PL92401B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania inhibitora sacharazy.Opis patentowy RFN DOS nr 2064092 i opis patentowy Wielkiej Brytanii nr 1374751 oparte sa na stwierdzeniu, ze szereg Actinomycetes wytwarza inhibitory hydrolaz glikozydów, a zwlaszcza inhibitory hydrolaz glikozydów, korzystnie enzymów przewodu pokarmowego, rozszczepiajacych weglowodany. Grupa tych inhibitorów jest wzglednie odporna na wyzsza temperature. Naleza one pod wzgledem chemicznym do klasy oligo- lub polisacharydów, lub ich pochodnych. W wymienionych opisach patentowych, np. w przykladach XXVIII—XXXVIII opisany jest sposób uzyskiwania takiego inhibitora amylazy ze szczepu SE 50 Actinoplana- oeae, nalezacego do rzedu Actinomycetales.Ciecze pofermentacyjne szczepu SE 50 maja równiez czesto nieznaczne dzialanie, hamujace sacharaze.Wydzielanie i otrzymywanie w stanie czystym utworzonego inhibitora sacharazy jest bardzo trudne ze wzgledu na zawartosc znacznych ilosci inhibitora amylazy w cieczy pofermentacyjnej.Szczep SE 50 jest zlozony w Centraalbureau voor Schimmelcultures w Baarn w Holandii pod numerem CBS 961.70, a jego mutanty — szczep SE 50/110 i szczep SE 50/13 sa zlozone odpowiednio pod numerami: CBS 674.73 i CBS 614.71.Przedmiotem wynalazku jest sposób, polegajacy na zahamowaniu procesu tworzenia sie inhibitora amylazy i jednoczesnie przyspieszeniu tworzenia sie inhibitora sacharazy. * Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze szczepy SE 50 = CBS 961.70, SE 50/110 = CBS 674.75 lub szczep SE 50/13 = CBS 614.71, w pozywce, zawierajacej wegiel i azot, jak równiez solejnineralne oraz która nie zawiera skrobi;, a zawiera maltoze, poddaje sie fermentacji przy pH = 5,0—8,5 i w temperaturze 15—60°C, a nastepnie z roztworu kulturowego i ewentualnie grzybni izoluje sie inhibitor sacharazy znana metoda, korzystnie przez liofilizacje, wytracanie za pomoca rozpuszczalników i/lub metoda adsorbcyjno-desorpcyjna, po czym ewentualnie oczyszcza.2 92 401 Charakterystyka szczepu SE 50: Actinoplanes SE 50 wyizolowano dnia 22.12.1969, metoda polska; pochodzenie—Kenia, przy Ruiru pole kawowe pH = 6,2. 0,4-1,3/x nieregularna, pofaldowana, pomarszczona 4-13/i ± kulista ca 1// zwiniete lancuszki, ulozone równolegle Grzybnia Postac zaródni Wielkosc zarodni Postac zarodników Wielkosc zarodników Ulozenie zarodników w zarodni Melanina Redukcja azotanu Mleko — peptonizacja Skrobia — hydroliza Wzrost w temperaturze: °C 26°C 32°C 37°C 42°C Kazamina—Pepton Agar-Czapka (CPC) Pepton—Agar Czopka (PC) Agar—Czapka (Cz) Mleko—Agar (Ca) Tyrozyna—Agar (Ty) :} CPC Ty + + ++ ++ + + + + W bardzo dobry SM brazowe SP Agar ciemno-brazowy Spg- W bardzo dobry SM brazowe SP ciemno-brazowy W bardzo dobry SM czerwono-brazowe SP zlotawo-brazowy W dobry SM pomaranczowo-brazowe SP ciemnobrazowy kazeina peptonizuje W sredni SM ciemne, jak Agar SP czarnobrazowy Tyrozyna—krystaliczna nie rozpuszcza sie Platki drozdzowe—drozdze -Agar (HaH) „Emerson" Agar E (Drozdze—skrobia—Agar) Spg + W dobry SM brazowe SP brazowy Spg- Skrobia—Agar W sredni do dobrego i SM blado-brazowo-pomaranczowe Skrobia hydroliza + Spg + W = wzrost, SM = podloze grzybni, Spg = zarodnia, SP = barwnik podloza.Szczep SE 50/13 rózni