DE2209834B2

DE2209834B2 - Herstellung von saccharase- inhibitoren

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Publication number: DE2209834B2
Application number: DE19722209834
Authority: DE
Priority date: 1972-03-01
Filing date: 1972-03-01
Publication date: 1977-08-25
Also published as: DK130227C; FI49842B; AU5265873A; NO136498C; DE2209834A1; KR780000002B1; AR196914A1; ZA731395B; FR2174239A1; DD104553A5; NL175318B; FI49842C; LU67106A1; IL41613A; CS174870B2; NO136498B; AT319172B; FR2174239B1; US4019960A; BE795996A

Description

Gegenstand älterer Patentanmeldungen (deutsche Patentanmeldung P 20 64 092.0, britische Patentanmeldung Nr. 59 939/71) ist die Erkenntnis, daß eine Reihe von Actinomyceten Inhibitoren von Glycosidhydrolasen, und zwar insbesondere Inhibitoren für Glycosidhydrolasen vorzugsweise kohlenhydratspaltender Enzyme des Verdauungstraiaes bilden. Eine Gruppe dieser Inhibitoren ist relativ hitzestabil und bei Raumtemperatur säure- und alkalistabil. Diese Inhibitoren gehören chemisch in die Klasse der Oligo- oder Polysaccharide bzw. deren Derivate.

In den genannten Patentanmeldungen, z. B. in den Beispielen 28 bis 38 der genannten deutschen Patentanmeldung, wird die Gewinnung eines derartigen Amylase-Inhibitors aus dem zur Ordnung Actinomycetales gehörenden Actinoplanaceen-Stamm SE 50 beschrieben.

Die Kulturlösungen des Stammes SE 50 besitzen oft auch eine geringe saccharaseinhibitorische Wirksamkeit.

Die Gewinnung und Reindarstellung des gebildeten Saccharase-Inhibitors wird jedoch sehr stark erschwert durch das Vorhandensein erheblicher Amylase-Inhibitor-Mengen in der Kulturlösung.

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen definierten Gegenstände.

Bei den Verfahren gelingt es, die Bildung von Amylase-Inhibitor zu vermindern bei gleichzeitiger Förderung der Bildung von Saccharase-Inhibitor. Diese Effekte werden durch die folgenden Maßnahmen erreicht, die erfindungsgemäß entweder einzeln oder miteinander kombiniert angewandt werden:

1. Man verwendet eine stärkefreie Nährlösung (Anspruch 2).

2. Mau fügt Maltose zur Nährlösung zu (Anspruch 3).

3. Man bricht die Kultur kurz vor oder beim Erreichen eines optimalen Gehaltes an Saccharase-Inhibitor ab (Anspruch 4).

Ad 1. Die Nährlösungen müssen stärkefrei sein. Man erhält so nach Optimierung Nährlösungen, z.B. der Zusammensetzung 3,5% Glucose, 0,5% Caseinhydrolysat, 1,3% Hefe-Extrakt, 0,3% K₂HPOt, 0,3% CaCO j (pH mit KOH vor Sterilisation auf 7,8 eingestellt), die nach mehrtägiger Fermentation mit dem zur Ordnung Actino-" mycetales gehörenden Actinoplanaceen-Stamm SE 50. der im Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn, Niederlande, unter der Nr, CBS 961.70 hinterlegt wurde, Kulturbrühen ergeben, die über 10 SIE/ml enthalten. Bei einem Gehalt ίο von 300-700 AIE/ml (Amylase-Inhibitor-Einhei-

ten) ergibt sich ein SIE/AIE-Verhältnis von 15x10->-30χ10-γΛ=8ΙΕ/ΑΙΕχ ΙΟ³).
Ad 2. Man kann die Produktion von Saccharase-Inhibitor noch erhöhen, wenn man der Nährlösung Maltose zusetzt. Gibt man z. B. in oben erwähnte Nährlösung 1,5% Maltose, so erhält man Kulturbrühen mit einem Gehalt von z. B. 16 -18, ja bis zu 24 SIE/ml.

