DE2209832A1 - Verfahren zur herstellung von saccharaseinhibitoren - Google Patents

Verfahren zur herstellung von saccharaseinhibitoren

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Description

2209832 FARBENFABRIKEN BAYER AG
LEVERKUSEN-Bayerwerk .
ϊ 9F". 1972
Patente, Maiken und Lizenzen
Si/MH
Verfahren zur Herstellung von SaccharaseinhiMtoren
Gegenstand älterer Patentanmeldungen (z. B. deutsche Patentanmeldung P 20 64,092.0) ist die Erkenntnis, daß eine Reihe von Actinomyceten, vor allem die Actinoplanaceen, Inhibitoren für Glykosidhydrolasen vorzugsweise kohlenhydratspaltender Enzyme des Verdauungstraktes bilden. Eine Gruppe dieser Inhibitoren ist relativ hitzestabil und bei Raumtemperatur säure- und alkalistabil. Diese Inhibitoren gehören chemisch in die Klasse der Oligo- oder Polysaccharide bzw. deren Derivate.
Die meisten der Inhibitoren aus dieser Gruppe sind hochpotente Amylaseinhibitoren, aber mar mittelstarke oder schwache Saccharaseinhibitoren.
Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren zur Umwandlung der genannten Amylaseinhibitoren in potente Saccharaseinhibitoren. Ss besteht darin, daß man die Amylaseinhibitoren enzymatisch oder chemisch abbaut.
Amylasetest
Eine Amylase-Inhibitor-Einheit (1 AIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Amylaseeinheiten zu 50 # inhibieren. Eine Amylaseeinheit (AE) ist die Menge an Enzym, die in einer
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Hinute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 λχ Äquivalent glucosidischer Bindungen in der Stärke spaltet. Die /uVal gespaltenen Bindungen werden als yuVal gebildeter reduzierender Zucker mit Dinitrosalicylsäure kolorimetrisch bestimmt und mit Hilfe einer Maltoseeichkurve als /uVal Maltoseäquivalente angegeben. Zur Durchführung de3 Testes werden 0,1 ml Amylaselösung (20 - 22 AE/ml) mit 0-10 yug Inhibitor oder 0-20 yul der zu testenden Lösung in 0,4 ml 0,02 m Natriumglycerophosphatpuffer/0,001 m CaCIp pH 6,9 versetzt und etwa 10-20 Minuten in einem Wasserbad von 35°C äquilibriert. Dann wird 5 Minuten mit 0,5 ml einer auf 35 C vorgewärmten 1 # Stärkelösung (Stärke, löslich, der Firma Merck, Darmstadt, Nr. 1252) bei 35°C inkubiert und anschließend mit 1 ml Dinitrosalicylsäure-Reagens (nach P. Bernfeld in Colowick-Kaplan, Meth. Enzymol., Band J-, Seite 149) versetzt. Zur Farbentwicklung wird der Ansatz 5 Minuten auf dem siedenden Wasserbad erhitzt, dann abgekühlt und mit 10 ml destilliertem Wasser versetzt. Die Extinktion bei 540 nm wird gegen einen entsprechend angesetzten Leerwert ohne Amylaöe gemessen. Zur Auswertung wird aus einer vorher aufgenommenen Amylaseeichkurve die nach Inhibitorzusatz noch wirksame Amylaseaktivität abgelesen und daraus die prozentuale Hemmung der eingesetzten Amyläse errechnet. Die prozentuale Hemmung wird als Funktion des Quotienten
Inhibitor +
AE ++
+ bezögen auf Trockensubstanz
++ AE im nicht inhibierten Ansatz der gleichen Serie
aufgetragen, der 50 ^ Hemmungspunkt aus der Kurve abgelesen und auf AIE/mg Inhibitor umgerechnet.
