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Amylase-Inhibitor
In der Natur sind hochmole];ulare Hemmstoffe hydrolytischer Enzyme weit verbreitet.
Solche Inhibitoren sind meist Proteine1 die selektiv einzelne Enzyme hemmen. Am
besten bekannt sind heute Inhibitorproteine proteolytischer Enzyme. Inhibitoren
anderer hydrolytischer Enzyme sind bisher weit weniger detailliert untersucht worden
als die Proteinase-Inhibitoren. Eine Ausnahme bilden die -Amvlase-Inhibitoren aus
Pflanzen, deren Existenz schon lange bekannt ist, die aber erst in den letzten Jahren
intensiver erforscht wurden. In der DOS 2003934 wird ein -Amylase-Inhibitor aus
Weizen beschrieben und beansprucht.
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Es wurde nun gefunden, dap sich mit wässerigen, verdünnten Säuren,
vorzugsweise wässerigen verdünnten Mineralsäuren, wie EC1, H2S04 oder H3P04, oder
vor allem bei sauren pH-Werten, aus Bohnen (Bohnenmehl, Phaseolus vulgaris) ein
hochaktiver Inhibitor der Amylase aus Pankreas oder Speichel in hohen Ausbeuten
extrahieren und in einfacher Weise rein darstellen lädt. Der Grad der Hemmung der
beiden Amylasen durch den Inhibitor ist identisch. Der Inhibitor zeigt keine Wirkung
gegen die Amylase aus folgenden Quellen: cc-Amylase aus den Bakterien Bacillus subtilis
und Bacillus amyloliquefaciens sowie «-Amylase aus dem Pilz Asperqillus oryzae.
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In verschiedenen Bohnenarten (Phaseolus vulqaris) ist Inhibitoraktivität
gegen z-Rmylase enthalten. Diese Aktivität ist nicht nur aus den Samen, sondern
auch aus grünen Früchten extrahierbar.
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Der Inhibitor ist farblos und löst sich gut in Wasser, verdünnten
Säuren und Laugen. Der Inhibitor wird durch Dialyse nicht verändert, besitzt ein
Molekulargewicht von etwa 64 000 und wird durch Proteinasen langsam inaktiviert.
Wässerige Lösungen des Inhibitors sind zwischen pH 1 und pH 8 bei Zimmertemperatur
und bis zu etwa 80 °C relativ stabil. Erhitzen einer wässerigen Lösung auf 100 °C
bzw. Inkubation im alkalischen pH-Bereich verursacht Aktivitätsverlust. Das pH-Optimum
für die Inhibitoraktivität liegt bei pH 5,5.
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Die quantitative Messung der Inhibitoraktivität beruht auf der Bestimmung
der Restaktivität an im Inkubationsansatz im Uberschup befindlicher a-Amylase. α-Amylase-Aktivität
wird durch Messung der Zunahme reduzierender Endgruppen, die durch Hydrolyse löslicher
Stärke entstehen, bestimmt. Die Freisetzung reduzierender Endgruppen wird mit Hilfe
eines alkalischen Kupferreagenz in Modifikation einer von Nelson beschriebenen Methode
kolorimetrisch verfolgt. Mit bekanten Mengen eines reduzierenden Zuc];ers (Maltose)
wird eine Eichkurve aufgestellt. Eine Amylaseeinheit ist definiert als die Menge
Enzym, die unter den angegebenen Testbedingungen 1 µ Mol reduzierender Endgruppen
pro Minute freisetzt. Eine Inhihitoreinheit ist definiert als die Menge Inhibitor,
die eine Amylaseeinheit vollständig hennt. Da die vollständige Hemmung asymptotisch
erreicht wird, wird der Wert einer Inhibitoreinheit abgeleitet von jener Menge Inhibitor,
die benötigt wird,um die Aktivität von 2 Amylaseeinheiten auf 1 Amylaseeinheit zu
reduzieren, d. h.
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eine 50 %ige Hemmung von 2 Amylaseeinheiten verursacht. Zur Durchführung
des Tests werden geeignete Mengen an α-Amylase und Inhibitor, gelöst in 0,5
ml 20 mM Tris/HCl-Puffer pH 7,0, der 0,15 M an NaCl ist, bei 37 °C 10 Minuten inkubiert.
