DE2209832B2

DE2209832B2 - Herstellung von Saccharaseinhibitoren

Info

Publication number: DE2209832B2
Application number: DE2209832A
Authority: DE
Inventors: Werner Dr. Frommer; Walter Dr. Puls; Delf Dr. Schmidt
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1972-03-01
Filing date: 1972-03-01
Publication date: 1978-07-27
Also published as: HU171216B; GB1376574A; IL41611A0; FR2174238A1; AT319171B; IE37351B1; BG25655A3; SU576050A3; FR2174238B1; AR196913A1; DE2209832A1; CS189590B2; DD105243A5; FI49840C; RO77618A; NO136844B; SE418454B; DK129530B; ZA731397B; AU5265973A

Description

Gegenstand älterer Patentanmeldungen (z. B. deutsche Patentanmeldung P 20 64 092.0) ist die Erkenntnis, daß eine Reihe von Actinomyceten, vor allem die Actinoplanaceen, Inhibitoren für Glykosidhydrolasen, insbesondere kohlenhydratspaltender Enzyme des Verdauungstraktes bilden. Eine Gruppe dieser Inhibitoren ist relativ hitzestabil und bei Raumtemperatur säure- und alkalistabil. Diese Inhibitoren gehören chemisch in die Klasse der Oligo- oder Polysaccharide bzw. deren Derivate.

Die meisten der Inhibitoren aus dieser Gruppe sind hochpotente Amylaseinhibitoren, aber nur mittelstarke oder schwache Saccharaseinhibitoren.

Die Erfindung befaßt sich mit der Umwandlung der genannten Amylaseinhibitoren in potente Saccharaseinhibitoren. Dieses Verfahren zur Hersteilung von Saccharaseinhibitoren ist dadurch gekennzeichnet, daß man die von den Actinoplanaceenstämmen CBS 957.70, 961.70 und 615.71 gebildeten Amylaseinhibitoren in 1 bis 40% Lösung mit 0,1 bis 5 n-Mineralsäuren während 0,1 bis 6 Stunden bei 60 bis 110⁰C hydrolysiert oder sie enzymatisch hydrolysiert.

Amylasetest

Eine Amylase-Inhibitor-Einheit (1 AIE) ist definiert als die Menge inhibitor, die zwei Amylaseeinheiten zu 50% inhibieren. Eine Amylaseeinheit (AE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 μ Äquivalent glucosidischer Bindungen in der Stärke spaltet. Die μ\α\ gespaltenen Bindungen werden als μνβΐ gebildeter reduzierender Zucker mit Dinitrosalicylsäure kolorimetrisch bestimmt und mit Hilfe einer Maltoseeichkurve als μν&\ Maltoseäquivalente angegeben. Zur Durchführung des Testes werden 0,1 ml Amylaselösung (20 — 22 AE/ml) mit 0-10μg Inhibitor oder 0-20 μΐ der zu testenden Lösung in 0,4 ml 0,02 m Natriumglycerophosphatpuffer/0,001-m CaCl₂ pH 6,9 versetzt und etwa 10 — 20 Minuten in einem Wasserbad von 35°C äquilibriert. Dann wird 5 Minuten mit 0,5 ml einer auf 35° C vorgewärmten 1% Stärkelösung bei 35° C inkubiert und anschließend mit 1 ml Dinitrosalicylsäure-Reagens (nach P. Bernfeld in Colowick-Kaplan, Meth. Enzymol., Band 1, Seite 149) versetzt. Zur Farbentwicklung wird der Ansatz 5 Minuten auf dem siedenden Wasserbad erhitzt, dann abgekühlt und mit 10 ml destilliertem Wasser versetzt. Die Extinktion bei 540 nm wird gegen einen entsprechend angesetzten Leerwert ohne Amylase gemessen. Zur Auswertung wird aus einer vorher aufgenommenen Amylaseeichkurve die nach Inhibitorzusatz noch wirksame Amylaseaktivität abgelesen und daraus die prozentuale Hemmung der eingesetzten Amylase errechnet. Die prozentuale Hemmung wird als Funktion des Quotienten

μ» Inhibitor*)
AE**)

*l Bezogen iiuf Trockcnsiihsuiu/.
**) AE im nichl inhibierten Ansät/ der gleichen Serie.

aufgetragen, der 50% Hemmungspunkt aus der Kurve abgelesen und auf AI E/mg Inhibitor umgerechnet.

