JPH05505099A

JPH05505099A - ヒトのインフルエンザを診断する方法ならびにそれに使われる４位修飾の発色性ｎ―アセチルノイラミン酸基質

Info

Publication number: JPH05505099A
Application number: JP3502946A
Authority: JP
Inventors: ターナー，グレゴリー　エイ．; メイヤー，ジェイムズ　エフ．; クリンクスケイルス，シー．ワース; ローク，マイケル　ディー．
Original assignee: サイメックス　コーポレイション
Priority date: 1989-12-29
Filing date: 1990-12-27
Publication date: 1993-08-05
Anticipated expiration: 2016-02-13
Also published as: EP0507854B1; JP3134999B2; CA2072368A1; ATE145673T1; WO1991009972A1; EP0507854A1; ES2097804T3; DE69029276D1; CA2072368C; EP0507854A4; AU7164791A; GR3022421T3; AU656721B2; DE69029276T2; DK0507854T3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトのインフルエンザを，断　る　゛ならびにそれにわれる４　１の　Ｎ−アセチルノイラミン技１しし賢本発明は、ヒトのインフルエンザに対する診断テストに関する。さらに詳細には、本発明は、ヒトのインフルエンザのノイラミニダーゼ（ＨＡ）酵素活性の検出によるインフルエンザの診断に有用な、発色性（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ）の基質に関する。

１五立！ｉインフルエンザウィルスは、平均すると米国内だけでも年間３Ｇ−５０百万人に感染する。インフルエンザ流行の疫学的研究は、全人口では２５％および学齢期の子供ではもつと高率になる感染の発生を推定している。研究者らは、感染した人の半数までが、身体の具合いが悪いために医師を訪ねていると推定しｒｌ．Ｎる。　１９３６年に、疾病管理センター（ｔｈｅ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）（ＣＤＣ）は、インフルエンザ流行がこれまでの２８年間のうち１８年でｔｏ，０００Å以上の死亡者に結び付いていると推定した。ＣＤＣの研究は、米国における死亡の第５番目の原因としてインフルエンザを指摘している。インフルエンザＡおよびＢの表面域タンパク質の抗原性変異がその絶え間ない流行の原因となっている。

インフルエンザウィルスは、ＮＡ活性を持つ表面域タンパク質を有している。これらの糖タンパク質は、ウィルス、細菌、マイコプラズマおよび動物組織に見られるノイラミニダーゼファミリーの一員である。それらは、アルファーケトシト結合されたＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ　；以前はｒＮＡＮＡＪと呼ばれていた）を含む基質を加水分解する。ウィルスでは、ＮＡは典型的には５ −１０％のウィルスタンパク質を構成し、そしてエンベロープ上のマツシュルーム状スパイクとして存在している。

ウィルスのＮＡは、酵素の触媒部位を含む親水性領域およびウィルスに酵素を固定するようにウィルスのエンベロープに挿入される疎水領域から構成されている。

ＮＡ活性の種々のアッセイが、文献中に記載されている。Ｓａｎｔｅｒ，　Ｕ．Ｖ．ら、Ｂｉｏｃｈｉ＋＊ｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　５２３：　４３５−４４２　（１９７８）は、基質として２−（３−メトキシフェニル）−Ｎ−アセチル−アルファー〇ーフイラミン酸および酵素的に放出されるメトキシフェノールを測定するために、酸化剤の存在下で４−アミノアンチピリンを用いたＮＡの比色分析を記載している。Ｍｙｅｒｓ．　ＲＪ．ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１０１：　１６６−１７４　（１９８０）は、ＮＡの蛍光定量分析へのＮｅｕ５Ａｃの４−メチルウンベリフエリルーアルファーゲトシドの使用を記載している。このＮｅｕ５Ａｃの発色性誘導体はまた、Ｙｏｌｋｅｎ．　Ｒ．Ｈ．ら、Ｊ．　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　１４２：　５１１６−５２３　（１９８Ｇ）；　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７：　１４９Ｇ−１４９８　（１９８１）；および、Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ４：　３５−６８　（１９８２）；およびＩ［ｉｙｏｔａｎｉら、Ｂｉｒｏｓｈｉｍａ　Ｊ．　ＭｅｄｉｃａＩ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　３３：　２８７−２９２　（１９８４）　；　Ｚｂｌ　Ｂａｋｔ　Ｈｙｇ　Ａ２６０−２７３−２８５　（１９８５）；　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｉｔａ＋ｕｎ．　３１：　１１３１−１１３５　（１９８７）、によってインフルエンザウィルスのＮＡ活性の研究にも用いられた。しかしながら、これらの従来のＮＡアッセイが利用可能であるにも関わらず、現在まだ医者たちはもっばら症候に基づいてインフルエンザを診断している。これは幾分は、これらの従来のアッセイが複雑であり、そして／あるいは病院設備には典型的には見られない器具を必要とするという事実に起因している。これらの従来のアッセイの他の欠点は、これらのアッセイがインフルエンザ型の間を識別し得ないことである。その能力は、感染と戦うための適切な化学療法および／あるいは支持療法を医者たちが処方し得るために特に重要なことである。

