DE2366210C2 - Aminozuckerderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel - Google Patents

Description

in der R einen Oligosaccharidrest mit 4 bis 7 Hexoseeinheiten bedeutet.

2. Verfahren zur Herstellung von Aminozuckerderi vaten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Gattung Actinoplanes in einem wäßrigen Stärke- und/oder Glucose- und/oder Maltose-enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen bei pH 5,0-8,5 und 15-45°C züchtet und anschließend die Aminozuckerderivate isoliert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Abtrennung inerter Saccharide von den Verbindungen gemäß Anspruch 1 an Kationenaustauschern vornimmt.

4. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Aminozuckerderivatcn gemäß Anspruch 1.

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Aminozuckerderivate. Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel, insbesondere Mittel gegen Diabetes und Adipositas.

Es ist bereits bekannt geworden, daß eine Rsihe von Actinomyceten, vor allem die Actinoplanaceen, Inhibitoren für Glycosidhydrolasen vorzugsweise kohlenhydratspaltender Enzyme des Verdauungstraktes bilden. Eine Gruppe dieser Inhibitoren ist relativ hitzestabil und bei Raumtemperatur säure- und alkalistabil. Diese Inhibitoren gehören chemisch in die Klasse der Oligo- oder Polysaccharide bzw. deren Derivate.

Die meisten der Inhibitoren aus dieser Gruppe sind hochpotente Amylaseinhibibitoren, aber nur mittelstarke oder schwache Saccharaseinhibiloren (siehe DE-OS 20 64 092).

Es wurde nun gefunden, daß man neue Aminozuckerderivate der allgemeinen Formel

HO

OH

HO

CH,^OM H " OH OH

in der R einen Oligosaccharidrest mit 4 bis 7 Hexoseeinheiten bedeutet, erhält, wenn man Mikroorganismen der Familie Actinoplanaceae, insbesondere von Stämmen der Gattung Aclinoplanes, in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet und anschließend die Aminoziickerderivale isolier!.

Weiterhin wurde gefunden, daß die neuen Aminozuckerderivate starke Inhibitoren für Glykosidhydrolasen des Verdauungstraktes sind und insbesondere starke Hemmung von Amylase zeigen.

Überraschenderweise besitzen die erfindungsgemäßen Aminozuckerderivate eine höhere spezifische Hemmaktivität gegenüber Amylase als die bereits bekannten Inhibitoren. Dabei fällt als besonders merkwürdig auf, daß einige der neuen Aminozuckerderivate in vivo eine um ein Vielfaches höhere Hemmwirkung besitzen als ihrer in vitro-Hemmwirkung entspricht

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Mikroorganismen der Gattung Actinoplanes verwendet. Als Beispiele seien genannt die Stämme Actinoplanes spec. SE 50 (CBS 961.70), SB 18 (CBS

957.70) und SE 82 (CBS 615.71). Diese Mikroorganismen sind bereits in der südafrikanischen Patentschrift Nr. 71/8677 beschrieben und sind unter den in Klammern aufgeführten Nummern im Centralbureau vor Schimmelcultures in Baarn/1 lolland hinterlegt.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können weiterhin — wie auch schon in der südafrikanischen Patentschrift Nr. 71/8677 beschrieben

2> — Mutanten oder Varianten aus diesen Stämmen verwendet werden. Besonders geeignet erwiesen sich im Hinblick auf die Gesamtausbeute an den erfindungsgemäßen Aininozuckerdcrivaten und/oder im Hinblick auf die Größe des Restes R im Gemisch der bei der

ίο Fermentation gebildeten Amino/uckcrdcrivatc die Stämme SE 50/13 (CBS 614.71), und SE 50/110 (CBS 674.73). Beide Stämme entsprechen in ihrer Beschreibung weitgehend dem Eltcrnstamm SE 50. Diese Stämme sind ohne Anwendung von Mutagcnen durch

π natürliche Auslese aus Stamm SE 50 gewonnen worden. Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet man feste und flüssige, insbesondere flüssige, wäßrige Nährböden, die neben Kohlcnstoffqucllen Stickstoffquellcn, Salze und Antischaummittel in den üblichen Konzentrationen enthalten. Die Konzentrationen können in weiten Grenzen schwanken.

Als Kohlcnstoffquellcn dienen vorwiegend Kohlenhydrate, insbesondere Stärke, Maltose. Glucose und Gemische von zweien (oder dreien) dieser Stoffe, aber

4^r> auch komplexe Gemische wie Malzextrakt.

Als Stickstoffquellen können die in der Mikrobiologie üblichen komplexen Gemische wie z. B. Kaseinhydrolysal, Hefeextrakt, Pcpton, Fischmehl, Fishsolubles, Maisquellwasscr, Fleischextrakt und auch Mischungen ebenso wie Aminosäuren und/oder Ammoniumsalze verwendet werden.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird aerob im allgemeinen in belüfteten Schüttelkulturcn oder in Behältcrkulturen gearbeitet.

