JP4004763B2 - ビフィズス菌増殖促進組成物 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ナフトキノン誘導体、その製造法及び用途に関するものである。本発明に係るナフトキノン誘導体は、新規化合物であって、すぐれたビフィズス菌増殖促進作用を有し、薬剤としての使用、各種飲食品への添加による腸内フローラの改善やビフィズス菌数計測用の選択培地に利用されるものである。
【０００２】
これまでの母乳栄養児と人工栄養児の腸内フローラの比較研究から、ビフィズス菌が人の健康に有用であることが示唆されてきた。現在では、各種消化管疾病等や老化に伴いビフィズス菌が有意に低下すること、腸内ビフィズス菌の増殖を促進することが発癌抑制、腸内腐敗の抑制、感染症の防止等に有効であることが確認されてきている。したがって、腸内のビフィズス菌を選択的に増殖させることは、健康維持や各種成人病等の予防・治療の観点から極めて重要であるといえる。
【０００３】
また、以上の観点から、近年ビフィズス菌を添加した食品（発酵乳、ヨーグルト等）が増加しており、これらの食品の製造や品質管理の面から、それらの食品中のビフィズス菌数を特異的に計測できる選択培地の開発が必要となってきている。
【０００４】
【従来の技術】
有用なビフィズス菌を増殖促進せしめる物質、いわゆるビフィズス因子については、従来よりいくつかの物質が研究され、報告されている。例えば、母乳中に含まれるＮ−アセチルグルコサミン（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，９０，２１９（１９５５））、ペプチド関連物質（Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，３２，１４２８（１９７４）；Ａｇｒｉｃ.Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，２１５９（１９８４））、人参抽出物（日農化誌、５５，４９９（１９８１）；Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，（Ｔｏｋｙｏ）１４，１１９１（１９６６））、糖関連物質（東北福祉大紀要、１０，３１３（１９８６））等がある。しかしながらこれらビフィズス菌の増殖促進物質の調製は、いずれも煩雑であり、ビフィズス菌のみを選択的に増殖させるという作用においても必ずしも十分とは言えない点があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ビフィズス菌のみを選択的に且つ迅速に増殖せしめる化合物からなるビフィズス菌増殖促進組成物、及びこれらの化合物を利用した、ビフィズス菌数計測等分析システムを提供することを、その目的とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記した目的を達成するためになされたものであって、本発明者らはビフィズス菌の増殖を選択的に促進する各種化合物について、各種のビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂ．ｂｒｅｖｅ、Ｂａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ等）に対して強い増殖促進活性を有する物質をスクリーニングする研究の過程において、既知の化合物のほかに新たなビフィズス菌増殖促進物質を求めて、微生物の代謝産物につき鋭意研究を重ねた結果、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌が菌体内外にすぐれた高活性のビフィズス菌増殖促進物質を産生することを見出した。
【０００７】
そして更にこの物質について、その理化学的性質を詳細に研究したところ、従来未知の新規物質であることを確認し、また、その構造決定にも成功し、工業的製法も確立し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
このようにして発見された本発明に係る新規ビフィズス菌増殖促進物質（以下、ビフィズス因子ということもある）は、下記表１、表２に示される理化学的性質を有する従来未知の新規物質である。
【０００９】
【表１】
【００１０】
【表２】
【００１１】
また、この微生物由来のビフィズス因子は、上記した理化学的性質からみて低分子のキノン化合物の性状を示しており、その構造決定を試みた結果それに成功し、下記化２において式（Ｉ）で示される化学構造式を得、従来未知の新規化合物である２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノンと同定された。
【００１２】
【化２】
【００１３】
本発明に係る新規物質２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノンは２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノンを産生する能力を有する菌株を培養し、培養物から２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノンを採取することにより得られる。また、化学合成法によっても製造することができる。
【００１４】
