CN101340923B - 用乙醇沉淀的菜豆提取物，其应用及制剂 - Google Patents
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Abstract
可通过用乙醇和水的混合物提取菜豆获得的提取物，其特征在于：α-淀粉酶抑制剂的含量为1000-1600USP/mg(HPLC含量在6-14％w/w之间)，植物血凝素含量范围为8000-30000HAU/g，以及该提取物的制备方法。
Description
发明概述
本发明涉及从菜豆属植物的种子获得的提取物以及其制备方法。
更具体地讲，本发明涉及菜豆种子的提取物，其特征在于该提取物中含有确定比例的α-淀粉酶抑制剂和植物血凝素，其可减少来源于食物淀粉中的葡萄糖的吸收，并且能在重复给药后抑制食欲。
现有技术
α-淀粉酶抑制剂(αAI)是一种存在于菜豆种子中的糖蛋白类物质，它能够以一种受到区分的物种依赖性方式抑制动物源性淀粉酶的活性，特别是人类淀粉酶的活性。该抑制剂是由Marshall和Lauda于1974年首次提纯发现的(J.Biol.，250(20)，8030-8037，1975)，他们之所以对此感兴趣，是因为它的胰腺淀粉酶抑制活性能够影响小肠对葡萄糖(由淀粉的酶水解产生)的吸收，而以上的这些又都为α-淀粉酶抑制剂在饮食行业的潜在应用奠定了基础。碳水化合物是卡路里的重要来源，并有助于形成个体中的脂肪，导致个体的肥胖或II型糖尿病。在自然界中，在物种进化的过程中，有时不能保证食物对生物的足够供给，所以在这种情况下，积累超过机体直接需求的那部分能量的功能是必须的。遍布于机体不同部位的脂肪细胞是积累能量的场所之一，这些能量在机体需要可被迅速利用。这种生理学系统处于内分泌系统及神经系统的精细调控中，它使人类即使处于缺乏食物的状态下也可以生存更长时间。然而，在工业化国家中，由于食物充足、固有的生活方式以及遗传的原因，该系统导致不受控制的脂肪能量堆积增加，从而产生了负面后果，例如，影响美观和心血管系统的超负荷运转。最主要的问题是肥胖，这在有些国家例如美国日趋普遍。肥胖已成为导致心血管疾病、高血压和糖尿病的主要原因。超重在男性与女性中都普遍存在，造成个体摄入的食物数量越来越多，其结果是健康的恶化。由于高血糖可增加能量的堆积，因此获得可以减少葡萄糖吸收的物质就变的十分重要。
世界范围内对减肥物质的需求，促进了对防止进行性体重积累的食物的研究。
很久以来，人们就已经发现在多种豆类和谷物中存在α-淀粉酶抑制剂，在过去的一些年中人们已经开始了针对这一方向的临床试验，并得到了一系列不确定的结果。根据浓缩和分离这种抑制剂所用的不同制备方式，可以得到互相矛盾的试验结果，许多商品化制剂显示其在体内缺乏有效的活性。根据Layer，Carlson和Di Magno的首次研究成果(Gastroenterology，88(6)：1895，1902，1985)显示，这个问题似乎是因为在高度不纯的制剂中抑制剂被高度的稀释；事实上，当将纯化的抑制剂制品直接注入到小肠内腔时，它对α-淀粉酶是有活性的。
文献中描述的有关α-淀粉酶抑制剂制备的一些不完整的方法包括利用磷酸盐缓冲液提取并用硫酸铵使蛋白质不溶，没有任何选择性。获得的提取物包含有高浓度的植物血凝素，所以必须进行稀释以获得具有可以接受的毒性水平的提取物。除生物学方面之外，已知的提取过程由于在某些阶段有缺陷，所以很难使提取物兼备安全性与活性。利用不同的离子浓度和pH值的缓冲液进行提取时所出现的问题是由于高浓度的蛋白质和多糖杂质导致粘度过高，从而致使其可滤过性降低，以及处理时间增长。当利用水提法时，同样有着很高的蛋白质提取物的微生物污染的风险，这种风险是很难控制的，尤其是在制品粘度很高的情况下。以上的这些情况可导致产物损失，并且很难获得含低滴度植物血凝素和相应的多成分的标准化的最终提取物。人们采用了多种方法试图解决限制植物血凝素的问题，包括热处理，但是这种方法不仅破坏了植物血凝素，而且还破坏了产物中的α-淀粉酶抑制剂，从而导致获得的产物缺乏活性。实践证明，商业产品含有非常低的αAI含量。而其他含有过高α-淀粉酶抑制剂的产品在以大剂量使用时则会导致令人不适的胃肠胀气的问题。
发明描述
本发明的产物是通过用水或水-乙醇溶媒进行提取并用适当的乙醇和水的混合物进行沉淀来制备的。
已令人惊奇的发现，将适当浓缩的菜豆水提取物用水-乙醇混合物进行处理时得到了一种富集的提取物，其中所含α-淀粉酶抑制剂的活性为1000-1600 USP/mg(高效液相值(HPLC)为6-14％w/w)，植物血凝素的含量在8000-30000 HAU/g之间，因此其可以以足够低的剂量添加在饮食中使用并获得所需的结果。除这项主要的优点以外，本发明的方法还显著降低了微生物计数。另一项值得注意的优点是该方法有可能获得一种αAI含量丰富、具有确定的植物血凝素比率的终产物。
本发明的方法包括将植物材料用pH范围在3-6.5之间，优选3.5-5.5，更优选pH为4的缓冲液在2-25℃，优选4-18℃的温度下进行提取，然后通过离心将提取物与植物材料分离。
