DE2614393A1 - Aminozucker-derivate - Google Patents
Aminozucker-derivateInfo
- Publication number
- DE2614393A1 DE2614393A1 DE19762614393 DE2614393A DE2614393A1 DE 2614393 A1 DE2614393 A1 DE 2614393A1 DE 19762614393 DE19762614393 DE 19762614393 DE 2614393 A DE2614393 A DE 2614393A DE 2614393 A1 DE2614393 A1 DE 2614393A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- glucose
- solution
- compounds
- amino sugar
- sugar derivatives
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/20—Carbocyclic rings
- C07H15/22—Cyclohexane rings, substituted by nitrogen atoms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/20—Carbocyclic rings
- C07H15/207—Cyclohexane rings not substituted by nitrogen atoms, e.g. kasugamycins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Obesity (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Seasonings (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Aminozucker-Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung, pharmazeutische
Zusammensetzungen, die diese Aminozucker-Derivate als Wirkstoffe enthalten, sowie Verfahren zur Kontrolle
des Kohlenhydratstoffwechsels von Menschen und Tieren durch Hemmung von Glycosidhydrolasen mit Hilfe dieser
Aminozucker, wie beispielsweise zur Behandlung von Diabetes, Fettsucht und Hyperlipämie.
Es ist bekannt, daß eine Reihe von Mikroorganismen der Ordnung Actinomycetales Inhibitoren für Glycosidhydrolasen
bilden, wobei man je nach den Züchtungsbedingungen Inhibitoren mit überwiegender Amylase- oder Saccharase-Hemmwirkung
erhält (s. hierzu die USA-Patentschriften 3 876 766, 3 855 066 und 3 879 546).
Le A 17 089
709840/0520
26U393
Gefunden wurden nun die neuen Aminozucker-Derivate der
Formel I
'. CK2 OH \
OH OH
2 CH2OH H
— 0 —
in der
η. und n2 für eine Ziffer von O bis 8 stehen können, die
Summe von n« + n"2 jedoch stets einen Wert von ri = 1 bis
8 besitzt, mit der Ausnahme, das im Falle von n- + n2 =
oder 2 n2 stets gleich O ist.
Je nach dem Wert der Summe von η^ +η2 besitzen diese
Aminozucker-Derivate überwiegend amylase- bzw. saccharasehemmende Wirkung. So sind Aminozucker-Derivate, die gezielt
zur Hemmung der Amylase eingesetzt werden können, solche mit η ^ +n2 = 4 bis 8, insbesondere mit η« + n2 =
4 und 5. Aminozucker-Derivate, die gezielt zur Hemmung der Saccharase eingesetzt werden können, sind solche mit
n- + n2 = 1 bis 3, bevorzugt mit n. + n2 = 2 bis 3, insbesondere
bevorzugt mit n- = 2.
Es wurde weiterhin gefunden, daß überraschenderweise Aminozucker-Derivate mit ri- + ri2 = 2 bis 3, insbesondere
mit n, = 2 in vivo eine starke Hemmung des Stärkeabbaus zeigen.
Le A 17 089
709840/0520
2614333
-fc-
Die Herstellung der erfindungsgemaßen Aminozucker-Derivate
erfolgt durch Züchtung von Stämmen der Ordnung Actinoirycetales,
insbesondere der Familie Actinoplanaceae in an sich bekannter Weise und durch anschließende Auftrennung und
Isolierung der einzelnen Verbindungen in ebenfalls an sich bekannter Weise.
Isolierung der einzelnen Verbindungen in ebenfalls an sich bekannter Weise.
Aminzucker-Derivate mit Werten der Summe von H + η von
1 bis 4 können weiterhin durch chemische oder enzymatische Hydrolyse höhermolekularer Aminozuckerderivate erhalten
werden.
werden.
Als zur Herstellung der erfindungsgemäßen Aminozucker-Derivate
in Frage kommende Stämme der Ordnung Actinomycetales seien beispielsweise genannt SE 50 (CBS 961.70),
SB 18 (CBS 957.70) und SE 82 (CBS 615.71), sowie Mutanten oder Varianten dieser Stämme. Besonders gut geeignet erwiesen
sich dabei im Hinblick auf die Ausbeute an erhaltenen Aminozucker-Derivaten die Stämme SE 50/13 (CBS
614.71) und SE 50/110 (CBS 674.73). Beide Stämme entsprechen in ihrer Beschreibung weitgehend dem Elternstamm
SE 50 (CBS 971.60), aus dem diese Stämme durch natürliche Selektion ohne Anwendung von Mutagenen gewonnen
werden.
Zur Züchtung der Mikroorganismen verwendet man feste oder flüssige, insbesondere flüssige, wässrige Nährböden,
die die an sich bekannten Ausgangsstoffe für Kohlenstoff und Stickstoff, Salze und Antischaummittel
in den üblichen Konzentrationen enthalten.
Le A 17 089 - 3 -
709840/0520
26H393
Als Ausgangsstoffe für Kohlenstoff dienen vorwiegend Kohlenhydrate, insbesondere Stärke, Maltose, Glucose
sowie komplexe Stoffgemische wie beispielsweise handelst
üblicher Malzextrakt.
Als Ausgangsstoffe für Stickstoff kommen die an sich
bekannten komplexen Stoffgemische wie beispielsweise Kaseinhydrolysat, Hefeextrakt, Pepton, Fischmehl, Maisquellwasser,
Fleischextrakt sowie Mischungen dieser Ausgangsstoffe in Frage, ebenso wie einzelne Aminosäuren
und/oder Ammoniumsalze als Stickstoffquellen verwendet werden können.
Die Züchtung der Mikroorganismen erfolgt aerob in belüfteten Schüttelkulturen oder in den üblichen Behälterkulturen.
Art und Konzentration der für Kohlenstoff eingesetzten Ausgangsstoffe beeinflußt in Verbindung mit dem jeweiligen
zur Fermentation verwendeten Stamm die Art des überwiegend gebildeten Endproduktes.
So werden beispielsweise in Nährlösungen, die Stärke über 2 Gew.-% enthalten, vor allem Verbindungen mit
U1 + rip = 4 bis 8 gebildet. Für die Herstellung dieser
Aminozucker-Derivate mit n^ + n2 = 4 bis 8 ist der Stamm
SE 50/13 (CBS 614.71) "besonders gut geeignet.
Le A 17 089 - 4 -
709840/0520
Ü6U393
Enthält die Nährlösung hinreichend Glucose (ca, 3,5 Gew,-^%)
so reichen jedoch bereits 0,1 bis 3 Gew.^% Stärke, um überwiegend
Gemische von Aminozucker^Derivaten mit n-, + n~ =
4 bis 8 zu erhalten. Sämtliche dieser so erhaltenen Aminozucker-Derivate können als Ausgangsverbindungen für die Herstellung
der niederen Homologen auf dem Wege der chemischen oder enzymatischen Hydrolyse verwendet werden.
Aminozucker-Derivate mit n.. + n._ = 1 bis 4 werden in überwiegendem
Maße erhalten, wenn man in stärkefreien Nährlösungen arbeitet. Besonders günstig wirkt sich hierbei
die Zugabe von Maltose zur Nährlösung aus. So erhält man beispielsweise bei Zugabe von Maltose und unter Verwendung
des Stammes SE 50 (CBS 961.70) Gemische von Aminozucker-Derivaten, mit überwiegend n.. +n2 = 2 bis 3. Die Bildung
eines Aminozuckers mit n.. = 1 wird insbesondere dadurch
erreicht, daß man als Ausgangsmaterial für Kohlenstoff nur Glucose verwendet. Zu beachten ist hier jedoch, daß
bei einem Überschuß an Glucose bei längerer Fermentationsdauer auch die höhermolekularen Aminozuckerderivate gebildet
werden.
Verwendet man Nährlösungen, die keine Glucose enthalten und gibt als alleinigen Ausgangsstoff für Kohlenstoff
Maltose hinzu, so erhält man überwiegend den Aminozucker mit n.. +n_ = 2. In einer technisch vorteilhaften Ausführungsform
kann man dabei die reine Maltose durch ein billigeres Produkt ersetzen, wie z.B. Maltzin, einen -natürlichen
handelsüblichen Malzextrakt.
Le A 17 089 - 5 -
709840/0520
2ÖH393 Λ"
Als besonders geeignet für die Herstellung von Aminozucker-Derivaten,
die überwiegend solche Derivate mit η* + n2 =
1 bis 3 enthalten, erwies sich der Stamm SE 50/110 (CBS 674.73).
Dieser Stamm ergibt Ausbeuten an niedermolekularen Aminozucker-Derivaten,
die etwa zweimal so groß sind wie die mit dem Stamm SE 50/13 (CBS 614.71) erhaltenen.
Die Züchtung der Mikroorganismen erfolgt im allgemeinen bei Bebrütungstemperaturen zwischen 15 bis 45°C, vorzugsweise
zwischen 24 bis 32^C. So erhält man bei Verwendung
der Stämme SE 50 (CBS 961.70) oder SE 50/13 (CBS 614.71)
Aminozucker-Derivate mit U1 + n« = 4 bis 8 bei einer
höheren Temperatur, z.B. 28 C, während bei niedrigen
Temperaturen z.B. 24°C, beispielsweise die Stämme SE 50 (CBS 961.70) und SE 50/110 (CBS 674.73) in überwiegendem Maße Aminozuckerderivate mit Ii1 + n_ = 1 bis 3 bilden.
höheren Temperatur, z.B. 28 C, während bei niedrigen
Temperaturen z.B. 24°C, beispielsweise die Stämme SE 50 (CBS 961.70) und SE 50/110 (CBS 674.73) in überwiegendem Maße Aminozuckerderivate mit Ii1 + n_ = 1 bis 3 bilden.
Die Kulturdauer beträgt im allgemeinen 1 bis 8 Tage, vorzugsweise 2 bis 6 Tage. Eine längere Kulturdauer, insbesondere
in Verbindung mit Kohlenhydra"tüberschuß im Nährmedium, begünstigt die Bildung von Aminozucker-Derivaten
mit höheren Werten von Ii1 + n_.
Der pH-Wert des Kulturmediums variiert im allgemeinen
zwischen 5,0 bis 8,5, wobei pH-Werte von 6,0 bis 7,0
bevorzugt werden.
zwischen 5,0 bis 8,5, wobei pH-Werte von 6,0 bis 7,0
bevorzugt werden.
Le A 17 089 - 6 -
709840/0520
Der Endpunkt der Fermentation erfolgt im allgemeinen durch Bestimmung des Gehaltes an Hemmaktivität im enzymatischen
Hemmtest sowie durch dünnschichtchromatografische Bestimmung der Zusammensetzung des Fermentationsmediums.
Im Falle der chemischen Hydrolyse höhermolekularer Aminozucker-Derivate
zur Herstellung von niedermolekularen wie bereits vorstehend erwähnt, geht man im allgemeinen
in der Weise vor, daß man die höhermolekularen Aminozucker-Derivate mit 1 bis 5 normalen wässrigen Mineralsäuren bei
Temperaturen von 50 bis 100 C, insbesondere von 90 bis 10O0C 10 bis 180 Minuten behandelt. Die ebenfalls mögliche
enzymatische Hydrolyse erfolgt im allgemeinen durch Inkubation mit Enzymen (Hydrolasen), insbesondere mit
ß-Amylasen oder nicht hemmbaren rj^-Amylasen oder Amyloglucosidasen
mikrobiellen Ursprungs, wie beispielsweise OC-Amylasen aus B.subtilis, oder durch Inkubation mit
Mikroorganismen, die in Nährlösungen, welche die höhermolekularen Aminozucker-Derivate in Gehalten von 1 bis
10 %, vorzugsweise 2 bis 5 % als vorzugsweise alleinige Kohlenstoffquelle enthalten, zu wachsen vermögen, beispielsweise
Aspergillus niger (ATC 11.394).
Die Auftrennung und Isolierung der einzelnen erfindungsgemäßen Aminozuckerderivate geht aus entweder von den mikrobiologischen
Kulturbrühen oder von den Hydrolysaten bzw. Inkubationsgemischen, in denen der enzymatische und/oder
Le A 17 089 - 7 -
709840/0B20
/ÖH393 MA'
mikrobiologische Abbau der höhermolekularen Aminozucker» Derivate durchgeführt wurde.
Je nach den Werten für n. + n2 erfolgt die Aufarbeitung
in unterschiedlicher Weise. So geht man zur Reindarstellung der Aminozucker-Derivate von 1I1 + n~ = 1 bis 4 im
allgemeinen in der Weise vor, daß man/ gegebenenfalls
nach vorheriger Abtrennung des Mycels, die betreffende
Kulturbrühe oder das Hydrolysat mit Aktivkohle bei neutralem pH behandelt, anschließend die so an die Aktivkohle
gebundenen Aminozucker-Derivate durch Behandlung der Aktivkohle mit wässrigen Alkoholen oder Aceton,
vorzugsweise 50 bis 80 %igem Aceton, desorbiert. Besonders vollständig gelingt dabei die Desorbtion bei
sauren pH-Werten im Bereich von pH 1,5 bis 4, vorzugsweise von pH 2 bis 3.
Falls die aufzutrennenden Kulturbrühen bzw. Hydrolysate sehr dunkel gefärbt sind, hat es sich als vorteilhaft
erwiesen, sie vor der vorstehend beschriebenen Behandlung mit Aktivkohle bei saurem pH zunächst mit Aktivkohle
oder Absorbtionsharzen wie dem handelsüblichen Lewapol Ca 9221 (0,35 mm Körnung, Bayer AG) bei pH-Werten
von pH 2 bis 6, vorzugsweise 2 bis 3 zu behandeln und so eine Entfärbung zu erreichen. Die Aktivkohle
bindet dabei im sauren Bereich bevorzugt nur die Farbstoffe, nicht jedoch die Aminozucker-Derivate.
Le A 17 089 - 8 -
709840/0520
Die Auftrennung der einzelnen erfindungsgemäßen Aminozucker-Derivate
aus dem wie vorstehend beschrieben erhaltenen Aktivkohle-Desorbat erfolgt dann im allgemeinen in der
Weise, daß man dieses Desorbat über an sich bekannte stark saure Kationenaustauscher wie z.B. Dowex 50 W
(Fa. Dow Chemicals) leitet (pH 1 bis 8, vorzugsweise pH 2 bis 4; bei niedriger Ionenstärke, entsprechend
einer Leitfähigkeit r· 10 mS »cm , vorzugsweise
<2 mS.cm ) Die einzelnen Amino zucker—Derivate werden dabei an den
Kationenaustauscher gebunden. Besonders vorteilhaft lassen sich dabei die Aminozucker-Derivate aus acetonischer
Lösung (50 bis 80 % Aceton, pH 1 bis 5, vorzugsweise pH 2 bis 4) an solche Kationenaustauscher binden.
Die selektive Desorption der erfindungsgemäßen Aminozucker-Derivate
von diesen Kationenaustauschern erfolgt dann im allgemeinen unter Verwendung von wässrigen Säuren
oder Basen als Elusionsmittel, wobei man vorzugsweise Ammoniak oder Salzsäure in Konzentrationen von- 0,01 bis
1 Val/Liter verwendet.
Aus den einzelnen Desorbaten wird dann das betreffende Aminozucker-Derivat nach Neutralisierung des Desorbats
mit einem schwach sauren bzw. basischen Austauscher oder nach Entfernen der Base bzw. Säure durch Abziehen im
Vakuum im Falle von flüchtigen Basen oder Säuren nach Einengen der Lösung durch lyophilisation oder Fällung
mit organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise mit Aceton erhalten.
Le A 17 089 - 9 -
709840/0520
Weiterhin ist es möglich/ niedermolekulare Aminozucker-Derivate
von inerten Sacchariden durch Chromatographie an Austauschern auf Cellulosebasis, vorzugsweise Phosphor-Cellulose
(Fa. Serva, Heidelberg), abzutrennen. Als Laufmittel werden dabei Puffer, vorzugsweise Phosphatpuffer,
von geringer Ionenstärke, vorzugsweise 2 bis 100 mMf
insbesondere 5 bis 10 mM, im pH-Bereich von 2,5 bis 8, vorzugsweise 5 bis 6, verwendet. Voraussetzung für eine
effektive Fraktionierung sind dabei möglichst geringe Salzgehalte in den zu fraktionierenden Präparationen,
deren Farbstoffe weniger stören.
Zur Reindarstellung der einzelnen Aminozucker-Derivate chromatographiert man dann die vorgereinigten Präparate,
über ein geeignetes Molekularsieb, z.B. Bio-Gel P-2 (Fa. Bio-Rad, München) und untersucht die Fraktionen
des Eluates dünnschichtchromatographisch. Fraktionen, welche die erfindungsgemäßen Verbindungen rein enthalten,
werden vereinigt, rechromatographiert und schließlich nach Einengen lyophilisiert oder mittels organischer Lösungsmittel,
wie oben beschrieben, gefällt.
Le A 17 089 - 10 -
709840/0520
26U393
Alle Aminozucker-Derivate sind dadurch gekennzeichnet, daß
bei saurer Totalhydrolyse 'Komponente I1 /C13H1 gO7Ii7
sowie Glucose gebildet werden. Für 'Komponente I' wurde nachstehende
Strukturformel hergeleitet:
OH
"Komponente I"
Das Anfangsglied der Aminozucker-Derivate der vorliegenden Erfingung
besitzt eine Glucoseeinheit. Diese Verbindung ist eine farblose, amorphe Substanz mit guter Löslichkeit in Wasser, Dimethylformamid,
Dimethylsulfoxid, Methanol und heißem Aethanol. Bei Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Essigester,
Methanol und Wasser in einem Verhältni-s von 10:6:4 zeigte
die Verbindung einen R^,-Wert von 0,46 (Maltose = 0,50 und
Glucose = 0,65) auf F 1500 Kieselgelfolien /Schleicher &
Schüll7 und von 0,47 (Maltose = 0,54 und Glucose = 0,66) auf F 254 Kieselgelplatten /Merck, Darmstadt/.