Die Art und die Konzentration der Kohlcnstoffquelle beeinflußt in Kombination mit dem jeweiligen zur Fermentation verwendeten Stamm die Art des Endproduktes im Hinblick auf die Größe des Restes R soweit, daß man einzelne Glieder der homologen Reihe oder

bo zumindest einen sehr engen Bereich von Homologen nahezu selektiv herstellen kann. Es hat sich dabei gezeigt, daß in Nährlösungen, die Stärke über 2'/o enthalten, vor alkin Aminozuckerderivate mit 4 — 7 Hexoseeinheiten gebildet werden, und daß für diese

t,-i Produktion insbesondere der Stamm SE 50/13 (CBS

614.71) geeignet ist. Es genügt aber unter Umständen schon, zu Nährlösungen, die z. B. 3,5% Glucose als GrundkohlenstoffoMcllo enthalten, 0.1-2% Stärke

zuzugeben, um Gemische von Aminozuckerderivaten mit 4—7 Hexoseeinheiten zu erhalten. Besonders geeignet zur Herstellung des erfindungsgemäßen Aminozuckerderivats mit R = Glucose haben sich Nährlösungen erwiesen, die allein Glucose als Kohlensioffquelle enthalten.

Bei den Fermentationen kann die Zusammensetzung der übrigen Nährlösung, insbesondere die Konzentration der Stickstoffquellen und die Salzzusammensetzung in weiten Bereichen schwanken.

Die Nährmedien werden in der üblichen Weise sterilisiert Die pH-Werte der Nährlösung liegen zwischen 5,0—8,5, vorzugsweise zwischen 6,0 — 7,8. Die Bebrütungstemperaturen liegen zwischen 15 und 45° C, vorzugsweise zwischen 24 —32⁰C. Für die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen mit den Stämmen SE 50 und SE 50/13 ist eine höhere Temperatur z. B. 28°C günstiger. Die Kulturdauer beträgt 1 —8 Tage, vorzugsweise 2—6 Tage. Der Endpunkt der Fermentation wird durch Bestimmung des Gehaltes an Hemmaktivität im enzymatischen Hemmtest und durch dünnschichtchromatografische Bestimmung der Zusammensetzung bestimmt.

Die Isolierung und Reinigung der erfindungsgemäßen Aminozuckcrderivate geht von mikrobiologischen Kulturbrühen aus und geschieht durch direkte Fällung nach vorheriger Entfärbung und Einengung der Lösungen.

Wenn die Ausgangslösungen sehr dunkel gefärbt sind, werden sie vor der Adsorption der erfindungsgemäßen Substanzen mittels Aktivkohle bei sauren pH-Werten |pH 1 — 3) oder mit einem Adsorplionsharz mit 0,35 mm Körnung im Bereich von pH 2-7, vorzugsweise bei pH 2-3, entfärbt. Die Aktivkohle bindet nur im sauren Bereich bevorzugt Farbstoffe, während das Harz die inhibitorisch aktiven erfindungsgemäßen Aminozuckerderivate weder im Neutralen noch im Sauren adsorbiert.

Zur Abtrennung der hemmaktiven Aminozuckerderivate von inaktiven Saccharidcn und anderen hemmaktiven Verbindungen nutzt man den schwach basischen Charakter dieser Komponenten aus. Unter geeigneten Bedingungen (pH 1 —8, vorzugsweise pH 2 —4; bei niedriger lonenstärke, entsprechend einer Leitfähigkeit < 1OmS, vorzugsweise < 2 mS) werden die homologen Aminozuckerderivate von stark sauren Kationenaustauschern in der H+-Form, gebunden. Besonders gut lassen sich die hemmaktiven Aminozuckerderivate aus acetonischer Lösung (50-80% Aceton, pH 1-5, vorzugsweise pH 2 — 4) an Kationenaustauscher binden, die unter diesen Bedingungen eine wesentlich höhere Kapazität für die Substanzen zeigen. Unter der Voraussetzung, daß die Lösung mehr als 50% Aceton enthält, gelingt die Bindung auch an schwach sauren Austauscher recht gut.

Zur Desorption der erfindungsgemäßen Amino-/iickerderivate von den Kationenaustauschern verwendet man am besten wäßrige Ammoniaklösungen. Aus den Desorbaten zieht man den Ammoniak im Vakuum ab und gewinnt die inhibitorisch aktiven Aminozuckerderivate nach Einengen der Lösung durch Lyophilisation oder Fällung mit organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise mit 10 — 20 Volumina Aceton.

Zur Reindarstellung der einzelnen Glieder aus der erfindungsgemäßen homologen Reihe inhibitorisch aktiver Aminozuckerderivate Chromatographien man die vorgereinigten Präparate über ein geeignetes Molekularsieb und untersucht die Fraktionen des Fluates dünnschichtchromaiographisch. Fraktionen, welche die Aminozuckerderivate rein enthalten, werden vereinigt, rechromalographiert und schließlich nach Einengen lyophilisiert oder mittels organischer Lösungsmittel, wie oben beschrieben, gefällt.

