NO136844B - Fremgangsm}te til fremstilling av saccharaseinhibitorer. - Google Patents

Description

Gjenstanden for eldre patentsøknader er den er-kjennelse at en rekke av aktinomyceter, fremfor alt aktinoplanaceen danner inhibitorer for glykosidhydrolase, fortrinnsvis kullhydrat spaltende enzymer av fordøyelseskanalen. En gruppe av disse inhibitorer er relativt varmestabile og.ved værelses-temperatur syre- og alkalistabile. Disse inhibitorer hører kjemisk i klassen bligo- eller polysaccharider resp. deres derivater.

De fleste av inhibitorene fra denne gruppe er høypotente amylaseinhibitorer, men bare middelssterke eller svake saccharaseinhibitorer.

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte til fremstilling saccharaseinhibitorer, idet fremgangsmåten er karakterisert ved dyrkning av en av stammene Actinoplanes CBS 961.70, CBS 615.71 eller CBS .957.70 utvunne amylaseinhibitorer fra klassen av oligo- eller polysaccharider eller deres derivater nedbrytes hydrolytisk til saccharaseinhibitorer ved hjelp av vandige syrer ved 60 - 110°C eller enzymatisk med 6-amylase. Amylaseprøve.

En amylase-inhibitor-enhet (1 AIE) er definert

som den inhibitormengde som inhiberer to amylaseenheter 50%.

En amylaseenhet (AE) er den enzymmengde som i et minutt under de nedenfor angitte prøvebetingelser spalter l^u ekvivalent glukosidiske bindinger i stivelsen. De ^u valspaltede bindinger bestemmes kolorimetrisk som ^ u. valdannet reduserende

sukker 'med dinitrosalicylsyre og angis ved hjelp av en maltose-..justeringskurve som ,u val maltoseekvivalent. Til gjennomføring av prøven blandes 0,1 ml amylaseoppløsning (20 - 22 AE/ml) med 0-10 ^ug inhibitorer eller 0-20 ^ul av oppløsningen som skal prøves i 0,4 ml 0,02 m natriumglycerofosfatpuffer/0,001 m CaCl2 pH 6,9 og ekvilibreres i 10 - 20 minutter i et vannbad av 35°C.

Deretter inkuberes 5 minutter med 0,5 ml av en til 35°C foroppvarmet 1%- ig stivelsesoppløsning (stivelse oppløselig fra firma Merck, Darmstadt, nr. 1252) ved 35°C og blandes deretter med 1 ml dinitrosalicylsyre-reagens (ifølge P. Bernfeldi Colowick-Kaplan, Meth. Enzymol. bind 1, side 149). Til farge-fremkalling oppvarmes blandingen 5 minutter på kokende vannbad, avkjøles deretter og blandes med 10 ml destillert vann. Ek-stinksjonen ved 540 nm måles mot et tilsvarende blindforsøk uten amylase. Til vurdering avleses fra en på forhånd opptatt amylasejusteringskurve den etter inhibitortilsetning ennå virksomme amylaseaktivitet og herav beregnes den prosentuelle hemning av anvendt amylase. Den prosentuelle hemning oppføres som funksjon av kvotienten

+ refererer til tørrstoff

++ AE i ikke inhibert blanding av samme serie 50$ hemningspunkt avleses_av kurven og omregnes til AIE/mg inhibitor.

Saccharaseprøve.

En saccharase-inhibitorenhet (SIE) er definert • som den inhibitormengde som inhiberer to saccharaseenheter til 50$. En saccharaseenhet (SE) er den enzymmengde som på

ett minutt under de nedenfor angitte prøvebetingelser spalter lyumol saccharase i glucose og fructose. Den ^umol dannede . glucose bestemmes ved hjelp av glucoseoksydasereaksjonen kvan-titativt under betingelser hvor den ytterligere saccharosespalt-ning ikke mere finner sted ved saccharasen. Til gjennomføring av prøven blandes 0,05 ml av en til 0,12 SE til saccharaseopp-løsning"^ med 0-20 ^ug inhibitor eller 0-20 . ^ul av den oppløs-ning som skal prøves og oppfylles med 0,1 m natriummaleinatpuffer pH 6,0 til 0,1 ml. Det ekvilibreres i 10 minutter ved 35°C og deretter blandes med 0,1 ml av en til ,35°C foroppvarmet 0,05 m saccharoseoppløsning i 0,1 m natriummaleinatpuffer pH 6,0. Man inkuberer i 20 minutter ved 35°C og stopper saccha-

