DE2855409A1

DE2855409A1 - Neue aminozucker und verfahren zu ihrer gewinnung

Info

Publication number: DE2855409A1
Application number: DE19782855409
Authority: DE
Inventors: Junzo Mizoguchi; Naoki Muto; Masaru Otani; Tetsu Saito; Shuzo Satoi
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1977-12-28
Filing date: 1978-12-21
Publication date: 1979-07-12
Also published as: JPS5492909A; GB2011397B; FR2413401B1; FR2413401A1; JPS5953920B2; US4254256A; GB2011397A

Description

Neue Aminozucker und Verfahren zu ihrer Gewinnung

beanspruchte Priorität:

28. Dezember 1977 - Japan - Nr. 157328/77

Die Erfindung betrifft neue Aminozucker, die von einem Mikroorganismus der Gattung Streptomyces produziert werden _} und ein Verfahren zu ihrer Gewinnung.

Der Stamm Actinomyces A23i)6 aus dem Boden von Reisfeldern in Shimomata, Kakegawa-shi, Sizuoka-ken, Japan,produziert diesen neuen Aminozucker, der eine Amyläse hemmende Aktivität hat.

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Gegenstand dieser Erfindung ist somit ein Aminozucker der Formel I

CH₂OH 0

CH₀OH OH OH m 2

'CH_nOH \

OH OH

CH₂OH

OH

OH OH 1

in der m eine ganze Zahl von 0 bis 8/ η eine ganze Zahl von 1 bis 8 ist und die Summe von m + η einen Wert von 1 bis Ö hat.

Der Aminozucker der Formel I hat eine starke und spezifische Hemmwirkung gegen Glykosidasen, wie Amyläse, Saccharase und Maltase. Bei Menschen und Tieren hemmt diese Verbindung der Formel I den Kohlenstoff-Metabolismus und ist somit für die Behandlung verschiedener Erkrankungen geeignet, z.B. von Diabetes, Fettleibigkeit und Pseudohypertrophia lipomatosa, von Zweiterkrankungen, die durch diesen anormalen Metabolismus verursacht werden, und anderen Erkrankungen, die durch den Kohlenhydrat-Metabolismus von Mikroorganismen im Mund verursacht werden, z.B. Zahnfäulnis.

In den Fig. 1 und 2 sind die IR-Absorptions- und magnetischen Kernresonanzspektren der erfindungsgemässen Verbindungen der Formel I angegeben.

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(a) Physikochemische Eigenschaften der neuen Aminozucker der Formel I

I. Verbindung der Formel I, in der η 1 und m O ist

1. Formel : C₁₉Ii₃₃O₁₄N;

2. Molekulargewischt: 499 (Massenspektrum);

3. UV-Absorptionsspektrum (mit Wasser als Lösungsmittel bei einer Konzentration von iO^i/ml): Endtyp-Absorption;

4. IR-Absorptionsspektrum (KBr-Methode): Spe ktrallinien gemäss Fig. 1 ;

5. Löslichkeit: löslich in Wasser, Methanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und heissem Äthanol, unlöslich in Aceton, Äthylacetat und Chloroform;

6.. Farbreaktionen: positiv in Anthron, Kaliumpermanganat und Schwefelsäure, negativ bei der Ninhydrin- und Eisen-(III)-Chlorid-Reaktion;

7. Schwachbasisches weisses Pulver;

8. Dünnschichtchromatographie mit Äthylacetat/Methanol/ Wasser im Verhältnis 10:6:4 als Eluiermittel auf Kieselgel F 254, Nachweis mit Silbernitrat/Natronlauge: R_f= 0,32;

9. Massenspektrum: Acetylform (Pyridin/Essigsäureanhydrid): Hauptgipfel bei 961 (Undecaacetyl-Form), §o2,901,ö42,841, 817;

Methylform (Dimethylsulfoxid/Methyljodid/Natriumhydrid): 667 (Dodecamethyl-Form), 663 (Undecamethyl-Form), 565;

10. MNR-Spektrum: gemäss Fig. 2 mit 100 MHz, DSS als innerem. Standard und als Lösungsmittel D₃O;

11. durch Methylierung, anschliessende Hydrolyse, anschliessende Reduktion mit Natriumborhydrid, an-

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schliessendo Acetylierung und Bestimmung durch Gaschromatographie erhält man 1, 4, 5-Tri-O-acetyl~2 ,3, 6-tri-0-methyl-D-sorbib;

12. Optische Drehung: fpQ_Ώ' + 153° (1 % in Wasser);

13. C %: 42,86; H %: 6,44; N %: 2,42;

14. Zuckergehalt nach der Anthron-Methode: 60 %;

15. Amylasehemmwirkung (Amylaseinhibitoreinhext): 3,4 χ 10

Alü/mg.

