシド、３−レゾルフィン−４−メ
トキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−４−メトキシ
−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、２−［４
−（４−ニトロフェニルアゾ）フェニル］−４−メトキ
シ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、２−
［４−（４−ニトロフェニルアゾ）レゾルシニル］−４
−メトキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシ
ド、３−メトキシフェニル−４−メトキシ−Ｎ−アセチ
ルノイラミン酸−α−ケトシド、３−ジメチルアミノフ
ェニル−４−メトキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α
−ケトシド、６−ブロモ−２−ナフチル−４−メトキシ
−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、４−クロ
ロ−１−ナフチル−４−メトキシ−Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸−α−ケトシド、４−メチルウンベリフェリル−
４−フルオロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシ
ド、２−ニトロフェニル−４−フルオロ−Ｎ−アセチル
ノイラミン酸−α−ケトシド、４−ニトロフェニル−４
−フルオロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシ
ド、３−シアノウンベリフェリル−４−フルオロ−Ｎ−
アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、３−レゾルフィ
ン−４−メトキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケ
トシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−４
−フルオロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシ
ド、２−［４−（４−ニトロフェニルアゾ）フェニル］
−４−フルオロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケト
シド、２−［４−（４−ニトロフェニルアゾ）レゾルシ
ニル］−４−フルオロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α
−ケトシド、３−メトキシフェニル−４−フルオロ−Ｎ
−アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、３−ジメチル
アミノフェニル−４−フルオロ−Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸−α−ケトシド、４−クロロ−１−ナフチル−４−
フルオロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、
および６−ブロモ−２−ナフチル−４−フルオロ−Ｎ−
アセチルノイラミン酸−α−ケトシドである。
の例は、４−メチルウンベリフェリル−４−デオキシ−
Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、３−シアノ
ウンベリフェリル−４−デオキシ−Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸−α−ケトシド、２−ニトロフェニル−４−デオ
キシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、４−
ニトロフェニル−４−デオキシ−Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸−α−ケトシド、３−レゾルフィン−４−デオキシ
−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル−４−デオキシ−Ｎ−
アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、２−［４−（４
−ニトロフェニルアゾ）フェニル］−４−デオキシ−Ｎ
−アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、２−［４−
（４−ニトロフェニルアゾ）レゾルシニル］−４−デオ
キシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、３−
メトキシフェニル−４−デオキシ−Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸−α−ケトシド、３−ジメチルアミノフェニル−
４−デオキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシ
ド、４−クロロ−１−ナフチル−４−デオキシ−Ｎ−ア
セチルノイラミン酸−α−ケトシド、６−ブロモ−２−
ナフチル−４−デオキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−
α−ケトシド、４−メチルウンベリフェリル−４−メト
キシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、２−
ニトロフェニル−４−メトキシ−Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸−α−ケトシド、４−ニトロフェニル−４−メトキ
シ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、３−シ
アノウンベリフェリル−４−メトキシ−Ｎ−アセチルノ
イラミン酸−α−ケトシド、３−レゾルフィン−４−メ
トキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−４−メトキシ
−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、２−［４
−（４−ニトロフェニルアゾ）フェニル］−４−メトキ
シ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、２−
［４−（４−ニトロフェニルアゾ）レゾルシニル］−４
−メトキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシ
ド、３−メトキシフェニル−４−メトキシ−Ｎ−アセチ
ルノイラミン酸−α−ケトシド、３−ジメチルアミノフ
ェニル−４−メトキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α
−ケトシド、６−ブロモ−２−ナフチル−４−メトキシ
−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、４−クロ
ロ−１−ナフチル−４−メトキシ−Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸−α−ケトシド、４−メチルウンベリフェリル−
４−フルオロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシ
ド、２−ニトロフェニル−４−フルオロ−Ｎ−アセチル
ノイラミン酸−α−ケトシド、４−ニトロフェニル−４
−フルオロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシ
ド、３−シアノウンベリフェリル−４−フルオロ−Ｎ−
アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、３−レゾルフィ
ン−４−メトキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケ
トシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−４
−フルオロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシ
ド、２−［４−（４−ニトロフェニルアゾ）フェニル］
−４−フルオロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケト
シド、２−［４−（４−ニトロフェニルアゾ）レゾルシ
ニル］−４−フルオロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α
−ケトシド、３−メトキシフェニル−４−フルオロ−Ｎ
−アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、３−ジメチル
アミノフェニル−４−フルオロ−Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸−α−ケトシド、４−クロロ−１−ナフチル−４−
フルオロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシド、
および６−ブロモ−２−ナフチル−４−フルオロ−Ｎ−
アセチルノイラミン酸−α−ケトシドである。
上述のNeu5Ac誘導体は、一般に、１、２、７、８およ
び９位にあるNeu5Acの官能基を保護し、指示されるよう
に４位を修飾し、１、２、７、８および９位を脱保護
し、そして４位修飾のNeu5Acと発色体とを結合させるこ
とによって作られる。これらの反応の詳細は、以下の実
施例に与えられている。
び９位にあるNeu5Acの官能基を保護し、指示されるよう
に４位を修飾し、１、２、７、８および９位を脱保護
し、そして４位修飾のNeu5Acと発色体とを結合させるこ
とによって作られる。これらの反応の詳細は、以下の実
施例に与えられている。
基質は、標準的には0.05mΜと0.5mΜとの間の範囲に
入る量が、緩衝・安定化された試料に加えられる。この
混合物は、周囲の温度から生理学的温度（例えば、約22
℃から37℃まで）までで、試料中の任意のNAが基質と反