２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン（以下、本発明物質と省略することがある）を産生する菌属の例としては、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）等が挙げられる。例えば、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）ＡＴＣＣ ６２０７株は、本発明物質産生菌として好適である。
【００１５】
本発明により、２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノンを製造するには、まず本発明物質を産生する能力を有する菌株を、通常の微生物が増殖し得る栄養源を含む培地で好気的又は嫌気的に培養する。栄養源としては従来から微生物の培養に用いられている公知のものが使用できる。特にトリプチケース、フィトン、酵母エキス及びグルコースからなる培地が好適に用いられる。
【００１６】
培養方法としては、公知の各種好気的、嫌気的培養方法を用いることができるが、液体培地による好気又は嫌気培養法が大量生産の上から最も好ましい。培養温度は約２０〜４０℃、培地のｐＨは中性乃至微酸性の条件下で培養する。液体培養では、培養開始後約１〜３日経過すると培地及び菌体中に本発明物質が蓄積される。培養を停止し、培養上清と菌体を分離して菌体を本発明物質の分離精製に供する。
【００１７】
本発明物質の分離精製方法を以下に記載する。まず通常の遠心分離法によって培養液から菌体を分離する。得られた菌体にクロロホルム：メタノール＝２：１溶液を加え、活性物質を撹拌抽出する。次いで、この抽出画分を減圧濃縮した後、シリカゲルカラムにかける。その後、ｎ−ヘキサン中の酢酸エチルの濃度を増加させつつ溶出すると、ｎ−ヘキサン中の酢酸エチル濃度が４５〜６０％の溶出画分にビフィズス菌の増殖促進活性が認められる。この溶出画分を減圧濃縮した後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムによるゲル濾過クロマトグラフイーに処す。メタノールで溶出すると、比較的低分子側の溶出位置にビフィズス菌の増殖促進活性が認められる。
【００１８】
この溶出画分を減圧濃縮した後、さらに逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーに処す。アセトニトリル：メタノール：水：酢酸＝２５０：１００：９００：０．６（ｐＨ５．６）を用いて溶出すると、ビフィズス菌の増殖促進活性物質が単一ピークとして溶出される。この溶出画分を減圧濃縮すると、黄色粉末の本発明物質を得ることができる。
【００１９】
以上のようにして分離精製された本発明物質は、既述のような理化学的性質を示す。そして構造決定もなされ、その結果、式（Ｉ）で示される新規物質２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノンであると同定された。
【００２０】
また、本発明物質には、式（Ｉ）で示されるナフトキノン誘導体のみでなく、その塩も広く包含される。そして本発明物質の塩基との塩としてはナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土金属塩などが挙げられ、酸との塩としては、塩酸塩、硫酸塩等の酸付加塩が挙げられる。
【００２１】
本発明物質は、後記するところからも明らかなように、非常に強いビフィズス菌増殖促進作用を有するため、本発明物質を有効成分として含有した組成物は、ビフィズス菌増殖促進剤として、医薬品、飲食品、分析用剤から選ばれる少なくともひとつの形態で利用することができ、例えば医薬品として直接投与することによりあるいはまた特定保健用食品等栄養食品ないし機能性食品として直接投与ないし摂取することにより、あるいはまた、各種食品（発酵乳、ヨーグルトその他）に添加しておきこれを摂取することによって、腸内フローラの改善を図ることができる。また、ビフィズス菌数計測等アッセイ系にも本発明の組成物は利用することができる。
【００２２】
本発明に係る組成物を医薬品として使用する場合には、本発明物質を有効成分化合物として種々の形態で投与する。その投与形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与をあげることができる。これらの各種製剤は、常法に従って主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーテイング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。
【００２３】
この製剤をヒトに適用する場合、経口投与によるのが好ましい。有効成分の治療有効量は治療される各患者の年令および条件によって変動するが、−般に有効成分を、ヒト体重１ｋｇ当り１日量０．０１〜１．０ｍｇ経口投与する。
【００２４】
本発明において使用する各種化合物は、経口投与によって所期の目的を達成しうるので、本発明に係る組成物は、飲食品として使用することができる。そのためには、本発明物質を各種補助剤や他の飲食品を用いて、ドリンク、錠剤、その他各種の飲食品にしたり、飲食品に直接添加する等、各種の方法を利用することができる。このように飲食品とした本発明組成物は、長期間に亘って摂取することが可能であるので、通常の飲食品のほか、特定保健用食品、栄養剤、健康食品等として市販に供することができる。
【００２５】