Aus den Spektren und den chemischen Eigenschaften ergibt sich folgende Strukurformel für die Verbindung:

OH OH CH₂OH

-/>-N—< V-O

H0-</-N-H /~°\ CH_OH

CH₂OH OH OH

II. Verbindung der Formel I, in der η 2 und m O ist

1. Formel: C₂₅H₄₃O₁₉N;

2. Molekulargewicht: 661 (Massenspektrum);

3. UV-Absorptionsspektrum: Endtyp-Absorption;

4. Löslichkeit: löslich in Wasser, Methanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und heissem Äthanol, unlöslich in Aceton, Äthylacetat und Chloroform;

5. Farbreaktionen: positiv in Anthron, Kaliumpermanganat und Schwefelsäure, negativ in der Ninhyarin- und Eisen-{III)-chloria-Reaktion;

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6. Schwachbasisches weisses Pulver;

7. Dünnschichtchromatographie mit Äthylacetat/Methanol/ ' Wasser im Verhältnis 10:6:4 als Lösungsmittel auf Kieselgel F 254, Nachweis mit Silbernitrat/Natronlauge: R_f=O,25;

8. Massenspektrum:' Methylform (Dimethylsulfoxid/Methyljodid/ Natriumhydrid): Hauptgipfel bei 871 (15-Methylform), 857 (14-Methylform), 769, 622, 565, 418, 416, 315, 217, 201, 131, 118 und 105;

Acetylform (Pyridin/Essigsäureanhydrid): 1249 (14-Acetylform), 1190, 1189, 1131, 1130 , 1105, 902, 842, 782, ' 739, 614, 554 und 494;

9. C%_:42,78, H%:6,65, N%:1,81;

10. Optische Drehung: /oC/q'· +127° (1% in Wasser);

11. Zuckergehalt mit der Anthron-Methode: 67%;

12. Nach Methylierung, anschließender Hydrolyse, anschließender Reduktion mit Natriumborhydrid, anschließender Acetylierung und Bestimmung durch Gaschromatographie erhält man nur l,4,5-Tri-O-acetyl-2,3,6-tri-0-methyl-D-sorbit;

13. Durch Teilhydrolyse mit Säure erhält man in der Dünnschichtchromatographie eine Verbindung der Formel I, in der η 1 und m 0 ist, und Glukose;

14. Amylasehemmwirkung: 3,6 χ 10 Alü/mg;

Nach diesen Daten kommt der Verbindung folgende Formel zu:

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OH OH

CH₂OH CHpOH

CH₂OH OH OH HQ

III. Verbindung der Formel I, in der η 3 und m O ist

1. Durch Hydrolyse mit einer Säure erhält man eine Verbindung der Formel I, in der η 1 und m O ist, und Glukose;

2. Dünnschichtchromatographie mit Äthylacetat/Methanol/ Wasser im Verhältnis 10:6:4 als Lösungsmittel auf Kieselgel F 254: R_f=0,18;

3. Zuckergehalt mit der Anthron-Methode: 74%;

4. Nach Methylierung, anschließender Hydrolyse, anschließender Reduktion mit Natriumborhydrid, anschließender Acetylierung und Bestimmung durch Gaschromatoguaphie erhält man nur 1,4,5-Tri-O-acetyl-2,3,6-tri-O-methyl-D-sorbit-;

5. Amylasehemmwirkung: 1,4 χ 10 AIÜ/mg;

Nach diesen Daten kommt der Verbindung folgende Formel zu: OH pH CH₂OH

Y~\ HO- T-J

IU ritt \

CH₂OH OH OH _0H

H0^J I^ ' ²

OH

OH -'^0H

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IV. Verbindung der Formel I, in der η 2 und m 1 ist

1. Durch Hydrolyse mit einer Säure erhält man eine Verbindung dex" Formel I, in der η 1 und m 0 ist, und Glukose;

2. Dünnschichtchromatographie mit Äthylacetat/Methanol/ Wasser im Verhältnis 10:6:4 als Lösungsmittel auf Kieselgel F 254: R_f = 0,18;

Bei der Dünnschichtchromatographie mit Äthylacetat/ Methanol/Wasser/25 % Ammoniak im Verhältnis 100:60:40:2 als Lösungsmittel auf silanbehandeltem Kieselgel ist die Beweglichkeit einige Male (3- bis 5mal) geringer als die der Verbindung der Formel I, in der η 1 und m 0 ist;

3. Zuckergehalt nach der Anthron-Methode: 74%;

4. Nach Methylierung, anschließender Hydrolyse, anschließender Reduktion mit Natriumborhydrid, anschließender Acetylierung und Bestimmung durch Gaschromatographie erhält man 1,4,5-Tri-O-acetyl-2,3,6-tri-O-methyl-D-sorblt und 1,5-Di-O-acetyl-2,3,4,6-tetra-O-methyl-D-sorbit in einem Verhältnis von 2:1;

5. Amylasehemmwirkung: 1,2 χ 10 AIU/mg.

Nach diesen Daten kommt der Verbindung folaende Formel zu: OH

__o OH OH CH OH

l 4 «»,OB

CH₂OH

OH

_H0J—p^A

^0H

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V. Verbindung der Formel I, in der η + m einen Wert von 4 bis 6 hat

1. Zuckergehalt gemäss der Anthron-Methode: 8 3%;

2. Dünnschichtchromatographie mit Äthylacetat/Methanol/ Wasser im Verhältnis 1O:6:4 als Lösungsmittel auf Kieselgel F 254: R_f = 0,013 bis 0,07;

3. Amylasehemmwirkung: 1,9 χ 10 AlU/mg.

VI. Verbindung der Formel I, in der die Summe η + m einen Wert von 5 bis 7 hat

1. Zuckergehalt gemäss der Anthron-Methode: 87%;

2. Dünnschichtchromatographie mit Äthylacetat/Methanol/ Wasser im Verhältnis 10:6:4 als Lösungsmittel auf Kieselgel F 254: R_f = 0,09 bis 0,04;

3. Amylasehemmwirkung: 3,5 χ 10 Alü/mg.

(b) Vergleich mit bekannten analogen Substanzen

Mikroorganismus CharacteristJka Literatur

1. Actinoplanes HO pH CH-, Japanische Patent-

\—( \-?q anmeldungen Nr.