Die erfindungsgemäßen Substanzen gehören ihrer chemischen Natur nach zur Substanzklasse der Kohlenhydrate. Sie bilden homologe Reihen, als deren Grundkörper das folgende Aminozuckerderivat (C19H33NO13) anzusehen ist.(R = Hexose)

OH CH₃

N

OH OH

Die erfindungsgemäßen Glieder leiten sich nun vom Grundkörper in der Weise ab, daß sie 3 bis 6 Einheiten eines Monosaccharides, vorzugsweise einer Hexose, insbesondere von Glucose, zusätzlich enthalten.

Alle Glieder solcher homologer Reihen sind weiter-

2ϊ hin dadurch gekennzeichnet, daß sie bei saurer Totalhydrolyse »Komponente I« (C1JH19NO7) sowie das entsprechende Monosaccharid liefern. Für »Komponente I« wurde nachstehende Strukturformel hergeleitet:

OH
^IU\ λ O

OH

HOH₁C T ^N II

»Komponente

Als Beispiel für das Strukturprinzip einer homologen Reihe sei der Fall genannt, in dem die Oligosaccharidkette aus 4 - 7 Glucoseeinhciten besteht. (In der Formel bedeutet R hier einen Oligosaccharidrest mit η = 4-7 Glucoseeinheiten):

HO

IK) ■ \
HOH₅C

OH

OH OH

Die erfindungsgemäßen Verbindungen insbesondere Komponenten I (n = 4) bis IV (/? = 7) vermögen (vAmylase aus Pankreas sehr stark zu hemmen.

''■i der sauren Hydrolyse der erfindungsgemäßen V«. 1 uindungen lassen sich die jeweils niederen I lomologen als Zwischenprodukte nachweisen; daneben treten als Spaltprodukte Glucose und Maltose auf.

Dünnschichtchromatographie

Fließmittel:

n-Butanol/Athanol/Wasser = 50 :30 :20
DC-Fertigplatten F 1500 Kieselgel

Rciucose-Werte: I: 0,30-0,34

II: 0,21-0,23

III: 0.14-0,16

IV: 0,09-0,11

Die spezifischen Hemmaktivitäten der inhibitorisch wirksamen Aminozuckerderivate werden mittels in vitro Enzymhemmtests ermittelt

Amylasetest

Eine Amylse-Inhibitor-Einheit (1 AUE) ist definiert als die Menge inhibitor, die zwei Amylaseeinheiten zu 50% inhibiert. Eine Amylaseeinheit (AE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 μ Äquivalent glucosidischer Bindungen in der Stärke spaltet. Die μ VaI gespaltenen Bindungen werden als μ\α\ gebildeter reduzierender Zucker mit Dinitrosalicylsäure kolorimetrisch bestimmt und mit Hilfe einer Maltoseeichkurve als μναί Maltoseäquivaltente angegeben. Zur Durchführung des Testes werden 0,1 ml Amylaselösung (20-22 AE/ml) mit 0— 10 μg Inhibitor oder 0 — 20 μΐ der zu testenden Lösung in 0,4 ml 0,02-m Natriumglycerophosphatpuffer/ 0,001-m CaCI₂ pH 6,9 versetzt und etwa 10-20 Minuten in einem Wasserbad von 35⁰C äquilibriert. Dann wird 5 Minuten mit 0,5 ml einer auf 35°C vorgewärmten 1% Stärkelösung (Stärke, löslich) bei 35⁰C inkubiert und anschließend mit 1 ml Dinitrosalicylsäure-Reagens (nach P. ßernfeld in Colowick-Kaplan, Meth. EnzymoU Band I₁ Seite 149) versetzt. Zur Farbentwicklung wird der Ansatz 5 Minuten auf dem siedenden Wasserbad erhitzt, dann abgekühlt und mit 10 ml destilliertem Wasser versetzt. Die Extinktion bei 540 nm wird gegen einen entsprechend angesetzten Leerwert ohne Amylase gemessen. Zur Auswertung wird aus einer vorher aufgenommenen Amylaseeichkurve die nach Inhibitorzusatz noch wirksame Amylaseaktivität abgelesen und daraus die prozentuale Hemmung der eingesetzten Amylase errechnet. Die prozentuale Hemmung '.vird als Funktion des Quotienten

μg Inhibitor*)

AE**)

*) Bezogen auf Trockensubstanz
**) AE im nicht inhibierten Ansatz dci gleichen Serie

aufgetragen, der 50% Hemmungspunkt aus der Kurve abgelesen und auf AIE/mg Inhibitor umgerechnet.

Die Ergebnisse der in vitro Enzymhemmtests für diskrete Bereiche von Homologen der erfindungsgemäßen Aminozuckerderivate sind in nachstehender Tabelle zusammengefaßt:

ι = Zahl der Hexoseeinheiten

AIE/g Wie aus der Tabelle ersichtlich, steigt die spez. Hemmaktivität gegenüber Pankreas-ci-Amylase mit zunehmendem Molekulargewicht der homologen Reihe stark an.