Saccharasetest

Eine Saccharase-Inhibitor-Einheit (SIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Saccharaseeinheiten zu 50% inhibieren. Eine Saccharaseeinheit (SE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 μΜοΙ Saccharose in Glucose und Fructose spaltet. Die μΜοΙ gebildete Glucose wird mit Hilfe der Glucoseoxidasereaktion quantitativ bestimmt unter Bedingungen, bei denen eine weitere Saccharosespaltung durch die Saccharose nicht mehr stattfindet. Zur Durchführung des Testes werden 0,05 ml einer auf 0,12SE eingestellten Saccharaselösung¹) mit 0 — 20 μg Inhibitor oder 0—20 μ! der zu testenden Lösung versetzt und mit 0,1-m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 auf 0,1ml aufgefüllt. Es wird 10 Minuten bei 35°C äquilibriert und dann mit 0,1 ml einer auf 35°C vorgewärmten 0,05-m Saccharoselösung in 0,1-m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 versetzt. Man inkubiert 20 Minuten bei 35° C und stoppt die Saccharasereaktion durch Zugabe von 1 ml Glucoseoxidasereagens²) ab und inkubiert weitere 30 Minuten bei 35° C. Danach wird 1 ml 50% H₂SO₄ zugesetzt und bei 545 nm gegen einen entsprechenden Leerwert gemessen.

Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten Saccharase berechnet und aus dem 50% Hemmpunkt mit Hilfe einer Glucoseeichkurve auf SIE/g bzw. SIE/Liter umgerechnet.

Die Umwandlung der Amylaseinhibitoren in Saccharaseinhibitoren geschieht durch Abspaltung hemminaktiver Molekülbruchstücke (meist Mono-, Di- oder Trisaccharide) aus den Inhibitor-Molekülen. Diese Abspaltung hemminaktiver Molekülbruchstücke erfolgt durch enzymatisch-hydrolytische oder durch chemischhydrolytische Spaltung; am besten bedient man sich der Säurehydrolyse unter folgenden Bedingungen:

l-40%ige, am besten 2-20%ige, Lösungen der vorgenannten hochpotenten Amylaseinhibitoren werden in 0,1 —5 n-, am besten 0,5 — 2 n-Mineralsäuren, am günstigsten HCl oder H₂SO₄, während 0,1 —6 Stunden, am besten während 0,5-4 Stunden, bei 60-110°C, am günstigsten 80-100° C, hydrolysiert. Dabei beobachtet man mit zunehmender Hydrolysedauer einen steilen Abfall der amylaseinhibitorischen Aktivität der Lösungen bei gleichzeitigem steilem Anstieg und anschließen-

') Solubilisierte Saccharase aus Schweinedünndarmmucosa nach B. Borgström, A. Dahlquist, Acta Chem. Scand. 12, (1958), Seite 1997. Mit 0,1-m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 auf entsprechenden SE-Gehalt verdünnt.
²) Das Glucoseoxidasereagens wird durch Lösung von 2 mg Glucoseoxidase in 100 ml 0,565-m Tris-HCl-Puffer pH 7,0

^b5 und anschließenden Zusatz von 1 ml Detergenslösung (2 g Triton X 100 + 8 g 95% Äthanol p. a.), 1 ml Dianisidinlösung (260 mg o-Dianisidin ■ 2 HCI in 20 ml H2O) und 0,5 ml 0,l%iger wäßriger Peroxidaselösung hergestellt.

dem flachem Abfall der saccharaseinhibitorischen Aktivität der Lösungen. Der Quotient

./ AIC

Kurve 1:
Kurve 2:
Kurve 3:
Kurve 4:
Kurve 5:
Kurve 6:

In-HCI
In-HCl
0,75 n-HCl
0,75 n-HCl
0,5 n-HCl
0,5 n-HCl

20 mg/ml,
200 mg/ml,

20 mg/ml,
200 mg/ml.

Kurve 1:	2	η	η	η	η	90°	C,
Kurve 2:	2n	η	η		80°	C,
Kurve 3:	1	0,5	η		90°	C,
Kurve 4:	1	2			80°	C,
Kurve 5:	2		90°	C,
Kurve 6:	1		70°	C = 0,5 80⁰C,
Kurve 7:		60°	C,
Kurve 8:	70°	C.

Die Isolierung des saccharaseinhibierenden Prinzips aus derartigen Hydrolysaten geschieht am besten durch Adsorption an Aktivkohle nach vorherigem Neutralisieren des Hydrolats und anschließender fraktionierender Desorption des Inhibitors von der Kohle mit wäßrigen Alkoholen oder wäßrigem Aceton. Wenn die Hydrolysate sehr dunkel gefärbt sind, werden sie vor der Adsorption des Saccharaseinhibitors an die Kohle bei sauren pH-Werten (pH 1 -3) mit Aktivkohle entfärbt.

Die Hemmkapazität der besten Inhibitorpräparate beträgt 15 000 SIE/g.

Der erfindungsgemäße Abbau kann auch enzymatisch erfolgen, wofür sich /J-Amylase besonders eignet.