R_D—( V-NH-/ V-R₁ 53593/75 und

έ \=/ V_J J- Nr. 122342/77

CH₂OH OH OH

n+m=l bis 7 R₂=(Glukose)_m

2. Streptorayces Die 3 Komponenten Agr. Biol.

A, B und C sind Zucker- Chem. 40 peptide. Positiv in 1167(19^7) der Kinhydrin-Reaktion.

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-χ«

Al

Actinomycetes

Hauptkomponente ist Glukose. Molekulargewicht 600.
Glukoamylase-Wirkung. Glukoamylase-Hemmwirkung^ ct-Amylase-

Saure Substanz. Keine optische Aktivität.

Japanische Patentanmeldungen Nr. 54990/76 und Nr. 24119/77

Streptomyces Amilostatin A

Neutrale Substanz Agr. Biol.Chem. Al (6) 1977 Japanische Patentanmeldungen Nr. 21596/77 und Nr. 21597/77

5. Streptomyces Nozirimycin

CH₂OH

6. Bacillus

V-NH

J. ohV oh

OH

Hemmwirkung
gegen Pluranase Agr. Biol. Chem. 966 (1970)

Japan Agricultural Chemistry, jil 184 (1976)

7. Streptomyces

OH OH CH₂OH

CH₂OH 0Ή OH

R, = (Glukose)_n

Rp = OH oder (Glukose)

η + m = 1 bis 7 erfindungsgemäss

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Die Substanzen 1 und 5 sind strukturell deutlich verschieden.

Die erfindungsgemässe Substanz 7 ist basisch, negativ in der Ninhydrin-Reaktion und somit von den Substanzen 4 und 2 verschieden. Sie ist schwachbasisch und besitzt optische Drehung, wogegen die Substanzen 1 bis 5 sauer sind und keine optische Drehung haben. Ausserdem besitzt die Substanz 7 eine starke Ct-Amylasewirkung und unterscheidet sich dadurch von der Substanz 6, ferner hemmt sie Saccharase und Maltase, insbesondere die Verbindungen der Formel I, in der η 1 bis 3 ist.

ο Aus diesen Vergleichen ergibt sich, dass die erfindungsgemässen

Verbindungen der Formel I neu sind.

Die erfindungsgemässen Verbindungen der Formel I zeigen nach oraler Verabreichung von 1 g keine Toxizität. Sie können oral in Form von Tabletten oder Sirup oder durch Injektion verabreicht werden. Auch im Gemisch mit Getränken oder Nahrungsmitteln sind sie geeignet.

(c) Mikrobiologische Eigenschaften des die Amylase hemmende Substanz produzierenden Actinomyceten

Der Actinomycetenstamm A 2396 hat folgende mikrobiologische Eigenschaften:

I. Morphologische Eigenschaften

Mit blossem Auge sieht man ein gräulich-braunes Luftmyzel, das reife Sporen gebildet hat, und ein gelbes oder gelblichoranges Substratmyzel. Lösliches Pigment wird nicht gebildet.

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Der Stamm wird auf Stärkeagar bei 30°C 10 Tage lang kultiviert und unter dem Lichtmikroskop beobachtet. Praktisch die gleiche Form erhält man auf Glukose/Asparagin, Glycerin/ Asparagin,. Hafermehl und Hefe/Malz-Agar.

Das Luftmyzel hat einen Durchmesser von 0,6 bis 0,8 u, ist gerade oder wellig, dehnt sich unter Bildung einfacher Zweige aus und produziert viele Kettensparen. Die Kette der Spore ist meist haken- oder schlingenförmig und bildet selten Spiralen von 2 bis 3 Umdrehungen. Im späteren Stadium wird die Kultur nass, da die Kette der Spore bricht • (hygroskopischer Zustand).

Die Spore ist eiförmig mit Abmessungen von 0,8 bis 1,0 χ 1,0 bis 1,5 u und hat unter dem Elektronenmikroskop eine glatte Oberfläche.

Das Substratmyzel verzweigt sich und dehnt sich in beweglichem oder welligem Zustand aus und hat einen Durchmesser •von 0,5 bis 0,6 p. Es tritt keine Teilung des Substratmyzels oder eine Bildung von Sporen auf. Es werden auch keine begeisselten Sporen und Sporangien produziert.

II. L-D3sminopimelinsäure kann nachgewiesen werden.

III.Eigenschaften der Kultur

Nach einer 20tägigen Bebrütung bei 30°C auf verschiedenen Medien erhält man folgende Merkmale (die angegebene Farbe

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bezieht sich auf "Color harmony manual, 4. Ausgabe, Container Corporation of America, V.St.A., 1958).