sie tym do szczepu macierzystego, ze troche slabiej zarodnikuje. Natomiast szczep SE 50/110 w porównaniu do szczepu macierzystego SE 50 wykazuje troche bardziej zdecydowane zarodnikowa¬ nie. Ogólnie jednak szczepy SE 50/13 i SE 50/110 nie wykazuja zadnych zasadniczych róznic w porównaniu do macierzystego szczepu SE 50.92 401 3 Stosowane optymalne pozywki zaweraja np. 3,5% glikozy, 0,5% hydrolizatu kazeiny, 1,3% wyciagu drozdzowego, 0,3% K2HP04,/3,3% CaC03; a wartosci pH pozywki po sterylizacji, ustalona za pomoca NaOH, wynosi 7,8.Pozywki takie po kilkudniowej fermentacji szczepu SE 50 Actinoplanacese daja ciecze pofermentacyjne o zawartosci ponad 10 SI E/ml. Przy zawartosci 300—700 SI E/ml (jednostka ihibitora amylazy) otrzymuje sie stosunek SI E/Al E 15X10"3-3X10"3 (f = SIE/AIEX103).Produkcje inhibitora sacharazy mozna zwiekszyc, dodajac do pozywki maltozy. Na przyklad wprowa¬ dzajac do wymienionej pozywki 1,5% maltozy otrzymuje sie ciecze pofermentacyjne o zawartosci np. 16—18, a nawet do 24 SI E/ml.Dla stosunku SI E/Al E decydujacym czynnikiem jest czas fermentacji. Przerywajac fermentacje na krótko przed lub w chwili osiagniecia maksymalnej zawartosci SIE, co nastepuje juz po 1,5—2 dniowej fermentacji, otrzymuje sie wartosci f, siegajace 180.Wydzielanie inhibitora sacharazy z odpowiednio przefermentowanych pozywek przeprowadza sie albo przez zatezenie cieczy pofermentacyjnej pod zmniejszonym cisnieniem do 1/10—1/20 poczatkowej objetosci i nastepnie liofilizowanie, albo przez stracenie stezonych roztworów 4—10 czesciami objetosciowymi rozpusz¬ czalnika organicznego takiego, jak alkohole lub ketony, korzystnie 5—9 czesciami objetosciowymi acetonu albo bardzo prosto przez adsorpcje inhibitora z obojetnych cieczy pofermentacyjnych 0,5—4%, korzystnie 1—2%, wegla aktywnego i nastepnie desorpcje wodnymi roztworami alkoholi lub acetonem, zwlaszcza przy kwasnych wartosciach pH korzystnie 50% acetonem przy wartosci pH = 2—3. Desorbat zateza sie nastepnie pod zmniejszonym cisnieniem do 1/50—1/200, korzystnie 1/100 pojemnosci wyjsciowej (cieczy pofermentacyjnej), po czym straca sie rozpuszczalnikami organicznymi, korzystnie acetonem. Przewaznie dla uzyskania czystszego preparatu stosuje sie adsorpcje wstepna brazowych barwników, zanieczyszczajacych ciecz pofermentacyjna, na 1—2% wegla aktywnego przy kwasnych wartosciach pH (wartosci pH = 1—4, korzystnie 2—3), przy których niespodziewanie nie zachodzi wyrazna adsorpcja substancji czynnej.Wiadomo, ze u zwierzat i ludzi po podaniu pozywienia lub uzywek, zawierajacych sacharoze, wystepuje hiperglikemia, wywolana szybkim rozszczepieniem sacharozy sacharazami przewodu pokarmowego wedlug schematu: Sacharoza sacharaza glikoza + fruktoza.Hiperglikemie te wystepuja szczególnie silnie i utrzymuja sie przez dluzszy czas szczególnie u cukrzyków.U osób otylych pokarmowa hiperglikemia wywoluje szczególnie silne wydzielanie insuliny,co z kolei prowadzi do zwiekszonej syntezy tluszczów i zmniejszonej ich odbudowy.Otrzymane sposobem wedlug wynalazku inhibitory sacharozy zmniejszaja znacznie pokarmowa hipergli¬ kemie i hiperinsulinemie u szczurów, którym poddano sacharoze.Ponadto wiadomo, ze próchnica wystepuje szczególnie