Es ist bekannt, daß bei Tieren und Menschen nach Aufnahme von saccharosehaltigen Nahrungs- und Genußmitteln Hyperglykämien auftreten, die infolg" einer raschen Spaltung der Saccharose durch Saccharasen des Verdauungs.raktes nach folgendem Schema

■*

steigt mit steigender Hydrolysedauer entsprechend steil an [vergleiche F i g. 1. Diese zeigt den zeitlichen Verlauf des Amylaseinhibitorgehaltes (1) und Saccharaseinhibitorgehaltes (2) sowie des Quotienten /(3) einer 2%igen Lösung des Amylaseinhibitors aus dem Stamm CBS 961.70 bei Hydrolyse in 0,5 n-HCl bei 100°C über 0 - 100 Minuten. Auf der x--Ach.se ist die Zeit in Minuten, auf der yi-Achse AIE χ 10⁶ pro Liter, auf der j^-Achse SIE χ 10³ pro Liter und auf der/3-Achse der Quotient λ aufgetragen]. Hohe Säurekonzentrationen, niedrige Konzentrationen des Inhibitors in der Lösung und hohe Temperaturen innerhalb der im Patentanspruch genannten Bedingungen bewirken ein besonders starkes Ansteigen des /-Wertes, also eine besonders kräftige Verschiebung der Saccharase/Amylase-Inhibitionsrelation zur Saccharase (vgl. F i g. 2 und 3. Diese Abbildungen zeigen den zeitlichen Verlauf der Saccharase/Amyiase-Inhibitionsrelation gegen die Hydrolysezeit bei verschiedenen Hydrolysebedingungen). In beiden Abbildungen zeigt die x-Achse die Zeit in Minuten, die y-Achse den Quotient f.
F i g. 2 zeigt den Hydrolyse-Verlauf bei 100° C

Fig.3 zeigt den Einfluß der Säurekonzentration und Hydrolysetemperatur auf das SIE/AIE-Verhältnis. C = 20 mg Amylaseinhibitor aus Stamm SE 50/ml Säure (HCI).

Saccharase

Saccharose

» Glucose + Fructose

bewirkt werden. Diese Hyperglykämien sind bei Diabetikern besonders stark und anhaltend ausgeprägt. Bei Adipösen bewirkt die alimentäre Hyperglykämie oftmals eine besonders starke Irisulinbekretion, die ihrerseits zu vermehrtem Fettaufbau und vermindertem Fettabbau führt.

Die erfindungsgemäß nach obigen Methoden gewonnenen und dann isolierten Saccharaseinhibitoren vermindern die alimentäre Hyperglykämie und Hyperinsulinämie nach Belastung mit Saccharose erheblich.

Weiter ist bekannt, daß Karies nach Genuß von saccharosehaltigen Genuß- und Nahrungsmitteln besonders stark und häufig vorkommt (z.B. W. Gold; Advances in Applied Microbiology Il 1 [1969] 135— 157). Eine Hemmung der Saccharosespaltung durch erfindungsgemäßen Inhibitor vermindert die Bildung kariogener Stoffe in der Mundhöhle.

Beispiel 1

5 g des Amylaseinhibitors aus dem Actinoplanaceen-Stamm CBS 961.70 mit 10 χ 10° AIE/g und 220 SIE/g wurden in 50 ml 0,05-m Na-Acetatpuffer pH 4,5 gelöst und mit 25 mg jS-Amylase aus Gerste versetzt und bei 35°C inkubiert. Nach 3 Stunden war die Spaltung beendet. Der Inkubationsansatz wurde direkt in 450 ml Trockensprit unter Rühren eingetropft, die weiße flockige Fällung abgenutscht, mit Äthanol und Äther je 2mal gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute:
' 2,5gmit4,6 χ 10⁶ AIE/gund 700SlE/g.

Beispiel 2

100 g des Amylaseinhibitors aus dem Stamm CBS

•40 961.70 wurden in 500 ml 2 n-H₂SO₄ gelöst und 4 Stunden bei 100°C hydrolysiert. Die schwarzbraune Lösung wurde nach dem Abkühlen mit 1On-KOH auf pH 2,0 eingestellt und zur Entfärbung 2mal mit je 4 g Aktivkohle versetzt, jeweils ca. 10 Minuten gerührt und j abgenutscht. Die Kohle wurde verworfen, das hellgelbgefärbte Filtrat mit 1On-KOH neutralisiert (pH 6,6). Man versetzte mit 20 g Aktivkohle zur Adsorption der hemmaktiven Bruchstücke an die Kohle. Nach 1 Ominütigem Rühren wurde abgenutscht und das Filtrat nochmals mit 10 g Aktivkohle adsorbiert. Die Kohlerückstände wurden vereinigt, das Filtrat verworfen. Die vereinigten Kohlerückstände wurden zur Entfernung restlicher Salze und Glucose mit 2 Liter destilliertem Wasser und 2 Liter 2,5°/oigem Äthanol auf der Nutsche gewaschen und anschließend je 3mal mit je 750 ml 10%igem und dann 15%igem Äthanol desorbiert. Zur Desorption wurde jeweils 10 Minuten gerührt, dann abgenutscht und mit frischem Desorptionsmittel versetzt. Die entsprechenden Filtrate der 10% bzw. 15%

bo Desorption wurden vereinigt, am Rotationsverdampfer auf ca. 20 ml eingeengt und anschließend lyophilisiert.