1. Saccharosenitrat-Agar: fast kein Wachstum;

2. Glycerinnitrat-Agar: massiges Wachstum, kolonialgelb (2 ga) bis he11-weizengelb (2 ea) massiges Luftmyzel: weiss (a), Flecken von hellem Braun (3 gc)
■ kein lösliches Pigment;

3. Glukose-Asparagin-Agar: massiges bis schwaches Wachstum, farblos bis hell-Elfenbein (2 ca) Spuren oder nur wenig Luftmyzel, kamelfarben (31 e), Flecken von Biberbraun (31 i) Kein lösliches Pigment;

4. Glycerin-Asparagin-Agar: massiges Wachstum, hell-weizengelb (2 ea) bis honiggelb (2 ic) Massiges Luftmyzel, ziegelbraun (31 g) bis biberbraun (31 i>

Kein lösliches Pigment;

5. Stärke-Agar: massiges Wachstum, senf-goldfarben (2 pe) bis bernsteinfarben (3 pe) Rotgelbes(3 ec) bis beiges (3 ge) Luftmyzel, Flecken von Biberbraun Kein lösliches Pigment;

6. Tyrosin-Agar: massiges bis gutes Wachstum, bambusfarben (2 gc) bis honiggelb (2 ic) Massiges bis gutes Luftmyzel, ziegelbraun (31 g) bis biberbraun (31 i) Kein lösliches Pigment;

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7. Hafermehl-Agar: massiges Wachstum, hell-Elfenbein (2 ca) bis hell-weizengelb (2 ea) Massiges Luftmyzel, rotgelb (3 ec) bis biberbraun (31 i)

Kein lösliches Pigment; θ. Hefe -Malz-Agar: gutes Wachstum, senf-goldfarben (2 pe) bis bernsteinfarben (3 pe) Massiges 'Luftmyzel, kamelfarben (3 ie), Flecken von Biberbraun (31 i)

Kein lösliches Pigment; 9. Bennett's-Agar: massiges Wachstum, senf-goldfarben (2 pe) Geringes Luftmyzel, beige (3 ge) Kein lösliches Pigment;

10. Nähragar: geringes Wachstum, hell-weizengelb (2 ea) Kein Luftmyzel

Kein lösliches Pigment;

11. Pepton-Hefe-Eisen-Agar: massiges Wachstum, hell-elfenbeinfarben (2 ca) bis hell-weizengelb (2 ea) Kein Luftmyzel

Kein lösliches Pigment.

IV.Physiologische Eigenschaften .

1. Wachstumstemperatur: 13-46°Cj

2. Verflüssigung von Gelatine: positiv;

3. Hydrolyse von Stärke: positiv;

4. Koagulation und Peptonisation von Milchhaut: in beiden Fällen positiv;

5. Bildung von Melanoid: negativ;

6. Assimilierfähigkeit von Kohlenstoff: positiv bei L-Arabinose,

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D-Xylose, D-Glukose, D-Fruktose und Inosit; negativ bei Saccharose, L-Rhamnose, L-Raffinose und D-Mannit;

Wie oben angegeben, produziert der Stamm A2396 Luftmyzel mit vielen Sporenketten aus echtem Substratmyzel, das keinen Bruch verursacht; außerdem enthält der Organismus L-Diaminopimelinsäure. Daraus wird geschlossen, dass der Mikroorganismus den Streptomyceten zuzurechnen ist , der Name ist Streptomyces sp. A2396.

Dieser Stamm wurde unter der Nummer 4275 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, hinterlegt.

(f) Kultur und Isolierung

Der Stamm Streptomyces sp. A2396 ist nur ein Beispiel von den Aminozucker der Formel I produzierenden Stämmen, die im erfindungsgemässen Kulturverfahren verwendet werden können.

Die Bebrütung des Aminozucker der Formel I produzierenden Stammes kann entweder in flüssiger oder fester Kultur erfolgen. Im grosstechnischem Maßstab wird entweder eine Sporensuspension eines geeigneten Mikroorganismus oder eine während 2 bis 3 Tage bebrütete Kulturlösung beimpft und zur Gewährleistung einer durchgehenden Belüftung geschüttelt.

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Es werden die üblichen Nährstoffe für das Medium verwendet. Als Kohlenstoffquelle sind assimilierbare Kohlenstoffverbindungen geeignet, z.B. Glukose, Saccharose, Laktose, Maltose, Stärke, Melasse und Glycerin. Als Stickstoffquelle sind assimilierbare Stickstoffverbindungen geeignet, z.B. Maisquellwasser, Sojabohnenmehl, Weizengluten, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Casein-Hydrolysat, verschiedene Ammoniumsalze und Nitrate.

Auch Phosphate, Sulfate und Magnesium-, Kalzium-, Kalium-, Natrium-, Eisen-, Zink- und Mangansalze können gegebenenfalls verwendet werden.

Die Bebrütungstemperatur wird so gewählt, dass der Stamm zur Produzierung des Aminozuckers der Formel I wächst. Die Bebrütungstemperatur liegt vorzugsweise bei 26 bis 33°C. Die Bebrütungszeit hängt von den Bedingungen ab, im allgemeinen beträgt sie etwa 3 bis 4 Tage bei 26 bis 32°C. Nach Erreichen der maximalen Produktion an Aminozucker der Formel I kann die Bebrütung eine geeignete Zeit lang fortgesetzt werden.