Bei Anwendung eines Silbernitrat/Natriumhydroxid-Sprühreagens erhält man eine braun-schwarze Anfärbung bei Raumtemperatur
oder nach geringfügigem Erwärmen.
Le A 17 089 - 11 -
709840/0520
Die Verbindung wurde zusammen mit D-Glucose oder Saccharose
als Standards in einem Gemisch aus Pyridin (1), Trimethylchlorsilan (0,5) und N-Methyl-trimethyl-silyltrifluoracetamid
(1) silyliert und anschließend der Gaschromatographie in einer 1,8 m Glassäule, gefüllt mit
3 % SE 30 Silikon-Elastomer /""Packard/ auf Chromosorb
WAW, unterzogen.
Die Einspritz- und Detektortemperatur lag bei 3000C. Die
Ofentemperatur betrug 2200C, isotherm bis zur Elution der
et- und ß-D-Glucose Standards. Anschließend wurde die
Temperatur bei einer Geschwindigkeit von 15°C/Minute bis auf 3000C erhöht.
Ein Flammenionisationsdetektor wurde verwendet, wobei Stickstoff als Trägergas bei 40 ml/Minute, Luft als Verbrennungsgas
bei 80 ml/Minute und Wasserstoff bei 20 ml/Minute eingeführt wurden. Die Verbindung wies eine Retentionszeit von
16 - 17 Minuten auf; (c£-D-Glucose = 3 Minuten, ß-D-Glucose
= 4 Minuten und Saccharose =12-13 Minuten.
Eine durch Einengen einer methanolischen Lösung gewonnene, nicht kristalline Probe der Verbindung wurde in Wasser gelöst
und die spezifische optische Drehung zu £</, 7 =
+134,3° bestimmt. °
Das NMR Spektrum in CD3OD bei 220 MHz zeigt Figur 1 (Abszisse
= cf ppm) .
Le A 17 089 - 12 -
709840/0520
26H393
Vorherrschende Merkmale des NMR-Spektrums zeigt die folgende
Tabelle 1 :
| din ppm | Multiplizität | J=6,5Hz | J=12 Hz · | relative Intensität |
H |
| 1,3 | Dublett; | u.J2 8-10 Hz | J= 7 Hz ) | 3 | H |
| 2,3 | "Triplett", J1 | u.J9 7-9 Hz | J=2,5Hz < | 1 | H |
| 3,15 | "Triplett"; J1 | 9 Signale sind nicht einzeln zuzuordnen! |
1 | H | |
| 3,3 - 3, | AB-System; | J=2-3 Hz aufgelöst) |
12 | H | |
| 4,13 | Dublett; | J=3-4 Hz aufgelöst) |
2 | H | |
| 4,48 ) | Dublett; | 1 | |||
| 5,1 | Singlett | gegen Deu H terium ausge tauschte Protonen |
|||
| 4,9 | Dublett; (schlecht |
11 | H | ||
| 5,0 | Dublett; (schlecht |
1 | H ■■·■■· H |
||
| 5,8 | 1 ·■■■■■■■■■*■ 33 |
Wenn man diese Verbindung in einem 1:1-Gemisch aus Acetanhydrid und Pyridin bei Raumtemperatur umsetzt, erhält man
ein Dekaacetylderivat (Molgewicht:903). Das NMR-Spektrum
des Dekaacetylderivats zeigt Figur 2.
Wird die Reaktion in Eisessig/Acetanhydrid 1:1 mit kata-Iytischen
Mengen H2SO4 durchgeführt, so läßt sich neben
dem Dekaacetylderivat auch die Bildung eines Undeacetylderivats (Molgewicht: 945) massenspektroskopisch nachweisen.
Le A 17 089
- 13 -
709840/0520
Z6U393
Das Massenspektrum des Dekaacetylderivats zeigt einen Molekelpeak
bei 903 (2,5 % rel. Intensität) und einen Basepeak bei 843.
Wichtige Fragmentpeaks im oberen Massenbereich sind 844 (55 % r.I.), 784 (36 % r.I.) 783 (34 % r. I), 759 (34 % r. I.)»
556 (36 % r.I.)/ 496 (37 % r.I.) und 436 (29 % r.I.).
Die Methylierung mit CH3J / NaH in Dimethylsulfoxid nach Hakamori
ergibt als Hauptprodukt das Dekamethylderivat, in geringer Menge auch das Ündekamethylderivat.
Das Massenspektrum zeigt einen Holekelpeak bei 623 (6,1% rel.
intensität) und einen Basepeak bei 535. Ein zweiter Molekelpeak wird bei 637 (0,2 % rel. Intensität) beobachtet.
Spektroskopische Daten und chemische Eigenschaften ergeben die folgende Struktur für diese Verbindung
OH OH CH3
)—C V-Q II A
CH9OH H OHOH & H
OH OH
Insbesondere zeigt das NMR-Spektrum,daß dieser Verbindung Ha
die Struktur einer 0- £,4,6-bisdesoxy-4-£l S-(1,4,6/5)-4,5,6-trihydroxy-3-hydroxymethylcyclohex-2-en-1-ylamino7-oC-D-glucopyranosyiy'-(i—^
4)-D-glucopyranose der konformativen Formel:
Le A 17 089 - 14 -
709840/0520
26U393
HOCH7
ν2 μ—OH
CH2OH
dll "^-OH
zukommt.
Das nächste Glied der Reihe (n,. +n2 = 2) besitzt die allgemeine
Zusammensetzung C25H43°ifiN un<* ist ein gut was~
serlösliches amorphes Produkt. Bei der Dünnschichtchromatographie zeigt es einen R„-Wert von 0,35 auf F 1500 Kieselgelfolien
und 0,33 auf F 254 Kieselgelplatten unter Anwendung des oben beschriebenen Systems.
Die optische Rotation in Wasser /JfJ* ist + 147,2 .
Das NMR-Spektrum in D0O bei 220 MH, zeigt Figur 3.
Die Methylierung, wie oben beschrieben, liefert eine 13-fach
methylierte Verbindung,in geringer Menge auch ein 14-fach methyliertes
Produkt.
Das Massenspektrum des Methylierungsproduktes zeigt einen Molekelpeak bei 827 (1,5 % v.l.) und entspricht einer Summenformel
C00H^nNO1Q.
oo by 1 ο
oo by 1 ο
Le A 17 089 - 15 -
709840/0520
Ζ6Ί4393
Mit 0,1 % r.I. ist bei 841 ein zweiter Molekelpeak vorhanden,
Die wichtigesten Pragmentpeaks sind:
739 ( 27 * r.I. )
592 ( 3,7 Υ» r. I. )
535 ( 30 <fo r. I. )
388 ( 9 # r. I. )
386 ( 13 # r. I. )
284 ( 13 fo r. I. )
187 ( 12 "h r. I. )
171 ( 40 $> r. I. )
101 ( 34 $> r. I. )
88 ( 25 # r. I.)
75 Base peak
Aus den chemischen und spektroskopischen Eigenschaften ergibt sich folgende Struktur für diese Verbindung:
Le A 17 089
- 16 -
709840/0520
2ß14393
wobei diesem zweiten Glied der Reihe der erfindungsgemäßen
Aminozucker-Derivate die Struktur einer 0- ^4,6-bisdesoxy-4-/i S- (1,4 ,6/5) -^S/e-trihydroxy-S
thylcyclohex^-en-i-ylamino/- o^-D-glycopyranosyl Z -(1—r 4)-0-ο<ϊ-D-glucopyranosyl-(1—^
4)-D-glucopyranose der konformativen Formel zukommt:
HOCH
XIIB
.CH2OH
Das nächst höhere Glied der Reihe (nV+i^ = 3) erhält man in
zwei isomeren Formen, wobei eine der beiden isomeren Formen überwiegend gebildet wird.
Bei saurer Teilhydrolyse lassen sich beide isomeren Verbindungen in das erste Glied der Reihe (n.. +n~ = 1) und Glucose
im Molverhältnis 1:2 spalten.
Das in kleineren Mengen vorhandene Produkt ist die Verbindung O-^^je-bisdesoxy^-^i S-(1,4,6/S)-4,5,6-trihydroxy-3-hydroxymethylcyclohex-2-en-1-ylaminq/-
^C -D-glucopyranosyl^
-(1—? 4)-O-r£ -D-glucopyranosyl- (1—■? 4) -0-o^-D-glucopyranosyl-
(1—■> 4) -D-glycopyranose der konformativen Formel:
Le A 17 089
- 17 -
709840/052 0
26U393
HOCH2 Α —GH
IV
Das in größeren Mengen vorhandene isomere Produkt ist die Verbindung 0- ^4,6-bisdesoxy-4-/"1 S-(1,4,6/5)-4,Sje-trihydroxy-S-hydroxymethyl-'i-O-
QL-D-glucopyranosyl-(1—9 4)-cyclohex-2-en-1-ylantinq7-C£
-D-glycopyranosylJf - (1—? 4) -0-
<X-D-glucopyranosyl-(1—? 4)-D-glucopyranose der konformativen
Formel:
Le A 17 089
2ÖU393
CH2OH
HOCH2 a—°H
HO—N
Diese Isomere zeigen auf F 1500 Platten unter Verwendung von n-Butanol·, Äthanol und Wasser im Verhältnis von 50:30:20
Rq, -Werte von 0/41 bis 0,46. Die Anwesenheit des Isomeren
mit der in Formel V gezeigten Struktur läßt sich nachweisen,
indem man die Produkte aus dem hydrierenden Abbau (Palladium/Aktivkohle) analysiert. Es gehören zu diesen
Abbauprodukten:
3-Hydroxymethyl-4,5,e-trihydroxy-4-O-o^-D-glucopyranosyl- (1)-hexan,
0-(4-amino-4,6-bisdesoxy- ^-D-glucopyranosyl)-(1—» 4)-0-
<&-D-glucopyranosyl-(1—ψ 4)-D-glucopyranose und Glucose.
Le A 17 089
- 19 -
709840/0520
26H393
Da die Hydrierung die Doppelbindung der Hexengruppe reduziert
und die Aminobindung spaltet, ist es klar, daß die se Verbindung, die gegenüber der Verbindung der Formel IV
isomer ist, mit der Verbindung der Formel III A oder III B strukturell verwandt ist; sie ist jedoch durch die Anwesenheit
einer weiteren Glucopyranosylgruppe in 4-Stellung des Cyclohexenringes gekennzeichnet.
CH4OH CH4OH
CH1OH CH1OH
O" ° "O"°H
OH OH OH OH
/ CH1OH \ OH OH
Die Anwesenheit des Isomeren mit der in Formel IV gezeigten Struktur wird durch die Bildung von Validatol
und O- (4-Amino-4 , ö-bisdesoxy-oiT-D-glucopyranosyl) - (1—* 4) -0-o6
-D-glucopyranosyl (1—Ψ 4)-0-o£-D-glucopyranosy1-(1—f 4)-D-glucopyranose
bewiesen.
Le A 17 089
- 20 -
709840/0520
CH2OH J CH3
OH
OH, O
CH2OH
KO OH
0 £j- 0 .K 0 -R-CH

In weiteren Untersuchungen wurden die Isomeren mit ri/ +n2 = 3 nach bekannten Methoden methyliert, hydrolysiert,
mit Natriumborhydrid reduziert, acetyliert und gaschromatographisch analysiert. Während die Verbindung der Formel IV
nur 1,4,5-Tri-0-acetyl-2,3,6-tri-0-methyl-D-glucitol ergibt,
liefert die Verbindung der Formel V 1,4,5-Tri-O-acetyl-2,3,6-tri-O-methyl-D-glucitol
und 1,5-Di-O-acetyl-2,3,4,6-tetra-O-methyl-D-glucitol
im Molverhältnis von 2:1.
Die isomeren Verbindungen mit den Formeln IV und V lassen sich chromatographisch an einem sauren Austauschharz mit
0,025 η Salzsäure als Elutionsmittel trennen.
Die höheren Glieder der Reihe, die 4 bis 8 Glucoseeinheiten mit Molgewichten von 969 bis 1617 enthalten, vermögen Saccharase
weniger zu hemmen #
Bei der sauren Hydrolyse dieser höheren Glieder lassen sich die jeweils niederen Komponenten als Zwischenprodukte zusammen
mit Glucose und Maltose nachweisen.
Le A 17 089
- 21 -
709840/0520
. 26Η393
Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von n-Butanol,
Äthanol, Wasser im Verhältnis von 50:30:20 auf F 1500 Kieselgelplatten
ergibt IU, -Werte von 0,30 - 0,34 4 Glucoseeinheiten);
0,21 - 0,23 5 Glucoseeinheiten);
0,14-0,16 6 Glucoseeinheiten); und
0,09 - 0,11 "7 Glucoseeinheiten).
Wie bei den niederen Gliedern dieser Reihe ergibt die totale saure Hydrolyse 'Komponente I1 und Glucose in diskreten
Molverhältnissen, nämlich 1:4, 1:5, 1:6, 1:7 und 1:8,(wobei die Glucoseprozentsatze 74,4 %, 79,7 %, 83,3 %,
86,5 % bzw. 89,1 % sind).
Bei der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von F 1500 Kieselgelplatten mit n-Butanol, Äthanol, Wasser im Verhältnis
von 45 : 35 : 20 als Lösungsmittel werden folgende Rf-Werte
bei der dreifachen Entwicklung beobachtet:
Le A 17 089 - 22 -
709840/0520
26H393
Verhältnis Glucose:' Komponente I
Standard
Rf-Wert
| Glucose | 0.77 | |
| Maltose | 0.65 | |
| Maltotriose | 0.51 | |
| Maltotetraose | 0.39 | |
| Maltopentaose | 0.27 | |
| 4:1 | 0.25 | |
| Maltohexaose | 0.21 | |
| 5:1 | 0.18 | |
| Maltoheptaose | 0.15 | |
| 6:1 | 0 X^ | |
| Maltooctaose | 0.11 | |
| 7:1 | 0.09 | |
| 8:1 | 0.07 |
Ebenfalls zeigt die oben beschriebene katalytische Hydrierung, daß einige aber nicht alle Glucoseeinheiten dieser höheren
Glieder in 4-Stellung der Cyclohexengruppe gebunden sind.
Da diese Verbindungen lineare Oligoglucosidketten mit 1—*>
Bindungen enthalten, können sie als Substrate für gewisse Kohlenhydrat-abbauende Enzyme Verwendung finden. Der Bereich
der Enzyme ist offenbar auf solche beschränkt, die nicht wesentlich durch die Verbindungen gehemmt werden.
Le A 17 089
- 23 -
709840/0520
-Ϊ1- 26U393
Bakterielle und pilzartige o{ -Amylasen können zum Abbau jeder
Oligoglucosidkette verwendet werden, die 3 oder mehr Glucoseeinheiten enthalten und niedermolekulare Verbindungen und
inerte Saccharidfragmente wie ζ, B. Maltose und Maltotriose
ergeben. Dieses Abbauverfahren ist auf die Verbindungen mit n-, + Up ^ 3 anwendbar und stellt einen weiteren Beweis
für die 6-, 1—)k Bindung dar. Erfindungsgemäße Verbindungen
mit 4 bis 7-Glucoseeinheiten sind auch teilweise durch ß-Amylase
abbaubar. Da ß-Amylase Maltoseeinheiten von dem nichtreduzierenden Ende einer Glucosekette mit t£, 1—)k Bindungen
abspaltet, liefert sorgfältige Analyse der ß-Amylaseabbauprodukte wertvolle Information über jeden an der 4-Stellung des
Cyclohexenrings gebundenen Oligoglucosidsubstituenten, insbesondere
über seine Kettenlänge,und die Zahl der Glucosen in der an der Bisdesoxyglucose gebundenen Kette, d.h. in dem
reduzierenden Ende der Verbindung. Die 4,5,6,7 oder 8 Glucoseeinheiten
enthaltenden Verbindungen sind jedoch nicht völlig abbaubar durch ß-Amylase. Der Resistenz eines Teils
der Verbindungen ist offensichtlich unzureichenden Strukturbedingungen für den ß-Amylaseangriff zuzuschreiben.
Die Ergebnisse des ß-Amylaseabbaus können folgendermaßen
zusammengefaßt werden.
Le A 17 089
7 0 9 8"4 Ö4/ D 5 2 0
26U393
Zahl der Glucoseeinheiten im Ausgangsmaterial
Zahl der Glucoseeinheiten
in Abbauprodukten
in Abbauprodukten
entfernte Maltoseeinheiten
| 4 | • | .8 | 4 | O |
| 2 | 1 | |||
| 5 | 5 | O | ||
| 3 | 1 | |||
| 6 | 6 . | O | ||
| 4 | 1 | |||
| 2 | 2 | |||
| 7 | 7 | O | ||
| 5 | 1 | |||
| 3 | 2 | |||
| 8 | O | |||
| 6 | 1 | |||
| 4 | 2 | |||
| 2 | 3 |
Gegebenenfalls wird ein Teil des Ausgangsmsterials wiedergewonnen.