Anschließend wird als Substrat 0,5 ml einer vorgewärmten 1 %igen gepufferten Stärkelösung
(lösliche Starke, Artikel 1253 der Firma Merck, Darmstadt) zugegeben und 15 Minuten
bei 37 °C inkubiert. Die Inkubation wird durch Zugabe von 1 ml alkalischer Kupfertartratlösung
beendet und 20 Minuten am siedenden Wasserbad erhitzt reagenz C der modifizierten
Methode zur Bestimmung reduzierender Endgruppen nach Robyt, J. F. und Whelan, W.
J. in: Starch and its derivatives (Radley, J. A., Herausgeber), Chapman & Hall,
London 1968. Nach dem Abkühlen wird der Reaktionsmischung 0,5 ml Reagenz D zur Farbentwicklung
zugesetzt. Die Extinktion bei 520 nm wird gegen eine Blindinkubation ohne -Amylase
gemessen. Erfolgt parallel die Inkubation identischer Mengen an a-Amylase mit und
ohne Inhibitor, so kann die Auswertung der Resultate in der Form einer prozentualen
Hemmung der eingesetzten Amylase erfolgen.
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Die Extraktion des erfindungsgemäßen Inhibitors aus Bohnenmehl erfolgt
erfindungsgemäP mit 0,001 bis 0,02 N wässrigen Säuren,
vorzugsweise
Mineralsäuren, insbesondere Schwefelsäure.
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Dazu wird ein Gewichtsteil Bohnenmehl mit etwa 1,5 - 7 Gewichtsteilen,
vorzugsweise etwa 2-4 Gewichtsteilen des entsprechenden Extraktionsmediums versetzt,
1-2 Minuten homogenisiert und anschließend 0,5 - 4 Stunden (vorzugsweise 1-2 Stunden)
bei Raumtemperatur (20 - 25 OC) gerührt.
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Danach wird der Ansatz filtriert oder 20 Minuten bei mindestens 10
000 x g zentrifugiert. Der Rückstand wird mit 1-2 Gewichtsteilen des Extraktionsmediums,
wie oben beschrieben, reextrahiert und zentrifugiert bzw. filtriert. Die Überstände
bzw. Filtrate werden vereinigt.
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Die Isolierung des Inhibitors aus den jeweiligen Extraktionslösungen
geschieht erfindungsgemäß wie folgt: Die Etra};tionslösung wird einer Hitzebehandlung
bei 65 - 80 OC für 10-30 Minuten unterworfen. Nach der Hitzebehandlung wird erneut
bei mindestens 10 000 x g zentrifugiert und der Überstand in an sich üblicher Weise
dialysiert. Besonders günstig ist es, gegen etwa das dreifache Volumen an 0,02 M
Tris/HCl-Puffer bei pH 7,0 zu dialysieren. Die weitere Reinigung, kann, falls gewünscht,
durch Ammoniumsulfat-Fraktionierung erfolgen, wobei der Inhibitor zwischen 40 :obiger
und 65 %iger Sättigung an Ammoniumsulfat ausfällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert,
in 0,02 M Tris/HCl-Puffer gelöst und gegen etwa das dreifache Volumen des Puffers
dialysiert. Wenn gewünscht, kann noch weiter gereinigt werden und zwar in üblicher
Weise durch Chromatographie auf Molekularsieben, z. B. Polyacrylamidgelen (Acryle«
P-100 der Firma Macherey & Nagel, Düren) mit 0,02 M Tris/HCl-Puffer als Elutionsmittel.
Nach Vereinigung der Inhibitorfraktionen und Dialyse gegen vollentsalztes Wasser,
wird der Inhibitor durch Lyophilisieren gewonnen.
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Die Amylasen aus Speichel und Pankreas von Säugetieren sind bekanntlich
am Abbau der Stärke aus kohlenhydratreicher Nahrung beteiligt. Im Verdauungstrakt
werden cc-Glucane unter Beteiligung von Amylasen bis zu Glucose abgebaut und in
dieser Form resorbiert.
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(alimentäre Hyperglykämie). Aufgrund der Spezifität des erfindungsgemäßen,
nach obigen Methoden isolierten Inhibitors als Hemmstoff der Amylasen aus Speichel
und Pankreas, kann der Inhibitor den
A'bbau der Stärke aus kohlenhydratreichen
Nahrungsmitteln vermindern. Der Inhibitor ist daher als Therapeutikum zur Behandlung
von Adipositas, Atherosklerose, Diabetics und prädiabetes geeignet.