" . 2) rasereaksjonen ved tilsetning av 1 ml glucoseoksy.dasereagens og inkuberer videre i 30 minutter ved 35°C. Deretter tilsettes 1 ml 50% HgSO^ og måles ved 545 nm mot tilsvarende blindverdi.

l_ 1) Solubilisert saccharase fra svinetynntarmmucosa ifølge B. Borgstrøm, A. Dahlquist, Acta Chem. Scand. 12, (1958), side 1997, ble fortynnet med 0,1 m natriummaleinatpuffer pH

6,0 tilsvarende SE-innhold.

2) Glucoseoksydasereagenset fremstilles ved oppløs-ning av 2 mg glucoseoksydase (firma Boehringer Nr. 15423 EGAB) 1 100 ml 0,565 m tris-CHl-puffer pH 7,0 og etterfølgende tilsetning av 1 ml detergensoppløsning (2 g triton X 100 + 8 g 95% etanol p.a.), 1 ml dianisidinoppløsning (260 mg o-dianisidin . 2 HC1 i 20 ml HpO) og 0,5 ml 0,1% vandig peroksydaseoppløsning

.(firma Boehringer Nr. 15302 EPAP_)_7.

Til vurdering beregnes den prosentuelle hemning

av den anvendte saccharase og omregnes fra 50%-hemningspunktet ved hjelp av en glucosejusteringskurve til SIE/g resp. SIE/liter.

Omdannelsen av amylaseinhibitoren til saccharaseinhibitor foregår ved avspaltning av hemmeinaktive molekylbrudd-stykker (for det meste mono-, di- eller trisaccharider) fra inhibitor-molekylene. Denne avspaltning av hemmeinaktive mole-kylbruddstykker foregår ved enzymatisk-hydrolytisk eller kjemisk-hydrolytisk spaltning, fortrinnsvis betjener man seg av syre-hydrolyse ved høye temperaturer. Hertil hydrolyserer 1 - 40%, fortrinnsvis 2 - 20%, oppløsninger av ovennevnte høypotente amylaseinhibitorer i 0,1 - 5 n, fortrinnsvis 0,5 - 2 n, mineral-syre, fortrinnsvis HC1 eller f^SO^ i 0,1 - 6 timer, fortrinnsvis i 0,5 - 4 timer ved 60 - 110°C, fortrinnsvis 80 - 100°C. Derved iakttar man med økende hydrolysevarighet et steilt fall av den amylaseinhibitoriske aktivitet av oppløsningen ved samtidig steil stigning og etterfølgende flatt fall av den saccharase-inhibitoriske aktivitet av oppløsningene. Kvotienten f =

SIE 3

jjg— x 10 øker med økende hydrolysevarighet tilsvarende steilt l_ sammenlign fig. 1. Denne viser det tidsmessige forløp av amylaseinhibitorinnholdet (1) og saccharaseinhibitorinnholdet (2) samt kvotienten f (3) av en 2% oppløsning av amylaseinhibitor fra stammen SE 50 ved hydrolyse i 0,5 n HC1 ved 100°C over 0 - 100 minutter. På x-aksen er det oppført tiden i minutter, på y-^-aksen AIE x 10° pr. liter, på y2~aksen SIE x 10 pr. liter og på y^-aksen kvosienten f7. Høye syrekonsentrasjoner, lave konsentrasjoner av inhibitoret i oppløsningen og høye temperaturer bevirker en spesielt sterk økning av f-verdien, altså en

spesielt kraftig forskyvning av saccharase/amylase-inhibisjons-forholdet til saccharase £~sammenlign fig. 2 og 3. Disse figurer viser det tidsmessige forløp av saccharase/amylase-inhibi-sjonsforholdet mot hydrolysetiden ved forskjellige hydrolysebe-tingelser/. I begge figurer viser x-aksen tiden i minutter, y-aksen kvotienten f.