応するのに十分な時間、インキュベートされる。その時
間は、標準的には20から120分の範囲で、さらに通常は3
0から60分である。試料中にNA活性があれば、発色基は
基質から切り離され、そして遊離される発色体は混合物
に特徴的な色を与える。本発明の基質は異なるヒトイン
フルエンザNA類にそれぞれ異なる反応性を示すので、イ
ンフルエンザ感染の特定の型は、試料の混合物の色を、
それぞれのインフルエンザのNA型に対する標準反応混合
物の色と比較することにより識別される。例えば、イン
フルエンザＡとインフルエンザＢとは、これらのインフ
ルエンザウイルスのNAに対する基質の反応性に基づいて
識別される。以下の表は、NAが修飾されるNeu5Acと反応
し、そして発色体を放出した時に生ずる色を示してい
る。
入る量が、緩衝・安定化された試料に加えられる。この
混合物は、周囲の温度から生理学的温度（例えば、約22
℃から37℃まで）までで、試料中の任意のNAが基質と反
応するのに十分な時間、インキュベートされる。その時
間は、標準的には20から120分の範囲で、さらに通常は3
0から60分である。試料中にNA活性があれば、発色基は
基質から切り離され、そして遊離される発色体は混合物
に特徴的な色を与える。本発明の基質は異なるヒトイン
フルエンザNA類にそれぞれ異なる反応性を示すので、イ
ンフルエンザ感染の特定の型は、試料の混合物の色を、
それぞれのインフルエンザのNA型に対する標準反応混合
物の色と比較することにより識別される。例えば、イン
フルエンザＡとインフルエンザＢとは、これらのインフ
ルエンザウイルスのNAに対する基質の反応性に基づいて
識別される。以下の表は、NAが修飾されるNeu5Acと反応
し、そして発色体を放出した時に生ずる色を示してい
る。
従って、本発明は、病院あるいは医院で実行され得、
そして感染を処置するための適切な治療および／あるい
は感染した患者と身近に接触する人への適切な予防処置
を医者が指示し得る、インフルエンザを選択的に診断す
るための単純ですばやい方法を提供する。
そして感染を処置するための適切な治療および／あるい
は感染した患者と身近に接触する人への適切な予防処置
を医者が指示し得る、インフルエンザを選択的に診断す
るための単純ですばやい方法を提供する。
本発明は、さらに以下の実施例によって例証される。
これらの実施例は、どんな意味でも本発明を限定する意
図はない。
これらの実施例は、どんな意味でも本発明を限定する意
図はない。
実施例 1. ４−デオキシNeu5Acの合成 この合成の反応スキームを図１に示す。
100mlのメタノール中のNeu5Ac（500mg）および1.25g
のDowex−50W（H+）を還流温度で20時間加熱し、そして
脱色用カーボンで処理してNeu5Acのメチルエステルメチ
ルケトシド（Neu5Ac−MEMK）を得た。乾燥アセトン（モ
レキュラーシーブで乾燥させた）中のこのケトシドにｐ
−トルエンスルホン酸一水和物を触媒として添加し、攪
拌しながら室温で４時間反応させた。Dowex−１（アセ
テート型）で中和し、そして溶媒をエバポレーション
し、8,9−イソプロピリデンNeu5Acメチルエステルメチ
ルケトシドを得た。塩化メチレン中のメタンスルホニル
−クロリドおよび1.5当量のトリエチルアミンで０℃で3
0分間処理することにより４−メシル化−8,9−イソプロ
ピリデンNeu5Acメチルエステルメチルケトシドを得た。
このメシレートを次に、アセトンまたはメチルエチルケ
トン中のヨウ化ナトリウムで処理し、密封した反応バイ
アル中で約100℃で加熱して４−ヨード化合物を形成さ
せた。続いてパラジウムカーボンで水素化、４−デオキ
シ分子を得た。脱保護はまず、水酸化ナトリウムで処理
した後、希HCl/Dowex−50W（H+）で処理して行い、４−
デオキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を得た。
のDowex−50W（H+）を還流温度で20時間加熱し、そして
脱色用カーボンで処理してNeu5Acのメチルエステルメチ
ルケトシド（Neu5Ac−MEMK）を得た。乾燥アセトン（モ
レキュラーシーブで乾燥させた）中のこのケトシドにｐ
−トルエンスルホン酸一水和物を触媒として添加し、攪
拌しながら室温で４時間反応させた。Dowex−１（アセ
テート型）で中和し、そして溶媒をエバポレーション
し、8,9−イソプロピリデンNeu5Acメチルエステルメチ
ルケトシドを得た。塩化メチレン中のメタンスルホニル
−クロリドおよび1.5当量のトリエチルアミンで０℃で3
0分間処理することにより４−メシル化−8,9−イソプロ
ピリデンNeu5Acメチルエステルメチルケトシドを得た。
このメシレートを次に、アセトンまたはメチルエチルケ
トン中のヨウ化ナトリウムで処理し、密封した反応バイ
アル中で約100℃で加熱して４−ヨード化合物を形成さ
せた。続いてパラジウムカーボンで水素化、４−デオキ
シ分子を得た。脱保護はまず、水酸化ナトリウムで処理
した後、希HCl/Dowex−50W（H+）で処理して行い、４−
デオキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を得た。