Es ist bekannt, daß bei Tieren und Menschen nach Aufnahme von kohlenhydrathaltigen Nahrungs- und Genußmitteln (ζ. Β. Getreide-, Kartoffelstärke, Obst, Fruchtsaft, Bier, Schokolade) Hyperglykämien auftreten, die infolge eines raschen Abbaus der Kohlenhydrate

ίο durch Glykosidhydrciasen (z. B. Speichel- und Pankreasamylasen, Maltesen, Saccharasen) nach folgendem Schema

Amylase

Stärke bzw. Glykogen ► Maltose

Maltase

► Glucose

Saccharase
Saccharose > Glucoxid + Fruklosc

bewirkt werden. Diese Hyperglykämien sind bei Diabetikern besonders stark und anhaltend ausgeprägt. Bei Adipösen bewirkt die alimentäre Hyperglykämie oftmals eine besonders starke Sekretion von Insulin, das seinerseits zu vermehrtem Fettaufbau und vermindertem Fettabbau führt. Im Anschluß an derartige Hyperglykämien tritt bei stoffwechselgesunden und adipösen Personen infolge der Insulinsekretion häufig eine Hypoglykämie auf. Bekannt ist, daß sowohl Hypoglykämien als auch im Magen verweilender Speisebrei die Produktion von Magensaft fördern, der seinerseits die Entstehung einer Gastritis eines Ulcus ventriculi oderduodeni auslöst oder begünstigt.

Es wurde nun gefunden, daß erfindungsgemäße, nach obigen Methoden gewonnene und isolierte Inhibitoren der Glykosidhydrolasen die alimentäre Hyperglykämie, Hyperinsulinämie, Hypoglykämie nach Belastung von Ratte und/oder Mensch mit Weizenstärke oder Saccharose oder Maltose erheblich vermindern und die Magenpassage dieser genannten Kohlenhydrate beschleunigen. Darüber hinaus kommt sie die Resorption von Glucose aus dem Darm. Ferner wird die Konversion von Kohlenhydraten in Lipide des Fettgewebes und der Einbau von alimentärem Fett in die Fettgewebedepots vermindert bzw. verzögert.

Ferner ist bekannt, daß in der Mundhöhle Kohlenhydrate, besonders Saccharose, durch Mikroorganismen gespalten werden und dadurch die Kariesbildung gefördert wird.

Inhibitoren der Glykosidhydrolasen eignen sich deshalb als Therapeuticum für folgende Indikationen: Adipositas, Hyperlipämie (Atherosklerose), Diabetes, Prädiabetes, Gastritis, Ulcus ventriculi, Ulcus duodeni und Karies.

Aminozuckerderivat mit

η = 4-6
ι, = 5-7

17 5OOOOO
30 000000 Dosierung

30-300 000 Al E/kg ein- oder mehrmals täglich vor _b0 und/oder während und/oder nach den Mahlzeiten bzw. Getränken p. os.

Zubereitungsformen

Tablette. Dragee, Kapsel, Lösung, Suspension, Granu_b5 lat, Kaugummi, Zahnpasta und als Zusatz zu kohlenhydrathaltigen Lebens- und/oder Genußmitteln.

Die Toxizität dieser Inhibitoren der Glykosidhydrolasen und GlucoseresorDtionshemmer ist extrem serine.

Vorteilhaft sind auch Kombinationen der erfindungsgemäßen Inhibitoren mit den bekannten oralen Antidiabetica (/J-cytotrope Sulfonylharnstoffderivate und/oder blutzuckerwirksame Biguanide).

Beispiel 1

In einigen Beispielen wird als Ausgangsmaterial eine Zubereitung verwendet, die wie folgt hergestellt wird:

Man beimpft einen Glasfermenter mit 8 Liter Nährlösung der Zusammensetzung 5,0% Stärke, 1,0% Hefeextrakt, 0,2% K₂HPO₄ mit einem 3 Tage alten Schüttelkolben des Stammes SE 50/13 (CBS 614.71) und bebrütet unter intensiver Rührung und Belüftung 3 Tage bei 28°C und erhält eine Kulturbrühe mit 105 000 AI E/ml.

61 dieser Fermentationsbrühe werden nach dem Abkühlen auf 20⁰C mit halbkonzentrierter HNO₃ auf pH 2,5 eingestellt, mit 30 g Aktivkohle versetzt und 10 Minuten gerührt. Anschließend wird 15 Minuten bei 10 000 Upm zentrifugiert und der klare, hellgelbe Überstand nach Neutralisation mit NH3 auf 500 ml eingeengt. Die 500 ml Konzentrat wurden 45 Minuten mit 200 g eines Anionenaustauschers (Cl--Form) gerührt, abgenutscht und mit 4/5 Vol. = 400 ml Methanol versetzt, um die Hauptmenge der höhermolekularen Stärkeabbauprodukte (zusammen mit noch vorhandenen Aktivkohleresten) auszufällen. Es wird 5 Minuten bei 5000 Upm zentrifugiert. Die 850 ml Überstand werden unter intensivem Rühren in 41 Trockensprit eingetropft. Die weiße, flockige Fällung wird abgenutscht, 3mal mit Trockensprit und 2mal mit Äther gewaschen und im Vakuum bei 50°C getrocknet. Ausbeute:36 g eines weißen Pulvers mit 1Ox 10⁶AIE/g.