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Saccharasetest
Eine Saccharase-InhiMtor-Einheit (SIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Saccharaseeinheiten zu 50 $ inhibieren. Eine Saccharaseeinheit (SE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Tesfbedingungen 1 yuMol Saccharose in Glucose und Fructose spaltet. Die yuKol gebildete Glucose wird mit Hilfe der Glucoseoxxdasereaktion quantitativ bestimmt unter Bedingungen, bei denen eine weitere Baccharosespaltung durch die Saccharsise nicht mehr stattfindet. Zur Durchführung des Testes v/erden 0,05 ml einer auf 0,12 SE eingestellten Saccharaselösung ' mit 0-20 yug Inhibitor oder 0-20 yul der zu testenden Lösung versetzt und mit 0,1 m Natriumraaleinatpuffer pH 6,0 auf 0,1 ml aufgefüllt. Es wird 10 Minuten bei 35°C äquilibriert und dann mit 0,1 ml einer auf 35°C vorgewärmten 0,05 na Eaccharoselösung in 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 versetzt. Man inkubiert 20 Minuten bei 350C und stoppt die Saccharasereaktion durch Zugabe
2)
von 1 ml Glucoseoxidasereagens ' ab und inkubiert weitere 30 Minuten bei 35°C. Danach wird 1 ml 50 fo H 2S0. zugesetzt und bei 545 mn gegen einen entsprechenden Leerwert gemessen.
' Solubilisierte Saccharase aus Schweinedünndarmmucosa nach B. Borgström, A. Dahlquist, Acta Chem. Scand. J_2, (1958), Seite 1997. Mit 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 auf entsprechenden SE-Gehalt verdünnt.
2)
' Das Glucoseoxidasereagens wird durch Lösen von 2 mg GIu= coseoxidase (Pa. Boehringer Nr. 15423 EGAB) in 100 ml 0,565 m Tris-HCl-Puffer pH 7,0 und anschließenden Zusatz von 1 ml Detergenslösung (2 g Triton X 100 + 8 g 95 fo Äthanol p. a.), 1 ml Dianisidinlösung (260 mg o-Dianisidin • 2 HCl in 20 ml H3O) und 0,5 ml 0,1 $iger wäßriger Peroxi= daselösung (Pa. Boehringer Nr. 15302 EPAP) hergestellt.
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Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten Saccharase berechnet und aus dem 50 $ Hemmpunkt mit Hilfe einer Glucoseeichkurve auf SIE/g bzw. SIE/Liter umgerechnet.
Die Umwandlung der Amylaseinhibitoren in Sacoharaseinhibitoren geschieht durch Abspaltung hemminaktiver Molekülbruchstücke (meist Mono-, Di- oder Trisaccharide) aus den Inhibitor-Molekülen. Diese Abspaltung hemminaktiver Molekülbruchstücke erfolgt durch enzymatisch- hydrolytische oder durch chemisch-hydrolytische Spaltung; vorzugsweise bedient man sich der Säurenydrolyse bei hohen Temperaturen. Dazu werden 1 - 40 #ige, vorzugsweise 2-20 #ige, Lösungen der vorgenannten hochpotenten Amylaseinhibitoren in 0,1 - 5 n, vorzugsweise 0,5 - 2 n, Mineralsäuren, vorzugsweise HCl oder HpSO., während 0,1 - 6 Stunden, vorzugsweise während 0,5-4 Stunden, bei 60 - 11O0C, vorzugsweise 80 - 1000C, hydrolysiert. Dabei beobachtet man mit zunehmender Hydrolysedauer einen steilen Abfall der amylaseinhibitorischen Aktivität der Lösungen bei gleichzeitigem steilen Anstieg und anschließendem flachen Abfall der saccharaseinhibitorischen
Aktivität der Lösungen. Der Quotient f = j^g χ 10 3 steigt
mit steigender Hydrolysedauer entsprechend steil an ^vergleiche Abb. 1. Diese zeigt den zeitlichen Verlauf des Amylaseinhibitorgehaltes (1) und Saccharaseinhibitorgehaltes (2) sowie des Quotienten f (3) einer 2 #igen Lösung des Amylaseixihibitore aus dem Stamm SE 50 bei Hydrolyse in 0,5 η HCl bei 1000C über 0 - 100 Minuten. Auf der x-Achse ist die Zeit in Minuten, auf der y1-Achse AIE χ 10 pro Liter, auf der y2-Achse SIE χ pro Liter und auf der y,-Achse der Quotient f aufgetragen!/ Hohe Säurekonzentrationen, niedrige Konzentrationen des Inhibitors in der Lösung und hohe Temperaturen bewirken ein besonders starkes Ansteigen des f-Wertes, also eine besonders kräftige Verschiebung der Saccharase/Amylase-Inhibitions-
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relation zur Saccharase /yg±> Abb. 2 und 3. Diese Abbildungen zeigen den zeitlichen Verlauf der Saccharase/Amylase-Inhibitionsrelation gegen die Hydrolysezeit bei verschiedenen Hydrolysebedingungenj/7 In beiden Abbildungen zeigt die x-Achse die Zeit in Minuten, die y-Achse den Quotient f.