Bezüglich des ß-amylolytischen Abbaus soll nochmals betont
werden, daß ß-Amylase nur Maltoseeinheiten zu entfernen vermag und diese auch nur von dem nicht-reduzierenden Ende eines Oligosaccharids.
Es soll vermieden werden, daß irgendeine Theorie zu einer Einschränkung führt. Obwohl die genaue Struktur dieser
höheren Verbindungen nicht völlig geklärt ist, ist nach obigen Befunden zu folgern, daß zu den Verbindungen mit 4, 5, 6, 7
und 8 Glucoseeinheiten Derivate der niederen Verbindung mit der Formel III A gehören, welche Ketten mit 2, 3, 4, 5 und
Glucoseeinheiten enthalten, die <£, 1—>
4 miteinander verbunden sind, wobei die Oligosaccharidkette in du-Konformation mit
der 4-Stellung des Cyclohexenringes verbunden ist.
Le A 17 089
- 25 -
709840/0520
^614393
Methylierung der Verbindungen mit Methyljodid/Natriumhydrid
in Dimethylsulfoxid, totale Hydrolyse, Derivatisie-
rung und anschließende gaschromatographische Analyse ergibt
das 2,3,6-TrimethyIglucosederivat, so daß die Glucoseeinheiten
notwendigerweise 1— 4 in einer ausschließlich linearen Struktur verbunden sind.
Ein zweites Methylierungsprodukt, welches in Abhängigkeit
von der methylierten Verbindung in verschiedenem Maße oder unter Umständen gar nicht vorhanden ist, ist das 2,3,4,6-Tetramethylderivat.
Das Vorkommen dieses Derivats und sein Molverhältnis zu dem Trimethylderivat ist abhängig von dem
an dem Cyclohexenring gebundenen Substituenten.
Es ist bekannt, daß bei Tieren und Menschen nach Aufnahme von kohlenhydrathaltigen Nahrungsmitteln und Getränken (z.B.
Getreide-, Kartoffelstärke, Obst, Fruchtsaft, Bier, Schokolade) Hyperglykämien auftreten, die infolge eines raschen
Abbaus der Kohlenhydrate durch Glykosidhydrolasen Cz.B.
Speichel- und Pankreasamylasen, Maltasen, Saccharasen) nach
folgendem Schema
Amyläse Maltase
Stärke bzw. Glykogen ■ ■ Kaitose * Glucose
Saccharase Saccharose * Glucose + Fruktose
bewirkt werden. Diese Hyperglykämien sind bei"Diabetikern
besonders stark und anhaltend ausgeprägt. Bei Adipösen
bewirkt die alinentäre Hyperglykämie oftmals eine besonders starke Sekretion von Insulin, das seinerseits zu vermehrtem
Fettaufbau und vermindertem Fettabbau führt. Im Anschluß an derartige Hyperglykämien tritt bei stoffwechselgesunden und
adipösen Personen infolge der Insulinsekretion häufig eine
Le A 17 089 - 26 -
709840/0520
Hypoglykämie auf. Bekannt ist, daß sowohl Hypoglykämien als auch im Magen verweilender Speisebrei die Produktion von Magensaft
fördern, der seinerseits die Entstehung einer Gastritis, eines Ulcus ventriculi oder duodeni auslöst oder begünstigt.
Es wurde nun gefunden,- daß die erfindungsgemäßen Aminozuckerderivate
die alimentäre Hyperglykämie, Hyperinsulinämie und Hypoglykämie erheblich vermindern.
Ferner ist bekannt, daß in der Mundhöhle Kohlenhydrate, besonders Saccharose, durch Mikroorganismen gespalten werden
und dadurch die Kariesbildung gefördert wird.
Die erfindungsgemäßen Aminozuckerderivate können zur Verhinderung
bzw. Verminderung einer solchen Kariesbildung eingesetzt werden.
Le A 17 089 - 27 -
709840/0520
26U393
Eine Amylase-Inhibitor-Einheit (1 AIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Amylaseeinheiten zu 50 1° inhibiert.
Eine Amylaseeinheit (AE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 /u Äquivalent
glucosidischer Bindungen in der Stärke spaltet. Die /uVal gespaltenen Bindungen werden als ,uVal gebildeter reduzierender
Zucker mit Dinitrosalicylsäure kolorimetrisch bestimmt und mit Hilfe einer Maltoseeichkurve als yuVal Maltoseäquivalente
angegeben. Zur Durchführung des Testes werden 0,1 ml Amylaselösung (20 - 22 AE/ml) mit 0-10 ,ug Inhibitor
oder 0-20 /Ul der zu testenden Lösung in 0,4 ml 0,02m
Natriumglycerophosphatpuffer/0,001m CaCl2 pH 6,9 versetzt und
etwa 10 - 20 Minuten in einem Wasserbad von 35°C äquilibriert.
ο _<
Dann wird 5 Minuten mit 0,5 ml einer auf 35 C vorgewärmten 1 >
Stärkelösung (Stärke, löslich, der Firma Merck, Darmstadt, Nr. 1252) bei 35°C inkubiert und anschließend mit 1 ml Dinitrosalicylsäure-Reagens
(nach P. Bernfeld in Colowick-Kaplan,
Meth. Enzymol., Band J., Seite 149) versetzt. Zur Farbentwicklung wird der Ansatz 5 Minuten auf dem siedenden Wasserbad
erhitzt, dann abgekühlt und mit 10 ml destilliertem Wasser versetzt. Die Extinktion bei 540 nm wird gegen einen entsprechend
angesetzten Leerwert ohne Amylase gemessen. Zur Auswertung wird aus einer vorher aufgenommenen Amylaseeichkurve die nach
Inhibitorzusatz noch wirksame Amylaseaktivität abgelesen und
daraus die prozentuale Hemmung der eingesetzten Amylase errechnet. Die prozentuale Hemmung wird als Funktion des Quotienten
/Ug Inhibitor +
AE ++
Le A 17 089 - 28 -
709840/0520
26U393
+ bezogen auf Trockensubstanz
++ AE im nicht inhibierten Ansatz der gleichen Serie
aufgetragen, der 50 % Hemmungspunkt aus der Kurve abgelesen und auf AIE/mg Inhibitor umgerechnet.
In vitro
Saccharasetest
Saccharasetest
Eine Saccharase-Inhibitor-Einheit (SIE) ist definiert als die
Menge Inhibitor, die zwei Saccharase einheit en zu 50 f° inhibiert.
Eine Saccharaseeinheit (SE) ist die Menge an Enzym,die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen
1 yuMol Saccharose in Glucose und Fructose spaltet. Die /uMol
gebildete Glucose werden mit Hilfe der Glucoseoxidasereaktion quantitativ bestimmt unter Bedingungen, bei denen eine weitere
Saccharosespaltung durch die Saccharase nicht mehr stattfindet. Zur Durchführung des Testes werden 0,05 ml einer auf
0,12 SE eingestellten Saccharaselösung ' mit 0 -' 20 /ug Inhibitor
oder 0-20 /ul der zu testenden Lösung versetzt und mit 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 auf 0,1 ml aufgefüllt.
Es wird 10 Minuten bei 35°C äquilibriert und dann mit 0,1 ml einer auf 35 C vorgewärmten 0,05 m Saccharoselösung in 0,1 m
Natriummaleinatpuffer pH 6,0 versetzt. Man inkubiert 20 Minuten bei 350C und stoppt die Saccharasereaktion durch Zugabe
2)
von 1 ml Glucoseoxidasereagens ' ab und inkubiert weitere 30 Minuten bei 35°C Danach wird 1 ml 50 $S H2S°4 zugesetzt und bei 545 nm gegen einen entsprechenden Leerwert gemessen. Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten Saccharase berechnet und aus dem 50 # Hemmpunkt mit Hilfe einer Glucoseeichkurve auf SIE/g bzw. SIE/Liter umgerechnet.
von 1 ml Glucoseoxidasereagens ' ab und inkubiert weitere 30 Minuten bei 35°C Danach wird 1 ml 50 $S H2S°4 zugesetzt und bei 545 nm gegen einen entsprechenden Leerwert gemessen. Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten Saccharase berechnet und aus dem 50 # Hemmpunkt mit Hilfe einer Glucoseeichkurve auf SIE/g bzw. SIE/Liter umgerechnet.
Solubilisierte Saccharase aus Schweinedünndarmmucosa nach
B. Borgström,-A. Dahlquist, Acta Chem. Scand. J_2, (1958),
Seite 1997. Mit 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 auf
entsprechenden SE-Gehalt verdünnt.
Le A 17 089 - 29 -
709840/0520
y^ . 26U393
2)
' Das Glucoseoxidasereagens wird durch Lösen von2 mg GIucoseoxidase
(Pa. Boehringer Nr. 15423) in 100 ml 0,565 m Tris-HCl-Puffer pH 7,0 und anschließenden Zusatz
von 1 ml Detergenslösung (2g Triton X100+8g95$
Äthanol p. a.), 1 ml Dianisidinlösung (260 mg o-Dianisidin
. 2 HCl in 20 ml H2O) und 0,5 ml 0,1#iger wäßriger Peroxidaselösung
(Pa· Boehringer Nr. 15302) hergestellt.
Le A 17 089 - 30 -
709840/0520
26K393
Maltasetest
Eine Maltase-Inhibitor-Einheit (MIE) ist definiert als die >!enc-*e Inhibitor, die zwei Maltnseeinheiten zu 50 # inhibiert.
Eine Maltaseeinheit (ME) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 /uMol
Maltose in 2 /ullol Glucose spaltet. Die /uMol gebildete Glucose
werden mit Hilfe der Glucoseoxidasereaktion quantitativ bestimmt unter Bedingungen, bei denen eine weitere Maltosespaltung
durch die Maltase nicht mehr stattfindet. Zur Durchführung des Testes werden 0.05 ml einer auf 0.060 - 0.070 ME
eingestellten Malt.use lösung ' mit 0-20 /Ug Inhibitor oder
0-20 /Ul der zu testenden Lösung versetzt und mit 0.1 m Natriunmaleinatpuffer
pH 6.0 auf 0.1-ml aufgefüllt. Es wird 10 Minuten bei 35 C äquilibriert und dann nit 0.1 ml einer auf 35 C
vorgewärmten 0.05 m Kaitoselösung in 0.1 m ITatriumnaleinatpuffer
pH 6.0 versetzt. Man inkubiert 20 Minuten bei 350C und stoppt
die Kaltasereaktion durch Zugabe von 1 ml Glucoseoxidasereagens
*"' ab und inkubiert weitere 30 Minuten bei 35°C.
Danach wird 1 ml 50 c/» H2S04 znSe8e^z^ un<* ^ei 545 mn gegen
einen entsprechenden Leerwert gemessen.
Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten Maltase berechnet und aus den 50 c/o Hemmpunkt mit Hilfe einer
Glucoseeichkurve auf KIE/g bzw. MIE/Liter umgerechnet.
Solubilisierte Maltase aus SchweinedUnndarmmucosa nach
B. Borgström, A.Dahlquist, Acta Chem.Scand.J^, (1958),
Seite 1997. Mit 0.1 m Natriummaleinatpuffer pH 6.0 auf
entsprechenden ME-Gehalt verdünnt.
Bereitung des Glucoseoxidasereagens: wie beim Saccharase-
test, S. 30, Fußnote 2), beschrieben.
Le A 17 089 - 31 -
709840/0520
^S 26U393
Die Ergebnisse der in vitro Enzymhemmtests für einzelne der
erfindungsgemäßen Aminozuckerderivate sind in nachstehender Tabelle I zusammengefaßt:
| Formel | Zahl der Glucose- eiriheiten |
«=<Γ-Amy läse Inhibition AIE/g |
Saccharase inhibition SIE/g |
Maltase- Inhibition MEE/g |
| II B III B V |
1 2 3 |
300.000 300.000 1.400.000 |
30.000 68.000 21.000 |
5.000 15.000 5.000 |
|
4-6
5 - 7 . |
17.500.000 30.000.000 |
8.500 2.500 |
- |
Wie aus der Tabelle ersichtlich, steigt die spez. in vitro
Heiranaktivität gegenüber Pankreas-^-Amy läse mit zunehmendem
Molekulargewicht der Reihe stark an; so zeigen die Verbindungen mit 5-7 Glucoseeinheiten eine 10Ofach stärkere Enzymhemmung
in vitro als die Verbindung mit 1 oder 2 Einheiten. Die Saccharaseinhibition ist bei dem Derivat mit 2 Einheiten
am stärksten ausgeprägt, das Derivat mit 1 Glucoseeinheit hemmt nur noch halb so stark, und das höhere Glied zeigt
eine weiter abfallende spezifische Aktivität der Saccharasehemmung.
In vivo läuft die Wirksamkeit in der Saccharasehemmung der in vitro gefundenen spez. Hemmaktivität in etwa parallel. Dagegen
wurde überraschenderweise beim Stärkebelastungstest in vivo für die Verbindungen mit 1, 2 oder 3 Glucoseeinheiten eine im
Vergleich zur Amylasehemmung in vitro 10 - 40-fach gesteigerte
Wirksamkeit gefunden.
Le A 17 089
26H393
Zur Erzeugung einer alimentären Hyperglykämie und Hyperinsulin-
".T:Ie erhielten Gruppen mit jeweils 6 nüchternen Ratten
a) 2,5 Saccharose,
bj 2,5 g Maltose oder
c) 1g gekochte Stärke
p.os in wäßriger Lösung oder als Suspension appiiziert.
6 andere Ratten erhalten die genannten Kohlenhydrate in der jloicr.en Menge und zusätzlich einen Glucosidhydroseinhibitor
in der angegebenen Dosierung.
Weiterhin erhalten 6 andere Ratten eine entsprechende Menge Salzlösung.
Llutglucose und Seruminsulin wurden in kurzen zeitlichen
Ab3xänlen im Blut aus dem retroorbitalen Venenplexus gemessen»
Die Blutglucosebestimmungen werden im Auto-Analyzer (Technicon
nach Hoffman : J.biol.Chem. 120, 51 (1937) oder enzymatisch mit
Glucoseoxydase und o-Dianisidinhydrochlorid), die Seruminsulinbestinziiungen
nach der Methode von Haies und Rändle: Biochem. J. SS, 137 (1963)) ausgeführt.
Die Ergebnisse der in vivo Saccharaseinhibition (S ac chare· se Verabreichung)
in der nüchternen Ratte gibt die folgende Tabelle III:
Le A 17 089 - 33 -
709840/0520
TftbloITI
| Formel | η | Dosis (SIE) | Blutglucose | in mg | % (Mittelwert + | • | 45 Min | Abw.) | 60 Min. | \ |
| Salzlösung- Saccharose (Kontrolle) |
15 Min. | 30 Min | 3.9 8.1 |
91 + 152 + |
- | |||||
| HB | 1 | 3accharosef50 SIE | 69 + 5.2 117 + U |
84 +
135 + |
5.2* | 128 + | 5.9 18 |
- | ||
| Sacchaross+lOO SIE | 105 + 11 | 123 + | 4.1*** | 116 + | 11* | - | ||||
| Saccharose+ 200 SIE | 89 + 6.5*** | 111 + | 9.1*** | 104 + | 3.9*** | - | CO (£> |
|||
| IHB | 2 | Salzlösung Saccharose (Kontrolle) |
72 + 4.6*** | 95 + |
8.5
20 |
95 + 127 + |
9.6*** | - | CO | |
| Saccaroae+ 25 SIE | 55+ 4.5 113 + 9.9 |
92 + 126 + |
7.3* | 107 + |
6.4
14 |
- | ||||
| Saccarose + 100 SIE | 71 + 3.7*** | 100 + | 4.0** | 98 + | 2.4** | - | ||||
| -3 O γ |
3 | Salzlösung Saccharose (Kontrolle) |
58 + 5.9*** | 92 + | 4.3 16.0 |
76 + 128 + |
5.0*** | - | ||
|
CO
OO |
ο-j,cerόγob+- c-j SIE | 66 + 4.6 122 +6.6 |
73 + 125 + |
12.0 ♦ | 104 + | 3.9 14.8 |
- | |||
|
•C-
O |
~j:cc\\nm:o-r 50 SIE | 83 + 11.4 ♦♦ | 101 + | 7.0 ♦ | 94 + | 7.4 ♦♦ | - | |||
| 1^. r-i |
3:icch:uo:e-*- ICO SIE | 91 + 9.^ ** | 1C6 i | 6.0 *** | ς 7 + | 9.0 ♦♦♦ | - | |||
| »520 | 81 + 7.2 ·· | 90 + | , 1.6 ♦♦♦ | |||||||
Fortsetzung Tabelle III
| η | Dosis (SIE) | 15 Min | Blutglucose in mg | 30 Min | • | % (Mittelwert | ·** | 45 Min | + | • | Abw.) | 8 | 16 | .5** | 60 Min | • | 0 | i | 0 | |
| Formel '■ | Salzlösung | 58 + | • | 49 + | 3. | 9*** | 54 + | 4. | 7 | .7·« | 63 +. | 5. | 7 | .7 | ||||||
| Saccharose (KontrbUe] | 107 + | 2.9 | 121 + | 6. | 3 | 3 | 132 + | 16 | 1* | 3 | . 0*** | 132 + | 6. | 1*** | .9** | |||||
| 4-6 | Saccharose+ 25 SIE | 109 + | 11 | 105 + | 0 | .0 | 112 + | 9. | 7** | 9 | 108 + | 8. | 2*** | .3*** | ||||||
| mm | Saccharose +50 SIE | 103 + | 6.4 | 107 + | 10** | .6* | 102 + | 7. | 5*** | 101 + | 9. | # 5*** | ||||||||
| Saccharose+ 100 SIE | 85 + | 4.1 | 94 + | If | .3*** | 95 + | 8. | 8 | 85 + | 6. | ||||||||||
| Salzlösung | 58 + | 8.1** | 49 + | 9 | .7*** | 54 + | 4 | 63 + | 5 | |||||||||||
| Saccharose (Kontrolle | ι 107 + | 2.9 | 121 + | 3 | 132 + | 132 + | 6 | |||||||||||||
| 5-7 | Saccharose+ 75 SIE | 102 + | 11 | 108 + | 6 | 109 + | 101 + | 7 | ||||||||||||
| - | Saccharose+ 150 SIE | 92 + | 11 | 100 + | 9 | 109 + | 102 + | 6 | ||||||||||||
| Saccharose + 300 SIE | 95 + | 7.0* | 84 + | 8 | 93 + | 91 + | 4 | |||||||||||||
| 8.1* | 8 | |||||||||||||||||||
= Wahrscheinlichkeit gegen Kontrolle mit Saccharose ^- Viahrscheinlichkeit gegen Kontrolle mit Saccharo.se
*■**= V/ahrscheinlichkoit gegen Kontrolle mit .Saccharose
'0,05
.0,01 0,00.1
cn
(O
Wie aus obigen Daten ersichtlich läuft die in in der Saccharase-Inhibition der in vitro gefundenen Hemmaktivität
parallel. So steigt die BD50» während die Saccharaseinhibiticnseinheiten
pro mg abnehmen. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle IV zusammengefaßt:
| Glucoseein- heiten |
Saccharaseinhibition | in vivo | |
| Formel | in vitro | (ED50 mg/kg) | |
| (D | SIE/mg | 3.0 | |
| IZB | (2) | 30 | 0.21 |
| IHB | (3) | 68 | 2.65 |
| V | (4-6) | 21 | - 15.30 |
| - | (5-7) | 8.5 | - 52.00 |
| - | 2.5 | ||
Überraschenderweise ist die in vivo Inhibition des Stärkeabbaus durch die Verbindungen der Formel HB, IHB und V viel höher,
als nan anhand der in vitro gefundenen Daten für die Amylasehemir-ung
erwartet hätte und entspricht also nicht dem erwarteten Muster. Die folgende Tabelle V gibt die wie oben ermittelten.in...