Ad 3. Entscheidend wird das SIE/AIE-Verhältnis durch die Dauer der Kultur beeinflußt. Bricht man die Kultur kurz vor oder gerade beim Erreichen des maximalen SIE-Gehaltes ab, was je nach Beimpfung schon bei 1,5- bis 2tägiger Fermentation der Fall sein kann, so erhält man f-Werte bis zu 180.

Anstelle des Stammes SE 50 können erfindungsgemäß auch dessen Mutanten, z. B. der Stamm SE 50/13 (CBS-Nr. 614.71), verwendet werden (Anspruch 5).

Die Gewinnung des saccharaseinhibierenden Prinzips aus den entsprechend fermentierten Kulturlösungen geschieht entweder durch Konzentration der Kulturbrühen im Vakuum auf '/ιο-'/20 des ursprünglichen Volumens mit anschließender Lyophilisation oder durch Fällung der konzentrierten Lösungen mit 4-10 Volumenteilen organischen Lösungsmittels wie Alkoholen bzw. Ketonen, vorzugsweise mit 5-9 Volumenteilen Aceton, oder besonders einfach durch Adsorption des inhibierenden Prinzips aus der neutralen Kulturlösung an 0,5 - 4%, vorzugsweise 1 - 2%, Aktivkohle und anschließende Desorption mit wäßrigen Alkoholen oder Aceton besonders bei sauren pH-Werten, vorzugsweise mit 50%igem Aceton bei pH 2-3. Das Desorbat wird anschließend im Vakuum auf '/so-¹/200, vorzugsweise '/loo, des Ausgangsvolumens (der Kulturlösung) eingeengt und anschließend mit organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise Aceton, gefällt. Allgemein wird zur Gewinnung reinerer Präparate eine Voradsorption der die Kulturlösung verunreinigenden braunen Farbstoffe an 1 - 2% Aktivkohle bei sauren pH-Werten (pH-Werte von 1-4, vorzugsweise 2-3) vorgenommen, bei denen die Adsorption des Wirkstoffes überraschenderweise noch nicht in nennenswertem Umfang stattfindet.

Es ist bekannt, daß bei Tieren und Menschen nach Aufnahme von saccharosehaltigen Nahrungs- und Genußmitteln Hyperglykämien auftreten, die infolge einer raschen Spaltung der Saccharose durch Saccharasen des Verdauungstraktes nach folgendem Schema

_ , Saccharase _,, _

Saccharose ► Glucose + Fructose

bewirkt werden. Diese Hyperglykämien sind bei Diabetikern besonders stark und anhaltend ausgeprägt. Bei Adipösen bewirkt die alimentäre Hyperglykämie oftmals eine besonders starke Insulinsekretion, die ihrerseits zu vermehrtem Fettaufbau und vermindertem Fettabbau führt.

Die nach obigen Methoden gewonnenen und isolierten Saccharase-Inhibitoren vermindern die alimentäre Hyperglykämie und Hyperinsulinämie nach Belastung von Ratten mit Saccharose erheblich.

Weiter ist bekannt, daß Karies nach Genuß von saccharosehaltigen Genuß- und Nahrungsmitteln besonders stark und häufig vorkommt (z. B, W. G ο I d : Advances in Applied Microbiology Il [1969] 135-157). Eine Hemmung der Saccharosespaltung durch die erfindungsgemäßen Inhibitoren vermindert die Bildung kariogener Stoffe.

Diese Inhibitoren eignen sich deshalb als Therapeuticum für die folgenden Indikationen:

Adipositas, Hypeilipämie (Atherosklerose), Diabetes, Prädiabetes, Karies.
Dosierung:

100-10 000 SIE ein oder mehrmals täglich vor und/oder während und/oder nach den Mahlzeiten p. os.
Zubereitungsformen:

Tablette, Dragee, Kapsel, Lösung, Suspension, Granulat, Kaugummi, Zahnpasta und als Zusatz zu saccharosehaltigen Lebens- und/oder Genußmitteln.