2. ２−（ｐ−ニトロフェニル）−４−デオキシNeu5Ac
の合成 この合成の反応スキームを図２に示す。
の合成 この合成の反応スキームを図２に示す。
実施例１の４−デオキシNeu5Acをメタノール中のトリ
フルオロ酢酸と共に室温で攪拌することにより、対応す
るメチルエステルに変換した。このメチルエステルを次
に、過剰量の塩化アセチルで一晩処理して、完全にアセ
チル化した２−クロロ−４−デオキシNeu5Acメチルエス
テルを形成させた。この中間体を次に、ジメチルホルム
アミド（DMF）中のpara−ニトロフェノールのナトリウ
ム塩と室温で２時間処理した。カップリングした発色性
の４−デオキシNeu5Acを次に、メタノール中でナトリウ
ムメトキシドで処理（１時間）した後、水酸化ナトリウ
ムで処理（２時間）することにより脱保護して２−（ｐ
−ニトロフェニル）−４−デオキシ−Ｎ−アセチルノイ
ラミン酸のナトリウム塩を形成させた。
フルオロ酢酸と共に室温で攪拌することにより、対応す
るメチルエステルに変換した。このメチルエステルを次
に、過剰量の塩化アセチルで一晩処理して、完全にアセ
チル化した２−クロロ−４−デオキシNeu5Acメチルエス
テルを形成させた。この中間体を次に、ジメチルホルム
アミド（DMF）中のpara−ニトロフェノールのナトリウ
ム塩と室温で２時間処理した。カップリングした発色性
の４−デオキシNeu5Acを次に、メタノール中でナトリウ
ムメトキシドで処理（１時間）した後、水酸化ナトリウ
ムで処理（２時間）することにより脱保護して２−（ｐ
−ニトロフェニル）−４−デオキシ−Ｎ−アセチルノイ
ラミン酸のナトリウム塩を形成させた。
3. ４−デオキシNeu5Acの合成 この合成の反応スキームを図３に示す。
Neu5Ac−MEMKを１当量のtert−ブチルジメチルシリル
（TBDMS）クロリド、イミダゾールおよび触媒量の４−
ジメチルアミノピリジンと65℃で処理し、９−０−TBDM
S Neu5Ac−MEMKを得た。この化合物をアセトンおよび触
媒量のｐトルエンスルホニル一水和物と室温で処理して
９−０−TBDMS−7,8−イソプロピリデンNeu5Ac−MEMKを
得た。このエーテル中のジアゾメタン／トリフルオロボ
レートと０℃で処理することにより対応する４−メトキ
シ誘導体を得た。この化合物を、水酸化ナトリウムで処
理した後THF中のテトラブチルアンモニウムフルオリド
で処理し、そして最後に希HCl/Dowex−50W（H+）で処理
することにより完全に脱保護して４−メトキシ−Ｎ−ア
セチルノイラミン酸を得た。
（TBDMS）クロリド、イミダゾールおよび触媒量の４−
ジメチルアミノピリジンと65℃で処理し、９−０−TBDM
S Neu5Ac−MEMKを得た。この化合物をアセトンおよび触
媒量のｐトルエンスルホニル一水和物と室温で処理して
９−０−TBDMS−7,8−イソプロピリデンNeu5Ac−MEMKを
得た。このエーテル中のジアゾメタン／トリフルオロボ
レートと０℃で処理することにより対応する４−メトキ
シ誘導体を得た。この化合物を、水酸化ナトリウムで処
理した後THF中のテトラブチルアンモニウムフルオリド
で処理し、そして最後に希HCl/Dowex−50W（H+）で処理
することにより完全に脱保護して４−メトキシ−Ｎ−ア
セチルノイラミン酸を得た。
4. ２−（ｐ−ニトロフェニル）−４−メトキシNeu5Ac
の合成 この合成の反応スキームは図４に示されている。
の合成 この合成の反応スキームは図４に示されている。
９−TBDMS−7,8−イソプロピリデンで保護それた４−
メトキシNeu5Ac−MEMKをトシル酸処理の後、テトラヒド
ロフラン中のテトラブチルアンモニウムフルオリドで処
理して脱保護した。この中間体を次に、過剰の塩化アセ
チルと一晩処理して、完全なアセチル化された２−クロ
ロ−４−メトキシNeu5Acメチルエステルを形成させる。
ニトロフェニル色原体のナトリウム塩とのカップリング
を、乾燥DMF中で室温にて２時間行った。メタノール中
のナトリウムメトキシドと処理した後、水酸化ナトリウ
ムで処理することにより、脱保護および脱プロトン化が
行われ、２−（ｐ−ニトロフェニル］−４−メトキシ−
Ｎ−アセチルノイラミン酸のナトリウム塩を得た。
メトキシNeu5Ac−MEMKをトシル酸処理の後、テトラヒド
ロフラン中のテトラブチルアンモニウムフルオリドで処
理して脱保護した。この中間体を次に、過剰の塩化アセ
チルと一晩処理して、完全なアセチル化された２−クロ
ロ−４−メトキシNeu5Acメチルエステルを形成させる。
ニトロフェニル色原体のナトリウム塩とのカップリング
を、乾燥DMF中で室温にて２時間行った。メタノール中
のナトリウムメトキシドと処理した後、水酸化ナトリウ
ムで処理することにより、脱保護および脱プロトン化が
行われ、２−（ｐ−ニトロフェニル］−４−メトキシ−
Ｎ−アセチルノイラミン酸のナトリウム塩を得た。
5. ４フルオロNeu5Acの合成 この合成の反応スキームは図５に示されている。
100mlのメタノール中のNeu5Ac（500mg）および1.25g
のDowex−50W（H+）を還流温度で20時間加熱し、そして