本発明物質は、ビフィズス菌増殖促進能が非常に高いだけでなく、選択性及び特異性も極めて高いという特徴を有する。しかも本発明によれば、抗生物質等の存在により増殖が抑制されたビフィズス菌でも該増殖促進物質（本発明物質）を添加することにより、その増殖能を回復する。従って、本増殖促進組成物をヒトもしくは動物に直接投与し消化管中のビフィズス菌数を増大せしめる利用法の他に、食品、大腸内容物ならびに糞便試料等におけるビフィズス菌分析用の選択培地として利用することが可能である。
【００２６】
すなわち、これまでにビフィズス菌含有試料中のビフィズス菌数を計測するシステムのひとつとして、ビフィズス菌以外の來雑菌の増殖を抑制する選択剤を含有する寒天培地を用い、該培地に試料を接種してインキュベートすることにより、ビフィズス菌のみを特異的ないし選択的に増殖せしめて、ビフィズス菌の存否や生菌数を計測する方法が知られている。しかしながら、選択剤を添加した選択培地では特に高濃度の選択剤を使用した場合、ビフィズス菌以外の來雑菌の増殖が抑制されることはもちろんのこと、ビフィズス菌自体の増殖も抑制されることがあり、正確なビフィズス菌数の把握が困難であった。
【００２７】
これに対し、選択培地に本発明に係るビフィズス菌増殖促進組成物を添加すると、ビフィズス菌の増殖を特異的に促進しコロニーを形成させることができ、ビフィズス菌数の正確な計測ができるのである。しかもこの効果は、選択剤として、硫酸パロモマイシン、硫酸ネオマイシン等の抗生物質のほか、プロピオン酸塩、塩化リチウムその他既知のどのような選択剤を使用しても奏されるので、ビフィズス因子を添加してなるビフィズス菌アッセイ用選択培地は広範なアッセィ用途に有効に利用することができる。
【００２８】
【実施例】
以下、本発明の実施例につき述べる。
【００２９】
【実施例１】
（活性の程度）
後記する実施例で得た本発明物質（２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン）を１〜０．０１ｎｇ／ｍｌとなるようにＴＰＹＧ培地（トリプチケース（ＢＢＬ）８ｇ、フィトンペプトン（ＢＢＬ）３ｇ、酵母エキス５ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩０．５ｇ、グルコース２０ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ２ｇ、ＫＨ2ＰＯ4３ｇ、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ、精製水１０００ｍｌ、ｐＨ６．５）に添加し、引き続き、ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＡＴＣＣ １５７０７、Ｂｉｆ． ｂｒｅｖｅ ＡＴＣＣ １５７００、Ｂｉｆ．ｂｉｆｉｄｕｍ ＡＴＣＣ １１１４６、Ｂｉｆ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＡＴＣＣ １５７０３、Ｂｉｆ．ｉｎｆａｎｔｉｓ ＡＴＣＣ １５６９７）を接種し、ガスパック法にて３７℃で２０時間嫌気培養した後、それぞれの培養液のＯＤ580（波長５８０ｎｍにおける吸光度）を測定した。その結果を下記表３に示す。尚、対照としては、本発明物質を添加しないＴＰＹＧ培地（ｐＨ６．５）にそれぞれの供試菌を接種したものを用いた。
【００３０】
【表３】
【００３１】
表３で示したとおり、本発明物質は、０．０１〜０．１ｎｇ／ｍｌという極めて低い濃度で、各種ビフィズス菌に対する増殖促進作用を示すことが確認された。
【００３２】
【実施例２】
（増殖促進作用のビフィズス菌特異性）
後記する実施例で得た本発明物質を１０ｎｇ／ｍｌとなるようにＴＰＹＧ培地（ｐＨ６．５）に添加し、引き続き、下記するビフィズス菌をはじめとする各種腸内細菌を接種し、ガスパック法にて３７℃で２０時間嫌気培養した。
【００３３】
（イ）Bifidobacterium longum ATCC 15707
（ロ）Bif.breve ATCC 15700
（ハ）Bif.adolescentis ATCC 15703
（ニ）Bif.infantis ATCC 15697
（ホ）Bif.bifidum ATCC 11146
（へ）Clostridium perfringens ATCC 3626
（ト）Cl.butyricum ATCC 860
（チ）Cl.ramosum ATCC 13937
（リ）Enterobacter cloacae ATCC 961
（ヌ）Escherichia coli ATCC 26
（ル）Fusobacterium varium ATCC 8501
（オ）Bacteroides fragilis ATCC 23745
（ワ）Eubacterium aerofaciens ATCC 25986
（カ）Enterococcus faecalis IFO 3971
（ヨ）Staphylococcus aureus ATCC 4012
【００３４】
培養終了後、それぞれの培養液のＯＤ580（波長５８０ｎｍにおける吸光度）を測定し、下記表４の結果を得た。なお、対照として、本発明物質を添加しないＴＰＹＧ培地にそれぞれの供試菌を接種したものを用いた。
【００３５】
【表４】
【００３６】
上記表４で示したとおり、本発明物質を添加することにより、各種ビフィズス菌の顕著な増殖促進が認められた。一方、その他の腸内細菌に対しては、増殖促進作用が極めて微弱ないしは皆無であって、本発明物質の選択性ないし特異性も実証された。