silnie i czesto przy podawaniu pozywienia i uzywek, zawierajacych sacharoze (B.W. Gold: Advances in Applied Microbiology 11 /1969/ 135—157). Zahamowanie rozszczepienia sacharozy inhibitorami, otrzymywanymi sposobem wedlug wynalazku, zmniejsza wytwarzanie sie substancji, powodujacych próchnice.Inhibitory te stosuje sie dlatego jako srodki lecznicze o nastepujacych wskazaniach: Adipositas, Hyperlipae- mia (Atherosclerosis), Diabetes, Prepiabetes, Caries.Dawkowanie 100—10000 SIE jeden lub kilka razy dziennie przed i/lub podczas, i/lub po posilkach per os.Preparaty podaje sie w postaci tabletek, drazetek, kapsulek, roztworów, zawiesin, granulatów, gumy do zucia, pasty do zebów i jako dodatek do srodków zywnosciowych i/lub uzywek zawierajacych sacharoze.Test amylazy. Jednostka inhibitora amylazy (1 AIE) jest ilosc inhibitora, która hamuje aktywnosc dwóch jednostek amylazy o 50%. Jednostka amylazy (AE) jest ilosc enzymu, która wciagu 1 minuty w podanych warunkach doswiadczenia rozszczepia ly równowaznik wiazan glikozydowych w,skrobi, przy czym Ijuwal rozszczepionych wiazan oznacza sie kolorymetrycznie kwasem dwunitrosalicylowym jako 1/iwal redukujacych cukrów i za pomoca krzywej wzorcowej maltozy podaje sie jako /xwal matozy. Dla przeprowadzenia testu 0,1 ml roztworu amylazy (20—22 AE/ml) traktuje sie 0—10jug inhibitora lub 0—20/xg testowanego roztworu w 0,4 ml 0,02 m buforu: glicerofosforan sodu (0,001 m CaCI2 o wartosci pH = 6,9 i utrzymuje sie na lazni wodnej w temperaturze 35°C przez okres 10—20 minut. Nastepnie przez 5 minut utrzymuje sie z 0,5 ml 1% roztworu skrobi, ogrzanego wstepnie do temperatury 35°C (skrobia, rozpuszczalna, Firmy Merck, Darmstadt Nr 1252) i nastepnie traktuje sie 1 ml reagentu dwunitrosalicylowego (P.Bernfeld w Colowick—Kaplan, Meth. Enzymol, tom 1, strona 149).Dla wywolania zabarwienia wsad ogrzewa sie przez 5 minut na wrzacej lazni wodnej, nastepnie chlodzi sie i traktuje 10 ml wody destylowanej. Ekstrynkcje przy 540 nm mierzy sie w stosunku do odpowiednio zalozonej wartosci slepej bez amylazy.4 92 401 Przy obliczaniu odczytuje sie z uprzednio sporzadzonej krzywej wzorcowej amylazy jeszcze istniejaca aktywnosc amylazy po dodaniu inhibitora i z tego oblicza sie hamowanie procentowe aktywnosci wprowadzonej amylazy. Procentowe hamowanie aktywnosci nanosi sie jako funkcje ilorazu: /ig inhibitora* AE** w którym * podaje sie w stosunku do substancji suchej i ** we wsadzie tej samej serii bez inhibitora, odczytujac sie z krzywej punkt, w którym nastepuje hamowanie aktywnosci w 50% i przelicza sie na zawartosc inhibitora w Al E/mg.Test sacharazy. Jednostka inhibitora sacharazy (SIE) jest ilosc inhibitora, która hamuje o 50% aktywnosc dwóch jednostek sacharazy. Jednostka sacharazy (SE) jest ilosc enzymu, która w jednej minucie w podanych warunkach testowych rozszczepia 1 mol sacharozy na glikoze i fruktoze, przy czym 1 mol utworzonej sacharozy oznacza sie ilosciowo za pomoca oksydazy glikozy w warunkach, w których nie nastepuje dalsze rozszczepienie sacharozy. Przy przeprowadzaniu testu 0,05 ml roztworu sacharpzy1 / o zawartosci 0,12 SE traktuje sie 0—20/xg inhibitora lub 0—20/21 do 0,1 ml maleinianu sodu jako buforu ó wartosci pH = 