従来の研究者たちは、Ｎｅｕ５Ａｃの化学構造とその非インフルエンザのＮＡに対する基質としての生物学的機能との間の関連を研究してきたｏ　Ｇｒｏｓｓ．　Ｈ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７：　４２７９（１９８８）は、３種の異なる細１１１ＮＡ群（Ｃ．　ｅｒｆｒｉｎ　ｅｎｓ，　Ａ．　ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ．　およびＶ．　ｃｈｏｌｅｒａ）に対する基質としてのドアセチル−４−エビーＤーフイラミン酸のベンジル−アルファーグリコシド類を調べ、そして反応性に有意な相違を見いだした。２２時間後、Ｃ．■バｊ」阻ｕのＨＡは、その基質の１００％を切り離したが、一方ＳＡ．　ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ，　およびＶ．　１追！組のＮＡはそれぞれその基質のたった５・０％および１１％を切り離した。　Ｋｉｌら、Ｊ．　Ａｍ。

Ｃｈｅｗ．　Ｓａｃ．　１１０：　６４８１−６４８６　（１９８ｇ）は、ＮｅｕＳＡｃアルドラーゼに受け入れられる基質・の構造状の特徴、そのＮｅｕ５Ａｃの合成への使用、および２−デオキシ誘導体へのその化学変換を記載し、そしてさらに、研究がその２−デオキシ誘導体の生物学的活性を測定するべ（進展中であることを報告した。Ｂｒｏｓｓｍｅｒら、Ｈｅ１ｖ、　Ｃｈｉｔ　Ａｃｔａ、　６９：　２１２７　（１９８６）；　Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　４：１４５　（１９８７）は、４−デオキシＮｅｕ５Ａｃのメチル−アルファーグリコシドが家禽ベストのウィルスＮｅｕ５Ａｃに対するよい基質であったが、しかし上述した３種の細菌のＮＡ群に対してはそうでないことを報告した。さらに、　５ｃｈａｕｅｒ、　Ｒ，ら、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｔｏｃｈｅｍ、１０６：　５３１　（１９８０）は、４−メトキシＮ、ｅｕ５Ａｃが家禽ペストのウィルスＮＡに対する優れた基質であったが、しかしＶ、　ｃｈｏｌｅｒａのＮＡに対してはそうでないことを報告した。　４−デオキシＮｅｕ５Ａｃの・４−メチルウンベリフェリル誘導体もまた、文献に記載されている（Ｈｅｌｖ、　Ｃｈｉ＋ｍ、　Ａｃｔａ、　６９二１９２７　（１９８６＞）ｏ　Ｚｂｉｒａｌら、Ｍｏｎａｔｓｈｅｆｔ　ｆｕｒ　Ｃｈｅ＋＊ｉｅ　１１９：　１２７−１４１　（１９８８）、は、７−および８−デオキシＮｅｕ５Ａｃおよび４．７−ジデオキシＮｅｕ５Ａｃの合成を記載した。　Ｚｂｉｒａｌら、Ｌｉｅｂｉｇｓ　Ａｎｎ　Ｃｈｅ＋＊　１１９：　１２７−１４１　（１９８９）は、７−エビ、８−エビ、７．８−ビス−エピ、８−デオキシ、９−デオキシおよび４．７−ジデオキシＮｅｕ５Ａｃの４−メチルウンベリフェリル−２−αグルコシドの合成を記載し、そしてＶ、　ｃｈｏｌｅｒａ由来のシアリダーゼの阻害剤としてのそれらの化合物の反応を研究した。

出願人は、４位修飾のＮｅｕ５ＡｃとヒトのインフルエンザＮＡとの反応性について、いかなる先行する報告も知らない。

＆五二笠丞本発明の一つの面は、その活性を有することが疑われる臨床試料中の、ヒトインフルエンザのフイラミノダーゼ活性を検出する方法であって、（ａ）該試料を、下式の発色性に改変されたＮ−アセチルノイラミン酸基質と共にインキュベートする工程：ここでＡｃはアセチルを表し、Ｒは水素、フッ素またはメトキシを表し、およびＸは、該基質または該基質の塩から解裂されると異なる色を示す、発色性基を表す、および（ｂ）工程（ａ）の後に該試料−基質混合物が該色を示すか否かを観察することにより、ノイラミニダーゼ活性を検出する工程；を包含する、方法である。

本発明の他の面は、ヒトインフルエンザノイラミニダーゼ活性を有することが疑われる臨床試料中の、ヒトインフルエンザのフイラミノダーゼ活性の特定の型（例えばＡまたはＢ）を、ヒトインフルエンザノイラミニダーゼの他の型が示す活性から選択的に検出する方法であって、（ａ）該試料を、下式の発色性に改変されたＮ−アセチルノイラミン酸基質と共にインキュベートする工程：ここでＡｃはアセチルを表し、Ｒは水素、フッ素またはメトキシを表し、およびＸは、該基質または該基質の塩から解裂されると異なる色を示す、発色性基を表す：（ｂ）工程（ａ）の後に該試料−基質混合物が示す該色を観察し：および（ｃ）該色を、該基質に対して該特定の型のヒトインフルエンザノイラミニダーゼおよび他の型のヒトインフルエンザノイラミニダーゼの活性標準が示す色と、比較する工程；を包含する、方法である。