Abb. 2 zeigt den Hydrolyse-Verlauf bei 1000C, Kurve 1 1 η HCl 20 mg/ml, Kurve 4 0,75 η HCl 200 mg/ml, Kurve 2 1 η HCl 200 mg/ml, Kurve 5 0,5 η HCl 20 mg/ml, Kurve 3 0,75 η HCl 20 mg/ml, Kurve 6 0,5 η HCl 200 mg/ml.
Abb. 3 zeigt den Einfluß der Säurekonzentration und Hydrolysetemperatur auf das SIE/AIE-Verhältnis. C = 20 mg Amylaseinhibitor aus Stamm SE 50/ml Säure (HCl). Kurve 1 2 η 900C, Kurve 5 0,5 η 9O0C, Kurve 2 2 η 800C, Kurve 6 2 η 7O0C =0,5 8O0C,
Kurve 3 1 η 9O0C, Kurve 7 2 η 600C, Kurve 4 1 η 8O0C, Kurve 8 1 η 700C.
Die Isolierung des saccharaseinhibierenden Prinzips aus derartigen Hydrolysaten geschieht am besten durch Adsorption an Aktivkohle nach vorherigem Neutralisieren des Hydrolysats und anschließender fraktionierender Desorption des Inhibitors von der Kohle mit wäßrigen Alkoholen oder wäßrigem Aceton. Wenn die Hydrolysate sehr dunkel gefärbt sind, werden sie vor der Adsorption des Saccharaseinhibitors an die Kohle bei sauren pH-Werten (pH 1 - 3) mit Aktivkohle entfärbt.
Die Hemmkapazität der besten Inhibitorpräparate beträgt 15 000 SIE/g.
Der erfindungsgemäße Abbau kann auch enzymatisch erfolgen, wofür sich ß-Amylase besonders eignet.
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Es ist bekannt, daß bei Tieren und Menschen nach Aufnahme von saccharosehaltigen Nahrungs- und Genußnitteln Hyperglykämien auftreten, die infolge einer raschen Spaltung der Saccharose durch Saccharasen des Verdauungstraktes nach folgendem Schema
Saccharase
Saccharose ^ Glucose + Fructose
bewirkt werden. Diese Hyperglykämien sind bei Diabetikern besonders stark und anhaltend ausgeprägt. Bei Adipösen bewirkt die alimentäre Hyperglykämie oftmals eine besonders starke Insulinsekretion, die ihrerseits zu vermehrtem Fettaufbau und vermindertem Fettabbau führt.
Die erfindungsgemäß nach obigen Methoden gewonnenen und isolierten Saccharaseinhibitoren vermindern die alimentäre Hyperglykämie und Hyperinsulinämie von Ratten nach Belastung mit Saccharose erheblich.