Fig. 2 viser hydrolyseforløpet ved 100°C,

Fig. 3 viser innvirkning av syrekonsentrasjonen og hydrolysetemperatur på SIE/AIE-forholdet. C = 20 mg amylaseinhibitor fra stamme SE 50/ml syre (HC1).

Isoleringen av det saccharaseinhiberende prinsipp fra slike hydrolysater foregår best ved adsorpsjon på aktivt kull etter foregående nøytralisering av hydrolysatet og etter-følgende fraksjonerende desorpsjon av inhibitoren fra kull med vandige alkoholer eller vandig aceton. Når hydrolysatene er meget mørkfargede, avfarges de før adsorpsjonen av saccharase-' inhibitoren på kull ved sure pH-verdier (pH 1-3) med aktivt kull.

Hemningskapasiteten av de beste inhibitorpreparater

utgjør 15-000 SIE/g.

Avbygningen ifølge oppfinnelsen kan også foregå

enzymatisk, hvortil det spesielt egner seg g-amylase.

Det er kjent at ved dyr og mennesker etter opptak av saccharoseholdige nærings- og nytelsesmidler opptrer hyperglykemier som på grunn av en hurtig spaltning av saccharosen ved hjelp av saccharaser fra fordøyelseskanalen bevirkes etter følgende skjema

saccharase „ , ' - . saccharose <g>lucose + fructose Disse hyperglykemier er ved diabetikere spesielt sterkt og vedvarende utpreget. Ved adipøse bevirker den alimentære hyperglykemi ofte en spesiell sterk insulinsekresjon, som på sin side

fører til formeret fettoppbygning og nedsatt fettavbygning.

De ifølge oppfinnelsen etter ovennevnte metode utvundne og isolerte saccharaseinhibitorer nedsetter den alimentære hyperglykemi og hyperinsulinemi på rotter etter belast-ning med saccharose betraktelig.

Videre er det kjent at karies etter nytelse av saccharoseholdige nytelses- og næringsmidler forekommer spesielt sterkt og hyppig /"f.eks. B.W.. Gold: Advances in Applied Micro-biology 11 (1969) 135-157/- En hemning av saccharosespaltningen ved inhibitoren ifølge oppfinnelsen nedsetter dannelsen av kario-gene stoffer i munnhulen.

Inhibitoren ifølge oppfinnelsen egner seg derfor som terapeutikum for følgende indikasjoner: Adipositas, Hyperlipemi (Atherosklerose), Diabetes, Predia-betes, Karies.

Dosering:

100 - 10.000 SIE en eller flere ganger daglig før og/eller under og/eller etter måltidene p. os.

Tilberedelses former:

Tabletter, drasjeer, kapsler, oppløsninger, sus-pensjoner, granulater, tyggegummi, tannpasta og som tilsetning til saccharoseholdig nærings- og/eller nytelsesmidler.

Eksempel 1.

5 g av amylaseinhibitoren fra Actinoplanaceen-stammen CBS-Nr. 961.70 med 10 x 10<6> AIE/g og 220 SIE/g ble opp-løst i 50 ml 0,05 m Na-acetatpuffer pH 4,5 og blandet med 25 mg B-amylase fra bygg og inkubert ved 35°C. Etter 3 timer var spaltningen avsluttet. Inkubasjonsblandingen ble inndryppet direkte i 450 ml tørrsprit under omrøring, den hvite fnokkede utfelling suget fra, vasket med vann og eter hver gang 2 ganger og tørket i vakuum.

Utbytte: 2,5 g med 4,6 x 10<6> AIE/g og 700 SIE/g.

Eksempel 2.