Der Aminozucker der Formel I wird meistens als Flüssigkeit in den Kulturbrühen des Mikroorganismus produziert. Daraus wird er durch Behandeln des Kulturfiltrats mit Aktivkohle unter sauren Bedingungen, um Verunreinigungen zu entfernen, isoliert (der Aminozucker der Formel I wird nicht adsorbiert, da er sauer ist). Die Aktivkohle wird dann abfiltriert, das

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Filtrat wird neutralisiert und nochmals mit Aktivkohle behandelt, um den Aminozucker der Formel I zu adsorbieren.
Die Aktivkohle wird dann mit 50-bis 60 prozentigem wässrigen Aceton eluiert. Die Lösung des Rohprodukts wird mit einem stark sauren Ionenaustauscherharz behandelt, die aktive
Fraktion wird gesammelt.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1
Gewinnung des Rohprodukts aus der Kulturbrühe

Der Stamm A2396 wird aus einer Schrägkultur in einen. 500 ml fassenden Kolben, der 100 ml einer sterilen Nährlösung enthält, geimpft. Die Nährlösung enthält 1% lösliche Stärke,
1% Glukose, 1,5% Sojabohnenmehl, 0,1% Kaliumhydrogenphosphat, 0,3% Natriumchlorid und 0,1% Magnesiumsulfat und wird vor
dem Sterilisieren mit Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt.
Das Gemisch wird auf einem Drehschüttler bei 30⁰C 48 Tage bebrütet.

Ein 30 1 fassender Schüttelferraenter, der 20 1 des oben angegebenen Mediums enthält, wird mit dieser Kulturlösung beimpft und 72 Stunden bei 30⁰C bebrütet. 60 1 dieser Kulturbrühe werden mit einer geeigneten Menge Perlit versetzt
und dann filtriert. Der pH-Wert des Filtrats wird mit halbkonzentrierter Salpetersäure auf 2,0 eingestellt, das Filtrat wird mit 600 g Aktivkohle und 2400 g Perlit versetzt.

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Das Gemisch wird 15 Minuten gerührt, dann filtriert. Das Filtrat wird mit Ammoniumhydroxid neutralisiert und 30 Minuten mit 1200 g Aktivkohle gerührt. Dieses Gemisch wird durch eine Filterpresse filtriert, die Aktivkohle wird 3mal mit 10 1 destilliertem Wasser gewaschen. Die Aktivkohle wird gepresst und gut getrocknet, dann 15 Minuten in 4 1 15prozentigem wässrigem Aceton bei pH 2,5 gerührt, um die aktive Substanz von der Kohle abzulösen, Dieses Verfahren wird 3mal wiederholt. Die Aktivkohle wird dann abfiltriert, die Eluate werden vereinigt, in einem Drehverdampfer unter vermindertem Druck auf 250 ml eingeengt und mit 250 ml Methanol versetzt. Das Gemisch wird durch ein Filter filtriert. Das Filtrat (480 ml) wird unter starker Bewegung in 5 ml Aceton eingetropft. Der entstehende Niederschlag wird abfiltriert, mit Aceton und Äther 3mal gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 100 g eines weissen Pulvers.

Dieses Pulver wird in 330 ml destilliertem Wasser gelöst und auf eine Ionenaustauschersäule (8 χ 20 cm) in der H⁺-Form mit einer Fliessgeschwindigkeit von 50 ml/Minute aufgegeben. Die Säule wird mit destilliertem Wasser gewaschen und mit einer 2prozentigen Ämmoniumhydroxidlösung eluiert. Das Eluat wird in 20 ml-Fraktionen aufgefangen, die Fraktionen 30 bis 50 werden gesammelt und unter vermindertem Druck zu einem braunen Pulver eingeengt. Ausbeute: 5,0 g. Dieses Pulver wird in 100 ml destilliertem Wasser gelöst und auf eine Styrol-Divinylbenzol-Ionenaustauschersäule (3>5 x 90 cm, Teilchengrösse 74 bis 37 u) mit einer Fliessgeschwindigkeit von

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10 ml/Minute aufgegeben. Die Säule wird mit Wasser gewaschen und nacheinander mit 900 ml 0,1 m-Pyridin/Ameisensäure, pH 3,1, 900 ml 0,2 m-Pyridin/Ameisensäure, pH 3,1, und 900 ml 0,2 m-Pyridin/Ameisensäure, pH 4,4, eluiert. Das Eluat wird in 20 ml-Fraktionen geteilt, die Fraktionen 20 bis 35 werden Fraktion A, die Fraktionen 64 bis 82 Fraktion B und die Fraktionen 110 bis 128 Fraktion C genannt. Jede Fraktion wird zur Trockene eingedampft. Fraktion A enthält die Verbindungen der Formel I, in der m + n = 3, m + n = 4 bis 6 und m + η = 5 bis 7 ist (siehe Beispiel 5). Fraktion B enthält die Verbindung dar Formel I, in der η 2 und m 0 ist (siehe Beispiel 4). Fraktion C enthält die Verbindung der Formel I, in der η 1 und m 0 ist (siehe Beispiel 3).