Weiter ist bekannt, daß Karies nach Genuß von saccharosehaltigen Genuß- und Nahrungsmitteln besonders stark und häufig vorkommt /z. B. W. Gold: Advances in Applied Microbiology 11 (1969) 135 - 1527· Sine Hemmung der Saccharosespaltung durch erfindungsgemäßen Inhibitor vermindert die Bildung kariogener Stoffe in der Mundhöhle.
Die erfindungsgemüßer. Inhibitoren eignen sich deshalb als Therapeuticum für die folgenden Indikationen: .Adipositas, Hyperlipämie (Atherosklerose), Diabetes, Prädiabetes, Karies.
Dosierung: 100 - 10 000 SIE ein oder mehrmals täglich vor und/oder während und/oder nach den Mahlzeiten p. os.
Zubereitungsformen: Tablette, Dragee, Kapsel, Lösung, Suspension, Granulat, Kaugummi, Zahnpasta und als Zusatz zu saccharosehaltigen LebenB- und/oder Genußmitteln.
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Beispiel 1
5 g des Amylaseinhibitors aus dein Actinoplanaceen-Stamm SE 50 (GBS-IIr. 961.70) mit 10 χ 106 AIE/g und 220 SIE/g wurden in 50 ml 0,05 π Na-Acetatpuffer pH 4,5 gelöst und mit 25 mg ß-Amylase aus Gerste versetzt und bei 35°C inkubiert. Nach 3 Stunden war die Spaltung beendet. Der Inkubationsansatz wurde direkt in 450 ml Trockensprit unter Rühren eingetropft, die weiße flockige Fällung abgenutscht, mit Äthanol und Äther je 2mal gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeuteί 2,5 g mit 4,6 χ 106 AIE/g und ?0G SIE/g.
Beispiel 2
100 g des Amylaseinhibitors aus dem Stasra SE 50 wurden in 500 ml 2 η HgSO^ gelöst und 4 Stunden bei 1000C hydrolysiert. Die schwarzbraune Lösung wurde nach dem Abkühlen mit 10 η KOH auf pH 2,0 eingestellt und zur Entfärbung 2mal mit je 4 g Aktivkohle versetzt, jeweils ca. 10 Minuten gerührt und abgenutscht. Die Kohle wurde verworfen, das hellgelb gefärbte Filtrat mit 10 η KOH neutralisiert (pH 6,6). Man versetzte mit 20 g Aktivkohle zur Adsorption der hemmaktiven Bruchstücke an die Kohle. Nach 10-minütigem Rühren wurde abgenutscht und das Piltrat nochmals mit 10g Aktivkohle adsorbiert. Die Kohlerückstände wurden vereinigt, das Piltrat verworfen. Die vereinigten Kohlerückstände wurden zur Entfernung restlicher Salze und Glucose mit 2 Liter destilliertem Wasser und 2 Liter 2,5 5°igem Äthanol auf der Nutsche gewaschen und anschließend je 3mal mit ,je 750 ml 10 .tigern und dann 15 #igem Äthanol desorbiert. Zur Desorption wurde jeweils 10 Minuten gerührt, dann abgenutscht und mit frischem Desorptionsmittel versetzt. Die entsprechenden Filtrate der 10 $> bzw. 15 $> Desorption wurden vereinigt, am Rotationsverdampfer auf ca. 20 ml eingeengt und Anschließend lyophilisiert,
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Ausbeute: ca. 2 g der 10 f» Fraktion und 1,2 g der 15 $ Fraktion.