vivo Daten für die nüchterne Ratte nach Verabreichung der Stärke wieder:
Le A 17 089
- 36 709840/0520
| Glue ο | - Dosis | (AIE) | (Kontrolle) | (Kontrolle) | (Kontrolle) | 5 Min | 6. | 2 | . | 7 | . 6*** | Biutglucose in ing % | m | 0 | . 0*-·ν* | 15 Min | (Mittelwert -± | 20 Min | * | 5.4 | 45 Min | 9.2 | |
| ■"ormel | Vt ρ 'i*tai"i | + 75 AIE | + 150 AIE | + 750 AIE | 8. | 8 | 9 | 10 Min | . 6*·· Wf | 30 Min | 18 | 19 | |||||||||||
| Salzlösung | + 150 AIE | + 300 AIE | + 1,500 AIE | 74 4 | 2. | 9 | 5 | 3. | 9 | .3— | 82 4 | 71 4 | 11* | 90 4 | 18· | ||||||||
| Stärke | + 300AIE | f 600 AIE | + 3,000 AIL· | 101 4 | 8. | 7 | .2 | 74 4 | 13 | 0* | 146 4 | 9.4 | 151 4 | 76 4 | 5.2** | 156 4 | 5. i | ||||||
| 1 | Stärke | Salzlösung | + 1,200 AIL· | 102 4 | 12 | .6 | 135 4 | 6. | 8*** | 128 4 | 4.8 | 143 4 | 148 4 | 5.3* | 132 4 | 7.2* | |||||||
| HB | Stärke | Stärke | Salzlösung | 98 4 | 3 | .0*** | 130 4 | 9. | 9 | 128 4 | 5.4*** | 127 4 | 125 4 | 5.2 | 137 4 | 1.5 | |||||||
| Stärke | Stärke | Stärke | 87 4 | 7 | .3 | 116 4 | 1. | 7 | HO 4 | 5.8*** | 111 4 | 115 4 | 5.0 | 121 4 | 14 | ||||||||
| Stärke | Stärke- | 61 4 | 7 | .3 | 106 4 | 3. | 2*·.ν | 83 4 | 8.9*** | 75 4 | 108 4 | 6.1 | 84 4 | 5.2 , | |||||||||
| Stärke | Stärke | 85 4 | 8 | .5 | 68 4 | 7 | , 7*·Λ* | 132 4 | 5.3 | 140 4 | 91 4 | 9.9** | 128 4 | 5 9 CV | |||||||||
| 2 | Stärke | Stärke | 82 4 | 4 | • 14* | 120 4 | 4 | .8 | 120 4 | 11 | 124 4 | 135 4 | 9.2 | 125 4 | 4.2 * | ||||||||
| IHB | 79 4 | 7 | ■ 5 | 105 4 | 2 | .7*** | 105 4 | 6.0* | 118 4 | 134 4 | 5.0*** | 130 4 | 4. | ||||||||||
| 70 + | 2 | 97 4 | 8 | .9 | 94 4 | 10** | 91 4 | 119 4 | 6.5 | 102 4 | 6.9 | ||||||||||||
| 70 4 | 7 | 80 4 | 7 | 12 | 88 4 | 6.9 | 97 4 | 103 4 | 15 | 100 4 | 7,7 | ||||||||||||
| 52 4 | ■ 8 | 84 4 | 7 | 5 | 57 4 | 7.4*** | . 78 4 | 97 4 | 11*** | 70 4 | 3.6** | ||||||||||||
| 93 4 | 75 4 | 9 | 127 4 | 3.7 | 152 4 | 82 4 | 8.8*** | 124 4 | 4.2** | ||||||||||||||
| 3 | 86 4 | 133 4 | 3 | 117 4 | 9.3 | 121 4 | 156 4 | 6.4*** | 114 4 | 2.5·" | |||||||||||||
| V | 77 4 | 107 4 | 94 4 | 8.7* | 113 4 | 126 4 | 111 4 | ||||||||||||||||
| 65 i | 92 4 | 82 4 | 9.5*** | 112 4 | 112 4 | 104 4 | |||||||||||||||||
| 101 4 | _ Abw.) | 109 4 | |||||||||||||||||||||
| 11 | |||||||||||||||||||||||
| 9.5 | |||||||||||||||||||||||
| 11 | |||||||||||||||||||||||
| 4.8*** | |||||||||||||||||||||||
| 2.1*** | |||||||||||||||||||||||
| 8.7 | |||||||||||||||||||||||
| 12 | |||||||||||||||||||||||
| 7.0* | |||||||||||||||||||||||
| 6.7** | |||||||||||||||||||||||
| 16 | |||||||||||||||||||||||
| 5.2*** | |||||||||||||||||||||||
| 9.6 | |||||||||||||||||||||||
| 15 | |||||||||||||||||||||||
| 12** | |||||||||||||||||||||||
| 9.7*** | |||||||||||||||||||||||
| 4.5*** |
Le A 17 089 709840/0520
- 37 -
Table V
| For mel |
ι | alUGO- seein- |
Dosis (AIE) | Blutglucose | I | - | Stärke +12.000 AIE | 5 ~ | in mg | % (Mittelwert | 15 Min | ± | Abv/.) | 20 Min | • | .8 | 30 Min | • | 7 | 45 Min | • |
| '■ - | tieiten | Salzlösung | 5 Min. | - | Stärke + 24.000 AI] | 10 Min | • | 63 + | * | 67 + | 5 | .5 | 72 + | 4. | 9 | 66 + | 5.0 | ||||
| Stärke (Kontrolle | - | 55 + | 4.8 | 117 + | 5. | 9 | 118 + | 8 | .1* | 128 + | 8. | 109 + | 11 | ||||||||
| Stärke + 6.OOOAIE | 103 + | 11 | 118 + | 8. | 6 | 104 + | 8 | %\kkk | 123 + | 11 | 7* | 107 + | 7.3 | ||||||||
| - | A-6 | Stärke +12.000AIE | - | 99 + | 4.5 | 98 + | 5. | 8 | 99 + | 4 | 117 + | 6. | Q Ä "fCrC | 104 + | 8.2 | ||||||
| Stance +24.00OAIE | 90 + | 5.2* | 82 + | 8. | 2** | 83 + | 3 | .8 | 96 + | 6. | 7 | 85 + | 6.4* | ||||||||
| Salzlösung | 74 + | 5.5*** | 63 + | 2. | 9*** | 67 + | 5 | .5 | 72 + | 4. | 9 | 66 + | 5.0 | ||||||||
| Stärke (Kontrolle | 55 + | 4.8 | 117 + | 5. | 9 | 118 + | 8 | .5** | 128 + | 8. | 0** | 109 i | 11 | ||||||||
| Stärke + 6.000 AI | 103 + | 11 | 107 + | 8. | 6 | 102 + | 5 | .5*** | 111 + | 3. | 3*** | 102 + | G.7 | ||||||||
| •5-7 | 95 + | 4.3 | 94 + | 3. | 3* | 89 + | 8 | .9*** | 98 + | 8. | 5*** | 91 + | 4. | ||||||||
| 87 + | 8.6* | 84 + | 8. | 8** | 84 + | 6 | 85 + | 6. | 85 + | 4. | |||||||||||
| I | 74 + | 8.9*** | 7. | 2*** | |||||||||||||||||
«Ϊ ro ο
* = Wahrscheinlichkeit gegen Kontrolle mit Stärke
** = Wahrscheinlichkeit gegen Kontrolle mit Stärke
*** =1 Wahrscheinlichkeit gegen Kontrolle mit Stärke
<0.05 <Ό.Ο1 <0.001
Le A 17
- 38 -
26H393
Aus obigen Daten ist ersichtlich, daß, während sich der Grad der Saccharaseinhibition sowohl in vitro als auch in vivo als
eine deutliche Funktion des Molekulargewichtes erweist, die Amylaseinhibition nur in vitro abhängig vom Molekulargewicht
ist, währeniin vivo die Inhibition des Stärkeabbaus mit
dem fallenden Molekulargewicht nicht abnimmt, sondern überraschenderweise konstant bleibt.
Obwohl also die in vivo Amylasehemmaktivität mit dem Molgewicht abnimmt, sind die ED^0-¥erte der Starkeverdauungshemmung für alle
erfindungsgemäßen Verbindungen im wesentlichen gleich. Dies
ist in der folgenden Tabelle VI zusammengefaßt:
(4-6)
(5-7)
(5-7)
17.500 30.000
| Glucose- | <$--Amylas einhibition | Stärkeverdauungs inhibition |
|
| Formel | einheiten | in vitro | in vivo |
| (D (2) (3) |
AIE/mg | (ED50 mg/kg) | |
| 113 IHB V |
300 300 1.400 |
0.76 1.60 1.61 |
|
1.42 1.00
Es ist also überraschenderweise möglich mit den Verbindungen HB,
IHB,und V eine Hemmung der Saccharose- und Stärkeverdauung
gleichzeitig zu erreichen und zwar bei einer präzisen, vorhersehbaren und charakteristischen Dosis.
Die Verbindungen besitzen darüber hinaus eine vorteilhafte Wirkung
im Hinblick auf Glucoseadsorption. Dies ist ersichtlich
Le A 17 089
- 39 709840/0520
26H393
-UV
aus den folgenden Daten in Tabelle VII (Experimente'mit hungernden
Ratten) für die Verbindung der Formel IIIB (n = 2).
| Dosis | (Kontrolle) | Blutglueöse | in mg | % (Mittelwert | 45 | + Abw.) |
| + 30 mg | 15 Min. . | 30 | Min. | 87 | Min. | |
| + 60 mg | 72 + 4.6 | 78 + | 1.3 | 158 | + 6.8 | |
| 142 + 12 | 142 + | 12 | 132 | ± 19 | ||
| Salzlösung | 135 + 13 | 128 + | 5.5 | 130 | ± 7.3 | |
| Glucose | 125 + 13* | 118 + | 2.9 ** | ± 9.0*- | ||
| Glucose | ||||||
| Glucose |
* Wahrscheinlichkeit gegen Kontrolle mit Glucose = 0.05
** Wahrscheinlichkeit gegen Kontrolle mit Glucose = 0.01
Reinigung des Gemisches der höheren Glieder dieser Reihe und Anwendung
in reiner Form führt unerwarteterweise zu noch höherer Aktivität und Spezifität. Dies läßt sich durch einen Vergleich der
in Tabelle II angegebenen ς^,-Amylase- und Saccharase-in vitro-Hemmdaten
mit den in folgender Tabelle VIII angegebenen Daten für die reinen Verbindungen belegen:
| Zahl der Glucose- | cC-Amylase-Inhibition | Saccharase-Inhibiti |
| einheiten | AIE/g | SIE/g |
| 4 | 67.000.000 | 7.000 |
| Ul | 57.000.000 | 3.500 |
| 6 | 42.000.000 | 1.200 |
| 7 | 24.000.000 | 60 |
| 8 | 5.OOO0OOO | 10 |
Le A 17 089
- 40 -
709840/0520
•ΜΗ"
Die vorhergehenden Ergebnisse zeigen die hohe Aktivität der Verbindung mit 4 Glucoseeinheiten in der Rolle eines rC-Amylaseinhibitors.
Auch die Verbindungen mit 5 und 6 Einheiten zeigen wesentlich höhere spezifische Inhibitoraktivität als bei bisher
bekannten Präparaten gefunden wurde. Eine Abnahme der Inhibitoraktivität tritt mit zunehmendem Molekulargewicht auf,
wie bei den Verbindungen mit 7 und 8 Glucoseeinheiten zu sehen ist, obgleich diese noch erhebliche Hemmaktivität zeigen. In
vitro Saccharaseinhibition scheint in umgekehrter Abhängigkeit von dem Molekulargewicht zu stehen« Die Verbindung mit 4 Glucoseeinheiten
weist etwa 1/10 der spezifischen Aktivität auf, die die Verbindung mit 2 Glucoseeinheiten aufweist, wohingegen die
Hemmaktivität der Verbindung mit 8 Glucoseeinheiten nur geringfügig ist.
Die Verbindungen können ohne Verdünnung, z. B. als Pulver oder ir. einer Gelatinehülle oder in Kombination mit einem Trägerstoff
in einer pharmazeutischen Zusammensetzung appliziert
werden.
Pharmazeutische Zubereituneen können eine größere oder kleinere
Menge des Inhibitors enthalten, z. B. 0,1 % bis 99,5 %, in Kombination
mit einem pharmazeutisch verträglichen nichttoxischen, inerten Trägerstoff, wobei der Trägerstoff eine oder mehrere feste,
halbfeste oder flüssige Verdünnungsmittel, Füllstoffe und/oder nlchttoxisch.es, inertes und pharmazeutisch-verträgliches Formulierungshilfsmittel
enthalten kann. Solche pharmazeutischen Zubereitungen liegen vorzugsweise in Form von Dosierungseinheiten
vor, d. h. physikalisch-diskrete, eine bestimmte Men^e des Inhibitors enthaltenden Einheiten, die einem Bruchteil oder einem
Vielfachen der Dosis entsprechen, die zur Herbeiführung der gewünschten Hemmwirkung entsprechen. Die Dosierungseinheiten
können 1, 2, 3, 4 oder mehr Einzeldosen oder 1/2, 1/3 oder 1/4 einer Einzeldosis enthalten. Eine Einzeldosis enthält vorzugsweise
eine genügende Menge Wirkstoff, um bei einer Applikation gemäß eines vorher bestimmten Dosierungsschemas einer
oder mehrerer Dosierungseinheiten die gewünschte Hemmwirkung zu erzielen, wobei eine ganze, eine halbe, oder ein Drittel oder
ein Viertel der Tagesdosis gewöhnlich einmal, zweimal, dreimal
Le A 17 089 - 41 -
709840/0520
oder viermal am Tage verabreicht wird. Andere therapeutische Mittel
können auch eingenommen werden. Obgleich die Dosierung und das Dosierungsschema in ,jedem Fall sorgsam abgewogen v/erden sollte-,
unter Anwendung gründlichen fachmännischen Urteils und unter Beachtung des Alters, des Gewichts und des Zustands des Patienten,
der Art und der Schwere der Erkrankung, wird die Dosierung gewöhnlich in einem Bereich zwischen etwa 30 bis etwa 3 x 10
AlE/kg und zwischen etwa 1 bis etwa 1 χ 10 SIE/kg des Körpergewichtes
pro Tag liegen. In manchen Fällen wird man dabei eine ausreichende therapeutische Wirkung mit einer geringeren Dosis
erreichen, während in anderen Fällen eine größere Dosis erforderlich sein wird.
Orale Applikation kann unter Verwendung fester und flüßiger Dosierungseinheiten durchgeführt werden, wie z. B. Pulver, Tabletten,
Dragees, Kapseln, Granulate, Suspensionen, Lösungen und dergleichen.
Pulver wird durch Zerkleinerung der Substanz in einer geeigneten Größe und Vermischen mit einem ebenfalls zerkleinerten pharmazeutischen
Trägerstoff hergestellt. Obgleich ein eßbares Kohlenhydrat, wie z. B. Stärke, Lactose, Saccharose oder Glucose normalerweise
zu diesem Zwecke Verwendung findet und auch hier benutzt werden kann, ist es wünschenswert ein nicht metabolisierbares
Kohlenhydrat, wie z. B. ein Cellulosederivat zu benutzen.