Beispiel 2

Der Stamm A2396 wird von Schrägagar in einen 500 ml fassenden Kolben überimpft, der 100 ml einer sterilen Nährlösung enthält. Die .Nährlösung enthält 2% lösliche Stärke, 1% Glukose, 1,5% Sojabohnenmehl, 0,1% Kaliumhydrogenphosphat, 0,3% Natriumchlorid und 0,1% Magnesiumsulfat und wurde vor dem Sterilisieren auf einen pH-Wert von 7,2 mit Natronlauge eingestellt. Das Gemisch wird bei 30°C 48 Tage auf einem Drehschüttler bebrütet. 2 1 dieser Kulturbrühe werden in einen250 1 fassenden Behälter gegeben, der 200 1 eines sterilen Mediums mit 2% löslicher Stärke, 1,5% Sojabohnenmehl, 0,1% Kaliumhydrogenphosphat, 0,3% Natriumchlorid und 0,1% Magnesiumsulfat enthält.

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Dieses Gemisch wird 72 Stunden bei 30 C bebrütet, dann mit 2 kg Zeolith versetzt und abfiltriiert. Man erhält 180 1 eines Filtrats, das mit 4 kg Aktivkohle versetzt wird. Die aktive Substanz wird an die Kohle adsorbiert, die dann abfiltriert und mit Wasser gewaschen wird. Die Aktivkohle wird nochmals mit Wasser gewaschen, dann mit 20 1 50prozentigem wässEigem Aceton 3mal extrahiert. Die wässrige Acetonlösung wird auf 1 1 unter vermindertem Druck eingeengt und mit 10 1 Aceton versetzt, wobei ein Niederschlag ausfällt. Dieser Niederschlag wird abfiltriert und gepulvert. Ausbeute: 300 g.

■300 g des Pulvers werden in 1 1 Wasser gelöst und auf eine Ionenaustauschersäule (8 χ 20 cm, Styrol-Divinylbenzol-Cop'olymerisat in der H -Form, Teilchengrösse 74 bis 37 p) aufgegeben. Die adsorbierte aktive Substanz wird mit 1 η wässriger Ammoniumhydroxidlösung eluiert. Das Eluat wird in 20 ml-Fraktionen geteilt, die Fraktionen . 15 bis 35 (400 ml) enthalten die Amylasehemmwirkung. Diese Fraktionen werden eingeengt; durch Ausfällen mit Aceton erhält man 30 g ein schwachgelben Pulvers.

3 g dieses Pulvers werden in Wasser gelöst, die Lösung wird auf eine Ionenaustauschersäule (3 χ 30 cm , gefüllt mit Dextrangel, das eine Carboxymethylgruppe als Austauschergruppe hat und auf einen pH-Wert von 3,0 mit Salzsäure eingestellt worden war) aufgegeben, mit destilliertem Wasser gewaschen und mit einem Gradienten aus 500 ml destilliertem

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Wasser und 500 ml 0,3 η Natriumchlorid eluiert. Das Eluat wird in 20 ml-Fraktionen eingeteilt, die Fraktionen 13 bis 18, die die Amylasehemmwirkung enthalten, werden gesammelt, eingeengt, an einer geringen Menge Aktivkohle adsorbiert und entsalzen. Die Lösung wird wieder eingeengt und mit Aceton versetzt, wobei ein Pulver ausfällt. Dieses Produkt ist verhältnismässig rein, besteht jedoch aus einem Gemisch von homologen Verbindungen der Formel I, in der η 3 bis 7 ist.

Beispiel 3

Die als Pulver anfallende Fraktion C des Beispiels 1, die den Aminozucker derFormel I enthält, in der η 1 und m 0 ist, wird in einer geringen Menge Wasser, das Äthanol enthält, gelöst und auf eine Kieselgelsäule (2 χ 20 crn), die vorher mit Butanol/Äthanol/Wasser im Verhältnis 5:1:1 angefeuchtet worden ist, aufgegeben. Die Säule wird mit Butanol/Äthanol/ Wasser im Verhältnis 5:1:1 eluiert. Das Eluat wird in 10 ml-Fraktionen geteilt. In jeder Fraktion wird die Amylasehemmwirkung und der Zuckergehalt mit der Anthron-Methode bestimmt, ausserdem wird sie dunnschichtchromatographisch untersucht. Die Fraktionen Nr. 15 bis 25, die die erfindungsgemässe Verbindung enthalten, werden gesammelt, unter vermindertem Druck eingeengt und dann mit Äthanol versetzt, wobei ein Niederschlag ausfällt. Man erhält 60 mg der reinen Verbindung der Formel I, in der η 1 und m 0 ist, als trockenes Pulver.

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Beispiel 4

Die als Pulver anfallende Fraktion B des Beispiels 1, die den Aminozucker der Formel I enthält, in der η 2 und m O ist, wird in einer geringen Menge Äthanol enthaltendem Wasser gelöst. Diese Lösung wird auf eine Kieselgelsäule (2 χ 20 cm), die vorher mit Butanol/Äthanol/Wasser im Verhältnis 5:1:1 angefeuchtet worden ist, aufgegeben und mit Butanol/Äthanol/ Wasser im Verhältnis 5:1:1 eluiert. Das Eluat wird in 10 ml-Fraktionen aufgetrennt. In jeder Fraktion wird die Amylasehemmwirkung und der Zuckergehalt mit der Anthron-Methode bestimmt, die Fraktion wird ausserdem dünnschichtchromatographisch auf.Kieselgel untersucht. Die Fraktionen Nr. 24 bis 32, die die erfindungsgemässe Verbindung der Formel I enthalten, in der η 2 und m O ist, werden gesammelt, unter vermindertem Druck eingeengt und zur Fällung mit Äthanol versetzt. Man erhält 75Htg der reinen Verbindung der Formel I, in der η 2 und m 0 ist, als trockenes Pulver.