【００３７】
【実施例３】
（本発明物質の製造）
ＴＰＹＧ培地（ｐＨ６．５）１０Ｌを容量５Ｌの三角フラスコ３本に分注し、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌を行った。これにプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）ＡＴＣＣ ６２０７株の賦活培養液１００ｍｌを接種し、３０℃で３日間静置培養して種培養を調製した。
【００３８】
本培養においては、１３．５℃、５秒間滅菌を行った上記ＴＰＹＧ培地（ｐＨ６．５）５００Ｌに、前記によって調製された種培養１０Ｌを接種し、窒素ガス加圧（０．５ｋｇ／ｃｍ2）下、３０℃で、９６時間静置培養した。こうして得られた培養液を連続遠心処理して培養上清と菌体とを分離した。得られた菌体を凍結乾燥処理し、凍結乾燥菌体１７３８ｇを得た。
【００３９】
前記により得られた乾燥菌体にクロロホルム：メタノール＝２：１溶液１５Ｌを加え、室温で３０分間攪拌して本発明物質を抽出した。得られた抽出液を吸引濾過し、濾液を減圧濃縮して抽出物２２．８ｇを得た。これをシリカゲルカラム（カラム長７０ｃｍ、カラム径６．０ｃｍ、和光純薬社製ワコーゲルＣ−３００）にかけ、ｎ−ヘキサン中の酢酸エチル濃度を上昇させながら溶出を行ったところ、ｎ−ヘキサン中の酢酸エチル濃度が４５〜６０％の溶出画分にビブィズス菌増殖促進活性が認められた。
【００４０】
この溶出画分を減圧下で濃縮乾固した後、メタノール８ｍｌに溶解し、次にＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム（カラム長７０ｃｍ、カラム径２．６ｃｍ；ファルマシア社製）によるゲル濾過クロマトグラフィーを行った。メタノールを溶出液とし、流速３６ｍｌ／ｈｒで溶出したところ、溶出液量４９７〜５３９ｍｌの画分にビフィズス菌増殖促進活性が認められた。この溶出画分を減圧下で濃縮した。
【００４１】
次に、逆相カラム（カラム長２５０ｍｍ、カラム径２０ｍｍ；資生堂社製ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ18）を用いた高速液体クロマトグラフィーを行った。アセトニトリル：メタノール：水：酢酸＝２５０：１００：９００：０．６（ｐＨ５．６）を溶出液とし、流速１０ｍｌ／ｍｉｎで溶出したところ、保持時間３８分前後の溶出画分にビフィズス菌増殖促進活性が認められた。この溶出画分を減圧下で濃縮して、黄色粉末状の本発明物質７．１ｍｇを得た。その理化学的性質は既述のとおりであって、その化学構造は式（Ｉ）のように決定された。
【００４２】
【実施例４】
グラニュー糖５０ｇ、コーンスターチと乳糖の等量混合物１００ｇ、実施例３で得た本発明物質１００ｍｇを加えて充分に混合した。混合物を１００等分して袋に詰め、１袋１．５ｇのスティック状ビフィズス因子栄養健康食品を１００袋製造した。
【００４３】
【実施例５】
次に示す（１）〜（４）の配合を用意した。（１）実施例３で得た本発明物質１ｇ、（２）乳糖１４０ｇ、（３）コーンスターチ２９ｇ、（４）ステアリン酸マグネシウム１ｇ。
【００４４】
先ず、（１）、（２）、（３）（但し１７ｇ）を混合し、（３）（但し７ｇ）から調製したペーストとともに顆粒化した。得られた顆粒に（３）（但し５ｇ）と（４）を加えてよく混合し、この混合物を圧縮錠剤機により圧縮し、１錠あたり本発明物質を１ｍｇ含有する錠剤１０００個を製造した。
【００４５】
【発明の効果】
本発明に係る新規化合物からなるビフィズス因子は、ビフィズス菌の増殖促進効果にすぐれているので、飲食品や経口投与薬剤としてヒトや動物に直接投与ないし摂取せしめて、消化管中のビフィズス菌を増大させるのにきわめて有効である。
【００４６】
更にまた本発明に係るビフィズス因子は、ビフィズス菌の増殖促進効果にすぐれているだけでなく、選択性ないし特異性が強く、他の夾雑菌には増殖効果が認められないため、ビフィズス菌選択用培地に本ビフィズス因子を添加すると、ビフィズス菌のみのコロニーが速やかに形成され、ビフィズス菌の生菌数の計測その他各種アッセイに有利に利用することができ、ビフィズス菌の特異的選択剤としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】１０μｇ／ｍｌとなるようにメタノールに溶解させた２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノンの紫外線吸収スペクトルを示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ナフトキノン誘導体、その製造法及び用途に関するものである。本発明に係るナフトキノン誘導体は、新規化合物であって、すぐれたビフィズス菌増殖促進作用を有し、薬剤としての使用、各種飲食品への添加による腸内フローラの改善やビフィズス菌数計測用の選択培地に利用されるものである。
【０００２】
これまでの母乳栄養児と人工栄養児の腸内フローラの比較研究から、ビフィズス菌が人の健康に有用であることが示唆されてきた。現在では、各種消化管疾病等や老化に伴いビフィズス菌が有意に低下すること、腸内ビフィズス菌の増殖を促進することが発癌抑制、腸内腐敗の抑制、感染症の防止等に有効であることが確認されてきている。したがって、腸内のビフィズス菌を選択的に増殖させることは、健康維持や各種成人病等の予防・治療の観点から極めて重要であるといえる。