Amylasetest

Eine Amylase-lnhibitor-Einheit (1 AlE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Amylaseeinheiten zu 50% inhibieren. Eine Amylaseeinheit (AE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 μ Äquivalent glucosidischer Bindungen in der Stärke spaltet. Die <u.Val gespalteten Bindungen werden als μΥ&\ gebildeter reduzierender Zucker mit Dinitrosalicylsäure kolorimetrisch bestimmt und mit Hilfe einer Maltoseeichkurve als μ VaI Maltoseäquivalente angegeben. Zur Durchführung des Testes werden 0,1 ml Amylaselösung (20—22 AE/ml) mit 0~10 μg Inhibitor oder 0-20 μg der zu testenden Lösung in 0,4 ml 0,02 m Natriumglycerophosphatpuffer/0,001 m CaCl₂ pH 6,9 versetzt und etwa 10-20 Minuten in einem Wasserbad von 35° C äquilibriert Dann wird 5 Minuten mit 0,5 ml einer auf 35⁰C vorgewärmten 1% Stärkelösung (Stärke, löslich, der Firma Merck, Darmstadt, Nr. 1252) bei 35° C inkubiert und anschließend mit 1 ml Dinitrosalicylsäure-Reagens (nach P. Bernfeld in Colowick-Kaplan, Meth. Enzymol., Band 1, Seite 149) versetzt. Zur Farbentwicklung wird der Ansatz 5 Minuten auf dem siedenden Wasserbad erhitzt, dann abgekühlt und mit 10 ml destilliertem Wasser versetzt. Die Extinktion bei 540 nm wird gegen einen entsprechend angesetzten Leerwert ohne Amylase gemessen. Zur Auswertung wird aus einer vorher aufgenommenen Amylaseeichkurve die nach Inhibitorzusatz noch wirksame Amylaseaktivität abgelesen und daraus die prozentuale Hemmung der eingesetzten Amylase errechnet. Die prozentuale Hemmung wird als Funktion des Quotienten

μg Inhibitor ⁺

Saccharasetest

Eine Saccharase-lnhibitor-Einheit (SIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Saccharaseeinheiten zu 50% inhibieren. Eine Saccharaseeinheit (SE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 /Mol Saccharose in Glucose und Fructose spaltet. Die μΜοΙ gebildete Glucose wird mit Hilfe der Glucoseoxidasereaktion quantitativ bestimmt unter Bedingungen, bei denen eine weitere Saccharosespaltung durch die Saccharase nicht mehr stattfindet. Zur Durchführung des Testes werden 0,05 ml einer auf 0,12 SE eingestellten Saccharaselösung¹) mit 0-20 μg Inhibitor oder 0-20 μΐ der zu

testenden Lösung versetzt und mit 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 auf 0,1 ml aufgefüllt. Es wird 10 Minuten bei 35⁰C äquilibriert und dann mit 0,1 ml einer auf 35° C vorgewärmten 0,05 m Saccharoselösung in 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 versetzt. Man inkubiert 20 Minuten bei 35°C und stoppt die Saccharasereaktion durch Zugabe von 1 ml Glucoseoxidasereagens²) ab und inkubiert weitere 30 Minuten bei 35⁰C. Danach wird 1 ml 50% H₂SO₄ zugesetzt und bei 545 nm gegen einen entsprechenden Leerwert gemessen. Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten Saccharase berechnet und aus dem 50% Hemmpunkt mit Hilfe einer Glucoseeichkurve auf SI E/g bzw. Sin/Liter umgerechnet.

1) Solub'lisierte Saccharase aus Schweinedünndarmmucosa nach B. Borgström, A. Dahlquist, Acta Chem. Scand. 12 (1958), Seite 1997. Mit 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6 auf entsprechenden SE-Gehalt verdünnt.