6,0. Utrzymuje sie przez 10 minut w temperaturze 35°C i nastepnie traktuje sie 0,1 ml ogrzanego wstepnie do temperatury 35°C 0,05 m roztworu sacharozy w 0,1 m maleinianie sodowym jako buforze o wartosci pH = 6,0. Utrzymuje sie przez 20 minut w temperaturze 35°C, po czym zatrzymuje sie reakcje sacharazy przez dodanie 1 ml preparatu oksydazy glikozy2) i utrzymuje sie jeszcze przez 30 minut w temperaturze 35°C. Nastepnie dodaje sie 1 ml 50% H2S04 i mierzy sie przy 545 nm w stosunku do odpowiedniej wartosci slepej próby. Przy obliczeniu oblicza sie procentowe hamowanie aktywnosci wprowadzonej sacharazy i z punktu 50% hamowania przelicza sie na SI E/g wzglednie SI E/litr za pomoca krzywej wzorcowej glikozy. 1) Solubilizowana sacharaza z mukozy cienkiego jelita swin wedlug: Borgstrom; A.Dalhlquist, Acta Chem.Scand. 12, 1958 (strona 1997), rozcienczona do odpowiedniej zawartosci SE 0,1 m maleinianem sodu jako buforem o wartosci pH = 6. 2) Preparat oksydazy glikozy otrzymuje sie przez rozpuszczenie 2 mg oksydazy glikozy (Fe.Boehringer Nr 15423 EGAB) w 100 ml 0,565 m buforem tris-HCI o pH = 7 i nastepnie dodanie roztworu detergentu (2 g Tritonu 100+ 8g 95% etanolu p.a), 1 ml roztworu dianizydyny (260 mg Ordianizydyny2HCI w 20 ml H20) j 0,5 ml 0,1% wodnego roztworu peroksydazy (Fa.Boehringer Nr 15302 EPAP).Próby doswiadczalne, stwierdzajace dzialanie inhibitorów sacharazy u szczurów.Dla wywolania pokarmowej hiperglikemii i hiperinsulinemii podaje sie szczurom na czczo (n = 6) 2,5 g/kg sacharozy per os, a innym 6 szczurom podaje sie oprócz sacharozy inhibitor sacharazy w podanej dawce, otrzymany wedlug przykladu V.Po podanych odstepach czasu po podaniu sacharazy bada sie zawartosc glikozy we krwi i insuliny w serum.Próby krwi pobiera sie z retroorbitalnego splotu zyInego. Glikoze oznacza sie za pomoca Auto-Analizera (TechnoconR; Hoffmann; l.biol. Chem. 120, 51 (1937), insuline w serum metoda Halesa i Randle: Biochem.J. 88, 237 (1963).Wyniki podano w tablicy II i III.Przyklad I. W 1 litrowej kolbie Erlenmayera umieszcza sie 120 m I pozywki, zawierajacej 3,5% glikozy, 0,5% hydrolizatu kazeiny, 1,3% wyciagu drozdzowego, 0,3% CaC03, 0,3% K2 HP04, doprowadzonej przed sterylizacja do wartosci pH = 7,8 za pomoca KOH i sterylizuje sie przez 30 minut w temperaturze 121°C, zaszczepia sie 4 ml 3 dniowej kultury posiewowej szczepu SE 50 w pozywce, zawierajacej 3% gliceryny, 3% maki sojowej, 0,2% CaC03, prowadzonej w temperaturze 28°C na wytrzasarce i fermentuje sie w temperaturze 24°C, przy czym po 3 dniowej fermentacji otrzymuje sie ciecz pofermentacyjna, zawierajaca 9,1 SIE/ml i 240 AlE/ml, a po 4 dniowwej fermentacji zawierajaca 10,4 SIE/ml i 675 AlE/ml.P r z y k l,a d II. Do pozywki wedlug przykladu I dodaje sie maltozy w róznych stezeniach, zaszczepia . sie i fermentuje wedlug przykladu I.Otrzymuje sie wydajnosci SIE/MI i AlE/ml, podane w tablicy IV.Przyklad III. Zaszczepia sie i fermentuje pozywke wedlug przykladu I, zawierajaca dodatkowo 1,3% maltozy. Otrzymuje sie po 2 dniowej fermentacji ciecz pofermentacyjna, zawierajaca 14,4 SIE/ml i AlE/ml, a po 4dniowej fermentacji 14,5 SIE/ml i 580 AlE/ml.Przyklad IV. W 1 litrowej kolbie Erlenmayera umieszcza sie 120 ml