Spez. Aktivität: 10 ·£ Fraktion 9 000 SIE/g;0,2 χ 10 AIE/g
15 £ Fraktion 15 000 SIE/g; 0,5 x 106 AIE/g
Eeist;iel 3
200 ng eines aus den Actinoplanaceen-Stamm SE 82 (CBS-Nr. 615.71) isolierten Ainylaseinhibitors (6 χ 10 AIE/g, 160 SIE/g) wurden in 10 ml 0,75 η HGl gelöst. Die Ausgangslösung hatte eine Aktivität von 120 χ 10 AIE/Liter bei 3 200 SIE/Liter. Diese Lösung wurde 30 Minuten bei 1000C im Wasserbad inkubiert, dann abgekühlt und getestet. Der Gehalt des so gewonnenen Hydrolysate an Amylaseinhibitor betrug 8 χ 10 AIE/Liter, der Gehalt an Saccharaseinhibitor 21 000 SIE/Liter.
Beispiel 4-
200 ng eines aus dem Actinoplanaceen-Stamm SB 18 (CBS-Nr. 957.70) isolierten Anylaseinhibitors (4 x 10 AIE/g, 31Ο SIE/g) wurden in 10 ml 0,75 η HCl gelöst. Die Ausgangslösung hatte eine Aktivität 80 χ 10 AIE/Liter und 6 200 SIE/Liter. Diese Lösung wurde 30 Minuten bei 1000C im Wasserbad inkubiert, dann abgekühlt.und getestet. Der Gehalt des so gewonnenen Hydrolysate an Amylaseinhibitor betrug 10 χ 10 AIE/Liter, an Saccharaseinhibitor 26 COO SIE/Liter.
Beispiel 5
Yersuchsanordnung zum Wirkungsnachweis vom Wirkstoff aus Beispiel 2 an Ratten im Saccharosebelastungsversuch.
Zur Erzeugung einer Hyperglykäaie und Hyperinsulinämie nach Kohlenhydratverfüxterung erhalten Ratten (n = 6) 2,5 g/kg
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3 22U9832
Saccharose als Lösung p. os. Einer gleichen Anzahl von Ratten wird zusätzlich zur Saccharose der genannte Wirkstoff zur Abschwächung der Hyperglykämie und Hyperinsulinämie oral appliziert. Blutglucose und Seruminsulin werden in den angegebenen Zeitabständen nach Kohlenhydratbelastung bestimmt. Die Bestimmung reduzierender Kohlenhydrate erfolgt im Auto-Analyzer /Technicon® , nach Hoffman: J. biol. Ghem. 120. 51 093717, die Bestimmung des Insulins nach Haies und Rändle ^Biochem. J. 88. 137 (1963^7. Blut wird aus dem retroorbitalen Venenplexus der Ratten entnommen.
Tabelle 1 zu Beispiel 5
Blutglucose in mg$ (Mittelwert - Is) und Seruminsulin in yuE/ral (Mittelwert - Is) von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach oraler Gabe von Saccharose - Wirkstoff aus Beispiel 2.
Dosis/kg Blutglucose 79 20 Min. 1? 1 Seruminsulin 20 Min.
P. OS. 10 148 ί 4,8 31 £ 0 S ± 7*3
Kontrolle
ohne
Saccharose		 79 ± 5,9 34 ± 17 8 + 1I9O 39 - 13.2
Kontrolle
mit
Saccharose		 142 i 20 _35 11 + 14,2 7 ί 2j8
Saccharose
+ 100 SIE		 + - 7 6 + 5s7
Saccharose
+ 1000 SIE		 32 ί 5,2
===== ρ < 0,001 gegen Saccharose-Kontrolle P < 0,01 " " " P < 0,05 " " "·
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Claims (4)

Patentansprüche
1) Verfahren zur Herstellung von Saccharaseinhibitoren,
dadurch gekennzeichnet, daß man Amylaseinhibitoren aus der Klasse der Oligo- oder Polysaccharide bzw. deren
Derivaten zu Saccharaseinhibitoren abbaut.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Amylaseinhibitoren aus den Actinoplanaceenstämmen SE 50, SE 82 oder SB 18 abbaut.
3) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Abbau mittels wäßriger Säuren bei erhöhter Temperatur durchführt.
4) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Abbau enzymatisch durchführt.
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