本発明のさらに他の面は、その活性を有することが疑われる臨床試料中の、ヒトインフルエンザのフイラミノダーゼ活性を検出するのに有用な、改変されたＮｅｕ５Ａｃ発色性基質および該基質の塩であり、該基質は下式を有する：ここでＡｃはアセチルを表し、Ｒはメトキシまたはフ・ノ素であり、およびＸは、該基質または該基質の塩から解裂されると、異なる色を示す、発色性基である。

本発明のさらに他の面は、その活性を有することが疑われる臨床試料中に、ヒトインフルエンザのノイラミニダーゼ活性を検出するのに有用な、下式を有する発色性基質、およびここでＡｃはアセチルを表し、Ｒは水素であり、およびＸは、３−シアノウンベリフェリル、２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、３− レゾルフィン、５−フロモー４−クロロ−３−インドリル、４−ニトロフェニルアゾフェニル、４−ニトロフエニルアゾレゾルシニル、３−メトキシフェニル、３−ジメチルアミノフェニル、４−クロロ−１−ナフチル、および６−プロモー２−ナフチルからなる群から選択される。

１１立１！呈■ユ図面において：図１は、実施例１に記載された合成過程を示すスキーム図である。

図２は、実施例２に記載された合成過程を示すスキーム図である。

図３は、実施例３に記載された合成過程を示すスキーム図である。

図４は、実施例４に記載された合成過程を示すスキーム図である。

図５は、実施例５に記載された合成過程を示すスキーム図である。

図６は、実施例６に記載された合成過程を示すスキーム図である。

良朋ｍ掻本発明の発色性に修飾されたＮ−アセチルノイラミン酸基質類およびそれらを用いる方法は、臨床試料あるいは標本中のヒトインフルエンザのノイラミニダーゼ活性を検出すること、およびその試料中に存在するヒトインフルエンザのノイラミニダーゼの型を識別することに有効である。従って、これらの基質および方法は、その臨床試料を採取した患者に存在する、インフルエンザの感染型、およびインフルエンザ感染を一般的に診断するのに有用である。これに関して、用語「インフルエンザ」は、インフルエンザＡおよびＢ型およびパラインフルエンザ１．２および３型を含むことを意味する。用語「選択的検出」は、ある型のインフレンザウイルスのＮＡ活性を他の型のインフルエンザウィルスの活性と比較して検出する能力を意味する。

本発明でテストされる臨床試料は、典型的には、インフルエンザに罹患している患者から、洗浄液、綿棒あるい吐き出した標本として採取した咽頭、鼻咽頭あるいは呼吸器の分泌物である。この洗浄液、吐き出したものあるいは綿棒は、好ましくは、基質と混合する前に、安定化剤を含む水性緩衝液と混ぜ合わせる。この緩衝液は、ｐＨを４から７、好ましくは５゜５から６．５までに維持する緩衝剤、さらに必要に応じて重量で約０．１％から１０％までの非イオン性界面活性剤、少量（１−２０ｍＭ）のアルカリ土類金属陽イオン（Ｃａ、　Ｍｇ、好ましくはＣａ）、および試料中のＮＡの温度安定性を促進するようなアルジトール、単糖類および三糖類からなる群から選択される十分な量の安定剤を含む。標本と混ぜ合わせる緩衝液の量は、通常は０．１から２ｍｌである。

緩衝液は、有機あるいは無機のどちらでもよい。好適な緩衝液の例は、以下のような有機酸類およびその塩類の通常の緩衝液である。例えば、クエン酸緩衝液（例えば、クエン酸モノナトリウム−クエン酸２ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸３ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸モノナトリウム混合物、など）、酢酸緩衝液（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物）、コハク酸緩衝液（例えば、コハク酸−コハク酸モノナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸２ナトリウム混合物、など）、酒石酸緩衝液（例えば、酒石酸−酒石酸塩混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物、など）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸−フマル酸モノナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸２ナトリウム混合物、フマル酸モノナトリウム−フマル酸２ナトリウム混合物）、グルコン酸緩衝液（例えば、グルコン酸 −グルコン酸ナトリウム混合物、クルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルーン酸−グルコン酸カリウム混合物、など）、シュウ酸緩衝液（例えば、シュウ酸 −シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸− シュウ酸カリウム混合物、など）、乳酸緩衝液（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物、など）、酢酸緩衝液（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物、など）、マレイン酸緩衝液（例えば、Ｄ、Ｌ−マレイン酸−マレイン酸２ナトリウム混合物）、リン酸緩衝液（例えば、リン酸モノナトリウム−リン酸２ナトリウム混合物、リン酸モノナトリウム−水酸化ナトリウム混合物、リン酸３ナトリウム−塩酸混合物、など）　、２−（Ｎ−モルホ“リノ）エタンスルホン酸、［ビス−（２−ヒドロキシエチル）イミノ］トリス（ヒドロキシメチル）メタン、ト２−アセトアミドイミノ２酢酸、１．３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノコプロパン、ピペラジン−Ｎ、　Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）、Ｎ−２−アセトアミド−２−アミノエタンスルホン酸、３−（Ｎ− モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、トＮ−ビス−（２−ヒドロキシエチル）２−アミノエタンスルホン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、２−［）リス（ヒドロキシメチル）メチルアミノコエタンスルホン酸、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎｏ−２−エタンスルホン酸、３−（［１−リス（ヒドロキシメチル）メチルコアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸である。