Ausbeute:

ca. 2 g der 10% Fraktion und
_b5 1,2 g der 15% Fraktion.

Spez. Aktivität:

10% Fraktion 9 000SIE/g;O,2 χ 10°AIE/g;

15% Fraktion 15 000SlE/g;O,5 χ IO"AIE/g.

Beispiel 3

200 mg eines aus dem Actinoplanaceen-Stamm CBS 615.71 isolierten Amylaseinhibitors (6 χ 10^hAIE/g, 160 SIE/g) wurden in 10 ml 0,75 n-HCI gelöst. Die Ausgangslösung hatte eine Aktivität von 120 χ IO^b AIE/Liter bei 3200 SIE/Liter. Diese Lösung wurde 30 Minuten bei 100⁰C im Wasserbad inkubiert, dann abgekühlt und getestet. Der Gehalt des so gewonnenen Hydrolysats am Amylaseinhibitor betrug 8 χ 10^h AIE/Liter, der Gehalt an Saccharaseinhibitor 21 000 SIE/Liter.

Beispiel 4

200 mg eines aus dem Actinoplanaceen-Stamm CBS 957.70 isoliertem Amylaseinhibitors (4 χ \0^b AIE/g, 310 SIE/g) wurden in 10 ml 0,75 n-HCI gelöst. Die Ausgangslösung hatte eine Aktivität 80 χ \0^h AIE/Liter und 6200 SIE/Liter. Diese Lösung wurde 30 Minuten bei 100^DC im Wasserbad inkubiert, dann abgekühlt und getestet. Der Gehalt des so gewonnenen Hydrolysats an Amylaseinhibitor betrug 10 χ 10^fcAIE/Litcr, an Saccharaseinhibitor 28 000 SIE/Liter.

2(1

Beispiel 5

Versuchsanordnung zum Wirkungsnachweis vom Wirkstoff aus Beispiel 2 an Ratten im Saccharosebelastungsversuch.

Zur Erzeugung einer Hyperglykämie und Hyperinsulinämie nach Kohlenhydratvcrfüttcrung erhalten Ratten (n = 6) 2,5 g/kg Saccharose als Lösung per os. Einer gleichen Anzahl von Ratten wird zusätzlich zur Saccharose der genannte Wirkstoff zur Abschwächung der Hyperglykämie und Hyperinsulinämie oral appliziert. Blulglucose und Seruminsulin werden in den angegebenen Zeitabständen nach Kohlenhydratbelastung bestimmt. Die Bestimmung reduzierender Kohlenhydrate erfolgt im Auto-Analyzer (Hoffman: J. biol. Chem. 120, 51 [1937]), die Bestimmung des Insulins nach H a I e s und R a η d 1 e (Biochem. J. 88, 137 [1963]). Blut wird aus dem retroorbilalen Venenplexus der Ratten entnommen.

Tabelle 1 zu B e i s ρ i e 1 5

Blutglucose in mg % (Mittelwert ± Is) und Seruminsulin in μΕ/ml (Mittelwert ±ls) von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach oraler Gabe von Saccharose ± Wirkstoff aus Beispiel 2.

Dosis/kg
p.os..

lilutgluco.se 10

20 Min.

Scmminsulin
10

20 Min.

Kontrolle ohne Saccharose	79± 5,9	79 +	4,8	17 ± 11,0	9± 7,3
Kontrolle mit Saccharose	142±20	148 +	17	31 ±14,2	39 ±13,2
Saccharose + 100 SIF.	95+ 5,3	94 +	6,3	8± 5,7	7± 2,8

Saccharose + 1000 SIE

83 ± 5,2 85 ± 7,6

I'<0.001 gegen Saccharose-Kontrolle. 1^><(),()1 gegen Saccharose Kontrolle. P <(),05 gegen Saccharose-Kontrolle.

11± 6,0

8± 5,4

Hierzu 3 BKitt Zeichnungen

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Saccharaseinhibitoren, dadurch gekennzeichnet, daß man die von den Actinoplanaceenstämmen CBS 957.70, 961.70 und 615.71 gebildeten Amylaseinhibitoren in 1- bis 40%iger Lösung mit 0,1 bis 5 n-Mineralsäuren während 0,1 bis 6 Stunden bei 60 bis 110⁰C hydrolysiert oder sie enzymatisch hydrolysiert.