2) Das Glucoseoxidasereagens wird durch Lösen von 2 mg Glucoseoxidase in 100 ml 0,565 m Tris- HCl- Puffer pH 7 und anschließenden Zusatz von 1 ml Detergenslösung (2 g Triton 100+ 8g 95% Äthanol p.a.), 1 ml Dianisidinlösung (260mg o-Dianisidin 2 HCl in 20 ml H2O) und 0,5 ml O,l°/oiger wäßriger Peroxidaselösung hergestellt.

Beispiel 1

Beimpft man 1-Liter-Erlenmeyerkolben mit 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 3,5% Glucose, 0,5% Caseinhydrolysat, 1,3% Hefe-Extrakt, 0,3% CaCO₃, 0,3% K₂HPO₄, pH vor der Sterilisation mit KOH auf 7,8 eingestellt und 30 Minuten bei 121°C sterilisiert, mit 4 ml einer 3 Tage alten Vorkultur des Stammes CBS 961.70 in einer Nährlösung der Zusammensetzung 3% Glycerin, 3% Sojamehl, 0,2% CaCO₃, gewonnen durch Inkubation auf einer Rund-Schüttelmaschine bis 28⁰C, bebrütet bei 24° C, so erhält man eine Kulturbrühe, die nach 3tägiger Inkubation 9,1 SIE/ml und 240 AIE/ml und nach 4tägiger Inkubation 10,4 SIE/ml und 675 AIE/ml enthält.

Beispiel 2

Gibt man einer Nährlösung nach Beispiel 1 Maltose in verschiedenen Konzentrationen zu, beimpft und inkubiert nach Beispiel 1, so erhält man folgende Ausbeuten an SIE/ml und AIE/ml:

⁺ bezogen auf Trockensubstanz.
^{+ +} AE im nicht inhibierten Ansatz der deichen
Serie. "

aufgetragen, der 50% Hemmungspunkt aus der Kurve ahtrelesen und auf AIE/mg Inhibitor umgerechnet.

Maltose- Nach 3 Tagen
konzentration AIE/ml SIE/ml

Nach S Tagen
AIE/ml SIE/ml

0	363	11,2	444	8,8
0,5	479	12,7	614	11,3

Fortsetzung

Mullosc-	Nach 3	Tngcn	Nach 5	Tilgen
konzen-
tralion %	AIE/ml	SIE/ml	AlI-VmI	SIl-ZmI
1,0	383	13,6	688	12,5
1,3	337	15,7	725	12,7
1,8	274	16,6	678	1-4,4
2,2	287	16,8	600	15,5

Beispiel 5

Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet.
Ausbeute: 1,4 g mit 6000 SlE/g=70

bezogen auf Aktivität.

trocknet.

lE/g=70% Ausbeute,

Beispiel 3

Beimpft und bebrütet man eine Nährlösung nach Beispiel 1, die zusätzlich 1,3% Maltose enthält, so erhält man eine Kulturbrühe, die nach 2tägiger Fermentation 14,4 SIE/ml und 81 AIE/ml und nach 4tägiger Fermentation 14,5 SIE/ml und 580 AIE/ml enthält.

Beispiel 4

Beimpft man 1-Liter-Erlenmeyerkolben, die 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 3% Glucose, 1% Maltose, 0,5% Caseinhydrolysat, 1,3% Hefe-Extrakt, 0,3% CaCO₃, 0,3% K₂HPO₄, pH vor der Sterilisation mit Na₂CO₃ auf 7,2 eingestellt und 30 Minuten bei 121°C sterilisiert, mit 4 ml einer 3 Tage alten Vorkultur des Stammes CBS 961.70 in einer Nährlösung der Zusammensetzung 3% Glycerin, 3% Sojamehl, 0,2% CaCO₃, gewonnen durch Inkubation auf einer Rundschüttelmaschine bis 28° C, bebrütet bei 24°C, so erhält man eine Kulturbrühe, die nach 4tägiger Inkubation 22 SIE/ml und 500 AIE/ml enthält.