Süßmittel, Geschmackszusätze, Konservierungsstoffe, Dispergiermittel
und Färbemittel können auch mitverwendet werdeno
Die Kapseln können durch Zubereitung der oben beschriebenen Pulvermischung und durch Füllung bereits gebildeter Gelatinehüllen
hergestellt werden. Die Pulvermischung kann man vor dem Füllvorgang mit Gleitmitteln, wie z. B. Kieselgel, Talkum,
Magnesiumstearat, Calciumstearat oder festem Polyäthylenglykol
versetzen. Die Mischung kann man ebenfalls mit einem Desintegrator oder LösungsVermittler, wie z. B. Agar-Agar, Calciumcarbonax
oder Natriumcarbonat versetzen, um bei Einnahme der Kapsel die Zugänglichkeit des Inhibitors zu verbessern.
Le A 17 089 - 42 -
709840/0520
26H333
Die Anfertigung der Tabletten erfolgt zun Beispiel durch Herstellung
einer Pulvermischung, grob oder feinkörnig, und Hinj
zufügung eines Gleitmittels und Desintegrators„ Aus dieser
Mischung formt man Tabletten., Eine Pulvermischung bereitet man
vor durch Mischung der Substanz, welche in geeigneter Weise zerkleinert wurde und ergänzt ein Verdünnungsmittel oder eine"
anderen Trägersubstanz wie oben beschrieben. Gegebenenfalls fügt nan ein Bindemittel hinzu: z. B. Carboxymethylcellulose, Alginate,
Gelatine oder Polyvinylpyrrolidone, einen Lösungsverzögerer, wie
z. B. Paraffin, einen Resorptionsbeschleuniger, wie z. B. ein quartemäres Salz und/oder ein Adsorptionsmittel, wie z. B.
Bentonit, Kaolin oder Dicalciumphosphat. Die Pulvermischung kann granuliert werden zusammen mit einem Bindemittel, wie z. B0
Syrup, Stärkepaste, Akazienschleim, oder Lösungen aus Zelluloseoier Polymerenmaterialien. Danach preßt man das Produkt durch
ein grobes Sieb. Als Alternative hierzu kann man die Pulvermischung durch eine Tablettenmaschine laufen lassen und die sich
ergebenden ungleichmäßig geformten Stücke bis auf Korngröße zerkleinern. Damit die entstandenen Körner nicht in den tablettbildenden
Düsen stecken bleiben, kann man sie mit einem Gleitmittel versetzen, wie z. B. Stearinsäure, Stearatsalz, Talkum
oder Mineralöl. Diese gleitfähig gemachte Mischung wird dann in Tablettenform gepreßt o Die Wirkstoffe können auch mit
freifließenden inerten Trägerstoffen vereinigt werden und direkt in Tablettenform gebracht werden unter Auslassung der
Granulat- oder Zerstückelungsschritte. Man kann das Produkt mit einer klaren oder opaken Schutzhülle versehen, z. 3O einem
Überzug aus Schellack, einem Überzug aus Zucker oder Polymersubstanzen und einer polierten Hülle aus Wachs. Farbstoffe können
diesen Überzügen beigefügt werden, damit zwischen den verschiedenen Dosierungseinheiten unterschieden werden kann.
Die oral zu verabreichenden Zubereitungsformen, wie z. B. Lösungen,
Syrup und Elixir e, las sen sich in Dosierungseinheiten herstellen, so daß eine bestimmte Menge Präparat eine bestimmte
Le A 17 089 - 43 -
709840/0520
26H393
Menge Wirkstoff enthält. Syrup kann so hergestellt werden, daß der Wirkstoff in einer wäßrigen Lösung, welche geeignete
Geschmacksstoffe enthält, gelöst wird; Elixire werden unter
Verwendung nichttoxischer, alkoholischer. Trägersxoffs erhalten.
Suspensionen kann man durch Dispergieren der Verbindung in einem nicht toxischen Trägerstoff darstellen. Lösungsvermittler
und Emulgiermittel, wie z. B. äthoxylierte Iscstearylalkohole und PolyoxyäthylensorMtester, Konservierungsmittel,
geschmacksverbessernde Zusätze wie z. B. Pfefferminzöl oder
Saccharin und dergl. können auch zugegeben werden.
Dosierungsvorschriften können auf der Kapsel angegeben werden. Überdies kann die Dosierung so abgesichert sein, daß der Wirkstoff
verzögert abgegeben wird, z. B. durch Einhalten des Wirkstoffes in Polymerensubstanzen, Wachse oder dergl.
Die Toxizität dieser Verbindungen ist sehr gering. Auch ohne Endreinigung
wird beispielsweise das Rohprodukt aus dem Beispiel 8 mit einer Aktivität von 8.500 SIE/g ohne Auftreten von Nebenwirkungen
vertragen. Dies trifft bei den hierin beschriebenen Verbindungen der vorliegenden Erfindung zu, die in einer Dosierung
von 340.000 SIE/kg Maus und Ratte p. os ohne Nebenwirkungen vertragen worden sind. Auch bei intravenöser Injektion tolerieren
Mäuse 10.000 SIE/kg ohne Nebenwirkungen.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch andere pharmazeutisch-wirksame Verbindungen enthalten, insbesondere
andere orale Antidiabetica, wie z. B. ß-cytotrop° Sulfonylharnstoffderivate und blutzuckerspiegelsenkende Biguanide.
Zusätzlich zu den oben erwähnten pharmazeutischen Zusammensetzungen
lassen sich auch diese Wirkstoffe enthaltende Lebensmittel hergestellt werden; beispielsweise Zucker, Brot, Kartoffelprodukte,
Fruchtsaft, Bier, Schokolade und andere Konfektartikel, und Konserven, wie z. B. Marmelade, wobei zu diesen Produkter., eine
therapeutisch-wirksame Menge mindestens eines der erfindungsgemäßen Inhibitoren gegeben wurde.
Le A 17 089 - - 44 -
709840/0520
^614393
Erläuterung einiger verwendeter Reagentien und Hilfsmittel:
Als Ionenaustauscher können z.B. die in Handel befindlichen Produkte Amberlite IRA 410 Cl" (Anioaenaustauseher);
A~berlite IRC 120 (H+-Form) (stark saurer Kationenaustauscher);
Ar.berlite (HCO^'-Form) (Anionenaustauscher); Amoerlite IRA
410 OH" (stark basischer Anionenaustauscher); Amberlite IRC
H+ (schwach saurer Kationenaustauscher) /"Warenzeichen der
Firna R.ohm and Haas Company_7 sowie Dowex 50 WX 4H+ (stark
saurer Kationenaustauscher) ^"Warenzeichen der Firma Dow
Chemical Co. Midland, Michigan, USA J verwendet werden«.
Als Anionenaustauscher auf Cellulosebasis kann z.B. DSAE-Zellulcse
der Firma Schleicher und Schüll verwendet werden.
Als Polyacrylamid-Gel kann z.B. Bio-Gel-P-2 ^"Warenzeichen der
Firma Bio-Rad Laboratories, Richmond, Califormia, USA J
verwendet werden.
I'altzin ist ein natürliches Malzextrakt der Firma Diamalt AG,
KUnchen (BRD).
lewapol^ist ein unspezifisches Adsorptionsharz der Firma
Tayer AG, Leverkusen (BRD).
Clarcel ist ein Filterhilfsmittel der Firma CECA, Velizy-Villacoublay,
Frankreich.
SE 30 ist ein Silicon Elastomer der Firma Hewlett Packard.
Le A 17 089 ' - 45 -
709840/0520
Ü6H393
Die im folgenden verwendeten Mikroorganismen sind bei American Type Culture Collection unter den folgenden Nummern hinterlegt
worden:
Stamm ^TCC-Nr-. _
SS 50 (CBS 961.70) 310 42 SE 18 (CBS 957.70) 310 41 SE 82 (CBS 615 ο71) 310 45
SE 50/13 (CBS 614.71) 310 43 SE 50/110 (CBS 674.73) 310 44
Le A 17 089 - 46 -
709840/0520
^614393
Kan beimpft einen Glasfermenter mit 8 Liter Nährlösung der
Zusammensetzung 5,0 % Stärke, 1,0$ Hefeextrakt, 0,2 %
PUKPO^ mit einem 3 Tage alten Schüttelkolben des Stammes
SE 50/13 (CBS 614.71) und bebrütet unter intensiver Rührung und Belüftung 3 Tage bei 28°C und erhält eine Kulturbrühe
mit 105.000 AIE/ml.
6 Liter dieser Fermentationsbrühe werden nach dem Abkühlen auf 200C mit halbkonzentrierter HNO, auf pH 2,5 eingestellt,
mit 30 g Carboraffin-Aktivkohle versetzt und 10 Hinuten gerührt.
Anschließend wird 15 Minuten bei 10.000 Upm zentrifugiert und der klare, hellgelbe Überstand nach Neutralisation
mit NH-, auf 500 ml eingeengt. Die 500 ml Konzentrat wurden
45 Minuten mit 200 g Amberlite IRA 410 Cl" gerührt, abgenuxscht
und mit 4/5 Vol. = 400 ml Methanol versetzt, um die Hauptrr.enge
der höhermolekularen Stärkeabbauprodukte (zusammen ir.it noch vorhandenen Aktivkohleresten) auszufällen. Es wird
5 Minuten bei 5.000 Upm zentrifugiert. Die 850 ml Überstand werden unter intensivem Rühren in 4 Ltr. Trockensprit eingetropft.
Die weiße, flockige Fällung wird abgenutscht, 3r;,al mit Trockensprit und 2mal mit Äther gewaschen und im
Vakuum bei 5O0C getrocknet. Ausbeute: 36 g eines weißen
Pulvers mit 10 χ 10 AIE/g. In einigen der folgenden Beispiele
wird diese Zubereitung verwendet.
1-lur Beurteilung des Endproduktes von Fermentationen ur.d der
Zus:i:..r.'.enseti:ur:g von Präparaten mittels Dünnschichtchroir.atc-,-rr.'iphie
trä/rt nan 1 /ul der Fernientationsbrühen oder 1 /ug
der I-räparate auf Kiesel^elferti/jfolien (Fa.Schleicher u.
SchulL, Dassel, Typ F 1500) auf und entwickelt 2ir.al in
r.-3utar.ol/Athar.ol/'./asser = 50/30/20.
Le A 17 089 - 47 -
709840/0520
Ü614393
Zur Jaccnar'iseinhibitior.sfarliurig besprüht mar. die entwickelte
unJ ^:ut getrocknete Platte rät ilnsyngel (20 r.l/20 χ 20 cir. rlatte)
v:.d lä-'t das Gel erstarrer.. Dann wird für 5' in einer
feuc:.ten KaKiTier bei Rauntenperatur vorinkubiert und ar.schliesii-enc
satt r.it Jubstratgel besprüht. !lach der. Erstarren dieser
2. C-f-lschicht bringt man die Platte in eine feuchte Kürzer
i.'Ln und inkubiert bei 40 C. Die Inhibitions! lirbung (helle
Flecken, rotbrauner Hintergrund) entwickelt sich in 60 - 90'.
Zui:. Zeitpunkt der optimalen Farbentwicklung wird abgebrochen
uj;d die !'latte mit den darauf befindlichen Agarschichten
a::; löhn ir.it Warmluft getrocknet.
7::-rv'ifunH der Gele: *
En:-'.y:.;t:el: 1,5 g Agarose (L'Industrie Eiologique Frar.cais)
v/lra in TOO ml 0.2 m Ka-HaIeinatpuffer pH 6.0 suspendiert und
anschließend durch Aufkochen gelöst. Die klare Agaroselösung
wird auf 500C abgekühlt und mit 250 #ul Triton X - 100 Lesung
(2 g Triton Z-100 + 8g A'thanol p.a.) und 0.5 rcl Dianisidinlösung
(20 mg Dianisidin/1 ml Aceton) unter Ur.schwer.ken versetzt. Direkt vor Gebrauch des Gels werden InI GCD/rOD-Reagena
(12.5 mg Glucoseoxidase, Reinheitsgrad I, Pa.Boehringer,
Best.ITr. 1 5423 und 2.5 mg Peroxidase,Reinheitsgrad II,
Fa.Boehringer, Best.Nr. 15302, gelöst in 5 ml Kaleinatpuffer)
und 4-5 Einheiten Saccharase aus Schweinedünndarm zugesetzt. Das Gel muß bis zum Versprühen auf 500C gehalten
werden, da es sonst beim Sprühvorgang in den Düsen erstarrt.
Substratgel: 0.5 β Agarose wird in 100 ml Ha-I-Ialeinatpuffer
ρΐί C.ü suspendiert und unter Kochen gelöst. Man kühlt
anschließend auf 500C ab, versetzt mit 100 /ul Triton
(2 g Triton X-100 + 8 g Äthanol p.a.) und gibt 1 g Saccharose
(Serva Nr. 35579) zu. Uach dem Lösen der Saccharose ist das Gel gebraucht?fertig.
Le A 17 089 - 48 -
709840/0520
BAD ORIGINAL
^614393
Zur Arv/laseiiihibitiorirsfärbung besprüht nuin dio entwickelte
und ,''etrocknete HO-Platte nit einem Amylasegel (20 ml/ 20 χ
ein Platte) und läßt erstarren, iiach 51 Vorinkubation bei
Raumtemperatur bringt ir.an die Platte mit der Gelachicht in
eine 0.5/Ji1^e Stärkelöoung (1 g Stärke, Kerck I.'r. 1252,
in 200 ml 0.2 ni (Jlycerophosphatpuffer 0.0ImGaGl2 pH u.S
unter Kochen gelöst) ein und beläßt sie dort für 2' bei 40 G
unter Umschwenken der Lösung. Danach wird die Platte ir.it des t.'..'asser gut abgespült und zur Anfärbung der nicht abgebauten
Stärke in eine verdünnte Jp-Lösung (4 n.1 J^
lösun^ auf 500 al H0O; Jp-Ii tammlö sung: 2.2 g Jp + 4.4 g KJ
in 100 r.l HpO gelöst) eingetaucht. Nach ca. 1 Minute i3t
die Färbung optimal. Man photographiert sofort, da die
blauen Flecken schnell verblassen.
1 3 Agaroöe wird in 100 ml 0.2 m Natriui-iglycerophosphat/
0.G1 η CaCl2-Puffer pH 6.9 bei 1000C gelöst, nach dem Abkühlen
auf 500C werden 100 /ul Triton X-IOC (2 g Triton
X-100 + 8g Äthanol p.a.)zugesetzt. Direkt vor dem Besprühen
setzt man 100 /ul einer A^lasekristallsulspenaion (10 mg
Schv/einepakreasamylase/nil ges.KH.-Sulfatlösung, Fa.Boehringer,
Ur. 15017) zu.
Beimpft man 1 Ltr Erlenmeyerkolben mit 120 ml einer Nährlösung
"bestehend aus 4 % Stärke, 2,4 % Glucose, C,9 0A Kaseinhydrolysat
und 0,9 % Hefeextrakt, pH mit NaOH auf 7,6 eingestellt, mit 0,4 % CaCO, versetzt und 30 min "bei 1210C sterilisiert,
mit 3 ml einer Vorkultur des Stammes SE 82 (CBS 615.71)» angewachsen in einer Nährlösung bestehend aus
2 % Stärke, 1 % Glucose, 0,5 % Kaseinhydrolysat und 1 % Hefeextrakt,
pH mit NaOH.auf 7,2 eingestellt, mit 0,4 % CaCO,
Le A 17 089 - 49 -
709840/0520
BAD ORIGINAL
versetzt und 30 min bei 1210C sterilisiert, und bebrütet
5 Tage bei 280C auf einer Rundschüttelmaschine, so erhält
man eine Kulturlösung mit 122.000 AIE/ml. Zur Aufarbeitung
trennt man das Mycel von den vereinigten Kulturlösungen durch Zentrifugation bei 12.000 Upm ab, bringt 300 ml des Kulturfiltrates
mit halbconc. HNO-* auf pH 2,5 und rührt für 10 min
mit 2,5 g Α-Kohle p.A. Nach Abtrennung der Kohle bei 12.000 Upm
wird die mittels 10 N KOH auf pH 6 neutralisierte Lösung mit 300 ml Methanol versetzt, kurz stehen gelassen und bei 12.000
Upm vom Niederschlag befreit. Tropft man nun den Überstand in 3 Ltr Äthanol, isoliert die Fällung nach kurzem Stehenlassen
durch Zentrifugation bei 12.000 Upm, wäscht den Niederschlag zweimal mit abs. Äthanol und einmal mit Äther und
trocknet im Vakuum, so erhält man 2,23 g eines Produktes mit 7,45 x 10 AIE/g, das zu über 95 % Verbindungen mit n-, + n~ =
4 und mehr Glucoseeinheiten enthält.
Beimpft man 1 L Erlenmeyerkolben mit 120 ml einer Nährlösung
der Zusammensetzung 3.5 # Glucose, 2 # Stärke, 0.5 i>
Kaseinhydrolysat, 1.3 5* liefeextrakt, 0.3 # CaCO5 und 0.3 £
K2HPO4 vor Sterilisation auf 7.8 eingestellt, Sterilisation
30'/1210C, mit 6 ml einer Vorkultur des Stammes SE 5O/IIO
in einer Nährlösung bestehend aus 3 # Sojamehl, 3 % Glycerin
und 0.2 ·$> CaCO, und bebrütet 3-4 Tage auf einer Rundscirüttelmachine
bei 24°C, so erhält man eine Kulturlösung, die 153 000 AIE/ml und 12 200 SIE/ltr enthält.