100 g av amylaseinhibitoren fra stammen SE 50 ble oppløst i 500 ml 2 n H2S0ij og hydrolysert i 4 timer ved 100°C. Den sortbrune oppløsning ble etter avkjøling med 10 n KOH inn-stillet på pH 2,0 og for avfarging blandet to ganger hver gang med 4 g aktivt kull, omrørt hver gang ca. 10 minutter og frasuget. Kullene ble kassert, det lysegule fargede filtrat nøy-tralisert med 10 n KOH (pH 6,6). Man blandet med 20 g aktivt

kull til adsorpsjon av hemmeaktive bruddstykker på kullene. Etter 10 minutters omrøring ble det suget fra, filtratet igjen adsorbert med-10 g aktivt kull. Kullresiduumet ble forenet, filtratet kassert. De forenede kullresiduer ble for fjerning av resterende salt og glucose vasket med 2 liter destillert vann og 2 liter 2,5%-ig etanol på nutschen og deretter desor-bert hver gang tre ganger med hver gang 750 ml 10%-ig og deretter 15%-ig etanol. Til desorpsjonen ble det hver gang omrørt i 10 minutter, deretter frasuget og blandet med friskt desorp-sjonsmiddel. De tilsvarende filtratet av den 10%-ige resp. 15%-ige desorpsjon ble forenet, inndampet på rotasjonsfordamper til ca. 20 ml og deretter lyofilisert.

Utbytte: ca. 2 g av 10% fraksjonen og 1,2 g av 15% fraksjonen. Spesifikk aktivitet: 10% fraksjonen 9000 SIE/g, 0,2x10^ AIE/g

15% fraksjonen 15000 SIE/g, 0,5xl0<6> AIE/g Eksempel 3-

200 mg av en fra aktinoplanaceen-stammen CBS-Nr. 615.71 isolert amylaseinhibitor (6 x 10<6> AIE/g, l60 SIE/g) ble oppløst i 10 ml 0,75 n HC1. Utgangsoppløsningen hadde en aktivitet på 120 x 10<6> AIE/1 ved 3200 SIE/1. Denne oppløsning ble inkubert i 30 minutter ved 100°C i vannbad, deretter av-kjølt og prøvet. Innholdet av det således dannede hydrolysat av amylaseinhibitor utgjorde 8 x 10^ AIE/liter, innhold av saccharaseinhibitor 21.000 SIE/liter.

Eksempel 4.

200 mg av et fra aktinoplanaceen-stammen CBS-Nr. 957.70 isolert amylaseinhibitor (4 x 10<6> AIE/g, 310 SIE/g) ble oppløst i 10 ml 0,75 n HC1. Utgangsoppløsningen hadde en aktivitet på 80 x 10<6> AIE/liter og 6200 SIE/liter. Denne opp-løsning ble inkubert i 30 minutter ved 100°C i vannbad, deretter avkjølt og prøvet. Innholdet av det således dannede hydrolysat av amylaseinhibitor utgjorde 10 x 10^ AIE/liter, av saccharasep inhibitor 28.000 SIE/liter.

Eksempel 5 -

Porsøksanordning til virkningspåvisning av virksomt stoff fra eksempel 2 på rotter i saccharosebelastningsforsøk.

For frembringelse av en hyperglykemi og hyperinsulinemi etter kullhydrat foring får rotter (n = 2,5 g/kg som saccharose som oppløsning p. os. Et like antall rotter ble i tillegg til saccharosen oralt applisert til nevnte virksomme stoff til avsvekning av hyperglykemi og hyperinsulinemi. Blodglucose og seruminsulin ble bestemt i de angitte tidsav-stander etter kullhydratbelastningen. Bestemmelsen av reduserende kullhydrater foregikk i auto-analysør £~Technicon, ifølge Hoffmann: J. biol. Chem. 120, 51 (193727, bestemmelse av insulin ifølge Hales og Randle [_ Biochem. J. 88, 137 (19 6 327" • Blod uttas fra rottenes retroorbitale venepleksus.

Tabell 1 til eksempel 5-

Blodglucose i mg% (middelverdi ± ls) og seruminsulin i ^uE/ml.

(Middelverdi ± ls) av fastende rotter til forskjellige tider etter oral inngivning av saccharosé ± virksomt stoff fra eksempel 2.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av saccharaseinhibitorer, karakterisert ved at ved dyrkning av en av stammene Actinoplanes CBS 961.70, CBS 615-71 eller CBS 957-70 utvunne amylaseinhibitorer fra klassen av oligo- eller polysaccharider eller deres derivater nedbrytes hydrolytisk til saccharaseinhibitorer ved hjelp av vandige syrer ved 60 - 110°C eller enzymatisk med g-amylase.