【０００３】
また、以上の観点から、近年ビフィズス菌を添加した食品（発酵乳、ヨーグルト等）が増加しており、これらの食品の製造や品質管理の面から、それらの食品中のビフィズス菌数を特異的に計測できる選択培地の開発が必要となってきている。
【０００４】
【従来の技術】
有用なビフィズス菌を増殖促進せしめる物質、いわゆるビフィズス因子については、従来よりいくつかの物質が研究され、報告されている。例えば、母乳中に含まれるＮ−アセチルグルコサミン（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，９０，２１９（１９５５））、ペプチド関連物質（Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，３２，１４２８（１９７４）；Ａｇｒｉｃ.Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，２１５９（１９８４））、人参抽出物（日農化誌、５５，４９９（１９８１）；Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，（Ｔｏｋｙｏ）１４，１１９１（１９６６））、糖関連物質（東北福祉大紀要、１０，３１３（１９８６））等がある。しかしながらこれらビフィズス菌の増殖促進物質の調製は、いずれも煩雑であり、ビフィズス菌のみを選択的に増殖させるという作用においても必ずしも十分とは言えない点があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ビフィズス菌のみを選択的に且つ迅速に増殖せしめる化合物からなるビフィズス菌増殖促進組成物、及びこれらの化合物を利用した、ビフィズス菌数計測等分析システムを提供することを、その目的とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記した目的を達成するためになされたものであって、本発明者らはビフィズス菌の増殖を選択的に促進する各種化合物について、各種のビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂ．ｂｒｅｖｅ、Ｂａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ等）に対して強い増殖促進活性を有する物質をスクリーニングする研究の過程において、既知の化合物のほかに新たなビフィズス菌増殖促進物質を求めて、微生物の代謝産物につき鋭意研究を重ねた結果、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌が菌体内外にすぐれた高活性のビフィズス菌増殖促進物質を産生することを見出した。
【０００７】
そして更にこの物質について、その理化学的性質を詳細に研究したところ、従来未知の新規物質であることを確認し、また、その構造決定にも成功し、工業的製法も確立し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
このようにして発見された本発明に係る新規ビフィズス菌増殖促進物質（以下、ビフィズス因子ということもある）は、下記表１、表２に示される理化学的性質を有する従来未知の新規物質である。
【０００９】
【表１】
【表２】
また、この微生物由来のビフィズス因子は、上記した理化学的性質からみて低分子のキノン化合物の性状を示しており、その構造決定を試みた結果それに成功し、下記化２において式（Ｉ）で示される化学構造式を得、従来未知の新規化合物である２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノンと同定された。
【００１２】
【化２】
本発明に係る新規物質２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノンは２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノンを産生する能力を有する菌株を培養し、培養物から２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノンを採取することにより得られる。また、化学合成法によっても製造することができる。
【００１４】
２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン（以下、本発明物質と省略することがある）を産生する菌属の例としては、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）等が挙げられる。例えば、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）ＡＴＣＣ ６２０７株は、本発明物質産生菌として好適である。
【００１５】
本発明により、２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノンを製造するには、まず本発明物質を産生する能力を有する菌株を、通常の微生物が増殖し得る栄養源を含む培地で好気的又は嫌気的に培養する。栄養源としては従来から微生物の培養に用いられている公知のものが使用できる。特にトリプチケース、フィトン、酵母エキス及びグルコースからなる培地が好適に用いられる。