适合于提取的缓冲液有磷酸盐、柠檬酸盐或醋酸盐缓冲液或二羧基氨基酸缓冲液，优选磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液。缓冲的水-醇混合液也可用作提取溶剂。
根据所用的提取剂以及提取的循环次数，每份药物使用5-20体积的缓冲液，优选10-12.5份，并将混合物搅拌1-4个小时，优选2小时；这些植物材料可以进一步用适宜量的缓冲液提取3次以上，直至其α-淀粉酶抑制剂和植物血凝素被全部提取。
将合并的提取物通过过滤或离心进行澄清，并在25-35℃，优选30℃的温度下真空浓缩，或在离心后超滤(10000Da截止值)至相当于约10％提取物重量的体积。
浓缩的水提取物随后用乙醇进行沉淀，并且使乙醇的最终浓度在60-70％v/v之间，优选65％v/v，操作温度在18-30℃之间，优选在20-25℃之间。
获得的沉淀物可以被离心和/或过滤，重新溶解于去离子水中并用60％的乙醇再次沉淀以减少其中含有的盐分。或者，可以将沉淀物通过10000Da截止值的半透膜进行过滤。将构成本发明提取物的沉淀物进行干燥。
采用以上方法，可以得到具有以下特征的提取物：
-HPLC含量：≥6％≤14％w/w
-α-淀粉酶抑制剂活性：≥1000≤1600 USP/mg
-血细胞凝集活性：≥8000≤30000 HAU/g
提取物的功效已经在大鼠试验中获得证实，所述大鼠每天用200和400mg/Kg的剂量进行处理，并让它们自由取食富含淀粉的特制食物。在用水量未改变的情况下，本发明的提取物显著减少了食物的消耗。
本发明的产物耐受性良好，并且可以以50-1000mg的剂量范围掺入药物或食品配方中并在正餐时服用。还可将该提取物掺入可饮用的形式中，用作食欲抑制剂。
以下实施例举例说明了本发明的制备方法和优点。
实施例1：通过用柠檬酸盐缓冲液提取并用乙醇沉淀制备富含αAI的菜豆提取物
将150g菜豆粉末在1.5L浓度为5.75g/L的柠檬酸中的悬浮液于4℃下搅拌3小时。
将悬浮液离心，将离心得到的水溶液浓缩7.5倍(干燥残余物：15.0％w/w)。得到的浓缩产物用95％乙醇稀释，使乙醇的浓度达到65％以产生沉淀，通过在+22℃离心回收沉淀物。将收集到的固体在不超过50℃的温度下真空干燥。获得的产物(收率2.36％)中α-淀粉酶抑制剂的活性为1050U/mg，血液凝集活性为9000 HAU/g，HPLC含量为7.3％w/w。
实施例2：通过用柠檬酸盐缓冲液提取并用乙醇沉淀制备富含αAI的菜豆提取物
将150g菜豆粉末在1.5L浓度为5.75g/L的柠檬酸中的悬浮液于+22℃下搅拌2小时。
将悬浮液离心，将离心得到的水溶液浓缩10.5倍(干燥残余物：17.1％w/w)。得到的浓缩产物用95％乙醇稀释，使乙醇的浓度达到65％以产生沉淀，通过在+22℃离心回收沉淀物。将收集到的固体在不超过50℃的温度下真空干燥。获得的产物(收率3.5％)中α-淀粉酶抑制剂的活性为1600U/mg，血液凝集活性为18600 HAU/g，HPLC含量为10.0％w/w。
实施例3：通过柠檬酸的水-醇混合液(30％乙醇)溶液两次提取并用乙醇沉淀制备富含αAI的菜豆提取物
将100g菜豆粉末在1.0L含有4.6g/L柠檬酸的70：30水-乙醇混合液中的悬浮液于+22℃下搅拌2小时。
将悬浮液离心，分出澄清的液相，将沉淀再次用750mL水进行提取。将第二次提取的液相部分与第一次的混合，并浓缩4.3倍(干燥残余物：4.78％w/w)。得到的浓缩产物用95％乙醇稀释，使乙醇的浓度达到65％以产生沉淀，通过在+22℃离心回收沉淀物。将收集到的固体在不超过50℃的温度下真空干燥。获得的产物(收率0.88％)中α-淀粉酶抑制剂的活性为1570 U/mg，血液凝集活性为27000 HAU/g，HPLC含量为13.6％w/w。
Claims (5)
1.其特征在于α-淀粉酶抑制剂的含量为1000-1600USP/mg，植物血凝素含量范围为8000-30000HAU/g的提取物的制备方法，该方法包括：
a)利用pH值在3-6.5之间的含水缓冲液对菜豆进行提取，然后将提取液与植物材料分离，并且利用缓冲液对所述植物材料进一步进行提取直至其α-淀粉酶抑制剂和植物血凝素被全部提取；
b)对合并的提取液进行过滤或离心，然后将其浓缩至相当于10％提取物重量的体积；
c)利用终浓度为60-70％v/v的稀乙醇对浓缩的含水提取物进行微分沉淀；
d)分离沉淀物，用60％的乙醇从去离子水中重新沉淀，或通过10000Da截止值的半透膜进行过滤，干燥沉淀残余物。
2.权利要求1所述的方法，其中在步骤a)中的提取使用磷酸盐、柠檬酸盐或醋酸盐缓冲液，二羧基氨基酸缓冲液，或缓冲的水-醇混合溶液。
3.通过权利要求1所述的方法获得的提取物，其特征在于α-淀粉酶抑制剂的含量为1000-1600USP/mg，植物血凝素含量范围为8000-30000HAU/g。
4.权利要求3所述的提取物用于制备食欲抑制剂的用途。
5.包含权利要求3所述的提取物的组合物。
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