緩衝液中に有用な非イオン性界面活性剤の例は、プルロニクス（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）、例えばポリツルベイト（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）２０あるいはポリツルベイト８０、トライトンＸ−１００、ＮＰ−’４０．およびＣａ−Ｃ，；アルキルグルコシドのようなアルキルグルコシド類である。界面活性剤は、付加的な成分であり、そしてウィルスエンベロープからのＮＡの遊離を促進する。

緩衝液中で使われる安定剤の例は、グリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトールのような三価あるいはそれ以上のアルジトール類、単糖類のグルコースおよびフルクトースおよび三糖類のスクロースである。これらの多価の糖アルコール、および単糖および三糖類は、単独であるいは組み合わせで使われ得る。ノイラミニダーゼ含有のウィルスの活性を安定化させるために、アルジトール類あるいは単糖類および三糖類が、０．２Ｍから２゜１Ｍまで、好ましくは０．６Ｍから２．０Ｍまでの量で液体の処方／賦形剤系に加えられる。

一旦緩衝液と混合されると、試料は長い期間、好ましくは２°Ｃから８°Ｃで有意なＮＡ活性の減少なしに貯蔵され得る。

緩衝・安定化された標本と混ぜ合わされる基質は、発色性（ＤＮｅｕ５Ａｃ誘導体であり、この誘導体は、４位の位置のヒドロキシル基の除去、ヒドロキシル基と７）素の置換、あるいはヒドロキシル基の水素と低級アルキル基との置換によって修飾されている。これらの基質は、以下の化学構造式で表され得る：（以下余白）Ｒ，ＸおよびＡｃは、前記に同じである。好ましくは、Ｘは４−メチルウンベリフェリル、３−シアノウンベリフェリル、２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、３−レゾルフィン、５−フロモー４−クロロ−３−インドリル、ニトロフェニルアゾフェニル、ニトロフェニルアゾレゾルシニル、３−メトキシフェニル、３−ジメチルアミノフェニル、４−クロロ−１−ナフチル、あるいは６−ブロモ−２−ナフチルを表す。これらの基質のＮａ５ＫおよびＮｉ１４”塩類のような単純な塩類もまた使用され得る。

本願中で使用される用語「発色体」は、これらに限定されないか、蛍光を出す分子を含むことを意図している。用語「色」は、同様にこれらに限定されないか、蛍光を含むことを意図している。

上記の構造内に属する４位修飾の発色性Ｎｅｕ５Ａｃ誘導体の例は、４−メチルウンベリフェリル−４−デオキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシト、３−シアノウンベリフェリル−４−デオキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α− ケトシト、２−ニトロフェニル−４−デオキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α −ケトシト、４−ニトロフェニル−４−デオキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸− α−ケトシト、３−レゾルフィン−４−デオキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸− α−ケトシト、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−４−デオキシ−Ｎ− アセチルノイラミン酸−α−ケトシト、２−［４−（４−ニトロフェニルアゾ）フェニル］−４−デオキシーＮ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシト、２−［４−（４−ニトロフェニルアゾ）レゾルシニル］−４−デオ牛シーＮ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシト、３−メト牛ジフェニルー４−デオ牛シーＮ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシト、３−シメチルアミノフエニル−４−デオキシ −Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシト、４−クロＣ−１−ナフチル−４− デオキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシト、６−ブロモ−２−ナフチル−４−デオキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシト、４−メチルウンベリフェリル−４−メトキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシト、２− ニトロフェニル−４−メト牛シーＮ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシト、４ −ニトロフェニル−４−メト牛シーＮ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシト、３−シアノウンベリフェリル−４−メトキン−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α− ケトシト、３−レゾルフィン−４−メトキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α− ケトシト、５−ブロモー４−クロロ−３−インドリル−４−メトキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシト、２−［４−＜４−ニトロフェニルアゾ）フェニル］−４−メトキシーＮ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシト、２−［４− （４−ニトロフェニルアゾ）レゾルシニル］−４−メト牛シーＮ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシト、３−メトキシフェニル−４−メトキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケト／ド、３−ジメチルアミノフェニル−４−メトキン−Ｎ −アセチルノイラミン酸−α−ケトシト、６−ブロモ−２−ナフチル−４−メトキン−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシト、４−クロロ−１−ナフチル− ４−メトキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシト、４−メチルウンベリフェリル−４−フルオロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシト、２−ニトロフェニル−４−フルオロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシト、４−ニトロフェニル−４−フルオロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシト、３− シアノウンベリフェリル−４−フルオロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシト、３−レゾルフィン−４−メトキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシト、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−４−フルオロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシト、２−［４−（４−ニトロフェニルアゾ）フェニルゴー４−フルオロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシト、２−［４−（４ −ニトロフェニルアゾ）レゾルシニル］−４−フルオロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシト、３−メトキシフェニル−４−フルオロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシト、３−ジメチルアミノフェニル−４−フルオロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシト、４−クロロ−１−ナフチル−４−フルオロ −Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシト、および６−ブロモ−２−ナフチル −４−フルオロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸−α−ケトシトである。