Beispiel 5

Die Fraktion A des Beispiels 1 wird unter verminderten Druck zur Trockene eingedampft und in einer geringen Menge Wasser gelöst. Diese Lösung wird auf eine Kieselgelsäule (2 χ 20 cm), die vorher mit Butanol/Äthanol/Wasser im Verhältnis 5:1:1 angefeuchtet worden ist, aufgegeben und mit Butanol/Äthanol/Wasser im Verhältnis 5:1:1 eluiert. Das Eluat wird in 10 ml-Fraktionen aufgetrennt, die Fraktionen Nr. 30 bis 47, die die Amylase-

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2855Α09

hemmwirkung enthalten ₍ werden gesammelt und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in einer geringen Menge destilliertem Wasser gelöst und durch eine Säule mit vernetztem Dextran (1,5 χ 95 cm) filtriert. In jeder der 2 ml-Fraktionen wird die Amylaseaktivität und der Zuckergehalt mit der Anthron-Methode bestimmt/ außerdem wird sie dünnschichtchromatographisch untersucht. Man erhält den Aminozucker der Formel I, in der

m + η = 3,in den Fraktionen Nr. 38 bis 43, den Aminozucker der Formel I, in der m + η = 4 bis 6, in den Fraktionen 30 bis 35 und den Aminozucker der Formel I, in der . m + η = 5 bis 7, in den Fraktionen Nr. 23 bis 30. Jede Fraktion wird eingeengt und zur Fällung mit Äthanol versetzt. Man erhält 70 mg der reinen Verbindung der Formel I, in der m + η = 3, 80 mg der Verbindung der Formel I, in der m + η = 4 bis 6, und 100 mg der Verbindung der Formel I, in

ist,
der m + η = 5 bis 7/"jeweils als trockenes Pulver.

Beispiel 5

10 g der aus Fraktion A des Beispiels 1 stammenden aktiven Substanz, die den Aminozucker der Formel I, in der

. η + m = 3 bis 7, enthält, werden in einer Lösung von 4 ml konzentrierter Schwefelsäure und 50 ml destilliertem Wasser gelöst und 30 Minuten bei einer Badtemperatur von 1O4°C unter Rückfluß erhitzt, wodurch die höheren Aminozucker hydrolysiert werden. Man erhält eine braun-schwarze Lösung, die mit 10 η Natronlauge neutralisiert, dann mit 1 g Aktivkohle gut gerührt wird, um die aktive Substanz an die Aktivkohle

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Z5

zu binden. Die Aktivkohle wird dann gut mit Wasser gewaschen und mit 10 ml 50prozentigem wässrigem Aceton extrahiert. Der Extrakt wird eingeengt und mit Aceton versetzt, wodurch 3 g eines Pulvers ausfallen.

3 g dieses Pulvers werden in Wasser gelöst und auf eine Säule mit 2,0 g lonenaustauscherharz in der H -Form aufgegeben. Die Säule wird so lange gewaschen, bis keine Glukose mehr nachweisbar ist, dann mit 50 ml einer lprozentigen Ammoniumhydroxidlösung eluiert. Das Eluat wird zur Trockene eingedampft und auf eine Kieselgelsäule (4 χ 40 cm), die vorher mit Butanol/ Äthanol/Wasser im Verhältnis 5:1:1 angefeuchtet worden ist, aufgegeben und mit Butanol/Ä'thanol/Wasser im Verhältnis 5:1:1 eluiert. Das Eluat wird in 20 ml-Fraktionen aufgetrennt, in jeder Fraktion wird die Amylasehemmwirkung und der Zuckergehalt nach der Anthron-Methode bestimmt. Ausserdem wird jede Fraktion dünnschichtchromatographisch auf Kieselgel untersucht. Die Fraktionen Nr. 30 bis 45, die die Verbindung der Formel I enthalten, in der η 1 und m 0 ist, und die Fraktionen Nr. 55 bis 64, die die Verbindung der Formel I enthalten, in der η 2 und m 0 ist, werden gesammelt, eingeengt und mit einem lonenaustauscherharz entsalzen. Man erhält 4 30 mg der reinen Verbindung der Formel I, in der η 1 und m 0 ist, und 54 mg der Verbindung der Formel I, in der η 2 und m 0 ist.