Beispiel 2

Zur Beurteilung des Endproduktes von Fermentationen und der Zusammensetzung von Präparaten mittels Dünnschichtchromatographie trägt man ! μΙ der Fermentationsbrühen oder 1 μg der Präparate aus Kieselgelfertigfolien (F 1500) auf und entwickelt 2mal in n-Butanol/Äthanol/Wasser = 50/30/20.

Zur Amylaseinhibitonsfärbung besprüht man die entwickelte und getrocknete DC-Platte mit einem Amylasegel (20 ml/20 χ 20 cm Platte) und läßt erstarren. Nach 5' Vorinkubation bei Raumtemperatur bringt man die Platte mit der Gelschicht in eine 0,5%ige Stärkelösung (1 g Stärke in 200 ml 0,2-m Glycerophosphatpuffer 0,01-m CaCb pH 6,9 unter Kochen gelöst) ein und beläßt sie dort für 2' bei 40⁰C unter Urnschwenken der Lösung. Danach wird die "latte mit dest. Wasser gut abgespült und zur Anfärbung der nicht abgebauten Stärke in eine verdünnte J2-Lösung (4 ml J2-Stammlösung auf 500 ml H₂O; J₂-Stammlösung: 2,2 g J₂+ 4,4 g KJ in 100 ml H₂O gelöst) eingetaucht Nach ca. 1 Minute ist die Färbung optimal. Man photographic« sofort, da die blauen Flecken schnell verblassen.

Bereitung des Amylasegels

1 g Agarose wird mit 100 ml 0,2-m Natriumglycerophosphat/0,01-m CaCl_rPuffer pH 6,9 bei 100° C gelöst, nach dem Abkühlen auf 50° C werden 100μ1 einer Lösung aus 2 g eines nicht-ionogenen Dispergiermittels und 8g Äthanol p.a. zugesetzt Direkt vor dem Besprayen setzt man 100μ1 einer Amylasekristallsuspension (10 mg Schweinepakreasamylase/ml ges. NH₄-Sulfatlösung) zu.

Beispiel 3

Beimpft man 1-l-Erlenmeyerkolben mit 120 ml einer Nährlösung bestehend aus 4% Stärke, 2,4% Glucose, 0,9 Kaseinhydrolysat und 0,9% Hefeextrakt, pH mit NaOH auf 7,6 eingestellt, mit 0,4% CaCO₃ versetzt und 30 min bei 121°C sterilisiert, mit 3 ml einer Vorkultur des Stammes SE 82, angewachsen in einer Nährlösung bestehend aus 2% Stärke, 1% Glucose, 0,5% Kaseinhy-

drolysat und 1% Hefeextrakt, pH mit NaOH auf 7,2 eingestellt, mit 0,4% CaCO₃ versetzt und 30 min bei 121⁰C sterilisiert, und bebrütet 5 Tage bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so erhält man eine Kulturlösung mit 122 000 AIE/ml. Zur Aufarbeitung trennt man das Mycel von den vereinigten Kulturlösungen durch Centrifugation bei 12 000 Upm an, bringt 300 ml des Kulturfiltrates mit halbconc. HNO₃ auf pH 2,5 und rührt für 10 Minuten mit 2,5 g Α-Kohle p. A. Nach Abtrennung der Kohle bei 12 000 Upm wird die mittels ION —KOH auf pH 6 neutralisierte Lösung mit 300 ml Methanol versetzt, kurz stehen gelassen und bei 12 00C Upm vom Niederschlag befreit. Tropft man nun den Überstand in 3 I Äthanol, isoliert die Fällung nach kurzem Stehenlassen durch Centrifugation bei 12 000 Upm, wäscht den Niederschlag zweimal mit abs. Äthanol und einmal mit Äther und trocknet im Vakuum, so erhält man 2,23 g eines Produktes mit 7,45 χ 10⁶AI E/g, das zu über 95% höhere Homologe der Aminozuckerderivate mit η > 4 enthält.

Beispiel 4

Beimpft man 1-l-Erlenmeyerkolben, 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 3.5% Glucose, 2% Stärke, 0,5% Kaseinhydrolysat, 1,3% Hefeextrakt, 0,3% CaCO₃ und 0,3% K₂HPO₄ vor Sterilisation auf 7,8 eingestellt, Sterilisation 307121°C, mit 6 ml einer Vorkultur des Stammes SE 50/110 in einer Nährlösung bestehend aus 3% Sojamehl, 3% Glycerin und 0,2% CaCO₃ und bebrütet 3-4 Tage auf einer Rundschüttelmaschine bei 24°C, so erhält man eine Kulturlösung, die 153 000 AIE/ml enthält.

1 Liter Kulturlösung wurde mit HNO₃ auf pH 2,5 eingestellt, mit 5 g Aktivkohle 10' gerührt und anschließend 30' bei 5000 Upm zentrifugiert. Anschlie-

4-, Bend wurde durch Zusatz von 25 g eines Anionenaustauschers (OH--Form) neutralisiert. Der neutrale Überstand wurde auf 100 ml einrotiert, mit 100 ml Methanol versetzt und filtriert. Das Filtrat wurde in 2 1 Trockensprit eingerührt, der ausfallende Niederschlag

so abgenutscht und nach 3 χ Waschen mit Aceton und Äther im Vakuum getrocknet.