上述のＮｅｕ５Ａｃ誘導体は、一般に、１．２．７．８および９位にあるＮｅｕ５Ａｃの官能基を保護し、指示されるように４位を修飾し、１．２．７，８および９位を脱保護し、そして４位ｖｉ飾のＮｅｕ５Ａｃと発色体とを結合させることによって作られる。これらの反応の詳細は、以下の実施例に与えられている。

基質は、標準的には０．０５ａ＋ＭとＯ，ＳｓＭとの間の範囲に入る量が、緩衝・安定化された試料に加えられる。この混合物は、周囲の温度から生理学的温度（例えば、約２２℃から３７℃まで）までで、試料中の任意のＮＡが基質と反応するのに十分な時間、インキュベートされる。その時間は、標準的には２０から１２０分の範囲で、さらに通常は３０から６０分である。試料中にＮＡ活性があれば、発色基は基質から切り離され、そして遊離される発色体は混合物に特徴的な色を与える。本発明の基質は異なるヒトインフルエンザＮＡ類にそれぞれ異なる反応性を示すので、インフルエンザ感染の特定の型は、試料の混合物の色を、色と比較することにより識別される。例えば、インフルエンザＡとインフルエンザＢとは、これらのインフルエンザウィルスのＮＡに対する基質の反応性に基づいて識別される。以下の表は、ＮＡが修飾された１Ｊｅｕ５Ａｃと反応し、そして発色体を放出した時に生ずる色を示している。

（以下余白）腺上目りへ邊」シ【生　検上舒λ型　色５−ブロモー４−クロロ−比色／　青／紫３−インドロール　可視　ニトロブルーテトラゾリウム存在下４−メチルランベリ　蛍光　３６０ｎｏ＋で励起後の４５０フエロン　ｎｍでの蛍光放射３−シアノランベリ　蛍光　４１５ｎｍで励起後の４５４フエロン　ｎｍでの蛍光放射レゾルフィン　比色／　ピンク／赤可視２−ニトロフェノール　比色／　黄色可視４−ニトロフェノール　比色／黄色可視ニトロフェニル−比色／　オレンジアゾフェノール　可視ニトロフェニル−比色／′緑緑青アゾレゾシンノール　可視　（Ｍｇ”存在下）３−メトキシフェノール　比色／赤かう青可視　ジアゾニウム塩と反応後３−ジメチルアミノ−比色／　赤から青フェ／　−ル　可視　ジアゾニウム塩と反応後４−クロロ−１−比色／　赤から青ナフソール　可視　ジアゾニウム塩と反応後６−ブロモ−２−ナフソール　比色／　赤から青可視　ジアゾニウム塩と反応後従って、本発明は、病院あるいは医院で実行され得、そして感染を処置するための適切な治療および／あるいは感染した患者と身近に接触する人への適切な予防処置を医者が指示し得る、インフルエンザを選択的に診断するための単純ですばやい方法を提供する。

本発明は、さらに以下の実施例によって例証される。これらの実施例は、どんな意味でも本発明を限定する意図はない。

Ｌ嵐五１．４−デオキシＮｅｕ５Ａｃのムこの合成の反応スキームを図１に示す。

１００ｍ１のメタノール中のＮｅｕ５Ａｃ　（５００ｍｇ）および１．２５ｇのＤｏｖｅｘ−５０Ｗ（Ｉ（”）を還流１度で２０時間加熱し、そして脱色用カーボンで処理してＮｅｕ５Ａｃのメチルエステルメチルケトシト（Ｎｅｕ５Ａｃ− ＭＥＭＫ＞を得た。乾燥アセトン（モレキニラーシーブで乾燥させた）中のこのケトシトにｐ−トルエンスルホン酸−水和物を触媒として添加し、攪拌しながら室温で４時間反応させた。Ｄｏｖｅｘ−１（アセテート型）で中和し、そして溶媒をエバポレーションし、８．９−インプロピリデンＮｅｕ５Ａｃメチルエステルメチルケトシドを得た。塩化メチレン中のメタンスルホニル−クロリドおよび１．５当量のトリエチルアミンで０℃で３０分間処理することにより４−メシル化−８，９−イソプロピリデンＮｅｕ５Ａｃメチルエチルケトシトを得た。このメシレートを次に、アセトンまたはメチルエチルケトン中のヨウ化ナトリウムで処理し、密封した反応バイアル中で約１００℃で加熱して４−ヨード化合物を形成させた。続いてパラジウムカーボンで水素化し、４−デオキシ分子を得た。脱保護はまず、水酸化ナトリウムで処理した後、希ＨＣ１／Ｄｏｗｅｘ−５０Ｗ（Ｈ”）で処理して行い、４−デオキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を得た。

２．２−　−二トロフェニル−４−デオキシＮ　ｅ　ｕ　５　Ａ　ＣのＡこの合成の反応スキームを図２に示す。

実施例１の４−デオキシＮｅｕ５Ａｃをメタノール中のトリフルオロ酢酸と共に室温で攪拌することにより、対応するメチルエステルに変換した。このメチルエステルを次に、過剰量の塩化アセチルで一晩処理して、完全にアセチル化した２ −クロロ−４−デオキシＮｅｕ５Ａｃメチルエステルを形成させた。この中間体を次に、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のと胆−ニトロフェノールのナトリウム塩と室温で２時間処理した。力・ノブリングした発色性の４−デオキシＮｅｕ５Ａｃを次に、メタノール中でナトリウムメトキシドで処理（１時間）した後、水酸化ナトリウムで処理（２時間）することにより脱保護して２−（巨−二トロフェニル）−４＝デオキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸のナトリウム塩を形成させた。

３゜４−メトキシＮｅｕ５Ａｃのムこの合成の反応スキームを図３に示す。

ＮｅｕＳＡｃ−ＭＥＭＫを１当量の皿−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）クロリド、イミダゾールおよび触媒量の４−ジメチルアミ／ピリジンと６５℃で処理し、９−９−０−ＴＢＤ　ＮｅｕＳＡｃ−ＭＥＭＫを得た。この化合物をア七トンおよび触媒量のｐ−１−ルエンスルホン酸−水和物と室温で処理して９−０ −９−０−ＴＢＤ、８−インプロピリデンＮｅｕ５Ａｃ−ＭＥＭＫを得た。エーテル中のジアゾメタン／トリフルオロボレートと０℃で処理することにより対応する４−メトキシ誘導体を得た。この化合物を、水酸化ナトリウムで処理した後ＴＨＦ中のテトラブチルアンモニウムフルオリドで処理し、そして最後に希ＨＣＩ／Ｄｏｗｅｘ−５０Ｗ（Ｈ’）で処理することにより完全に脱保護して４−メトキン−Ｎ−アセチルノイラミン酸を得た。

４、　２−（−ニトロフェニル）−４−メトキシＮｅｕ５Ａｃの合この合成の反応スキームは図４に示されている。

９−ＴＢＤＭＳ−７，８−インプロピリデンで保護された４−メトキシＮｅｕ５Ａｃ−ＭＥＭＫをトシル酸処理の後、テトラヒドロフラン中のテトラブチルアンモニウムフルオリドで処理して脱保護した。この中間体を次に、過剰の塩化アセチルと一晩処理して、完全にアセチル化された２−クロロ−４−メト牛シＮｅｕ５Ａｃメチルエステルヲ形成させる。ニトロフェニル色原体のナトリウム塩とのカップリングを、乾燥ＤＭＦ中で室温にて２時間行った。メタノール中のナトリウムメトキシドと処理した後、水酸化ナトリウムで処理することにより、脱保護および脱プロトン化が行われ、２−（２−ニトロフェニル）−４−メトキシ−Ｎ −アセチルノイラミン酸のナトリウム塩を得た。

５．４−フルオロ　ＮｅｕＳＡｃのムこの反応の反応スキームは図５に示されている。

１００ｍ１のメタノール中のＮｅｕＳＡｃ　（５００ｍｇ）および１．２５ｇのＤｏｖｅｘ−５０Ｗ（Ｈ”）を還流温度で２０時間加熱し、そして脱色用カーボンと処理してＮｅｕＳＡｃのメチルエステルメチルケトシト（ＮｅｕＳＡｃ−ＭＥＭに）を得る。乾燥アセトン（モレキュラー７−ブで乾燥させた）中のこのケトシトにｐ−トルエンスルホン酸−水和物を触媒として添加し、攪拌しながら室温で４時間反応させる。Ｄｏｖｅｘ−１（アセテート型）で中和し、そして溶媒をエバポレーションし、８．９−イノプロピリデンＮｅｕ５Ａｃメチルエステルメチルケトンドを得た。この化合物を次に、アセトニトリル中で４オングストロームのモレキュラー７−ブを用いて、重クロム酸ピリジニウム（ＰＤＣ）または四酸化ルテニウムのいずれかにより選択的に４−ケト誘導体に酸化させた。テトラヒドロフラン中のボラン−アンモニアでの穏和な還元により反転した４−アルコールを得、これは次に、ジエチルアミノサルファートリフルオリド（ＤＡＳＴ）によって４−フルオリド（立体配置の反転を伴う）に変換し得る。脱保護は、まず水酸化ナトリウムで処理した後、希ＨＣＩ／Ｄｏｗｅｘ−５０Ｗ　（Ｈ”）で処理して行ない、４−フルオロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を得た。

６、２−（４−クロ０−１−ナフチル）−４−フルオロＮｅｕ５Ａｃの合この合成の反応スキームは図６に示されている。

実施例５の４−フルオロＮｅｕ５Ａｃをメタノール中で、トリフルオロ酢酸と共に処理することにより、対応するメチルエステルに変換した。過剰の塩化アセチル中での反応は遊離のアルコール基をアセチル化し、そして同時に、グリコジルクロリドへの変換が起こった。１当量のＮａＯＨ水溶液により４−クロロ−１＝ナフトール（４−ＣＮ）のナトリウム塩を調製した。ペンジルトリエチルアンモニワムクロリド（相間移動試薬）の存在下でのこの水性４−ＣＮ溶ｄ　（２，５当ｊりとクロロホルム中のグリコジルクロリドとの反応は、カップリングされた発色性化合物を与えた。

アセテート基およびメチルエステル基の脱保護を、ナトリウムメトキシドおよび水酸化ナトリウムで処理して行い、２−（４−クロロ−１−ナフチル）−４−フルオロＮｅｕ５Ａｃのナトリウム塩ヲ得た。