脱色用カーボンで処理してNeu5Acのメチルエステルメチ
ルケトシド（Neu5Ac−MEMK）を得る。乾燥アセトン（モ
レキュラーシーブで乾燥させた）中のこのケトシドにｐ
−トルエンスルホン酸一水和物を触媒として添加し、攪
拌しながら室温で４時間反応させた。Dowex−１（アセ
テート型）で中和し、そして溶媒をエバポレーション
し、8,9−イソプロピリデンNeu5Acメチルエステルメチ
ルケトシドを得た。この化合物を次に、アセトニトリル
中で４オングストロームのモレキュラーシーブを用い
て、重クロム酸ピリジニウム（PDC）または四酸化ルテ
ニウムのいずれかにより選択的に４−ケト誘導体に酸化
させた。テトラヒドロフラン中のボラン−アンモニアで
の穏和な還元により反転した４−アルコールを得、これ
は次に、ジメチルアミノサルファートトリフルオリド
（DAST）によって４−フルオリド（立体配置の反転を伴
う）に変換し得る。脱保護は、まず水酸化ナトリウムで
処理した後、希HCl/Dowex−50W（H+）で処理して行な
い、４−フルオロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を得た。
のDowex−50W（H+）を還流温度で20時間加熱し、そして
脱色用カーボンで処理してNeu5Acのメチルエステルメチ
ルケトシド（Neu5Ac−MEMK）を得る。乾燥アセトン（モ
レキュラーシーブで乾燥させた）中のこのケトシドにｐ
−トルエンスルホン酸一水和物を触媒として添加し、攪
拌しながら室温で４時間反応させた。Dowex−１（アセ
テート型）で中和し、そして溶媒をエバポレーション
し、8,9−イソプロピリデンNeu5Acメチルエステルメチ
ルケトシドを得た。この化合物を次に、アセトニトリル
中で４オングストロームのモレキュラーシーブを用い
て、重クロム酸ピリジニウム（PDC）または四酸化ルテ
ニウムのいずれかにより選択的に４−ケト誘導体に酸化
させた。テトラヒドロフラン中のボラン−アンモニアで
の穏和な還元により反転した４−アルコールを得、これ
は次に、ジメチルアミノサルファートトリフルオリド
（DAST）によって４−フルオリド（立体配置の反転を伴
う）に変換し得る。脱保護は、まず水酸化ナトリウムで
処理した後、希HCl/Dowex−50W（H+）で処理して行な
い、４−フルオロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を得た。
6. ２−（４−クロロ−１−ナフチル）−４−フルオロ
Neu5Acの合成 この合成の反応スキームは図６に示されている。
Neu5Acの合成 この合成の反応スキームは図６に示されている。
実施例５の４−フルオロNeu5Acをメタノール中で、ト
リフルオロ酢酸と共に処理することにより、対応するメ
チルエステルに変換した。過剰の塩化アセチル中での反
応は遊離のアルコール基をアセチル化し、そして同時
に、グリコシルクロリドへの変換が起こった。１当量の
NaOH水溶液により４−クロロ−１−ナフトール（４−C
N）のナトリウム塩を調製した。ベンジルトリエチルア
ンモニウムクロリド（相間移動試薬）の存在下でのこの
水性４−CN溶液（2.5当量）とクロロホルム中のグリコ
シルクロリドとの反応は、カップリングされた発色性化
合物を与えた。アセテート基およびメチルエステル基の
脱保護を、ナトリウムメトキシドおよび水酸化ナトリウ
ムで処理して行い、２−（４−クロロ−１−ナフチル）
−４−フルオロNeu5Acのナトリウム塩を得た。
リフルオロ酢酸と共に処理することにより、対応するメ
チルエステルに変換した。過剰の塩化アセチル中での反
応は遊離のアルコール基をアセチル化し、そして同時
に、グリコシルクロリドへの変換が起こった。１当量の
NaOH水溶液により４−クロロ−１−ナフトール（４−C
N）のナトリウム塩を調製した。ベンジルトリエチルア
ンモニウムクロリド（相間移動試薬）の存在下でのこの
水性４−CN溶液（2.5当量）とクロロホルム中のグリコ
シルクロリドとの反応は、カップリングされた発色性化
合物を与えた。アセテート基およびメチルエステル基の
脱保護を、ナトリウムメトキシドおよび水酸化ナトリウ
ムで処理して行い、２−（４−クロロ−１−ナフチル）
−４−フルオロNeu5Acのナトリウム塩を得た。
7. 44−デオキシNeu5Acの酵素的試験 50μｌのインフルエンザウイルス溶液を、ミリモーラ
ー以下からミリモーラーの桁の範囲様々な濃度の基質４
−メチルウンベリフェリルNeu5Acの50μｌ、ミリモーラ
ー以下からミリモーラーの範囲の様々な濃度の阻害剤４
−デオキシNeu5Acの150μｌ、および50μｌの100mΜ Ca
Cl2を含む反応混合物と混合した。全ての溶液は50mM酢
酸ナトリウム緩衝液pH5.9中で混合し、最終体積は500μ
ｌに合わせた。37℃で15分から30分間（ウイルス下部に
依存する）インキュベートした後、1.33％エタノールを
含む500μｌの1Mトリス、pH9.0を添加することにより反
応を停止させた。蛍光強度は蛍光分光光度計（Hitachi
Model 3010）を用いて励起波長360nmおよび発行波長450
nmで測定した。1.33％エタノールを含む1Mトリス、pH9.