1 Ltr. Kulturlösung wurde mit HNO, auf pH 2.5 eingestellt, mit 5' g Aktivkohle 10' gerührt und anschließend 30' bei
5000 Upm zentrifugiert. Anschließend wurde durch Zusatz von 25 g Amberlite IRA 410 (OH"" Form) neutralisiert. Der
neutrale Überstand wurde auf 100 ml einrotiert, mit 100 ml Methanol versetzt und filtriert. Das Piltrat wurde in 2 Ltr.
Trockeneprit eingerührt, der ausfallende Niederschlag abgenutscht und nach 3 x Waschen mit Aceton und Äther im
Vakuum getrocknet.
Le A 17 089 -50-
Le A 17 089 -50-
709840/0520
26U393
Ausbeute 14 g eines weißen Pulvers mit 5 x. 10 AIE/g, das
überwiegend Verbindungen mit mindestens n-, + n2 = 4 Glucoseeinheiten
enthält.
Arbeitet man nach Beispiel 3» jedoch mit 0,5-% Stärke
so erhält man nach 4-tägiger Fermentation eine Kulturbrühe mit 40.000 AIE und 184 SIE/ml. Die Kulturbrühe enthält eine
Mischung der erfindungsgemäßen Verbindungen, die mindestens eine Glucoseeinheit haben.
Beimpft man 1 ltr Erlenmeyerkolben, die 120 ml Nährlösung
der Zusammensetzung 3 % Glucose, 0,6 % Kaseinhydrolysat,
1,6 % Hefeextrakt, 0,3 % CaCO3, 0,3 % K2HPO4, pH vor der
Sterilisation mit KOH auf pH 7,8 eingestellt, mit einer Vorkultur des Stammes SE 50/110 (CBS 674.73) nach Beispiel 3 und
bebrütet 4 Tage bei 240C auf einer Rundschüttelmaschine, so
erhält man eine Kulturbrühe mit 10.800 SIE/ltr, die überwiegend
die erfindungsgemäße Verbindung mit einer Glucoseeinheit enthält.
5 ltr Xulturfiltrat, bei 13.000 UPM vom Mycel abgetrennt,
wurden mit halbconc. HNO5 auf pH 2,5 gestellt und für 15 min
mit 55 g Aktiv-Kohle ("Merck") und 200 g Clarcel gerührt.
Nach dem Entfernen der Peststoffe durch Absaugen neutralisierte nan mit cone. Ammoniak auf pH 7, engte die Lösung
auf-1 ,"5 ltr ein und fällte mit der fünffachen Kenge Äthanol.
Der resultierende flockige Niederschlag wurde mittels eines Durchlauf ro tors bei 12.000 Upni abgetrennt und der gelbliche
Überstand auf 150 ml eingeengt und zur Abtrennung ge-
Le A 17 089 - 51 -
709840/0520
26H393
ringer Anteile ungelösten Materials niedertourig centrifugiert.
50 ml dieser Lösung wurden auf eine mit Amberlite IR-120
(H+-Form) gefüllte Säule (30x300 mm; 30 ml H3O pro Stunde)
gegeben. Nachdem man insgesamt 300 ml Eluat aufgefangen hatte, welches inerte Saccharide sowie einen Anteil nicht adsorbierter
hemmaktiver Komponenten enthält, überführte man den Austauscher mit ca. 400 ml HpO in ein Becherglas und fügte unter Rühren
so lange cone. Ammoniak zu, bis der pH einen Wert von 11,5
erreicht hatte. Nach 30 min weiterem Rühren trennte man vom Austauscher ab, engte auf 1/20 des Volumens ein, filtrierte
über eine Säule (20x150 mm) mit Amberlite IRA-410 (HCO-1-Form)
und fing bei einer Fließgeschwindigkeit von 30 ml/std
ca. 500 ml Eluat aufs welches eingeengt wurde und nach
Lyophilisation 1,3 g Rohprodukt ergab.
Zur weiteren Reinigung wurde das rohe Präparat an Bio-Gel P-2, 100-200 mesh (Fa. Bio-Rad, München) fraktioniert. Dazu
diente eine Säule von 50 mm 0 und 450 mm Länge, die mit EUO
bei einer Fließgeschwindigkeit von 40 ml/std betrieben wurde, wobei man Fraktionen von je 10 ml sammelte. Alle Fraktionen
wurden mittels des Anthrontestes auf Kohlenhydrate sowie mittels des Saccharase-Hemmtestes auf inhibitorisch aktive
Komponenten geprüft. Die Saccharase-Inhibitor enthaltenden
Fraktionen wurden weiterhin dünnschichtchromatographisch nach Beispiel 1 auf ihren Gehalt an individuellen Komponenten
untersucht. Diejenigen Fraktionen, welche die Verbindung mit einer Glucoseeinheit enthielten, wurden vereinigt, eingeengt
und lyophilisiert. Man erhielt 35 mg des Stoffes mit
0,3 x 106 AIE/g und 30.000 SIE/g.
Le A 17 089
- 52 -
709840/0520
26H393
Beimpft man 1 L Erlenmeyerkolben mit je 120 ml einer Nährlösung
der Zusammensetzung 5 % Stärke, 1 $>
Hefeextrakt,
0.2 $ KpH?O. mit je 2 ml einer Vorkultur nach Beispiel 3,
so erhält man nach 3-tägiger Bebrütung bei 280C Kulturlösungen mit folgender Ausbeute an Amylase-Inhibitor:
0.2 $ KpH?O. mit je 2 ml einer Vorkultur nach Beispiel 3,
so erhält man nach 3-tägiger Bebrütung bei 280C Kulturlösungen mit folgender Ausbeute an Amylase-Inhibitor:
S tamm AIE/ml
SE 50 (CBS 861.70 37 000
SE 50/13 (CBS 614.71) 109 000
SE 50/110 (CBS 674.73 53 500
die vorwiegend aus einer Mischung der Verbindungen mit 4 oder mehr
Glucoseeinheiten.
Beimpft man 1 L Erlenmeyerkolben mit je 120 ml Nährlösung
der Zusammensetzung 1.3 eA Maltose, 3.5 ^ Glucose, 0.5 <p Kasein-
hydrolysat, 1.3 0A Hefeextrakt, 0.3 % CaCO3, 0.3 $>
K rr.it je 2 ml einer Vorkultur nach Beispiel 3 , so erhält nan
nach 4-tägiger Bebrütung auf Rundschüttelmaschinen bei
mit verschiedenen Stämmen folgende Ausbeuten:
Stamm . SIE/ml AIE/ml
| SE | 50 (CBS 961.70) | 25 | 580 |
| SE | 50/13 (CBS 614.71) | 14.8 | 1460 |
| SE | 50/110(CBS 674.73) | 57.9 | 755 |
die vorwiegend aus einer Mischung der Verbindungen mit 4 oder
weniger Glucoseeinheiten.
Le A 17 089 - 53 -
709840/0520
Beimpft man einen Fermenter mit 100 L Nährlösung der Zusammensetzung
3.5 i» Glucose, 2.5 $ Maltζin , 0.5 # Kaseinhydrolysat,
1.3 uß> Hefeextrakt, 0.3 i>
CaCO , 0.3 5& K2HPO4 und 0.1 $>
Antischaummittel mit 5 L einer Vorkultur nach Beispiel 3 und bebrütet unter Rührung und Belüftung 5 Tage bei 24 C, so
erhält man eine Kulturlösung mit 73 000 SIE/L, die vorwiegend
die erfindungsgemäße Verbindung mit n-^ + il·-, = 2 enthält.
90 Ltr. Fermentationsansatz wurden mit Mycel am pH-Meter mit konz. HNO, auf pH 2,5 eingestellt und unter Rühren mit 900 g
(= 1 fi) Aktivkohle (Merck) zur Adsorption der Hauptmenge der
gebildeten Farbstoffe versetzt. Man rührte für 15 Kin., trennte über eine Zentrifuge bei 3000 Upm vom Mycel und der Hauptmenge
der Kohle ab und filtriert den Überstand schließlich unter Zusatz von 3 kg Clarcel über eine Drucknutsche. Man
erhielt 61 Ltr. gelbbraunen, klaren Filtrats mit einem SIE-Gehalt von 60 000 SIE/Ltr.
Das FiItrat wurde mit konz. NH, auf pH 7 eingestellt und zur
Adsorption des Wirkstoffs mit 13ΟΟ g (2#) Aktivkohle (Merck)
für 30' gerührt. Man filtriert über eine Drucknutsche und wusch das Aktivkohlesediment 3 x mit 10 Ltr. destilliertem
Wasser. Anschließend wurde die Kohle gut trocken gedrückt und in 3 x 4 Litern 50 1}Ό Aceton bei pH 2,5 für jeweils 15' gerührt,
um den Wirkstoff von der Kohle zu desorbieren. Die acetonischen Desorbate wurden - nach Abtrennen von der Kohle
durch Filtration - vereinigt. Man engte das vereinigte Desorbat am Rotationsverdampfer auf 250 ml ein, versetzte mit
einen gleichen Volumen (250 ml) Methanol und filtrierte durch ein Faltenfilter. Das Filtrat (480 ml) wurde in 5 Ltr.
Aceton unter kräftigem Rühren eingetropft. Der ausfallende
Niederschlag wurde abgenutscht und 3 χ mit Aceton und Äther gewaschen. Anschließend wurde im Vakuum bei 35°C getrocknet.
Ausbeute 230 g mit 6500
Le A 17 089 - 54
709840/0520
2SU393
25 g des obigen rohen Produkts wurden in 1 Itr. HpO gelöst
und reit 300 g Dowex 50VX 4 H+(200-400 me3h) 30' gerührt. Man
filtrierte das Harz ab und wusch 3 x mit 2 Ltr. 0.001
π HCl r.ach. Das gewaschene Dowex wurde anschließend in 500 nl HpO suspendiert und die Suspension am pH-Meter durch
Zugabe von 25 CA NH- auf pH 9.0 eingestellt. Anschließend
wurde noch 2 χ mit je 500 ml 0.6 i» NH, desorbiert, die
Descrbate vereinigt und an Rotationsverdampfer auf 100 ml eingeengt. Zur Entfärbung dieses Konzentrats wurde es mit
2 g DEAE-Zellulose (Fa.Schleicher und Schüll Nr. 02035,
0.6 mVal/g) für 5 min. gerührt, dann zentrifugiert. Der
hellgelbe Überstand wurde mit einen gleichen Volumen (100 el) Methanol versetzt und dann in 2 Litr. Aceton unter
intensiven Rühren eingetropft. Der Niederschlag wurde abgenutscht, mit Aceton und Äther gewaschen und im Vakuum
bei 35°C getrocknet.
Zur weiteren Peinreinigung v/urden die 4.0 g Inhibitor in 0.5 s Portionen über Biogel P-2 gelfiltriert. Dazu wurden
jeweils 0.5 g des Präparats in 10 ml H2O gelöst und auf eine
3iO£;el P-2-Säule (200-400 mesh, Fa. Bio-Rad) vom Durchmesser
5 cn und der Länge 95 cn aufgetragen. Man entwickelte in V/asser bei einer Fließrate von 80 in l/h. Es wurden 12 ml
Fraktionen gesammelt. Von allen Fraktionen wurde der Gesamtkohlenhydratgehalt
(in Form des Anthrontest als Extinktion bei EgOQ) sowie der Gehalt an Saccharase-Inhibitor und
Amylase-Inhibitor ermittelt. Außerdem wurden die Fraktionen
dünnschichtehronatographiscn (Ensym-Inhibitionsfärbung nach
Beispiel 1 ) geprüft.
Die Fraktionen, die die Verbindungen mit 4-6 Glucoseeinheiten enthalten, wurden vereinigt, im Vakuum auf 10 ml eingeengt und
durch Eintropfen in 200 ml Trockenspritz gefällt. Der Niederschlag wurde abeentrifugiert, mit Aceton und Äther gewaschen
und im Vakuum getrocknet; Ausbeute aus 4,0 g Rohinhibitor: 0,2 g der Verbindungen mit 4-6 Glucoseeinheiten mit 17,5 x 10 AIE/g
und 8,500 SIE/g. Die die Verbindung mit 3 Einheiten enthaltenden
Fraktionen wurden in gleicher Weise aufgearbeitet, wobei die Fällung mit 200 ml Aceton erfolgte; Ausbeute aus 4,0 g Rohin-
Le A 17 089 - 55 -
709840/0520
2ÖU393
hibitor: 0.1 g der Verbindimg mit ηχ + n2 = 3 mit 1,4 χ 10β
AIE/g iind 21.000 SIE/g. Aus den die Verbindung mit H1 + n2 =
enthaltenden Fraktionen (Fällung mit Aceton) wurden 0,9 g der Verbindung mit Dl1 + n2 = 2 Einheiten mit 0,3 x 10 AIE/g und
68.000 SIE/g isoliert.
Beimpft man 3 Kleinfermenter mit je 8 L der Nährlösung 7,5 %
Maltzin, 0,3 % Kaseinhydrolysat, 0,7 % Hefeextrakt, 0,3 %
CaCO,, 0,3 % K2HPO^ mit 5 % einer Vorkultur des Stammes SE 50/110
(CBS 674.73) (gewonnen nach Beispiel 3), so erhält man nach 5-tätiger Bebrütung bei 240C eine Kulturbrühe mit 73 SIE/ml,
die vorwiegend die Verbindung mit n-, + n2 = 2 enthalten.
Nach Zentrifu^ation (30*, 3000 Upm) zur Abtrennung des Kycels
erhielt man 20,5 Ltr. einer tiefbraunen Kulturlösung mit
67 000 SIE/L. Man stellte mit HNO, auf pH 3,5 ein und setzte zur Entfärbung 60 g Lewapol (Ca 9221, 0.35 mm Körnung,
Fa. Eayer)/L = 1.23 kg Lewapolzu. Nach 201 Rühren wurde über
ein Seitz K 3-Filter abgenutscht. Die entfärbte Kulturlösung wurde mit UH, neutralisiert (18.5 L, 67 000 SIE/L). Man
rührte anschließend zur Adsorption des Wirkstoffs 20 g Aktiv-Kohle/L
= 370 g ein und ließ 30' rühren. Anschließend wurde über ein Seitz K 3-Filter, das mit einer Schicht aus dem
Filterhilfsmittel Clarcel beschickt war, abfiltriert. Das
Filtrat (17.5 1, 3600 Slfc/l) wurde verworfen. Der Kohlerückstand
wurde 3 x mit 2 1 dest. H2O gewaschen. Zur
Desorption des Wirkstoffs von der Kohle wurde diese 3 x nacheinander mit jeweils 1 L 80?big. Aceton für 15' gerührt,
wobei das pH mit'konz. HCl auf pH 2.5 eingestellt wurde. Die Desorbate wurden vereinigt (2,4 L., 371.000 SIE/L). In
dieses Desorbat wurden 20 g Dowex H+/L (Dowex 50V/ X 4, H+-
Form, Fa.Serva,Heidelbei^ = 46 g Dowex eingetragen und 20'
gerührt. Anschließend wurde das Harz abfiltriert (Dowexfraktion I) und mit etwas 75 %igem Aceton'nachgewaschen. Das
Filtrat und Waschflüssigkeit (3 L = 215 000 SIE/L) wurden nit 60 g Amberlite IRA 410 (0H~Fonn) (Firma Serva Heidelbei^/L
gerührt, bis pH 7 erreicht war. Anschließend wurde abfiltriert und das Filtrat (2,8 L, 219 000 SIE/L) mit 72 g Dowex H+
versetzt und 20' gerührt. Das pH wurde dabei durch Einhängen
Le A 17 089 . - 56 -
709840/0520
eines mit Amberlite IKA 410 OH" gefüllten porösen Nylonbeutels
auf 3.0 gehalten. Anschließend wurde vom Dowex abfiltriert (Dowexfraktion II), das Piltrat (2,6 L, 27
SIE/L) wurde verworfen.
Dowexfraktion I und II wurden jede für sich 3 x mit 75 f°
Aceton bei pH 3»5 gewaschen und anschließend je 3 x mit je 100 ml (Dowexfraktion I) bzw. 150 ml (Dowexfraktion II)
0.6 fo NH, desorbiert. Bei der 1. Desorption, bei der die
Ammoniakmenge zur Neutralisation des Dowex-Harzes nicht
ausreichte, wurde durch Zugabe von konz. NH-. am pH-Meter
auf pH 9 eingestellt. Die 3 Desorbate von Dowex Fraktion I und II wurden für sich vereinigt, am Rotationsverdampfer
fast zur Trockne eingeengt, in 50 ml HpO aufgenommen, am
pH-Keter mit HCl auf pH 3 - 4 eingestellt und mit 50 ml
Methanol versetzt. Die Lösungen wurden in 1.5 1 absolutes Aceton unter Rühren eingetropft, der fallende Niederschlag
abgenutscht und 3 x mit Aceton sowie 1 χ mit Äther gewaschen. Kan trocknete im Vakuum.
Ausbeute: Fraktion I 6.5 g 25 000 SIE/g
Fraktion I112.3 g 36 000 SIE/g
Fraktion I und II enthalten als hemmaktive Bestandteile hauptsächlich die erfindungsgemäße Verbindung mit n-, + n2 =
neben geringen Anteilen der Verbindung mit n^ + n^= 3.