７．４−デオキシＮｅｕ５Ａｃの　素泊試験５０μｌのインフルエンザウィルス溶液を、ミリモーラ−以下からミリモーラ−の桁の範囲様々な濃度の基質４−メチルウンベリフェリル−ＮｅｕＳＡｃの５０μ■、ミリモーラ−以下からミリモーラ−の範囲の様々な濃度の阻害剤４−デオキシＮｅｕ５Ａｃの１５０μ１１　および５０μｌの１００ｍＭ　ＣａＣｌ２を含む反応混合液と混合した。全ての溶液は５０＋＋＋Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５，９中で混合し、最終体積は５００μｍに合わせた。３７°Ｃで１５分から３０分間（ウィルス下部に依存する）インキュベートした後、１．３３％エタノールを含む５００μｌの１Ｍトリス、ｐＦＩ９．ｏを添加することにより反応を停止させた。蛍光強度は蛍光分光光度計（Ｈｉｔａｃｈｉ　Ｍｏｄｅｌ　３０１０）を用いて励起波長３６０ｎｍおよび発光波長４５０ｎｍで測定した。

１．３３％エタノールを含むｌｉリス、ｐＨ９，０中の４−メチル−ウンベリフェロンを襟準物質として用いた。酵素活性は５０μｌのウィルス当り１分間当り遊離したＮｅｕＳＡｃの１Ｍとして表した。基質および阻害剤の濃度を変化させ、１／ｖ対１／［Ｓ］をプロｙ卜すると、典型的な競合的阻害が示された。阻害剤濃度に対して、１／ｖ対１／［Ｓ］プロットの傾きをプロットすることにより以下のように４−デオキシＮｅｕ５ＡｃのＫｉが算出された。

ウィルスのサブタイプ　■１インフルエンザＡ（ＦＩＩＮＩ）　０．９９８インフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）　２．１９８インフルエンザ８　１．０５０（天然の基質であるＮｅｕ５Ａｃは、インフルエンザＡ（ＨＩＮＩ）ウィルスを用いた場合、Ｋｉ＝０．６２６＋ｅＭであった。）４−デオキシＮｅｕ５ＡｃのＫｉは、その相互作用する速度と同時に、この化合物がどのように酵素と相互作用をするかをも示している。一般に、Ｋｉが低ければ、あらゆる与えられた基質および阻害剤の濃度について阻害の程度は大きくなる。その基質としての能力を損なうことなく、天然の化合物と同様の様式で酵素と相互作用し得る、改変された化合物を得ることも、望まれている。Ｋｉは、化合物の酵素との相互作用を示す第一の指標である。

本発明を実施するための上記様式の、有機化学、ウィルス学、生化学、臨床検査、および関連の分野の当業者に自明な改変が、以下の請求の範囲の範囲に入ることが意図される。

Ｆｉｇｕｒｅ　２−２Ｆｉｇｕｒｅ　４−２Ｆｉｇｕｒｅ　６−２要約書４位の位置がヒドロキシル基の除去、ヒドロキシル基とフッ素の置換、あるいはヒドロキシル基の水素とメチル基トノ置換によって修飾された発色性のＮｅｕ５Ａｃ誘導体が、インフルエンザ感染を選択的に診断する目的で、臨床標本中のヒトインフルエンザのノイラミニダーゼ活性の比色アッセイの基質として用いられる。この基質は異なるインフルエンザノイラミニダーゼ類にそれぞれ異なる反応性を示し得、従ってインフルエンザ感染の特定の型を職別すること、そしてそれに対する適切な処置および／または支持療法を処方することが可能になる。