Ausbeute 14 g eines weißen Pulvers mit 5 χ 10⁶ Al E/g, das überwiegend Homologen mit π > 4 enthält.

Beispiel 5

Beimpft man 1-l-Erlenmeyerkolben mit je 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 5% Stärke, 1% Hefeextrakt, 0,2% K₂HPO₄ mit je 2 ml einer Vorkultur nach Beispiel 4, so erhält man nach 3tägiger Bebrütung bei 28° C Kulturlösungen mit folgender Ausbeute an Amylase-Inhibitor:

Stamm

AIE/ml

SE 50	37 000
SE 50/13	109 000
SE 50/110	53 500

die vorwiegend aus Aminozuckerderivaten mit η > 4 bestehen.

Beispiel 6

Beimpft man einen Fermenter mit 1001 Nährlösung der Zusammensetzung 3,5% Glucose, 2,5% Malzextrakt, 0,5% Kaseinhydrolysat, 1,3% Hefeextrakt, 0,3% CaCO₃, 0,3% K₂HPO₄ und 0,1% Antischaummittel mit 5 I einer Vorkultur nach Beispiel 4 und bebrütet unter Rührung und Belüftung 5 Tage bei 24°C, so erhält man eine Kulturlösung, die vorwiegend das Aminozuckerderivat mit η = 2 enthält.

90 Liter Fermentationsansatz wurden mit Mycel am pH-Meter mit konz. HNO3 auf pH 2,5 eingestellt und unter Rühren mit 900 g (= 1%) Aktivkohle zur Adsorption der Hauptmenge der gebildeten Farbstoffe versetzt. Man rührte 15 Minuten, trennte über eine Zentrifuge bei 3000 Upm vom Mycel und der Hauptmenge der Kohle ab und filtriert den Überstand schließlich unter Zusatz von 3 kg eines Filtrierhilfsmittels über eine Drucknutsche. Man erhielt 65 Liter gelbbraunen, klaren Filtrats.

Das Filtrat wurde mit konz. NH₃ auf pH 7 eingestellt und zur Adsorption des Wirkstoffs mit 1300 g (2%) Aktivkohle für 30' gerührt. Man filtriert über eine Drucknutsche und wusch das Aktivkohlesediment 3 χ mit 10 Liter destilliertem Wasser. Anschließend wurde die Kohle gut trocken gedrückt und in 3 χ 4 Litern 50% Aceton bei pH 2,5 für jeweils 15' gerührt, um den Wirkstoff von der Kohle zu desorbieren. Die acetonisehen Desorbate wurden — nach Abtrennen von der Kohle durch Filtration — vereinigt. Man engte das vereinigte Desorbat am Rotationsverdampfer auf 250 ml ein, versetzte mit einem gleichen Volumen (250 ml) Methanol und filtrierte durch ein Faltenfilter, Das Filtrat (480 ml) wurde in 5 Liter Aceton unter kräftigem Rühren eingetropft. Der ausfallende Niederschlag wurde abgenutscht und 3 χ mit Aceton und Äther gewaschen. Anschließend wurde im Vakuum bei 35°C getrocknet. Ausbeute 230 g.

25 g des obigen rohen Produkts wurden in 1 Liter H2O gelöst und mit 300 g eines stark sauren Kationenaustauschers (H+ -Form) 30' gerührt. Man filtrierte das Harz ab und wusch 3 χ mit 2 Liter 0,001 n-HCI nach. Das gewaschene Harz wurde anschließend in 500 ml H₂O suspendiert und die Suspension am pH-Meter durch Zugabe von 25% NH₃ auf pH 9,0 eingestellt. Anschließend wurde noch 2 χ mit je 500 ml 0,6% NH₃ desorbiert, die Desorbate vereinigt und am Rotationsverdampfer auf 100 ml eingeengt. Zur Entfärbung dieses Konzentrats wurde es mit 2 g DEAE-Zellulose (0,6 mVal/g) für 5 Minuten gerührt, dann zentrifugiert. Der hellgelbe Überstand wurde mit einem gleichen Volumen (100 ml) Methanol versetzt und dann in 2 Liter Aceton unter intensivem Rühren eingetropft. Der Niederschlag wurde abgenutscht, mit Aceton und Äther gewaschen und im Vakuum bei 35°C getrocknet. Ausbeute 42 g- Zur weiteren Feinreinigung wurden die 4,0 g Inhibitor in 0,5-g-Portionen über ein Polyacrylamid-Gel gelfiitriert. Dazu wurden 0,5 g des Präparats in 10 ml H₂O gelöst und auf eine mit Polyacrylamidgel gefüllte Säule vom Durchmesser 5 cm und der Länge 95 cm aufgetragen. Man entwickelte in Wasser bei einer Fließrate von 80 ml/h. Es wurden 12 ml Fraktionen gesammelt. Von allen Fraktionen wurde der Gesamtkohlenhydratgehalt (in Form des Anthrontest als Extinktion bei E₆2o) sowie der Gehalt an Amylase-Inhibitor ermittelt Außerdem wurden die Fraktionen dünnschichtchromatographisch (Enzym-Inhibitonsfärbung) geprüft.