【００１６】
培養方法としては、公知の各種好気的、嫌気的培養方法を用いることができるが、液体培地による好気又は嫌気培養法が大量生産の上から最も好ましい。培養温度は約２０〜４０℃、培地のｐＨは中性乃至微酸性の条件下で培養する。液体培養では、培養開始後約１〜３日経過すると培地及び菌体中に本発明物質が蓄積される。培養を停止し、培養上清と菌体を分離して菌体を本発明物質の分離精製に供する。
【００１７】
本発明物質の分離精製方法を以下に記載する。まず通常の遠心分離法によって培養液から菌体を分離する。得られた菌体にクロロホルム：メタノール＝２：１溶液を加え、活性物質を撹拌抽出する。次いで、この抽出画分を減圧濃縮した後、シリカゲルカラムにかける。その後、ｎ−ヘキサン中の酢酸エチルの濃度を増加させつつ溶出すると、ｎ−ヘキサン中の酢酸エチル濃度が４５〜６０％の溶出画分にビフィズス菌の増殖促進活性が認められる。この溶出画分を減圧濃縮した後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムによるゲル濾過クロマトグラフイーに処す。メタノールで溶出すると、比較的低分子側の溶出位置にビフィズス菌の増殖促進活性が認められる。
【００１８】
この溶出画分を減圧濃縮した後、さらに逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーに処す。アセトニトリル：メタノール：水：酢酸＝２５０：１００：９００：０．６（ｐＨ５．６）を用いて溶出すると、ビフィズス菌の増殖促進活性物質が単一ピークとして溶出される。この溶出画分を減圧濃縮すると、黄色粉末の本発明物質を得ることができる。
【００１９】
以上のようにして分離精製された本発明物質は、既述のような理化学的性質を示す。そして構造決定もなされ、その結果、式（Ｉ）で示される新規物質２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノンであると同定された。
【００２０】
また、本発明物質には、式（Ｉ）で示されるナフトキノン誘導体のみでなく、その塩も広く包含される。そして本発明物質の塩基との塩としてはナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土金属塩などが挙げられ、酸との塩としては、塩酸塩、硫酸塩等の酸付加塩が挙げられる。
【００２１】
本発明物質は、後記するところからも明らかなように、非常に強いビフィズス菌増殖促進作用を有するため、本発明物質を有効成分として含有した組成物は、ビフィズス菌増殖促進剤として、医薬品、飲食品、分析用剤から選ばれる少なくともひとつの形態で利用することができ、例えば医薬品として直接投与することによりあるいはまた特定保健用食品等栄養食品ないし機能性食品として直接投与ないし摂取することにより、あるいはまた、各種食品（発酵乳、ヨーグルトその他）に添加しておきこれを摂取することによって、腸内フローラの改善を図ることができる。また、ビフィズス菌数計測等アッセイ系にも本発明の組成物は利用することができる。
【００２２】
本発明に係る組成物を医薬品として使用する場合には、本発明物質を有効成分化合物として種々の形態で投与する。その投与形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与をあげることができる。これらの各種製剤は、常法に従って主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーテイング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。
【００２３】
この製剤をヒトに適用する場合、経口投与によるのが好ましい。有効成分の治療有効量は治療される各患者の年令および条件によって変動するが、−般に有効成分を、ヒト体重１ｋｇ当り１日量０．０１〜１．０ｍｇ経口投与する。
【００２４】
本発明において使用する各種化合物は、経口投与によって所期の目的を達成しうるので、本発明に係る組成物は、飲食品として使用することができる。そのためには、本発明物質を各種補助剤や他の飲食品を用いて、ドリンク、錠剤、その他各種の飲食品にしたり、飲食品に直接添加する等、各種の方法を利用することができる。このように飲食品とした本発明組成物は、長期間に亘って摂取することが可能であるので、通常の飲食品のほか、特定保健用食品、栄養剤、健康食品等として市販に供することができる。
【００２５】
本発明物質は、ビフィズス菌増殖促進能が非常に高いだけでなく、選択性及び特異性も極めて高いという特徴を有する。しかも本発明によれば、抗生物質等の存在により増殖が抑制されたビフィズス菌でも該増殖促進物質（本発明物質）を添加することにより、その増殖能を回復する。従って、本増殖促進組成物をヒトもしくは動物に直接投与し消化管中のビフィズス菌数を増大せしめる利用法の他に、食品、大腸内容物ならびに糞便試料等におけるビフィズス菌分析用の選択培地として利用することが可能である。
【００２６】
すなわち、これまでにビフィズス菌含有試料中のビフィズス菌数を計測するシステムのひとつとして、ビフィズス菌以外の來雑菌の増殖を抑制する選択剤を含有する寒天培地を用い、該培地に試料を接種してインキュベートすることにより、ビフィズス菌のみを特異的ないし選択的に増殖せしめて、ビフィズス菌の存否や生菌数を計測する方法が知られている。しかしながら、選択剤を添加した選択培地では特に高濃度の選択剤を使用した場合、ビフィズス菌以外の來雑菌の増殖が抑制されることはもちろんのこと、ビフィズス菌自体の増殖も抑制されることがあり、正確なビフィズス菌数の把握が困難であった。