Die folgende Tabelle gibt die Saccharase-Hemmaktivitäten des
Präparats in aufeinanderfolgenden Stufen wieder:
Le A 17 089 - 57 -
709840/0520
Ausbeute
Volumen(L) SIE/L SIE gesant SIE Ausbeute
| 1)Kulturlö | 20.5 | 67000 1 | 373 | 500 | 100 | 60, | 11.8) | 32.2 |
| sung | )44, | |||||||
| 2)nach Lewapol | 19.5 | 67000 1 | 306 | 500 | 95 | |||
| Entfärbung | ||||||||
| 3)nach Aktiv | 18.5 | 3600 | 66 | 600 | (4.8 | |||
| kohle ad | verworfen) | |||||||
| sorption | ||||||||
| 4)1.Desorbat | 0.7 | 742000 | 519 | 400) | 37.8) | |||
| 5)2. " | 0.9 | 329000 | 296 | iooj | 883500 21.6?64,4 | |||
| 6)3. " | 0.8 | 85000 | 68 | οοοϊ | 5.0) | |||
| 7)Mischde | 2.4 | 371000 | 890 | 400 | 64.8 | |||
| sorbat (4-6) | ||||||||
| 8)nach I.Dowex- | 3.0 | 215000 | 645 | 000 | ||||
| adsorption | ||||||||
| 9)nach Keutra- | 2.8 | 219000 | 613 | 200 | ||||
| •lisat.mit | ||||||||
| IHA OH" | ||||||||
| 10)nach 2.Dowex- | 2.5 | 27000 | 67 | 500 | (4.9 | |||
| adsorption | verworfen) | |||||||
| 11)vereinigte KH | 3 0.29 | 682000 | 197 | 780 | 14.4^ | |||
| Desorbate von | ||||||||
| Dowexfraktion | ||||||||
| .· ι | ||||||||
| 12) " von | 0.45 | |||||||
| Dowexfraktion | 1 419000 | 638 | 550 | 46.5 | ||||
| II | ||||||||
| 13)Fällung | 6.5g | |||||||
| Fraktion I | 25000/g | 162 | 500 | |||||
| Fällung | 12.3g | |||||||
| Fraktion II | 36000/g | 442 | 800 |
Le A 17 089
- 58 -
709840/0520
Ü6U393
200 g einer Zubereitung wie in Beispiel 1 beschrieben wurden
in 940 ml destilliertem 'Wasser und 60 ml konz. \\JS>§. gelöst
und 4 Stunden unter Rückfluss erwärmt (Innontemperatur: 98-1000C; Ölbndtemperatür: 140°C). Die abgekühlte, schwarzbraune
Lösung wurde mit 10 g Aktivkohle (Merck Art. 2186) versetzt und 1 Stunde gerührt. Danach wurde die Aktivkohle
abgesaugt, mit Wasser gewaschen und das Filtrat mit ca. 250 ml 10 η KOII auf pH = 7 bis 8 eingestellt. Die Lösung
wurde 1 Stunde mit 50 g Aktivkohle ausgerührt. Die Kohle wurde abgesaugt, nit 2 1 Wasser gewaschen und das Filtrat
verworfen. Zur Desorption wurde die Kohle über Nacht mit 2 3Obigem Alkohol digeriert. Schließlich saugte man die Kohle
ab und engte die alkoholische Lösung am Rotationsverdampfer
ein. Rückstand: 6,2 .^. Dieses Rohprodukt (6,2 g) wurde in
500 ml V/asser gelöst und mit 30 g Amberlite IR 120 (U-Form)
1 Stunde vorsichtig gerührt. Man saugte den Austauscher ab und wusch mit destilliertem Vasser, bis das Filtrat neutral
und frei von Glucose war. Der Austauscher wurde dann mit 15 ml 25/»igem KH in 1000 ml H2O über Nacht ausgerührt, abgetrennt
und verworfen. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer eingeengt. Rückstand: 3»7 g.
Zur weiteren Reinigung wurde eine Chromatographie an Cellulose durchgeführt. 4,5 g des vpm Austauscher desorbierten
Materials wurden auf eine 1 m lange und 2,5 cm weite mit Cellulose gefüllte Säule aufgetragen. Als Fliessmittel
wurde zunächst Äthanol/^O 5 : lf zum Eluieren der erfindungsgemäßen
Verbindung mit H1 = 1 wurde zunächst Äthanol/HgO 3:lf
verwendet. Bei einer Tropfgeschwindigkeit von 20 Tropen pro
Minute wurden Fraktionen von jeweils 14 ml abgenommen. Die einzelnen Fraktionen wurden dünnschichtchromatographisch
geprüft. Die Fraktionen 47 - 85 lieferten nach dem Einengen 1,6 g einer schwach bräunlich verfärbten erfindungsgemäßen Verbindung
mit einer Glucoseeinheit. Die färbenden Verunreinigungen spielen mengenmäßig keine Rolle. Als farbloses Harz erhält
man die Verbindung mit n.,+ n« = 1 wenn man den Reini-
Le A 17 089 - 59 -
709840/0520
2BH393
gungsschritt mit stark saurem Ionenaustauscher nicht im batch-Verfahren,
sondern auf einer Säule durchführt.
200 g einer Zubereitung wie in Beispiel 1 beschrieben wurden
in 940 ml destillieren V/asser und 60 ml konz. HpSO. gelöst
und 1/4 Stunde unter Rückfluß erwärmt (Innenter:peratur:
98-1000C; Ölbadtemperatur:HO0C). Die abgekühlte, schwarzbraune
Lösung wurde mit 10 g Aktivkohle (Kerck, Art.2186)
versetzt und 1 otunde gerührt. Danach wurde die Aktivkohle abgesaugt, mit Wasser gewaschen und das PiItrat mit ca. 250 ml
10 η KOH auf pH = 7 bis 8 eingestellt. Die Lösung wurde 1 Stunde mit 50 g Aktivkohle ausgerührt. Die Kohle wurde abgesaugt,
mit 2 1 V/asser gewaschen und das Filtrat verworfen. Zur Desorption wurde die Kohle über Nacht mit 2 1 30yOigem
Alkohol digeriert. Schließlich saugte man die Kohle ab und engte die alkoholische Lösung an Rotationsdampfer ein.
Rückstand: 8,0 g.
Der Rückstand wurde in 15 ml HpO aufgenommen und auf eine
mit 50 g Amberlite IR 120 (H+-Form) gefüllte Säule (Höhe:'
20 cm, 0 2,4 cm) aufgetragen. Kan ließ-mit 3 Tropfen/
Minute einziehen und wusch mit V/asser nach (12 Tropfen/Minute),
bis alle nicht basischen Bestandteile entfernt waren. Dann wurden die basischen Produkte mit 0,5$igem ITK- von
der Säule eluiert (12 Tropfen/Minute) und die wäßrige Lösung
am Rotationsverdampfer zur Trockne gebracht. Rückstand: 4,1 g.
2 g dieses Rückstandes wurden in wenig Wasser gelöst und auf eine mit Sephadex G-15 gefüllte Säule (Höhe: 200 cm;
0'. 3,0 cm) aufgetragen. Es wurde mit Wasser eluiert. Bei einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/Stunde wurden Fraktionen
von jeweils 2 ml abgenommen. Die einzelnen Fraktionen wurden dünnschichtchromatographisch geprüft. Die Fraktionen 85 -
Le A 17 089 - 60 -
709840/0520
•Μ ^
lieferten 280 mg der Verbindung mit n, + n« = 2 mit einer
spez. Aktivität von 50 000 SIE/g.
Inkubiert man 2 g einer Zubereitung wie in Beispiel 1 beschrieben in 60 ml 20 ml4 Natriumglycerophqsphatpuffer,
pH 6,9 und 1 mM an CaCIp, mit 1 g <*-Amylase aus Aspergillus
spec. (S2RVA No. 13418) unter stetigem Rühren für 120 std.
bei 370C, erhitzt schließlich für 5 min auf 10O0C und zentrifugiert
bei 4000 Upm vom Ungelösten ab, so erhält man nach Lyophilisation der Lösung 1,9 g eines Produktes mit 3500
SIE/g und 2 χ 10 AIE/g. Prüft man dieses Produkt mittels
Dünnschichtchromatographie und Saccharase-Inhibitionsfärbung wie in Beispiel 1 beschrieben, so zeigt sich, daß an hemmaktiven
Verbindungen im wesentlichen die erfindungsgemäße Verbindungen
mit n^ + n2 = 1, 2 und 3.
Inkubiert man 2 g einer Zubereitung wie in Beispiel 1 beschrieben
in 30 ml 20 ml'I Acetatpuffer vom pK 4,8 mit 1,25 mg
ß-Amylase aus sweet potato (BOEHRINGER 15471) unter stetigem.
Rühren für 120 std bei 370C, erhitzt schließlich für 5 min
auf 1000C und zentrifugiert bei 4000 Upm vom Ungelösten ab,
so erhält man nach Lyophilisation der Lösung 1,5g eines
Produktes mit 1800 SIE/g und 3,8 χ 106 AIE/g.Prüft man dieses
Produkt mittels'Dünnschichtchromatographie und Saccharase-Inhibitionsfärbung
wie in Beispiel 1 beschrieben, so zeigt sich, daß an hemmaktiven Verbindungen im wesentlichen die erfindungsgemäßen
Verbindungen mit n, + n2 = 2 und 3.
Beimpft can einen 200 ml Erlenmeyerkolben, der 25 ml einer
Nährlösung der Zusammensetzung 0.1 °/>
K2HPO, 0.2 ιμ (NH^)2SO4,
0.05 °/° KgSO., 0.05 1= KCl, 0.01 c/o FeSO4, 2 ';£ einer Zubereitung
Le A - 61 -
709840/0520
•/614393
wie in Beispiel 1 beschrieben mit einer Sporensuspension des
otamir.es Asp.niger ATCC 11394 und bebrütet bei 280C auf einer
Rundschüttelraaschine, so sinkt nach 6 Tagen der AIE-Titer von
210 000 AIIä/nl auf 53000 AI E/ml und nach 10 Tagen auf 21300
Alu/ml. Gleichzeitig nimmt der SIE/xnl Gehalt von 7.0 auf
72 SIH/ml zu.
20 ml einer 10 Tage mit der Sporensuspension.inkubierten
Lösung wurden zur Abtrennung des Mycels 30' bei 3000 Upm zentrifugiert.
Die 15 ml Überstand (72 000 SIE/L) wurden durch 30-minütiges Rühren mit 2 g Amberlite IRC 50 H+ und 1 g Amberlite
IRA 410 OH" entsalzt (Leitfähigkeit kleiner als 2 m S.cm ). Man filtrierte ab und Iie3 das Piltrat mit 5 ml/h
durch eine mit Dowex H+ in 0.001 η HCl äquilibrierte Säule
(0 1 cm χ 10 cm) laufen. Anschließend wurde mit 200 ml C.001 η HCl nachgewaschen. Zur Desorption wurde 0.6 °fo NH,-Lösung
durch die Säule gepumpt (10 ml/h) und 5 ml Fraktionen
aufgefangen. Die die saccharaseinhibitorische. Aktivität enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, auf 2 ml am Rotationsverdampfer
einrotiert und mit 2 ml Methanol versetzt. I-Ian stellte diese Lösung auf pH 3-4 ein und brachte sie durch
Kintropfen in 100 ml Aceton zur Fällung. Der Niederschlag
wurde abgenutscht, mit Aceton und Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 26 mg mit 28 000 SIE/g, bestehend
aus Verbindungen mit n^ + n2 = 2 und 3. Die Gewinnung
der reinen Verbindung mit ηχ + n£ = 2 aus diesem Produkt
erfolgt wie in Beispiel 8 beschrieben durch Gelfiltration über eine Säule mit Bio-Gel P-2. Man erhält 7 mg der Verbindung mit
nl + n2 = 2 von ^0.000 SIE/g.
2 ltr Kulturfiltrat, welches man aus einem Fermentationsansatz
wie in Beispiel 5 beschrieben durch Abschleudern des Mycels bei 13.000 UPM gewinnt und welches eine Aktivi-
Le A 17 039 - 62 -
709840/0520
tat von 13.000 Slü/g aufweist, wurden zur Reduktion des
Salzgehaltes (Leitfähigkeit des Kulturfiltrates: ca. 10 mS.cm ' mit 500 g eines Gemisches aus 2,5 Teilen Amberlite IRC-50
(H+-Forn) und 1 Teil Anberlite IKA-41C (OH1-Form) für 1 std
gerührt. Der Austauscher wurde abgetrennt, die Lösung auf etwas unter 100 ml eingeengt und zur Entfernung ungelöster
Bestandteile bei 20.COC UPK für 15 mincentrifugiert. Der
Überstand wurde auf 100 nil aufgefüllt; er wie.s nunmehr eine
Leitfähigkeit von 3,5 niS.cm"1 auf und wurde zur weiteren Reinigung
auf eine Säule (55 x 400 mn) mit P-Cellulose (SERVA
Kr. 45130; nach bekannten Methoden vorbereitet und in 5n:K
Ammoniunphosphat-Puffer; pH 5,5; äquilibriert) aufgetragen.
Als Laufmittel diente genannter Phosphatpuffer; die Fließgeschwindigkeit
betrug 90 ml/std, und Fraktionen von 18 ml
Volumen wurden gesammelt.
Nachdem nan die Fraktionen des Eluates auf ihren Gehalt an Kohlenhydraten (mittels Anthrontest) und an Saccharase-inhibierenden
Komponenten (mittels Saccharase-Inhibitionstest) geprüft hatte, vereinigte man diejenigen Fraktionen, welche
sich in Anthrontest als nahezu frei· von Kohlenhydraten und zugleich
im Saccharase-Hemintest als besonders wirksam erwiesen
hatten (Fraktionen 60-170), engte auf 150 ml ein und filtrierte
über eine Säule (50 χ 300 mm} mit Amberlite IRA-410
(HCO-'-Form). Zur besseren Kontrolle der Entionisierung wurde das Eluat in Fraktionen aufgefangen (10 ml pro Fraktion
in 20 min) und auf Kohlenhydrat (mittels Anthrontest: durchweg nahezu negativ),__ auf Phosphat (mittels Ascorbinsäure-Kolybdat-Reagenz:
durchweg negativ) und auf Saccharase-Inhibition (mittels Erizymhemmtest) geprüft. Die henunaktiven Fraktionen
(3-30) wurden vereinigt, eingeengt und lyophilisiert, erneut aufgelöst und lyophilisiert, um 280 mg Rohinhibitor zu
erhalten.
Zur weiteren Reinigung wurde der Rohinhibitor an Bio-Gel P-2 fraktioniert wie in Beispiel 6 beschrieben. Aus den Fraktionen,
Le A 17 089 - 63 -
709 840/0520
welche die reine Verbindung mit n, + n« = 1 enthielten,
wurden nach Lyophilisation 30 mg eines Produktes isoliert mit 0,3 x 106 AIE/g und 35.000 SIE/g.
Zur Gewinnung der Aminozuckerderivate mit 5-7 Glucoseeinheiten
geht man z. B. von einer Zubereitung, wie sie in Beispiel 1 beschrieben
wurde, aus.
Dazu wurden 30 g der Zubereitung nach Beispiel 1 in 250 ml
HpO gelöst. Die Leitfähigkeit dieser Lösung beträgt 10 nS.cm ,
das pH 5.5. Zur Entsalzung wurde die Lösung mit 60 g Anberlite
IRC 50 H+ (schwach saurer Kationenaustauscher, der die
Aminozuckerderivate aus wässriger Lösung nur spurenweise
bindet) und 20 g Amberlite IRA 410 0H~ versetzt und 2C
gerührt. Das Filtrat (Leitfähigkeit 0.5 mS.cm , pH 3.5)wurde mit
1 η HCl auf pH 3.0 eingestellt (Leitfähigkeit 0.6 mS.cnf1). Diese
Lösung wurde mit 42 ml/h durch eine mit Dowex 50 W (H+) gefüllte
Säule (0 2.5 cm, Höhe 40 cm, äquilibriert in 0.001 η HCl) gepumpt und anschließend mit-2 L 0.001 η HCl nachgewaschen.
Nach dem Waschen der Säule eluierte man mit 1.2 ?S wässrigem Ammoniak und sammelte" 10 ml Fraktionen. Die inhibitorisch
aktiven Fraktionen wurden vereinigt, das Ammoniak im Vakuum abgezogen und die Lösung anschließend im Vakuum
auf 30 ml eingeengt. Man fällte durch Eintropfen in 600 ml Trockensprit, nutschte den ITiederschlag ab und trocknete
im Vakuum nach Waschen mit Alkohol und Äther. Ausbeute 4.4 g mit 26,5 x· 106 AIE/g.
Jeweils 0.5 g wurden zur Feinreinigung auf eine präparative Biogel P-2 Säule, wie in Beispiel 8 beschrieben, aufgetragen
und entwickelt. Die Fraktionen, die nach DC (Amylaseinhibitionsfärbung) Verbindungen mit H1 + Xi2 = 5 - 7 enthalten, wurden
vereinigt, im Vakuum eingeengt und wie oben beschrieben mit Trockensprit gefällt. Ausbeute aus 0.5 g Rohprodukt: 0.2 g Aminozuckerderivate
mit n^ + n2 = 5-7 mit 30 χ 10 AIE/g und
2.500 SIE/g.
Le A 17 089 - - 64 -
709840/0520
Dieses Beispiel zeigt,wie die erfindungsgemäßen Verbindungen
aus dem Kationenaustauscher unter sauren Bedingungen eluiert werden können.