Die Fraktionen, in denen die Aminozuckerderivate mit η — 4 — 6 nachgewiesen wurden, wurden vereinigt,

^r> im Vakuum auf 10 ml eingeengt und durch Eintropfen in 200 ml Trockenspritz gefällt. Der Niederschlag wurde abcentrifugiert, mit Aceton und Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet; Ausbeute aus 4,0 g Rohinhibitor: 0,2g Aminozuckerderivate mit π = 4-6 mit

in 17,5x10⁶AIE/g.

Beispiel 7

Zur Gewinnung der Aminozuckerderivate mit n = 5 — 7 geht man z. B. von einer Zubereitung, wie sie

is in Beispiel 1 beschrieben wurde, aus.

Dazu wurden 30 g der Zubereitung nach Beispiel i in 250 ml H₂O gelöst. Die Leitfähigkeit dieser Lösung beträgt 1OmS, das pH 5,5. Zur Entsalzung wurde die Lösung mit 60 g eines schwach sauren Kationenaustauschers (H+ -Form), der die Aminozuckerderivate aus wäßriger Lösung nur spurenweise bindet, und 20 g eines Anionenaustauschers (OH--Form) versetzt und 20' gerührt. Das Filtrat (Leitfähigkeit 0,5 mS, pH 3,5) wurde mit In-HCl auf pH 3,0 eingestellt (Leitfähigkeit

2) 0,6 mS). Diese Lösung wurde mit 42 ml/h durch eine mit einem sauren Kationenaustauscher (H+ -Form) gefüllte Säule (0 2,5 cm, Höhe 40 cm, äquilibriert in 0,00In-HCI) gepumpt und anschließend mit 2 1 0,001 n —HCI nachgewaschen. Nach dem Waschen der

κι Säure eluierte man mit 1,2% wäßrigem Ammoniak und sammelte 10 ml Fraktionen. Die inhibitorisch aktiven Fraktionen wurden vereinigt, das Ammoniak im Vakuum abgezogen und die Lösung anschließend im Vakuum auf 30 ml eingeengt. Man fällte durch

j-, Eintropfen in 600 ml Trockensprit, nutschte den Niederschlag ab und trocknete im Vakuum nach Waschen mit Alkohol und Äther. Ausbeute 4,4 g mit 26,5XiO⁶AIEZg.

Jeweils 0,5 g wurden zur Feinreinigung auf eine

4(1 präparative Polyacrylamidgel-Säule, wie in Beispiel 6 beschrieben, aufgetragen und entwickelt. Die nach DC (Amylaseinhibitonsfärbung) Aminozuckerderivate mit π = 5 —7-haltigen Fraktionen wurden vereinigt, im Vakuum eingeengt und wie oben beschrieben mit

•T) Trockensprit gefällt. Ausbeute aus 0,5 g Rohrprodukt: 0,2 g Aminozuckerderivutc mit η = 5 — 7 mit 30x 10^bAlE/g.

1 Versuchsanordnungen zum Nachweis der Wirkung von Glykosidhydrolaseinhibitoren und der Glucose-

resorptionshemmung an Ratte und Menvrh

Zur Erzeugung einer alimentaren Hyperglykämie und Hyperinsulinämie erhalten nüchterne Ratten (n = 6) bzw. nüchterne Versuchspersonen entweder 2,5 g

Yi Saccharose oder 2,5 g Maltose oder 1 g gekochte Stärke oder 2,5 g Glucose/kg p. os bzw. 50 g Saccharose oder 50 g Maltose oder 50 g gekochte Stärke oder 50 g Glucose/Person p. os in wäßriger Lösung oder als Suspension appliziert. Andere Ratten (n = 6) erhalten

Mi die genannten Kohlenhydrate in der gleichen Menge und zusätzlich einen der Kohlenhydrate in der gleichen Menge und zusätzlich einen in der den Beispielen genannten Wirkstoffe in der angegebenen Dosierung. Gesunden Versuchspersonen wird alternierend eines

b5 der genannten Kohlenhydrate im Abstand von 2 Tagen oder mehr einmal mit einem der genannten Wirkstoffe bzw. ohne diesen verabreicht Die Blutglucose und das Seruminsulin werden vor sowie in kurzen zeitlichen

11 12

Abständen von 5 Minuten bis zu 3 Stunden nach Analyzer nach Hoffman η : J. biol. Chem. 120. 51

Kohlenhydratbelastung ± Wirkstoff im Blut aus dem (1937) oder enzymatisch mit Glucoseoxydase und

retoorbitalen Venenplexus von Ratten bzw. im Cubital- o-Dianisidinhydrochlorid die Seruminsulinbestimmun-

venen- oder Kapillarblut der Versuchspersonen gemes- gen nach der Methode von Haies und Rändle:

sen. Die Blutglucosebesümmungen werden im Auto- ·> Biochem. J. 88,137 (1963) ausgeführt.