Beispiel 7

50 mg der in Beispiel 5 gewonnenen Verbindung der Formel I, in der m + η = 3, werden in Wasser gelöst und auf eine Ionen-

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-γ- 2855Α09

austauschersäule (2 χ 90 cm , Styrol-Polyvinylbenzol-Copolymerisat in der H -Form) aufgegeben und mit 0,25 η Salzsäure eluiert. Das Eluat wird in 5 ml-Fraktionen aufgetrennt, in jeder Fraktion wird die Amylasehenunwirkung bestimmt und die Dünnschichtchromatographie durchgeführt. In den Fraktionen Nr. 50 bis 185 erhält man die Verbindung dar Formel I, in der η 2 und m 1 ist, in den Fraktionen Nr. 190 bis 196 die Verbindung der Formel I, in dar η 3 und m 0 ist. Die Fraktionen werden gesammelt, eingeengt und mit Aceton versetzt. Man erhält 20 mg der reinen Verbindung der Formel I, in der η 2 und m 1 ist, und 3 mg der reinen Verbindung der Formel I, in der η 3 und m 0 ist, jeweils als Pulver.

Bestimmung der Amylase-Aktivität in vitro

Die Amylase-Inhibitoreinheit (1 AIU) wird als die Menge an Inhibitor definiert, die notwendig ist, um eine Amylase-^Einheit (AU) etwa 50 % zu hemmen, wobei die Amylase-Einheit die Menge an Enzym ist, die in einer Minute 1 Mikroäquivalent

den einer Glukosid-Bindung in Stärke unter/folgenden Bedingungen spaltet. Das Mikroäquivalent dieser gespaltenen Bindung ist bestimmt als das reduzierte Mikroäquivalent des mit Dinitrosalicyisäure nach der Kurie-Methode gebildeten Zuckers.

Die Standardkurve unter Verwendung von Maltose gibt die Mxkroäquivalente von Maltose an.

0 bis 20 ul Testlösung in 0,4 ml einer Lösung vom pH 6,9, die

1 mMol Calciumchlorid, 0 bis 10 ug des Inhibitors und 20 mMol

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Ζψ

enthält,
Natriumglycerinphosphat / werden zu 0,1 ml einer Amylaselösung, die 20 bis 22 AU/ml enthält, gegeben. Das Gemisch wird etwa 10 bis 20 Minuten in einem Wasserbad auf 35°C gehalten, dann 5 Minuten bei 35°C mit 0,5 ml einer lprozentigen Stärkelösung, die auf 35°C vorgewärmt wurde, bebrütet. Das Gemisch wird mit 1 ml Dinitrosalicylsäure-Reagens (vgl. P. Bernfeld, Colowick-Kaplan, in "Meth. Enzymol.", Bd. 1, S. 149 ) versetzt. Zur Entwicklung der Farbe wird die Probe in siedendem Wasser 5 Minuten erhitzt, dann abgekühlt und mit 10 ml destilliertem Wasser versetzt. Die Absorption bei 5^0 nm wird im Vergleich zu Leerproben, die auf die gleiche Weise, jedoch ohne Amylase, hergestellt worden sind, gemessen.

Zur Bestimmung wird die nach Zugabe des Inhibitors noch vorhandene Amylase-Aktivität aus vorher aufgezeichneten Amylase-Standardkurven abgelesen, die Hemmwirkung in % der verwendeten

/toyläse wird aus dieser Amylase-Aktivität berechnet. Die Hemmwirkung wird hierzu als Funktion des Quotienten /ig Inhibitor +

_Aü ++. graphisch aufgetragen,

wobei + die Trockensubstanz,

AU ++ die Amylase-Einheit in der Probe der gleichen Serie ist, - die nicht gehemmt wurde.

Die 50prozentige Hemmung wird aus dieser Kurve abgelesen und in AIÜ/mg des Inhibitors umgerechnet.

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Claims

P a tentansprüche

ι 1.) Aminozucker der allgemeinen Formel I

OH ^:o -0 OH
V OH -NH- CH
> ₂0H
-o CH,
y ,0H Λ CH.
y ₃ OH
-o -OH -O- J- TTl J- )—0 - _/ °" V _^ [I] \
OH CH, ,0H OH \
OH OH OH ^ /
OH OH

in der m eine ganze Zahl von 0 bis 8, η eine ganze Zahl von

1 bis 8 ist und die Summe von m + η einen Wert von 1 bis 8 hat,
2. Aminozucker nach Anspruch 1, Formel I/ in der m O und η 1 ist.
3. Aminozucker nach Anspruch 1, Formel I, in der m O und η 2 ist. ~
4. Aminozucker nach Anspruch 1, Formel I, in der m O und η 3 ist.
5. Aminozucker nach Anspruch 1, Formel I, in der m 1 und η

2 ist.
6. Aminozucker nach Anspruch 1, Formel I, in der die Summe von m + η den Wert 4 hat.
7. Aminozucker nach Anspruch 1, Formel I, in der die Summe von m + η den Wert 5 hat.

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ORIGINAL INSPECTED
8. Aminozucker nach Anspruch 1, Formel I, in der die Summe von m + η den Wert 6 hat.
9. Aminozucker nach Anspruch 1, Formel I, in der die Summe von m + η den Wert 7 hat.
10. Verfahren zur Herstellung des Aminozuckers nach Anspruch bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus der Gattung Streptomyces, der zur Bildung eines Aminozuckers der Formel I befähigt ist, in einem Kulturmedium bebrütet und den Aminozucker der Formel I aus der Kulturbrühe isoliert.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet/ daß man den Stamm Streptomyces sp. A239 6 bebrütet.

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