0中の４−メチル−ウンベリフェロンを標準物質として
用いた。酵素活性は50μｌのウイルス当り１分間当り遊
離したNeu5AcのmMとして表した。基質および阻害剤の濃
度を変化させ、1/v対1/［Ｓ］をプロットすると、典型
的な競合的阻害が示された。阻害剤濃度に対して、1/v
対1/［Ｓ］プロットの傾きをプロットすることにより以
下のように４−デオキシNeu5AcのKiを算出された。
ー以下からミリモーラーの桁の範囲様々な濃度の基質４
−メチルウンベリフェリルNeu5Acの50μｌ、ミリモーラ
ー以下からミリモーラーの範囲の様々な濃度の阻害剤４
−デオキシNeu5Acの150μｌ、および50μｌの100mΜ Ca
Cl2を含む反応混合物と混合した。全ての溶液は50mM酢
酸ナトリウム緩衝液pH5.9中で混合し、最終体積は500μ
ｌに合わせた。37℃で15分から30分間（ウイルス下部に
依存する）インキュベートした後、1.33％エタノールを
含む500μｌの1Mトリス、pH9.0を添加することにより反
応を停止させた。蛍光強度は蛍光分光光度計（Hitachi
Model 3010）を用いて励起波長360nmおよび発行波長450
nmで測定した。1.33％エタノールを含む1Mトリス、pH9.
0中の４−メチル−ウンベリフェロンを標準物質として
用いた。酵素活性は50μｌのウイルス当り１分間当り遊
離したNeu5AcのmMとして表した。基質および阻害剤の濃
度を変化させ、1/v対1/［Ｓ］をプロットすると、典型
的な競合的阻害が示された。阻害剤濃度に対して、1/v
対1/［Ｓ］プロットの傾きをプロットすることにより以
下のように４−デオキシNeu5AcのKiを算出された。
ウイルスのサブタイプ Ki（mM） インフルエンザＡ（H1N1） 0.998 インフルエンザＡ（H3N2） 2.198 インフルエンザＢ 1.050 （天然の基質であるNeu5Acは、インフルエンザＡ（H1N
1）ウイルスを用いた場合、Ki＝0.626mMであった。） ４−デオキシNeu5AcのKiは、その相互作用する速度と
同時に、この化合物がどのように酵素と相互作用をする
かをも示している。一般に、Kiが低ければ、あらゆる与
えられた基質および阻害剤の濃度について阻害の程度は
大きくなる。その基質としての能力を損なうことなく、
天然の化合物と同様の様式で酵素と相互作用し得る、改
変された化合物を得ることも、望まれている。Kiは、化
合物の酵素との相互作用を示す第一の指標である。
1）ウイルスを用いた場合、Ki＝0.626mMであった。） ４−デオキシNeu5AcのKiは、その相互作用する速度と
同時に、この化合物がどのように酵素と相互作用をする
かをも示している。一般に、Kiが低ければ、あらゆる与
えられた基質および阻害剤の濃度について阻害の程度は
大きくなる。その基質としての能力を損なうことなく、
天然の化合物と同様の様式で酵素と相互作用し得る、改
変された化合物を得ることも、望まれている。Kiは、化
合物の酵素との相互作用を示す第一の指標である。
本発明を実施するための上記様式の、有機化学、ウイ
ルス学、生化学、臨床検査、および関連の分野の当業者
に自明な改変が、以下の請求の範囲の範囲に入ることが
意図される。
ルス学、生化学、臨床検査、および関連の分野の当業者
に自明な改変が、以下の請求の範囲の範囲に入ることが
意図される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クリンクスケイルス，シー．ワース アメリカ合衆国 オクラホマ 74133, タルサ，イースト セブンティーエイス ストリート 7817 (72)発明者 ローク，マイケル ディー. アメリカ合衆国 オクラホマ 74055, オワッソ，イースト ナインティーファ ースト ストリート ノース 14855 (56)参考文献 Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓ．, （1980）Ｖｏｌ．142，Ｎｏ．４，ｐ. 516−523 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/34 C07H 15/203 C07H 17/04 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (15)
- 【請求項１】その活性を有することが疑われる臨床試料
中の、ヒトインフルエンザのノイラミニダーゼ活性を検
出する方法であって： （ａ）該試料を、下式の発色性に改変されたＮ−アセチ
ルノイラミン酸基質または該基質の塩と共にインキュベ
ートする工程： ここでAcはアセチルを表し、Ｒは水素、フッ素またはメ
トキシを表し、およびＸは、該基質または該基質の塩か
ら解裂されると異なる色を示す、発色性基を表す；およ
び （ｂ）工程（ａ）の後に該試料−基質混合物が該色を示
すか否かを観察することにより、ノイラミニダーゼ活性