国際調査報告一−醤１・Ｐ−・・−・・−・・−ａｌｍ−、＝’Ｉ＝ＰＣＴ／１３５９０１０７６８１

Claims

【特許請求の範囲】

１．その活性を有することが疑われる臨床試料中の、ヒトインフルエンザのノイラミノダーゼ活性を検出する方法であって：（ａ）該試料を、下式の発色性に改変されたＮ−アセチルノイラミン酸基質と共にインキュベートする工程：▲数式、化学式、表等があります▼ ここでＡｃはアセチルを表し、Ｒは水素、フッ素またはメトキシを表し、およびＸは、該基質または該基質の塩から解裂されると異なる色を示す、発色性基を表す；および（ｂ）工程（ａ）の後に該試料−基質混合物が該色を示すか否かを観察することにより、ノイラミニダーゼ活性を検出する工程；を包含する、方法。
２．前記臨床試料が、咽頭分泌物、鼻咽頭分泌物または呼吸器分泌物である、請求項１に記載の方法。
３．前記Ｒが水素であり、前記Ｘが４−メチルウンベリフェリル、３−シアノウンベリフェリル、２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、３−レゾルフィン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、４−ニトロフェニルアゾフェニル、４−ニトロフェニルアゾレゾルシニル、３−メトキシフェニル、３−ジメチルアミノフェニル、４−クロロ−１−ナフチル、および６−ブロモ−２−ナフチルからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
４．前記Ｒがフッ素であり、前記Ｘが４−メチルウンベリフェリル、３−シアノウンベリフェリル、２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、３−レゾルフィン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、４−ニトロフェニルアゾフェニル、４−ニトロフェニルアゾレゾルシニル、３−メトキシフェニル、３−ジメチルアミノフェニル、４−クロロ−１−ナフチル、および６−ブロモ−２−ナフチルからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
５．前記Ｒがメトキシであり、前記Ｘが４−メチルウンベリフェリル、３−シアノウンベリフェリル、２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、３−レゾルフィン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、４−ニトロフェニルアゾフェニル、４−ニトロフェニルアゾレゾルシニル、３−メトキシフェニッル、３−ジメチルアミノフェニル、４−クロロ−１−ナフチル、および６−ブロモ−２−ナフチルからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
６．ヒトインフルエンザノイラミニダーゼ活性を有することが疑われる臨床試料中の、ヒトインフルエンザのノイラミノダーゼ活性の特定の型を選択的に検出する方法であって、（ａ）該試料を、下式の発色性に改変されたＮ−アセチルノイラミン酸基質と共にインキュベートする工程：▲数式、化学式、表等があります ▼ ここでＡｃはアセチルを表し、Ｒは水素、フッ素またはメトキシを表し、およびＸは、該基質または該基質の塩から解裂されると異なる色を示す、発色性基を表す；（ｂ）工程（ａ）の後に該試料−基質混合物が示す該色を観察する工程；および（ｃ）該色を、該基質に対して該特定の型のヒトインフルエンザノイラミニダーゼおよび他の型のヒトインフルエンザノイラミニダーゼの活性標準が示す色と、比較する工程；を包含する、方法。
７．前記ヒトインフルエンザノイラミニダーゼ活性の特定の型が、ヒトインフルエンザＡノイラミニダーゼ活性、ヒトインフルエンザＢノイラミニダーゼ活性、またはパラインフルエンザノイラミニダーゼ活性である、請求項６に記載の方法。
８．前記臨床試料が、咽頭分泌物、鼻咽頭分泌物または呼吸器分泌物である、請求項６または７に記載の方法。
９．前記Ｒが水素であり、前記Ｘが４−メチルウンベリフェリル、３−シアノウンベリフェリル、２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、３−レゾルフィン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、４−ニトロフェニルアゾフェニル、４−ニトロフェニルアゾレゾルシニル、３−メトキシフェニル、３−ジメチルアミノフェニル、４−クロロ−１−ナフチル、および６−ブロモ−２−ナフチルからなる群から選択される、請求項６、７または８に記載の方法。
１０．前記Ｒがフッ素であり、前記Ｘが４−メチルウンベリフェリル、３−シアノウンベリフェリル、２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、３−レゾルフィン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、４−ニトロフェニルアゾフェニル、４−ニトロフェニルアゾレゾルシニル、３−メトキシフェニル、３−ジメチルアミノフェニル、４−クロロ−１−ナフチル、および６−ブロモ−２−ナフチルからなる群から選択される、請求項６、７または８に記載の方法。
１１．前記Ｒがメトキシであり、前記Ｘが４−メチルウンベリフェリル、３−シアノウンベリフェリル、２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、３−レゾルフィン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、４−ニトロフェニルアゾフェニル、４−ニトロフェニルアゾレゾルシニル、３−メトキシフェニル、３−ジメチルアミノフェニル、４−クロロ−１−ナフチル、および６−ブロモ−２−ナフチルからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
１２．その活性を有することが疑われる臨床試料中の、ヒトインフルエンザのノイラミノダーゼ活性を検出するのに有用な、下式を有する発色性基質および該基質の塩：▲数式、化学式、表等があります▼ ここでＡｃはアセチルを表し、Ｒはメトキシまたはフッ素であり、およびＸは、該基質または該基質の塩から解裂されると、異なる色を示す、発色性基である。
１３．前記Ｒがメトキシであり、前記Ｘが４−メチルウンベリフェリル、３−シアノウンベリフェリル、２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、３−レゾルフィン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、４−ニトロフェニルアゾフェニル、４−ニトロフェニルアゾレゾルシニル、３−メトキシフェニル、３−ジメチルアミノフェニル、４−クロロ−１−ナフチル、および５−ブロモ−２−ナフチルからなる群から選択れる、請求項１２に記載の発色性基質。
１４．前記Ｒがフッ素であり、前記Ｘが４−メチルウンベリフェリル、３−シアノウンベリフェリル、２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、３−レゾルフィン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、４−ニトロフェニルアゾフェニル、４−ニトロフェニルアゾレゾルシニル、３−メトキシフェニル、３−ジメチルアミノフェニル、４−クロロ−１−ナフチル、および６−ブロモ−２−ナフチルからなる群から選択される、請求項１２に記載の発色性基質。
１５．その活性を有することが疑われる臨床試料中の、ヒトインフルエンザのノイラミノダーゼ活性を検出するのに有用な、下式を有する発色性基質、および該基質の塩：▲数式、化学式、表等があります▼ここでＡｃはアセチルを表し、Ｒは水素であり、およびＸは、３−シアノウンベリフェリル、２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、３−レゾルフィン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、４−ニトロフェニルアゾフェニル、４−ニトロフェニルアゾレゾルシニル、３−メトキシフェニル、３−ジメチルアミノフェニル、４−クロロ−１−ナフチル、および６−ブロモ−２−ナフチルからなる群から選択される。