pozywki, zawierajacej 3% glikozy, 1% maltozy, 0,5% hydralizatu kazeiny, 1,3% wyciagu drozdzowego, 0,3% CaC03, 0,3% K2HP04, doprowadza sie do wartosci pH = 7,2 za pomoca Na2C03 i sterylizuje sie przez 30 minut w temperaturze 121°C, nastepnie zaszczepia sie 3 dniowa kultura posiewowa w ilosci 4 ml, otrzymana przez fermentacje szczepu SE 5092401 5 na wytrzasarce w temperaturze do 28°C, w pozywce, zawierajacej 3% gliceryny, 3% maki sojowej, 0,2% CaC03, po czym prowadzi sie fermentacje w temperaturze 24°C i otrzymuje sie po 4 dniach ciecz pofermentacyjna, zawierajaca 22 SI E/ml i 500 Al E/ml.Przyklad V. Pobiera sie 500 ml brazowej cieczy pofermentacyjnej szczepu SE 50 o zawartosci 22000 SI E/litr, otrzymanej wedlug przykladu IV i doprowadza sie do wartosci pH = 2,5 za pomoca pólstezonego HN03, traktuje sie 5 g wegla aktywnego (Fa.Merck) i miesza sie przez 10 minut. Odwirowuje sie przez 15 minut przy 10000 obrotów/minute i neutralizuje sie klarowny zólty przesacz. Nastepnie zateza 'sie w wyparce rotacyjnej pod cisnieniem 20 torów do 50 ml i otrzymany stezony roztwór traktuje sie 50 ml acetonu, w celu wytracenia nieaktywnych skladników. Klarowny przesacz wkrapla sie, mieszajac, do 400 ml acetonu i wytracony osad zbiera sie na nuczy, przemywa acetoneem i eterem, i suszy pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze pokojowej.Wydajnosc: 1,4 g 6000 SI E/g = 70% wydajnosci teoretycznej w odniesieniu do aktywnosci.Przyklad VI. Przerabia sie wedlug przykladu V 500 ml cieczy pofermentacyjnej szczepu SE 50 o 22000 SI E/litr, otrzymanej wedlug przykladu IV, przy czym nie straca sie acetonem, lecz alkoholem.Wydajnosc: 0,6 g 7000 SIE/g = 38% wydajnosci w odniesieniu do aktywnosci.Przyklad VII. Pobiera sie 1 litr fermentowanej wedlug przykladu IV ciemnobrazowej cieczy pofer¬ mentacyjnej (21000 SI E/litr), doprowadza sie do wartosci pH = 3,5 pólstezonym kwasem azotowym, traktuje sie 10 g wegla aktywnego (Fa.Merck) i 10 g pomocniczego srodka filtracyjnego Clarcell i 10 minut miesza sie, potem saczy sie przez nucze, zaopatrzona w warstwe Clarcell o wysokosci 1—2 cm i przesacz zobojetnia sie amoniakiem. Placek filtracyjny odrzuca sie. Do obojetnego przesaczu (19000 SIE/litr) dodaje sie 1,5% wegla aktywnego i miesza sie 10 minut, po czym ponownie saczy sie. Przesacz, awierajacy jeszcze okolo 10% aktywnosci, odrzuca sie. Dla odzyskania tych resztek aktywnosci adsorbuje sie ponownie 0,5% wegla aktywnego i laczy sie osady weglowe. Osad weglowy, zawierajacy sacharaze, przemywa sie mala iloscia wody i nastepnie dla desorpcji skladnika czynnego przemywa sie 3 razy po 50 ml 50% acetonu o wartosci pH = 2,5 (HCI) i miesza siie przez 10 minut. Kazdorazowo sie saczy i laczy sie trzy desorbaty. Zateza sie w wyparce rotacyjnej do 10 ml i gesty koncentrat traktuje sie, mieszajac, równa objetoscia (10 ml) metanolu. Wytracony osad odwirowuje sie, nastepnie klarowny, jasnobrazowy 50% roztwór metanolowy wkrapla sie, mieszajac, do 250 ml (=12,5 objetosci) absolutnego acetonu. Wytracony osad osadza sie dobrze i po zdekantowaniu ciemnozóltej cieczy znad osadu rozpuszcza sie go w absolutnym acetonie i przemywa. Odsacza sie i przemywa jeden raz absolutnym acetonem i eterem. Nastepnie suszy sie pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze pokojowej.Wydajnosc: 850 mg o zawartosci 12500 SIE/g = 51% wydajnosci w stosunku do jednostek aktywnosci w cieczy pofermentacyjnej.Wyniki podano w tablicy I.Przyklad VIII. W 1 litrowych kolbach umieszcza sie po 120 ml pozywki, zawierajacej 1,3% maltozy. 