35

500 ml einer nach Beispiel 4 fermentierten braunen Kulturlösung mit 22 000 SIE/Liter wurde mit halbkonz. HNO₃ auf pH 2,5 eingestellt und mit 5 g Aktivkohle versetzt und 10 Minuten gerührt. Man zentrifugierte 15 Minuten bei 10 000 UpM und neutralisierte den klaren gelben Überstand mit Ammoniak. Danach wurde am Rotationsverdampfer bei 20 Torr auf 50 ml einrotiert und diese konzentrierte Lösung mit 50 ml Aceton zur Ausfällung inaktiver Anteile versetzt. Das klare Filtrat wurde in 400 ml Aceton unter Rühren eingetropft und der ausfallende Niederschlag auf einer Nutsche gesammelt, mit Aceton und Äther gewaschen und im

Tabelle 1 zu Beispiel
(Aktivitätsausbeuten der Aufarbeitung)

Beispiel 6

500 ml einer nach Beispiel 4 fermentierten Kulturlösung mit 22 000 SIE/Liter wurden nach Beispiel 5 aufgearbeitet, jedoch nicht mit Aceton, sondern mit Äthanol gefällt.

Ausbeute: 0,6 g mit 7000 SIE/g==:38% Ausbeute, bezogen auf Aktivität.

Beispiel 7

1 Liter einer analog Beispiel 4 fermentierten dunkelbraunen Kulturlösung (21 000 SIE/Liter) wurde mit halbkonz. Salpetersäure auf pH 2,5 eingestellt, mit 10 g Aktivkohle und 10 g des Filterhilfsmittels Clarcell versetzt und 10 Minuten gerührt. Man saugte über eine mit einer 1 - 2 cm hohen Clarcellschicht versehene Nutsche ab und neutralisierte das Filtrat mit Ammoniak. Der Filterkuchen wurde verworfen. Zum neutralen Filtrat (19 000 SIE/Liter) wurde 1,5% Aktivkohle zugesetzt und 10 Minuten gerührt, danach erneut abgenutscht. Das Filtrat enthielt noch ca. 10% der Aktivität und wurde verworfen. (Soll diese Restaktivität mitgenommen werden, so adsorbiert man nochmals mit 0,5% Aktivkohle und vereint die Kohlerückstände.) Der die Saccharaseaktivität enthaltende Kohlerückstand wurde mit wenig Wasser gewaschen und anschließend 3mal mit je 50 ml 50%igem Aceton pH 2,5 (HCl) zur Desorption der Aktivität 10 Minuten gerührt. Danach wurde jedesmal abgenutscht und die drei Desorbate vereinigt. Man engte im Rotationsverdampfer auf 10 ml ein und versetzte das zähflüssige Konzentrat mit dem gleichen Volumen (10 ml) Methanol unter Rühren. Der ausgefallene Niederschlag wurde abzentrifugiert. Die klare, gelbbraune, 50% methanolische Lösung wurde dann in 250 ml (= 12,5 Vol.) absolutes Aceton unter Rühren eingetropft. Der ausfallende Niederschlag setzte sich gut ab, er wurde nach dem Abdekantieren des tiefgelben Überstandes mit absolutem Aceton aufgenommen und gewaschen. Es wurde abgenutscht und noch je einmal mit absolutem Aceton und Äther nachgewaschen. Anschließend wurde im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet

Ausbeute: 850 mg mit 12 500 SIE/g=51% Ausbeute (bezogen auf Einheiten in der Kulturbrühe).

Aufarbeitungsschritt	Volumen	SIE/L	AIE/L	x 10³	SIE	SIE-Ausbeute	81	72
				42		(%)		63
1) Originallösung	1000 ml	21 000	0,5 X 10'	48	21 000	100
2) nach 1. Aktivkohle-	1000 ml	19 000	0,4 X 10'		19 000	90
Adsorp. (pH 2,5)
3) nach 2. Aktiv-kohle-	1000 ml	2 000			2000	(verworfen:
Adsorp. (pH 7,0)				75		10%)
4) 1. Desorbat	45 ml	260000	3,5 X 10'	46	11 500	55
5) 2. Desorbat	45 ml	92 000	2 X 10'	40	100	19,5
6) 3. Desorbat	45 ml	30 000	0,75 X 10'	68	350	6,5
7) Einrotiert auf 10 ml	10 ml	1 500000	22 X IG⁶	61	15000
8) 50% Methanolfällung	18 ml	730000	12 X 10'		13200
(filtriert)