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Für die vorstehend angegebenen Verwendungen ist es in der Regel ausreichend,
den Inhibitor zu verwenden, wie er nach der Hitzebehandlung erhalten wird, ohne
ihn weiter aufzureinigen. Dazu wird der Inhibitor nach der Dialyse, die an die Hitzebehandlung
anschließt, durch Lyophilisieren gewonnen.
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Beisiel 1 100 g grüne Stangenbohnen (Phaseolus vulgaris) oder griine
Buschbohnen (Phaseolus vulgaris) vom örtlichen Markt werden in fliissiger Luft zerkleinert.
Zur Extraktion des Inhibitors wird mit 500 ml 0,1 tt Natriumacetatpuffer p 4,C im
er homogenisiert und anschließend 2 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Zentrifugation
(2C Minuten bei 20 000 X g wird der Uberstand unter Rühren 15 Minuten auf 70 °C
erhitzt. Durch nochmaliges Zentrifugieren werden ausgefallene Proteine entfernt,
der Uberstand wird 8 Standen gegen fliependes Wasser dialysiert und lyophisiert
oder weitcr vereinigt.
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Beispiel 2 100 g handelsübliche weiße lohnen (Phaseollls vulgaris)
aus einem Supermarkt werden gemahlen und 2 Stunden mit 500 ml destiliiertem Wasser
gerührt. Nach dem Abzentrifugieren (20 Minuten, 20 000 x g) wird der Rückstand erneut
r-'it 200 ml destillierten Wasser gerührt und wie zuvor zentrifugiert. Die beiden
löslichen Extrak-te werden vereinigt und 15 Minuten unter Rühren auf 80°C erhitzt.
Nach dem Abkühlen werden die denaturierten Proteine durch Zentrifugation entfernt.
Die Lösung wird über Nacht gegen destilliertes Wasser dialysiert und anschließend
lyophilisert oder weiter gerinigt.
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Beispiel 3 100 g Bohnenmehl (Phaseolus vulgaris) wird mit 300 ml einer
0,15 M NaCl-Lösung 3 Stünden bei Zimmertemperatur gerührt.
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Nach Zentrifugation wird der Rückstand nochmals mit der
gleichen
Menge einer 0,15 M NaCl-Lösung 1 Stunde gerührt.
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Vom Unlöslichen wird abzentrifugiert und die beiden Extrakte werden
vereinigt. Der Rohextrakt wird einer Hitzehehandlung unterworfen (15 Minuten 80
°C) und anschließend zentrifugiert.
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Die Lösung wird über Macht gegen Leitungswasser dialysiert, sodann
lyophilisiert oder weiter gereinigt.
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Beispiel b 500 g gemahlene zeine lohnen (Phaseolus vulcraris) werden
mit 1 1 0,01 M wässriger Schwefelsäurelösung 2 Stunden gerührt.
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;an zentrifugiert ab und wiederholt die Extraktion auf die angegebene
Weise. Die beiden Extrakte werden vereinigt, 15 Minuten unter Riihren auf 70 °C
erhitzt und anschließend 30 Min.
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bei 10 000 x g ( zentrifugiert. Niedermolekulare Bestandteile im Uberstand
werden durch Dialyse gegen das fünffache Volumen an 0,02 M Tris/HCl-Puffer pH 7,0
entfernt. Das Dialysat wird mit festem Ammoniumsulfat unter Rühren auf 40%ige Sättigung
gebracht, wobei der pH-Wert 7,0 eingehalten wird. Nach 2 Stunden wird der gebildete
Niederschlag abzentrifugiert (20 Minuten 10 OOC x g) und verworfen. Durch weitere
Zugabc von festem Ammonsulfat wird die Sättigung auf 65 % erhöht.
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Nach 2 Stunden wird der Niederschlag durch Zentrifugation gesammelt,
in 0,02 M Tris/HCl-Puffer pH 7 gelöst und gegen das zehnfache Volumen des gleichen
Puffers dialysiert. Die weitere Reinigung des Inhibitors erfolgt durch Molekularsiebchromatographie
an dem Polyacrylamidgel Acrylex P 100. Als Elutionspuffer dient wiederum C, 02 M
Tris/HCl-Puffer pH 7,0.
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Die Fraktionen mit Inhibitoraktivität werden vereinigt, gegen -Iasser
dialysiert und anschliepend lyophilisiert.