を検出する工程； を包含する、方法。 - 【請求項２】前記臨床試料が、咽頭分泌物、鼻咽頭分泌
物または呼吸器分泌物である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】前記Ｒが水素であり、前記Ｘが４−メチル
ウンベリフェリル、３−シアノウンベリフェリル、２−
ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、３−レゾルフィ
ン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、４−ニ
トロフェニルアゾフェニル、４−ニトロフェニルアゾレ
ゾルシニル、３−メトキシフェニル、３−ジメチルアミ
ノフェニル、４−クロロ−１−ナフチル、および６−ブ
ロモ−２−ナフチルからなる群から選択される、請求項
１または２に記載の方法。 - 【請求項４】前記Ｒがフッ素であり、前記Ｘが４−メチ
ルウンベリフェリル、３−シアノウンベリフェリル、２
−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、３−レゾルフ
ィン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、４−
ニトロフェニルアゾフェニル、４−ニトロフェニルアゾ
レゾルシニル、３−メトキシフェニル、３−ジメチルア
ミノフェニル、４−クロロ−１−ナフチル、および６−
ブロモ−２−ナフチルからなる群から選択される、請求
項１または２に記載の方法。 - 【請求項５】前記Ｒがメトキシであり、前記Ｘが４−メ
チルウンベリフェリル、３−シアノウンベリフェリル、
２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、３−レゾル
フィン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、４
−ニトロフェニルアゾフェニル、４−ニトロフェニルア
ゾレゾルシニル、３−メトキシフェニル、３−ジメチル
アミノフェニル、４−クロロ−１−ナフチル、および６
−ブロモ−２−ナフチルからなる群から選択される、請
求項１または２に記載の方法。 - 【請求項６】ヒトインフルエンザノイラミニダーゼ活性
を有することが疑われる臨床試料中の、ヒトインフルエ
ンザのノイラミニダーゼ活性の特定の型を選択的に検出
する方法であって、 （ａ）該試料を、下式の発色性に改変されたＮ−アセチ
ルノイラミン酸基質または該基質の塩と共にインキュベ
ートする工程： ここでAcはアセチルを表し、Ｒは水素、フッ素またはメ
トキシを表し、およびＸは、該基質または該基質の塩か
ら解裂されると異なる色を示す、発色性基を表す； （ｂ）工程（ａ）の後に該試料−基質混合物が示す該色
を観察する工程；および （ｃ）該色を、該基質に対して該特定の型のヒトインフ
ルエンザノイラミニダーゼおよび他の型のヒトインフル
エンザノイラミニダーゼの活性標準が示す色と、比較す
る工程； を包含する、方法。 - 【請求項７】前記ヒトインフルエンザノイラミニダーゼ
活性の特定の型が、ヒトインフルエンザＡノイラミニダ
ーゼ活性、ヒトインフルエンザＢノイラミニダーゼ活
性、またはパラインフルエンザノイラミニダーゼ活性で
ある、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】前記臨床試料が、咽頭分泌物、鼻咽頭分泌
物または呼吸器分泌物である、請求項６または７に記載
の方法。 - 【請求項９】前記Ｒが水素であり、前記Ｘが４−メチル
ウンベリフェリル、３−シアノウンベリフェリル、２−
ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、３−レゾルフィ
ン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、４−ニ
トロフェニルアゾフェニル、４−ニトロフェニルアゾレ
ゾルシニル、３−メトキシフェニル、３−ジメチルアミ
ノフェニル、４−クロロ−１−ナフチル、および６−ブ
ロモ−２−ナフチルからなる群から選択される、請求項
６、７または８に記載の方法。 - 【請求項１０】前記Ｒがフッ素であり、前記Ｘが４−メ
チルウンベリフェリル、３−シアノウンベリフェリル、
２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、３−レゾル
フィン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、４
−ニトロフェニルアゾフェニル、４−ニトロフェニルア
ゾレゾルシニル、３−メトキシフェニル、３−ジメチル
アミノフェニル、４−クロロ−１−ナフチル、および６
−ブロモ−２−ナフチルからなる群から選択される、請