Il Versuchsanordnung zum Nachweis einer Hemmung

der Konversion von Kohlenhydraten in

Fettgewebslipide

Ratten (/? = 6) erhalten eines der in I genannten perirenales Fettgewebe gewonnen, die Lipide mit

Kohlenhydrate in inaktiver Form zusammen mit einer 15 geeigneten Fcttlösungsmitteln, z.B. Chloroform/Me-

geeigneten Dosis desselben Kohlenhydrats, das aber thanol (2 : 1) extrahiert und die nicht lipidhaltigen

radioaktiv (¹⁴C) markiert ist, ± Wirkstoff aus den Stoffwechselmetaboliten ausgewaschen. Gemessen

genannten Beispielen per Schlundsonde appliziert. In wird die Radioaktivität der auf diese Weise isolierten

kurzen zeitlichen Intervallen nach Versuchsbeginn Lipide im Liquid Scintillation Counter. Die Aktivität

werden die Tiere getötet und epididymales und/oder >o wirdindpm/1 g Fettgewebe angegeben.

Tabelle 1

BlUglucose in mg% (Mittelwert ± Is) von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach oraler Gabe von Stärke + Wirkstoff aus Beispiel 7, Aminozuckerderivate mit η = 5-7

	10 min. niich Appl.	15	20	30	45	±5,0 ± 11 ±6,7
Kontrolle ohne Stärke Kontrolle mit Stärke 12000 AIE +Stärke	55 ± 4,8 103 ± 11 95 ± 4,3	63 ± 5,9 117 ±8,6 107 ± 3,3	67 ± 5,8 118 ±8,5 102 ± 5,5	72 ± 4.7 128 ±8.9 111 ±3.0	66 109 102	±4,3
24000 AIE +Stärke	87 ± S,6	94 ± 8,8	89 ± 8,5	9S ± 8,3	91	±4,9
48000 AlE + Stärke	74 ± 8,9	84 ± 7,2	84 ± 6,9	85 ± 6,5	85

Tabelle 2 zu Versuchsanordnung I und II

Blutglucosc in mg% (Mittelwert ± Is) von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach oraler Gabe von Stärke + Wirkstoff aus Beispiel 6, Aminozuckerderivate mit η = 4-6

	10 min. nach Appl.	15	20	30	45
Kontrolle ohne Stärke Kontrolle mit Stärke 6000 AIE + Stärke 12000 AIE+ Stärke	55 ± 4,8 103 ± 11 99 ± 4,5 90 ± 5,2	63 ± 5,9 117 ±8,6 118 ± 5,8 98 ± 8,2	67 ± 5,8 118 ±8,5 104 ±8,1 99 ±4,1	72 ± 4,7 128 ±8,9 123 ± U 117 ±6,7	66 ± 5,0 109 ±11 107 ± 7,3 104 + 8,2
24000 AIE + Stärke	74 ± 5,5	82 ± 2,9	83 ± 3,7	96 ± 6,6	85 ± 6,4
P < 0,05	P < 0,01 = = =	= = P<0,001	gegen Kontrolle	mit Stärke.

13 14

Tabelle 3 zu Versuchsanordnung I und II

Blutglucose in mg% (Mittelwert ± Is) von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach oraler Gabe von Saccharose + Wirkstoff aus Beispiel 7, Aminozuckerderivate mit η = 5-7

45

Kontrolle ohne Saccharose 58 ± 2,9 49 ± 3,3 54 ± 4,8

Kontrolle mit Saccharose 107 ± 11 121 ± 6,0 132 ± 16

25 SIE + Saccharose 102 ±11 I⁰UM 109 ± 7,5

50 SIE + Saccharose 92 ± 7,0 100 ± 8,3 109 ± 3,7 100 SIE + Saccharose

13	. nach Appl.	30	±	3,3
min	±2,9		±	6,0
58	± 11	49	±	9,6
107	± 11	121	11+	8,3
102	±7,0	108	+	8,7
92	±81	100
95	84

63	±	5,0
132	±	6,7
101	±	7,9
102	I +11	6,3
91	+1	4,5

P < 0,05 P < 0,01 = = = = = P < 0,001 gegen Kontrolle mit Stärke bzw. Saccharose.

Tabelle 4 zu Versuchsanordnung I und Il

Blutglucose in mg% (Mittelwert ± Is) von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach oraler Gabe von Saccharose ± Wirkstoff aus Beispiel 6, Aminozuckerderivate mit η = 4-6

	ohne Saccharose mit Saccharose Saccharose	15 min. nach Appl.	30	45	60
Kontrolle Kontrolle 25 SIE +	Saccharose	58 ± 2,9 107 ± 11 109 ± 6,4	49 ± 3,3 121 ±6,0 105 ± 10	54 ± 4,8 132 ± 16 112 ±9,1	63 ± 5,0 132 ± 6,7 108 ± 8,1
50 SIE +	Saccharose	103 ±4,1	107 ± 15	102 ± 7,7	101 ± 9,2
100 SIE +	85 ± 8,1	94 ± 9,9	95 ± 8,5	85 ± 6,4

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Aminozuckerderivate der allgemeinen Formel
HO OH CH₃

HO

-N —

C)II

OH

OH