【００２７】
これに対し、選択培地に本発明に係るビフィズス菌増殖促進組成物を添加すると、ビフィズス菌の増殖を特異的に促進しコロニーを形成させることができ、ビフィズス菌数の正確な計測ができるのである。しかもこの効果は、選択剤として、硫酸パロモマイシン、硫酸ネオマイシン等の抗生物質のほか、プロピオン酸塩、塩化リチウムその他既知のどのような選択剤を使用しても奏されるので、ビフィズス因子を添加してなるビフィズス菌アッセイ用選択培地は広範なアッセィ用途に有効に利用することができる。
【００２８】
【実施例】
以下、本発明の実施例につき述べる。
【００２９】
【実施例１】
（活性の程度）
後記する実施例で得た本発明物質（２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン）を１〜０．０１ｎｇ／ｍｌとなるようにＴＰＹＧ培地（トリプチケース（ＢＢＬ）８ｇ、フィトンペプトン（ＢＢＬ）３ｇ、酵母エキス５ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩０．５ｇ、グルコース２０ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ２ｇ、ＫＨ2ＰＯ4３ｇ、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ、精製水１０００ｍｌ、ｐＨ６．５）に添加し、引き続き、ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＡＴＣＣ １５７０７、Ｂｉｆ． ｂｒｅｖｅ ＡＴＣＣ １５７００、Ｂｉｆ．ｂｉｆｉｄｕｍ ＡＴＣＣ １１１４６、Ｂｉｆ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＡＴＣＣ １５７０３、Ｂｉｆ．ｉｎｆａｎｔｉｓ ＡＴＣＣ １５６９７）を接種し、ガスパック法にて３７℃で２０時間嫌気培養した後、それぞれの培養液のＯＤ580（波長５８０ｎｍにおける吸光度）を測定した。その結果を下記表３に示す。尚、対照としては、本発明物質を添加しないＴＰＹＧ培地（ｐＨ６．５）にそれぞれの供試菌を接種したものを用いた。
【００３０】
【表３】
表３で示したとおり、本発明物質は、０．０１〜０．１ｎｇ／ｍｌという極めて低い濃度で、各種ビフィズス菌に対する増殖促進作用を示すことが確認された。
【００３２】
【実施例２】
（増殖促進作用のビフィズス菌特異性）
後記する実施例で得た本発明物質を１０ｎｇ／ｍｌとなるようにＴＰＹＧ培地（ｐＨ６．５）に添加し、引き続き、下記するビフィズス菌をはじめとする各種腸内細菌を接種し、ガスパック法にて３７℃で２０時間嫌気培養した。
【００３３】
（イ）Bifidobacterium longum ATCC 15707
（ロ）Bif.breve ATCC 15700
（ハ）Bif.adolescentis ATCC 15703
（ニ）Bif.infantis ATCC 15697
（ホ）Bif.bifidum ATCC 11146
（へ）Clostridium perfringens ATCC 3626
（ト）Cl.butyricum ATCC 860
（チ）Cl.ramosum ATCC 13937
（リ）Enterobacter cloacae ATCC 961
（ヌ）Escherichia coli ATCC 26
（ル）Fusobacterium varium ATCC 8501
（オ）Bacteroides fragilis ATCC 23745
（ワ）Eubacterium aerofaciens ATCC 25986
（カ）Enterococcus faecalis IFO 3971
（ヨ）Staphylococcus aureus ATCC 4012
【００３４】
培養終了後、それぞれの培養液のＯＤ580（波長５８０ｎｍにおける吸光度）を測定し、下記表４の結果を得た。なお、対照として、本発明物質を添加しないＴＰＹＧ培地にそれぞれの供試菌を接種したものを用いた。
【００３５】
【表４】
上記表４で示したとおり、本発明物質を添加することにより、各種ビフィズス菌の顕著な増殖促進が認められた。一方、その他の腸内細菌に対しては、増殖促進作用が極めて微弱ないしは皆無であって、本発明物質の選択性ないし特異性も実証された。
【００３７】
【実施例３】
（本発明物質の製造）
ＴＰＹＧ培地（ｐＨ６．５）１０Ｌを容量５Ｌの三角フラスコ３本に分注し、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌を行った。これにプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）ＡＴＣＣ ６２０７株の賦活培養液１００ｍｌを接種し、３０℃で３日間静置培養して種培養を調製した。
【００３８】
本培養においては、１３．５℃、５秒間滅菌を行った上記ＴＰＹＧ培地（ｐＨ６．５）５００Ｌに、前記によって調製された種培養１０Ｌを接種し、窒素ガス加圧（０．５ｋｇ／ｃｍ2）下、３０℃で、９６時間静置培養した。こうして得られた培養液を連続遠心処理して培養上清と菌体とを分離した。得られた菌体を凍結乾燥処理し、凍結乾燥菌体１７３８ｇを得た。