求項６、７または８に記載の方法。 - 【請求項１１】前記Ｒがメトキシであり、前記Ｘが４−
メチルウンベリフェリル、３−シアノウンベリフェリ
ル、２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、３−レ
ゾルフィン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ル、４−ニトロフェニルアゾフェニル、４−ニトロフェ
ニルアゾレゾルシニル、３−メトキシフェニル、３−ジ
メチルアミノフェニル、４−クロロ−１−ナフチル、お
よび６−ブロモ−２−ナフチルからなる群から選択され
る、請求項６、７または８に記載の方法。 - 【請求項１２】その活性を有することが疑われる臨床試
料中の、ヒトインフルエンザのノイラミニダーゼ活性を
検出するのに有用な、下式を有する発色性基質または該
基質の塩： ここでAcはアセチルを表し、Ｒはメトキシまたはフッ素
であり、およびＸは、該基質または該基質の塩から解裂
されると、異なる色を示す、発色性基である。 - 【請求項１３】前記Ｒがメトキシであり、前記Ｘが４−
メチルウンベリフェリル、３−シアノウンベリフェリ
ル、２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、３−レ
ゾルフィン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ル、４−ニトロフェニルアゾフェニル、４−ニトロフェ
ニルアゾレゾルシニル、３−メトキシフェニル、３−ジ
メチルアミノフェニル、４−クロロ−１−ナフチル、お
よび６−ブロモ−２−ナフチルからなる群から選択され
る、請求項12に記載の発色性基質または該基質の塩。 - 【請求項１４】前記Ｒがフッ素であり、前記Ｘが４−メ
チルウンベリフェリル、３−シアノウンベリフェリル、
２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、３−レゾル
フィン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、４
−ニトロフェニルアゾフェニル、４−ニトロフェニルア
ゾレゾルシニル、３−メトキシフェニル、３−ジメチル
アミノフェニル、４−クロロ−１−ナフチル、および６
−ブロモ−２−ナフチルからなる群から選択される、請
求項12に記載の発色性基質または該基質の塩。 - 【請求項１５】その活性を有することが疑われる臨床試
料中の、ヒトインフルエンザのノイラミニダーゼ活性を
検出するのに有用な、下式を有する発色性基質または該
基質の塩： ここでAcはアセチルを表し、Ｒは水素であり、およびＸ
は発色性基であって、３−シアノウンベリフェリル、２
−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、３−レゾルフ
ィン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、４−
ニトロフェニルアゾフェニル、４−ニトロフェニルアゾ
レゾルシニル、３−メトキシフェニル、３−ジメチルア
ミノフェニル、４−クロロ−１−ナフチル、および６−
ブロモ−２−ナフチルからなる群から選択される。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US45880589A | 1989-12-29 | 1989-12-29 | |
| US458,805 | 1989-12-29 | ||
| PCT/US1990/007681 WO1991009972A1 (en) | 1989-12-29 | 1990-12-27 | Methods for diagnosting human influenza and 4-position modified chromogenic n-acetylneuraminic acid substrates for use therein |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05505099A JPH05505099A (ja) | 1993-08-05 |
| JP3134999B2 true JP3134999B2 (ja) | 2001-02-13 |
Family
ID=23822154
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03502946A Expired - Fee Related JP3134999B2 (ja) | 1989-12-29 | 1990-12-27 | ヒトのインフルエンザを診断する方法ならびにそれに使われる４位修飾の発色性ｎ―アセチルノイラミン酸基質 |
Country Status (10)
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