Fortsetzung

Aufarbeitungsschritt

Volumen SIE/L

AIE/L

X 10³

SIE

SIE-Ausbeutc

9) Überstand der
Acetonfällung

10) Niederschlag

260 ml 8 400

0,85 g 12 500/g . 0,22 X

56

2 200	(verworfen:
	10%)
10 600	51

Versuch

Versuchsanordnungen zum Wirkungsnachweis von Saccharase-Inhibitoren an Ratten.

Zur Erzeugung einer alimentären Hyperglykämie und Hyperinsulinämie erhalten nüchterne Ratten (n=6) 2,5 g/kg Saccharose p.os. 6 andere Ratten erhalten zusätzlich zur Saccharose den Saccharase-Inhibitor, hergestellt analog Beispiel 5, in der angegebenen Dosierung. Die Blutglucose und das Seruminsulin werden in den angegebenen Zeitintervallen nach Saccharoseapplikation untersucht. Die Blutproben werden aus dem retroorbitalen Venenplexus gewonnen. Blutglucose wird im Auto-Analyzer (Hoffman: J. biol. Chem. 120, 51 [1937]), Seruminsulin nach der Methode von Haies und Rändle: Biochem. J. 88, 137 (1963) bestimmt.

Tabelle 1 zum Versuch

Durchschnittliche Blutglucosewerte in mg/100ml ± Is von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach

oraler Gabe von Saccharose ± Wirkstoff analog Beispiel

Dosis/kg p. os

10

20

30

120 Min.

66	±	5,0	71	±	3,3
117	±	20	103	±	3,0
92	JH-	3,4	95	±	12

Kontrolle ohne Saccharose 67 ± 7,1 72 ± 4,6 68 ± 5,3

Kontrolle mit Saccharose 134 ± 15 140 ± 16 126 ± 12

100 SIE in Saccharose 96 ± 4,4 93 ± 6,2 92 ± 5,6

rs =: = s = — ==3=: = s== sa = :sr = = =s

P < 0,05 = = = = = = p < 0,001 gegen Kontrolle mit Saccharose.

Tabelle 2 zum Versuch

Durchschnittliche Seruminsulinwerte in μΕ/ml ± Is von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach oraler

Gabe von Saccharose ± Wirkstoff analog Beispiel 5.

Dosis/kg p. os

10

20

30

120 Min.

Kontrolle ohne Saccharose
Kontrolle mit Saccharose
100 SIE in Saccharose
P<0,05

8,8± 1,8 9,8± 1,4 10,8 ± 2,3 10,7 ± 4,6 8,1 ±0,7

22,2 ±11 35,3 ±14 19,3 ± 5,0 16,7 ±5,3 8,1 ± 1,1

9,9 ± 4,3 11,1 ± 3,5 7,6 ±1,7 14,8 ± 3,8 10,2 ± 2,8 P < 0,01 »===»= ρ < 0,001 Bogen Kontrolle mit Suechurosc

TOO 634/31

Claims

Patentansprüche:

1. Verwendung des Actinoplanaceen-Stammes CBS 961.70 sowie seiner Mutanten zur Herstellung von Saccharase-Inhibitoren.

2. Verfahren zur Herstellung von Saccharase-Inhibitoren, dadurch gekennzeichnet, daß man den Actinoplanaceen-Stamm CBS 961.70 oder seine Mutanten in einem stärkefreien Nährmedium kultiviert und aus dem Nährmedium die Inhibitoren nach an sich bekannten Methoden gewinnt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium Maltose zusetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultur kurz vor oder beim Erreichen eines optimalen Gehaltes an Saccharase-Inhibitor abbricht.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mutante den Stamm CBS 614.71 einsetzt.