【００３９】
前記により得られた乾燥菌体にクロロホルム：メタノール＝２：１溶液１５Ｌを加え、室温で３０分間攪拌して本発明物質を抽出した。得られた抽出液を吸引濾過し、濾液を減圧濃縮して抽出物２２．８ｇを得た。これをシリカゲルカラム（カラム長７０ｃｍ、カラム径６．０ｃｍ、和光純薬社製ワコーゲルＣ−３００）にかけ、ｎ−ヘキサン中の酢酸エチル濃度を上昇させながら溶出を行ったところ、ｎ−ヘキサン中の酢酸エチル濃度が４５〜６０％の溶出画分にビブィズス菌増殖促進活性が認められた。
【００４０】
この溶出画分を減圧下で濃縮乾固した後、メタノール８ｍｌに溶解し、次にＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム（カラム長７０ｃｍ、カラム径２．６ｃｍ；ファルマシア社製）によるゲル濾過クロマトグラフィーを行った。メタノールを溶出液とし、流速３６ｍｌ／ｈｒで溶出したところ、溶出液量４９７〜５３９ｍｌの画分にビフィズス菌増殖促進活性が認められた。この溶出画分を減圧下で濃縮した。
【００４１】
次に、逆相カラム（カラム長２５０ｍｍ、カラム径２０ｍｍ；資生堂社製ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ18）を用いた高速液体クロマトグラフィーを行った。アセトニトリル：メタノール：水：酢酸＝２５０：１００：９００：０．６（ｐＨ５．６）を溶出液とし、流速１０ｍｌ／ｍｉｎで溶出したところ、保持時間３８分前後の溶出画分にビフィズス菌増殖促進活性が認められた。この溶出画分を減圧下で濃縮して、黄色粉末状の本発明物質７．１ｍｇを得た。その理化学的性質は既述のとおりであって、その化学構造は式（Ｉ）のように決定された。
【００４２】
【実施例４】
グラニュー糖５０ｇ、コーンスターチと乳糖の等量混合物１００ｇ、実施例３で得た本発明物質１００ｍｇを加えて充分に混合した。混合物を１００等分して袋に詰め、１袋１．５ｇのスティック状ビフィズス因子栄養健康食品を１００袋製造した。
【００４３】
【実施例５】
次に示す（１）〜（４）の配合を用意した。（１）実施例３で得た本発明物質１ｇ、（２）乳糖１４０ｇ、（３）コーンスターチ２９ｇ、（４）ステアリン酸マグネシウム１ｇ。
【００４４】
先ず、（１）、（２）、（３）（但し１７ｇ）を混合し、（３）（但し７ｇ）から調製したペーストとともに顆粒化した。得られた顆粒に（３）（但し５ｇ）と（４）を加えてよく混合し、この混合物を圧縮錠剤機により圧縮し、１錠あたり本発明物質を１ｍｇ含有する錠剤１０００個を製造した。
【００４５】
【発明の効果】
本発明に係る新規化合物からなるビフィズス因子は、ビフィズス菌の増殖促進効果にすぐれているので、飲食品や経口投与薬剤としてヒトや動物に直接投与ないし摂取せしめて、消化管中のビフィズス菌を増大させるのにきわめて有効である。
【００４６】
更にまた本発明に係るビフィズス因子は、ビフィズス菌の増殖促進効果にすぐれているだけでなく、選択性ないし特異性が強く、他の夾雑菌には増殖効果が認められないため、ビフィズス菌選択用培地に本ビフィズス因子を添加すると、ビフィズス菌のみのコロニーが速やかに形成され、ビフィズス菌の生菌数の計測その他各種アッセイに有利に利用することができ、ビフィズス菌の特異的選択剤としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】１０μｇ／ｍｌとなるようにメタノールに溶解させた２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノンの紫外線吸収スペクトルを示す。
Claims (7)
- 下記化１で示される式（Ｉ）を有する２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン。
- ２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノンを産生する微生物を培養し、培養物中に該ナフトキノンを産生させ、これを採取することを特徴とする式（Ｉ）で表わされる２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノンの製造法。
- 該ナフトキノン生産菌としてプロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属からなる群から選ばれる微生物を使用することを特徴とする請求項２に記載の製造法。
- プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）を使用することを特徴とする請求項２に記載の製造法。
- ２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノンを有効成分として添加してなること、を特徴とするビフィズス菌増殖促進飲食品。
- ２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノンを有効成分とすること、を特徴とするビフィズス菌増殖促進剤。
- ２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノンを有効成分とすること、を特徴とするビフィズス菌選択剤。
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