3,5% glukozy, 0,5% hydrolizatu kazieiny, 1,3% wyciagu drozdzowego, 0,3% CaC03, 0,3% K2 P04 i zaszczepia sie kazda 2 ml kultury posiewowej w pozywce, zawierajacej 3% maki sojowej, 3% gliceryny, 0,2% CaC03. Po 4 dniowym rozmnazaniu na wytrzasarce w temperaturze 24°C z róznymi szczepami otrzymujee sie nastepujace wydajnosci: Szczep SIE/ml SE50 25 SE 50/13 = OBS614.71 14,8 SE 50/110 = CBS674.73 57,9 PL PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób otrzymywania inhibitora sacharazy, znamienny tym, ze szczep Actinoplanaceae CBS 961.70, CBS 674.73 albo CBS 614.71 w pozywce, zawierajacej wegiel i azot, jak równiez sole mineralne oraz która zamiast skrobi zawiera maltoze, poddaje sie fermentacji przy pH = 5,0—8,5 i w temperaturze 15—60°C, a nastepnie z roztworu kulturowego i ewentualnie grzybni izoluje sie inhibitor sacharazy znana metoda, korzystnie przez liofilizacje, wytracenie za pomoca rozpuszczalników i/lub metoda adsorpcyjno-desorpcyjna, po czym ewentualnie oczyszcza.92 401 Tablica I Wydajnosci aktywnosci w procesie przeróbki Lp, Operacje przeróbki 1 Roztwór poczatkujacy 2 Po pierwszej adsorpcji na weglu (pH = 2,5) 3 Po drugiej adsorpcji na weglu aktywnym (pH = 7,0) 4 1 Desorbat 5 1 Desorbat 6 3 Desorbat 7 Zatezeniedo 10 ml 8 Wytracenie 50% metanolem (saczenie) 9 Przesacz po wytraceniu acetonwm 10 Osad Objetosc (ml) 1000 1000 1000 45 45 45 10 18 260 0,85 g SI E/litr 21000 19000 2000 260000 92000 30000 1500000 730000 8400 12590/g AIE/litr 0,5X106 0,4X106 3,5X106 2X106 0,75X106 22X106 12X106 0,22X106 T AIE X103 42 48 75 46 40 68 61 56 SIE 21000 19000 2000 11500 4100 1350 15000 13200 2200 10600 SIE wydajnosc % 100 90 odrzuca sie 10% 55 19,5 81 65 72 63 odrzuca sie 10% 51 Tablica II Srednie stezenie glikozy we krwi w mg/100 ml±1 u szczurów na czczo w róznych odstepach czasu po podaniu per os sacharozy±substancje czynne Dawka/kg per os 10 minut 20 minut 30 minut 60 minut 120 minut Próba kontrolna bez sacharozy Próba kontrolna z sacharoza 100 SIE w sacharozie 67±7,1 134±15 96±4,4 72±4,6 140±16 93±6,2 68±5,3 126±12 92±5,6 66±5,0 117±20 92±3,4 71 ±3,3 103±3,0 95±12 — 0,5 0,001 w stosunku do próby kontrolnej z sacharoza92 401 7 Tablica III Przecietne stezenie insuliny w serum w Eml±le u szczurów na czczo po róznych odstepach czasu po podaniu per os sacharozy ± substancja czynna wedlug przykladu V Dawka/kg per os 10 minut 20 minut 30 minut 60 minut 120 minut Próba kontrolna bez sacharozy 8,8±1,8 9,8±1,4 10,8±2,3 10,7±4f6 8,1±0,7 Próba kontrolna z sacharoza 22,2±11 35,3±14 19,315,0 16,7±5,3 8,1±1,1 100 SIE w sacharozie 9,9±4,3 11#1±3,5 7,6±1,7 14,8±3,8 10,2±2,8 P<0,05, —P<0,01, = = = ==0,001 w stosunku do próby kontrolnej z sacharoza Tablica IV Stezenie po 3 dniach Po 5 dniach maltozy AlE/ml SIE/ml AlE/ml SIE/ml 0 0,5 1,0 1,3 1,8 2,2 363 479 389 337 274 287 11,2 12,7 13,6 15,7 16,6 16,8 444 614 688 725 678 600 8,8 11,3 12,5 12,7 14,4 15,5 PL PL