Man füllt eine Säule vom Durchmesser 1,5 cm mit 30 g (Feuchtgewicht)
Dowex®50 W χ 4, (H+) 200 - 400 mesh in 0.001 η HCl.
Anschließend pumpt man 500 ml Mischdesorbat (400 000 SIE/L, pH 2,5, 60 % Aceton), erhalten nach Beispiel 9 (Tabelle,
laufende Nr. 7) in ca. 1 Stunde durch die Säule und wäscht anschließend mit 500 ml 0.001 η HCl nach. Unter diesen Bedingungen
wird nur spurenweise Aktivität eluiert. Daran anschließend wurde mit 0.0125 η HCl desorbiert, wobei die Leitfähigkeit oder
das Brechungsindex des Säuleneluats registiert wurde. Außerdem wurde der SIE-Gehalt des Eluats getestet. Die aktiven Fraktionen
74 - 100 wurden vereinigt und durch Zugabe von Amberlite IRA 410 OH" neutralisiert, dann eingeengt auf 5 ml, mit 5 ml
Methanol reagiert und durch Eintropfen in 200 ml Aceton gefällt. Nach Waschen mit Aceton und Äther wurde im Vakuum getrocknet.
Ausbeute 1 g der Verbindung mit n^ + n2 = 2 mit 65 000 SIE/g.
Aus den aktiven Vorfraktionen können die Verbindungen mit n-, + n
= 3 und 4 Glucoseeinheiten gewonnen werden.
Dieses Verfahren der sauren Desorption ermöglicht also im Gegensatz
zur alkalischen Desorption eine Fraktionierung der einzelnen Aminozuckerderivate dieser Reihe.
Wenn man dem wie oben beschriebenen zubereiteten Stoff mit 4 bis 8 Glucoseeinheiten diesem Verfahren unterwirft, wobei die neutralisierten
Eluate lediglich lyophilisiert werden, erhält man die folgenden einzelnen höheren Fraktionen^
n,, + n2 - 4 = 67.000 AIE/mg
JtI1 + n2 = 5 '. = 57.000 AIE/mg
nl + n2 ~ ^ ~ ^2·000 AIE/mg
n^ + n2 = 7 = 24.000 AIE/mg
n^ + n2 = 8 . = 5.000 AIE/mg
Le A 17 089 - 65 -. 7 0 9 8 A 0 / 0 5 2 0
26U393
Das oben beschriebene ß-Amyläse-Abbauverfahren wird folgendermaßen
durchgeführt.
100 mg Verbindung wurden in 1,9 ml 20 mM Natriumacetatpuffer
(pH 4,75) gelöst und mit 0,1 ml ß-Amylase aus sweet potato (BOEHRINGER NR. 15471; 5 mg/ml; 500 E/mg) versetzt. Die Mischung
wurde 48 Stunden bei 370C gehalten und für 5 Minuten auf 1000C
erhitzt und anschließend bei 4500 Upm zentrifugiert, um ausgefälltes
Eiweiß und andere Verunreinigungen zu entfernen. Die ganze Mischung wurde dann auf eine Säule mit Bio-Gel P 2
(Durchmesser 22 mm; 100 cm lang; bei 650C thermostatisiert)
aufgetragen und mit Wasser bei einer Fließgeschwindigkeit von 25 ml/Std. eluiert. Das Eluat wird durch ein Konduktometer
und ein hochempfindliches Refraktometer mit Durchflußküvetten geleitet. Franktionen von jeweils 2,5 ml wurden aufgefangen.
Die Fraktionen können auf Amylase- oder Saccharasehemmaktivität oder mittels des Anthrontests auf Kohlenhydratgehalt geprüft
werd n. Die aus dem Puffer stammenden Elektrotypen und das Enzymp äparat werden mit dem Leervolumen und die Abbauprodukte
nach abnehmendem Molekulargewicht eluiert. Vollständige Abtrennung der Verbindungen, deren Molekulargewichte sich wenig
unterscheiden, wird durch recycling chromatography unter den oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Fraktionen, die
zu isolierende Produkte enthalten, werden vereinigt und lyophilisiert.
Zur Trennung der isomeren Verbindungen mit drei Glucoseeinheiten wurden 10 g einer in Wasser gelösten Isomerenmischung auf
eine mit DowesP 50 W χ 4 (H+) gefüllte Säule mit Wasser gewaschen,
bis das Eluat neutral war, und dann mit 0,025 η Salzsäure eluiert. Fraktionen von jeweils 3 ml wurden aufgefangen und
dünnschichtchromatographisch geprüft. Dünnschichtchromatographie
wurde auf silanisierten Kieselgelplatten (MERCK, Deutschland) mit 100 : 60 : 40 : 2 Äthylacetat + Methanol + Wasser +
Le A 17 089 - 66 -
709840/0520
26H393
25 % Ammoniak mit dreifacher Entwicklung durchgeführt. Die Verbindung
der Formel IV läuft eine größere Distanz von Ausgangsprodukt als die Verbindung der Formel V. Die 6 g Isomeres
mit der Formel V enthaltenden Fraktion 215 bis 272 und die 600 mg Isomeres mit Formel IV enthaltenden Fraktionen 288 bis
294 wurden vereinigt, mit Amberlite IRA-410 (OH") neutralisiert
und eingeengt.
Die in vitro Saccharase-Hemmäktivität des durch dieses Verfahren
isolierten Isomeren der Formel IV ist I9.OOO SIU/g.
Le A 17 089 - 67 -
709840/052Ö
Claims (9)
1.) Verbindungen der allgemeinen Formel
2SU393
'. CH2OH \
OH CH
— 0 —
2 CH2CH H
CH OH
in der
n1 und n2 für eine Ziffer von Null bis acht stehen können,
die Summe von n-^ und n2 jedoch immer einen Wert von 1 bis 8
besitzt und mit der Ausnahme, daß im Falle von n-, + n2 =
1 oder 2 n2 stets gleich Null ist.
2. ) 0-^4,6-bisdesoxy-4-/i S- (1 ,4 ,6/5) -4 ,5 ,6-trihydroxy- 3-hydroxyi
thylcyclohex^-en-i-ylamino/- dC -D-glycopyranosyl I -(1—r 4 )-(.«
<£ -D-glucopyranosyl-(1—^ 4)-D-glucopyranose der konformaLIVtM
Formel
HOCH,
)H
HIB
.CH2OH
^ OH
Le A 17 089
- 68 -
709840/OF-20
ORIGINAL INS
3.) O-^,e-bisdesoxy^-^i S-(1,4,6/5)-4,5,6-tri~
hydroxy-3-hydroxyniethyl-4-0- cc-D-glucopyranosyl-(1—? 4)-cyclohex-2-en-1-ylamino/-<Z-D-glycopyranosylJf
-(1—#■ 4)-O--CL-D-glucopyranosyl-(1—?
4)-D-glucopyranose der konforniativen
Formel:
H \ CH0OH
0H v CH2OH
■v (»
HO^—\
4.) Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß n^ + n2 = 4 ist.
5.) Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß n^ + n2 = 5 ist.
6.) Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß n^ + n2 = 6 ist.
7.) Arzneimittel enthaltend Verbindungen gemäß Anspruch 1.
8.) Arzneimittel enthaltend die Verbindung gemäß Anspruch 2.
Le A 17 089 - 69 -
709840/0520
>' *6U393
9.) Arzneimittel, enthaltend die Verbindung gemäß Anspruch 3. 10.) Arzneimittel, enthaltend die Verbindung gemäß Anspruch 4.
Le A 17 089 - 70 -
709840/0520
Priority Applications (19)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2614393A DE2614393C3 (de) | 1976-04-02 | 1976-04-02 | Aminozucker-Derivate und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel |
| NO770915A NO770915L (no) | 1976-04-02 | 1977-03-15 | Aminosukkerderivater. |
| AT213577A AT356618B (de) | 1976-04-02 | 1977-03-28 | Verfahren zur herstellung von neuen aminozucker -derivaten |
| FI770998A FI63964C (fi) | 1976-04-02 | 1977-03-30 | Foerfarande foer framstaellning av nya terapeutiskt anvaendbara aminosockerderivat |
| CH400577A CH633043A5 (en) | 1976-04-02 | 1977-03-30 | Process for preparing aminosugar derivatives |
| IL51785A IL51785A (en) | 1976-04-02 | 1977-03-30 | 4,6-bisdesoxy-4-(1s-(1,4,6/5)-5,6-dihydroxy-3-hydroxymethyl-cyclohex-2-en-1-yl-amino)-sugar derivatives their preparation and pharmaceutical compositions containing them |
| CS215177A CS197288B2 (en) | 1976-04-02 | 1977-03-31 | Process for preparing aminoderivatives of sugar |
| RO7789866A RO71905A (ro) | 1976-04-02 | 1977-03-31 | Procedeu de obtinere a unor amino-zaharuri inhibitori de glicozidhidrolaze |
| ES457386A ES457386A1 (es) | 1976-04-02 | 1977-03-31 | Procedimiento para la preparacion de amino-azucares. |
| LU77051A LU77051A1 (de) | 1976-04-02 | 1977-03-31 | |
| SE7703770A SE7703770L (sv) | 1976-04-02 | 1977-03-31 | Sett att framstella nya aminosockerderivat och anvendning derav som lekemedel |
| ZA00772009A ZA772009B (en) | 1976-04-02 | 1977-04-01 | Amino-sugar derivatives |
| JP52037462A JPS603319B2 (ja) | 1976-04-02 | 1977-04-01 | アミノ糖誘導体 |
| FR7709939A FR2346368A1 (fr) | 1976-04-02 | 1977-04-01 | Nouveaux derives de sucres amines et medicament les contenant |
| NZ18373777A NZ183737A (en) | 1976-04-02 | 1977-04-01 | Amino-sugars and pharmaceutical compositions |
| PL19713977A PL197139A1 (pl) | 1976-04-02 | 1977-04-01 | Sposob wytwarzania nowych pochodnych aminocukrowych oraz sposob kontrolowania weglowodanowej przemiany materii za pomoca tych pochodnych |
| DK144477A DK144477A (da) | 1976-04-02 | 1977-04-01 | Aminosukkerderivater og fremgangsmade til fremstilling deraf |
| BE176346A BE853155A (fr) | 1976-04-02 | 1977-04-01 | Nouveaux derives de sucres amines et medicament les contenant |
| AU23919/77A AU507385B2 (en) | 1976-04-02 | 1977-04-04 | Amino sugars |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2614393A DE2614393C3 (de) | 1976-04-02 | 1976-04-02 | Aminozucker-Derivate und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel |
| AU23919/77A AU507385B2 (en) | 1976-04-02 | 1977-04-04 | Amino sugars |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2614393A1 true DE2614393A1 (de) | 1977-10-06 |
| DE2614393B2 DE2614393B2 (de) | 1979-08-02 |
| DE2614393C3 DE2614393C3 (de) | 1980-04-03 |
Family
ID=25619182
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE2614393A Expired DE2614393C3 (de) | 1976-04-02 | 1976-04-02 | Aminozucker-Derivate und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS603319B2 (de) |
| AT (1) | AT356618B (de) |
| AU (1) | AU507385B2 (de) |
| BE (1) | BE853155A (de) |
| CH (1) | CH633043A5 (de) |
| DE (1) | DE2614393C3 (de) |
| FR (1) | FR2346368A1 (de) |
| LU (1) | LU77051A1 (de) |
| SE (1) | SE7703770L (de) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2375248A1 (fr) * | 1976-12-23 | 1978-07-21 | Bayer Ag | Nouveaux derives de sucres amines, leur procede de preparation et medicament les contenant |
| DE2855409A1 (de) * | 1977-12-28 | 1979-07-12 | Toyo Jozo Kk | Neue aminozucker und verfahren zu ihrer gewinnung |
| EP2145538A1 (de) | 2008-07-15 | 2010-01-20 | Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffentlichen Rechts | Pflanzen- und Materialschutzmittel |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2016497A (en) * | 1978-02-10 | 1979-09-26 | Taisho Pharmaceutical Co Ltd | Microbiological production of amylase inhibitor |
| CA1121290A (en) * | 1978-02-14 | 1982-04-06 | Yasuji Suhara | Amino sugar derivatives |
| JPS57146713A (en) * | 1981-03-09 | 1982-09-10 | Akira Endo | Hypoglycemic |
| JP3580900B2 (ja) * | 1995-04-20 | 2004-10-27 | ホクレン農業協同組合連合会 | α−グルコシダーゼ阻害剤を含む糖を主体とする組成物を有効成分とする食品及び飼料 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2347782C3 (de) * | 1973-09-22 | 1979-10-11 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Aminozuckerderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel |
-
1976
- 1976-04-02 DE DE2614393A patent/DE2614393C3/de not_active Expired
-
1977
- 1977-03-28 AT AT213577A patent/AT356618B/de not_active IP Right Cessation
- 1977-03-30 CH CH400577A patent/CH633043A5/de not_active IP Right Cessation
- 1977-03-31 SE SE7703770A patent/SE7703770L/xx unknown
- 1977-03-31 LU LU77051A patent/LU77051A1/xx unknown
- 1977-04-01 BE BE176346A patent/BE853155A/xx not_active IP Right Cessation
- 1977-04-01 FR FR7709939A patent/FR2346368A1/fr active Granted
- 1977-04-01 JP JP52037462A patent/JPS603319B2/ja not_active Expired
- 1977-04-04 AU AU23919/77A patent/AU507385B2/en not_active Expired
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2375248A1 (fr) * | 1976-12-23 | 1978-07-21 | Bayer Ag | Nouveaux derives de sucres amines, leur procede de preparation et medicament les contenant |
| DE2855409A1 (de) * | 1977-12-28 | 1979-07-12 | Toyo Jozo Kk | Neue aminozucker und verfahren zu ihrer gewinnung |
| US4254256A (en) * | 1977-12-28 | 1981-03-03 | Toyo Jozo Company, Ltd. | Amino sugar compound |
| EP2145538A1 (de) | 2008-07-15 | 2010-01-20 | Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffentlichen Rechts | Pflanzen- und Materialschutzmittel |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU507385B2 (en) | 1980-02-14 |
| JPS603319B2 (ja) | 1985-01-26 |
| DE2614393B2 (de) | 1979-08-02 |
| AT356618B (de) | 1980-05-12 |
| DE2614393C3 (de) | 1980-04-03 |
| AU2391977A (en) | 1978-10-12 |
| ATA213577A (de) | 1979-10-15 |
| FR2346368A1 (fr) | 1977-10-28 |
| CH633043A5 (en) | 1982-11-15 |
| BE853155A (fr) | 1977-10-03 |
| SE7703770L (sv) | 1977-10-03 |
| FR2346368B1 (de) | 1980-07-04 |
| LU77051A1 (de) | 1977-10-10 |
| JPS52122342A (en) | 1977-10-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0003616B1 (de) | Neue Aminozucker-Derivate, ihre Herstellung und Amylase-hemmende Mittel | |
| DE2347782C3 (de) | Aminozuckerderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel | |
| US4062950A (en) | Amino sugar derivatives | |
| DE2064092C2 (de) | Inhibitoren für Glykosidhydrolasen aus Actinomyceten | |
| DE2855409A1 (de) | Neue aminozucker und verfahren zu ihrer gewinnung | |
| DE2209834C3 (de) | Herstellung von Saccharase-Inhibitoren | |
| DE2614393A1 (de) | Aminozucker-derivate | |
| CH635616A5 (de) | Verwendung von organismen der familie bacillaceae zur gewinnung von inhibitoren fuer glykosid-hydrolasen. | |
| DE3035193C2 (de) | Antibiotikum SF-1130-x&darr;3&darr;, Verfahren zu dessen Herstellung und dieses Antibiotikum enthaltende Arzneimittel | |
| EP0067356B1 (de) | Gesättigte Aminocyclitderivate, ihre Herstellung und sie enthaltende Arzneimittel | |
| DE2715255B2 (de) | Anthracyclinglykoside MA 144-M1 und MA 144-M2 und deren Salze, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Zubereitungen | |
| DE2911353A1 (de) | 3-o-( beta -d-glucoronpyranosyl)- sojasapogenol b, verfahren zu deren herstellung und arzneimittel, welche diese enthalten | |
| EP0173950A2 (de) | Neuer alpha-Glukosidase Inhibitor, Verfahren zur seiner Herstellung, seine Verwendung und pharmazeutische Präparate | |
| EP0236894B1 (de) | Efomycin G, seine Herstellung und seine Verwendung als Leistungsförderer bei Tieren | |
| DE2209833C3 (de) | Herstellung eines Amylaseinhibitors | |
| EP0173948A2 (de) | Neue Pseudooligosaccharide mit alpha-Glukosidase-hemmender Wirkung, Verfahren zur deren Herstellung, deren Verwendung und pharmazeutische Präparate | |
| DE2658563C2 (de) | ||
| DE2726899C1 (de) | ||
| EP0257418B1 (de) | Oxiran-Pseudooligosaccharide, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und pharmazeutische Präparate | |
| DE2366210C2 (de) | Aminozuckerderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel | |
| DE2661012C2 (de) | ||
| DE2737943A1 (de) | Neue antibiotika, substanzen sf-1130- x tief 1 und -x tief 2 , verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung | |
| AT389516B (de) | Neue oxiran-pseudooligosaccharide, verfahren zu ihrer herstellung, ihre verwendung und sie enthaltende pharmazeutische praeparate | |
| DE68929084T2 (de) | Arzneimittel zur Verhinderung einer Infektion mit dem für AIDS verantwortlichen Virus | |
| DE2413720A1 (de) | Verwendung von aminozuckerderivaten in der tierernaehrung |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |