KR920001367B1

KR920001367B1 - 다당류 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR920001367B1
Application number: KR1019890019931A
Authority: KR
Inventors: 세이죠 야마나; 홍남두
Original assignee: 한만우; 유깡가이샤 니혼 바이오메디칼샤; 세이죠 야마나; 홍남두
Priority date: 1989-12-28
Filing date: 1989-12-28
Publication date: 1992-02-11
Also published as: KR910012258A

Abstract

내용 없음.

Description

다당류 및 그의 제조방법

제1도는 본 발명의 다당류를 메탄올리시스하여 전개시킨 박층 크로마토그래피.

제2도는 본 발명의 다당류의 박층 크로마토그래피 스캐너(scanner).

제3도는 표준품인 (α)-메틸-D(+)-글루코사이드의 박층 크로마토그래피 스캐너.

제4도는 본 발명의 다당류의 개스 크로마토그래피.

제5도는 표준품인 (α)-메틸-D(+)-글루코사이드의 개스 크로마토그래피.

제6도는 본 발명의 다당류의 IR 흡수 스펙트럼.

본 발명은 항암작용을 갖는 다당류 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 더 상세히는 페리누스 린테우스[Phellinus linteus, (Berk. et curt) Aoshima, 상황(幹黃)]의 인공배양에 의하여 균사체로부터 제조한 다당류 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

종래, 상목(幹木)의 고목(古木)에서만 사생하는 페리누스 린테우스(Phellinus linteus. 상황)가 항종양성이 있음은 알려져 있으나, 환자가 복용할 수 있는 천연 페리누스 린테우스를 입수하기가 극히 곤란할 뿐만 아니라, 인공배양법이 개발되지 않아 이용되지 못하여 왔다. 이와같이 상황 자체가 희귀하기 때문에 페리누스 린테우스의 어떠한 성분이 항종양 작용을 갖는지를 밝히지 못하고, 단지 천연 페리누스 린테우스 균사체의 추출물의 강한 항종양 작용을 밝힌 것 밖에 없다[참조, 일본, Vol 21. No.6(1976)].

우선 페리누스 린테우스(幹黃)에 대하여 혼동이 있으므로 이를 문헌에 기초하여 상세히 밝힌다.

상황은 상목(Morus alba L.), 양(楊, Populus spp.), 유(柳, Salix spp.), 백화(白華, Betula Platyphylla suk.), 락(絡, Quercus spp.). 거수(樹, Zelkova schneideriana Hano-Mazz.), 두견(杜鵑, Rhododendron Simsii Planch.), 사조화(Cornus Kousa HANE-Var. chinensis Osborn) 등의 광엽수(廣葉樹)의 수간(樹幹)에 자생하는 페리누스 이그니아리우스[Phellinus igniarius(L. ex FR.)Quel]의 약물명을 말하고 있으나, 진정한 상황은 상목(Morus alba L.)의 수간에서 자생하는 페리누스 린테우스(Phellinus linteus Berk. et curt)Aoshima=Pyropolyporus yucatensis Murr)를 말한다. 이 페리누스 린테우스는 페리누스 이그니아리누스와는 달리 상목에 자생하고, 이 버섯의 삿갓(蓋)의 표면을 제외하고는 모두 황색이므로 한명(漢名)으로는 상황(幹黃)이라고 한다.

따라서, 본 발명에서 의미하는 페리누스 린테우스는 상목에서 자생하는 황색 색소를 띈 진정 상황을 의미한다. 페리누스 린테우스는 자연계에 상목 고목 자체가 감소하여 상목 고목에 자생하는 진정한 페리누스 린테우스를 입수하는 것은 거의 불가능하다. 또한 페리누스 린테우스 균사체는 인공배양이 대단히 어려워 대량생산하기 위한 인공배양은 아직까지 성공하지 못하였다.

본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 예의 연구한 결과, 페리누스 린테우스를 대량생산하기 위한 인공배양법을 개발하였고, 또한 이와같이 배양된 균사체가 천연의 자실체 추출물과 동일한 높은 항종양 작용을 나타냄을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 전술한 페리누스 린테우스 균사체로 부터 추출한 다당류 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전술한 다당류를 유효성분으로 함유하는 항종양제를 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

우선, 본 발명의 페리누스 린테우스 균사체는 미생물 국제기관인 일본국 통산성 미생물 공업연구소에 미공연 FERM BP-2639호로 기탁되었다.

A. 페리누스 린테우스 균사체의 배양

1) 배양배지의 작제(作製):

대량 배양을 위하여 고형 또는 액체 배지를 작제(作製)한다.

고형배지는 상목 또는 그의 가지의 거치른 톱밥(이하, 단순히 “상목톱밥”이라 함), 겨 및 펩톤의 혼합물에 공지의 배지용 무기영양 성분을 가한 후, 수분이 50∼70% 함유하도록 한다. 여기서 상목톱밥:겨:펩톤의 비는 용량비로 10:0.5∼1.5:0.2∼0.8의 비율로 조성하는 것이 바람직하다. 또한 사용되는 무기영양 성분으로는 인산수소칼륨, 황산마그네슘, 황산철, 황산아연, 황산구리와 같은 황산염; 염화칼슘, 염화망간과 같은 염화물 등을 사용할 수 있다. 그러나, 이들 무기영양 성분에 한정하지 않고, 당분야에 공지의 성분을 사용할 수 있다.

또한 고형배지중 겨는 미강, 백강 등의 겨이다. 액체배지로는 전술한 무기영양 성분에 포도당, 펩톤, 효모엑기스, 유당, 맥아당 등을 혼합하고, 여기에 물을 가하고 pH 2∼8로 조정하여 작제한다.

2) 배양:

상목에 기생하는 페리누스 린테우스 자실체(子實體)의 조직 또는 포자를 한천배지(상기 액체배지에 1.5%농도의 한천을 첨가)에 이식하여 15∼35℃에서 수주간 배양한다. 이 배양조작을 2∼3회 반복하고, 잡균의 혼입이 없는 것을 확인한 후, 전술한 고형배지 또는 액체배지에 옮겨 배양한다.

고형배지에 옮긴 경우에는 15-35℃에서 20∼200일간 배양하여 균사체를 얻는다. 액체배지의 경우에는 20∼35℃에서 통기량 0.1∼2.0리터/분, 교반속도 10∼1000rpm에서 20-200일간 배양한다.

B. 균사체로부터 조(組)다당류의 추출

균사체 배양물에 물 10∼20배량을 가하여 50-100℃에서 1∼2시간 열탕 추출하고, 원심분리법으로 여과한 후, 유하박막식 감압농축기로 농축하고, 동결건조하거나 또는 상기 농축액을 분무건조기로 건조하여 조(組)다당류를 얻는다.

C. 다당류의 정제

상기 B에서 여과에 의하여 얻어진 여액에 에탄올, 메탄올, 아세톤의 수용성 유기용매를 가하여 생성된 침전물을 동일용매로 세정한 후 아세톤, 에테르 등을 사용하여 건조하든가 또는 물에 다시 용해한 후, 상기 B에 기재된 건조법에 따라 건조한다.

이렇게 얻어진 고형물을 물에 현탁시킨 후, 호모지나이저로 호모지나이즈한 후 다시 물을 가한 후 1∼5시간 호모지나이즈한다. 여기에 세틸트리메틸암모늄 히드록시드 용액을 소량씩 가하여 더이상 침전이 생성되지 않을 때까지 가한 다음, 원심분리하여 침전물을 얻는다. 이 침전물을 산수용액에 현탁시킨 후 0∼4℃에서 교반한 후, 다시 원심분리하여 침전물을 얻는다. 생성된 침전물을 다시 산수용액으로 세척한 후 알칼리수용액에 용해시키고, 원심분리한 후 여과하고, 얻어진 여액에 에탄올을 가하여 침전시키고, 이 침전물을 에탄올로 세정한다.

이와같은 방법에 의해 10⁴미만의 저분자량 성분을 제거하여 정제된 항종양성 다당류를 얻는다.

이하, 실시예로서 본 발명을 상세히 설명한다.

[실시예 1]

상간목(幹幹木)에서 기생하는 자실체의 조직 또는 포자를 한천배지[KH₂PO₄0.87g, MgSO₄7H₂O 0.5g, CaCl₂0.3g, FeSO₄·7H₂O 10mg, MnCl₂·4H₂O 7mg, ZnSO₄·7H₂O 4mg, CuSO₄·SH₂O 1mg, 무수포도당 50g, 펩톤 10g, 효모엑기스 12g, 유당 10g, 맥아당 5g 및 한천 15g을 교반 혼합하고, 여기에 물을 가해 총량 1리터로 만든 다음 pH 5.0으로 조정]에 이식하여 20±2℃에서 30일간 배양하였다. 이 배양 조작을 3회 반복한 후, 잡균의 혼입이 없는 것을 확인한 후, 고형배지[상목의 톱밥:쌀겨:펩톤=10:1:0.5의 혼합물에 KH₂PO₄0.89g, MgSO₄·7H₂O 0.5g, CaCl₂0.3g, FeSO₄·H₂O 10mg, MnCl₄·4H₂O 7mg, ZnSO₄·7H₂O 40g, CuSO₄·5H₂O 1mg을 가한 후, 수분함량이 65±5% 되도록 한 것]에 옮겨 25±2℃에서 100일간 배양하여 균사체 20kg을 얻었다. 이렇게 하여 얻어진 균사체 배양을 20kg에 물 300리터를 가하여 90±5℃에서 2시간 열탕 추출하고, 200메쉬의 원심분리기로 여과한 후, 유하 박막식 감압농축기(일본국, 岩井사 제품, 유속 200리터/시간, 진공도 30mmHg, 온도 30℃, 가열 60℃, 가압 610mmHg)고형물이 30중량% 되도록 농축한다.

이렇게 하여 얻어진 여액 2리터에 3배량의 에탄을 수용액을 가하여 침전물을 생성시킨 후, 이 침전물을 동일용액으로 세정한 후, 아세톤을 사용, 건조하여 조(組) 다당류를 얻었다. 조(朝) 다당류 50g을 물 2리터에 현탁하여 혼합기로 호모지나이즈한 후, 물 2리터를 가하고 혼합한다. 여기에 0.2M 세틸트리메틸암모늄 히드록시드(CTA-OH, pH 13.2)용액을 소량씩 가하여 더이상 침전이 생성되지 않을 때까지(pH 12.8), 가한 후 원심분리하여 침전물을 얻었다. 이 침전물을 20% 아세트산 수용액 1.2리터에서 현탁하고, 0℃에서 5분간 교반한 후 원심분리하여 침전물을 얻고, 이를 20% 아세트산 수용액 1리터로 세정한 후, 6% 수산화나트륨 수용액 2리터에 용해하고 원심분리로 여과하고, 여액에 에탄올 4리터를 가하여 침전시키고 침전물을 에탄올로 세정한다.

이렇게 함으로써 10⁴미만의 저분자 성분을 제거하셔 목적하는 다당류 34g(수율:dir 2%)을 얻었다.

상기 실시예에서 얻어진 다당류를 다음의 방법에 의해 실험하였다.

1. 분자량 측정

겔 여과법에 의하여 1% 암모늄 아세테이트 완충액을 사용하여 세파덱스 G-200 컬럼 크로마토그래피에 의하여 분자량이 1.510⁴∼68×10⁴임을 확인하였다.

2. 구성당 확인 및 정량

(1) 상기 실시예에서 얻은 다당류는 여러종류의 아미노산과 다당류로 구성되어 있으나, 이의 구성당 중의 주성분을 확인하기 위하여 염산으로 메탄올하에서 메탄올리시스한 후, 박층 크로마토그래피[용리액:n-BuOH:Acetone:H₂O=4:5:1]에 전개시키고, 10% 황산수용액으로 발색시켰다. 이때 표준으로 (α)-메틸-D(+)-글루코사이드를 사용하였다. 그 결과, 제1도에 나타난 바와같이, 발색부위는 표준품과 동일하게 R_f=0.59를 나타내었다. 또한, 상기의 본 발명의 다당류와 표준품인 (α)-메틸-D(+)-글루코사이드의 박층 크로마토그래피 스캐너를 제2도와 제3도에 나타내었다. 따라서, 주요 구성당은 D-글루코오즈임이 확인되었다.

(2) 당함량을 측정하기 위하여 실시예에서 얻은 시료 30mg을 3%(V/V)HCl-MeOH 1ml에 넣어 질소기류하여 80±5℃에서 16시간 메탄올리시스 한 후, 다시 메탄올을 가하고 감압 농축한다. 이 건조물을 피리딘 1ml에 녹인 다음, 헥사메틸디실란(HMDS) 0.2ml와 트리메틸클로로실란(TMCS) 0.1ml를 가한 후, 30초간 격렬하게 진탕하고, 30분간 방치한 후, 개스 크로마토그래피[컬럼:Chromosorb W에 SE-30을 2.0%코팅, 컬럼길이:1.5ml)를 사용하여 템퍼리춰-프로그래밍(180℃→200℃; 2.5℃/분, 200℃; 20분)하여 분석한다. 각 피크에 대하여 글루코오즈 피크에 대한 상대 보류시간(relative retension time)을 계산하고, 이를 기준으로 하여 동정하였으며, 정량은 피크 면적을 계산하여 시행한다. 표준품으로 (α)-메틸-D(t)-글루코사이드 20mg을 사용하여 상기와 같이 수행하였다. 그 결과를 제4도 및 제5도에 나타내었다.

(3) 본 발명의 다당류의 IR 스펙트럼을 제6도에 나타내었다.

IR(cm^-1):3387.0, 2927.9, 1643.3, 1396.5, 1365.6, 1145.7, 1026.1, 578.6, 528.5

상술 및 첨부도면에 나타난 바와같이, 구성당으로서는 D-클루코오즈가 함유된 것이 확인되었으며, 이의 함량은 전술한 바에 의해 얻어진 본 발명의 다당류는 각종 제형, 예컨대, 산제, 정제, 환제, 좌제, 캅셀제, 드링크제 등으로 제제화할 수 있으며, 그의 사용량으로는 복용자의 상태, 투여방법에 따라 다르나, 1일 1.0~6.0g이 적합하다. 또한, 경우에 따라 상기 제형에 다른 성분, 예컨대 소화제 등을 첨가하여도 지장이 없다.

[실험예 1]

급성독성 실험

실시예에서 얻은 다당류를 C57b1계 숫컷 마우스(1군=10마리, 중량:18∼22g)에 경구투여하였다. 이 다당류를 30g/kg 투여하고, 7일간 관찰한 바 치사는 없었다. 이 결과로부터 마우스에 대한 LD₅₀은 30g/kg이상이었다.

또한, 돈류계 숫컷 랫트(1군=10마리, 체중=80∼100g)에 대한 LD₅₀은 100g/kg이상이었다.

[실험예 2]

아급성 독성

마우스 C57b1(체중=약 20g,1군 10마리)에 본 발명의 다당류를 4mg/마우스를 계속해서 30일간 경구투여하였다. 그후 체중의 측정, 식욕의 이상을 관찰하였으나, 이상이 없었다. 30일 투여한 후, 치사시켜 혈액검사, 뇨검사, 장기 등의 이상 유무를 검사하였으나, 빈혈, 간장해, 뇨이상 등을 발견하지 못하였다.

이상의 실험을 통하여 본 발명의 다당류의 부작용을 조사하였으나, 본 발명의 다당류는 종래의 항암제가 갖고 있는 여러가지의 부작용, 즉 식욕감퇴, 빈혈, 체중감소, 간기능 장해등이 없는 우수한 항암제임을 알 수 있다.

Claims

상황[Phellinus linteus(Berk. et Curt)]의 균사체로부터 추출, 정제하여 얻은 하기 성질을 갖는 다당류 (1) 분자량(겔 여과법에 의해 측정):1.5×10⁴~68×10⁴, (2) 구성당의 주성분 D-글루코오즈, (3) IR(cm^-1):3387.0, 2927.9, 1643.3, 1396.5, 1365.6, 1145.7, 1026.1, 578.6, 528.5, (4) 염산으로 메탄올하 메탄올리시스한 후, 박층 크로마토그래피(TLC)에 전개시키고, 10% 황산수용액으로 발색시켰을 때 본 발명의 다당류의 R_f=0.59 표준품인 (a)-메틸-D(+)-글루코사이드의 R_f= 0.59.
상목에 기생하는 페리우스 린테우스 자실체의 조직 또는 포자를 한천배지에 이식하여 배양시킨 후, 이를 주요성분으로서 상목톱밥, 쌀겨 및 펩톤이 함유된 고형배지에 옮기고, 15∼35℃에서 20∼200일 배양시켜 균사체를 얻은 후, 열수추출 또는 소량의 산, 염기 또는 유기용매를 함유하는 수용매로 추출한 후, 농축, 건조함을 특징으로 하는 하기 성질을 갖는 다당류의 제조방법. (1) 분자량(겔 여과법에 의한 측정)6 1.5×10⁴~68×10⁴, (2) 구성당의 주성분 D-글루로오즈, (3) IR(cm^-1):3387.0, 2927.9, 1643.3, 1396.5, 1365.6, 1145.7, 1026.1, 578.6, 528.5, (4) 염산으로 메탄올하 메탄올리시스 한 후, 박층 크로마토그래피(TLC)에 전개시키고, 10% 황산수용액으로 발색시켰을 때 본 발명의 다당류의 R_f=0.59 표준품인 (α)-메틸-D(+)-글루코사이드의 R_f=0.59.
제2항에 있어서, 고형배지 중의 상목톱밥:쌀겨:펩톤의 혼합비가 10:1:0.5인 것이 특징인 방법.