INHIBIDOR DE AMILASA PURIFICADO Y PROCESO NOVEDOSO PARA OBTENER EL MISMO
Antecedentes de la Invención La amilasa es una enzima responsable por desintegrar la fuente principal de carbohidratos en la dieta humana, a saber, el almidón. La digestión de almidón comienza en la boca, donde la alfa-amilasa presente en la saliva hidroliza los enlaces glucosidicos del almidón. Para el tiempo en que alimentos completamente masticados llegan al estómago, la longitud de cadena promedio del almidón se reduce de varios miles a menos de ocho unidades de glucosa. El nivel de ácido en el estómago desactiva la alfa-amilasa salival. Digestión adicional del almidón continúa en el intestino delgado por alfa-amilasa pancreática, la cual es similar a aquella de la alfa-amilasa salival. Disminuir la absorción de carbohidratos por medio de inhibir la digestión de almidón es una estrategia muy prometedora en los campos de, por ejemplo, pérdida de peso y diabetes mellitus . A partir de un punto de vista dietético, es importante atacar la desintegración de almidón debido a que el almidón es un nutriente relativamente no esencial, el cual proporciona calorías con poco beneficio. Los inhibidores de amilasa se derivan de varias fuentes, incluyendo albúminas vegetales y plantas leguminosas. Actualmente, extractos de frijoles están siendo utilizados lo mas comúnmente como una fuente de inhibidores de amilasa. Los métodos actuales para purificación de inhibidores de amilasa, los cuales incluyen concentrar y secar frijoles, incluyen el uso de tratamientos con calor y/o con solventes. Ver la patente US 6,340,699 otorgada a Cestaro y colaboradores. Sin embargo, el uso de tratamientos con calor y/o con solventes tiene varias desventajas. Por ejemplo, a altas temperaturas, ciertos componentes sensibles al calor del inhibidor de amilasa a partir de frijoles pueden volverse degradados. Como resultado, el inhibidor de amilasa exhibe una disminución en su estabilidad y su potencia. Además, existen preocupaciones ambientales y de salud asociadas con el uso de solventes durante tales procesos de purificación. Por ejemplo, la extracción de inhibidores de amilasa a partir de frijoles usando solventes resulta en contaminación residual del extracto con el solvente tóxico. Además, el desecho de grandes cantidades del solvente requeridas durante los procesos de purificación es una preocupación ambiental mayor. Los inhibidores de amilasa que se derivan de extractos de frijol por los métodos de calor y de solvente convencionales no son purificados, es decir, contienen impurezas y/o contaminan-tes. Ejemplos de tales impurezas son residuo de solvente y componentes inactivos de los frijoles. Los inhibidores de amilasa comúnmente se añaden a productos alimenticios para consumo, tales como, por ejemplo, mezclas de bebidas en polvo, malteadas preparadas, barras de botana, etc. Las impurezas y/o contaminantes que permanecen en el extracto de frijol se asocian con sabores negativos que hacen a tales productos alimenticios no apetecibles. Estudios recientes han indicado que los inhibidores de amilasa actualmente disponibles trabajan bien ín vi tro, pero dejan de ser efectivos in vivo. Algunas de las razones profesadas son que los inhibidores de amilasa actualmente disponibles son inestables en el tracto gastrointestinal debido al pH, son insolubles en agua, y/o pierden potencia debido al uso de solventes y tratamientos con calor. Ver Layer, P. y colaborado-res, Gastroenterology 1985; 88(6): 1895-1902. Por lo tanto, a la luz de las deficiencias anteriores que existen con los inhibidores de amilasa actuales, existe una necesidad para un inhibidor de amilasa mas puro y potente derivado a partir de frijoles, y un proceso mas sofisticado para obtener el mismo. Compendio de la Invención Estos y otros objetivos han sido alcanzados por la presente invención por medio de proporcionar un inhibidor de amilasa obtenido por un proceso superior. El proceso comprende moler alubias, después extraer los frijoles molidos bajo presión al vacio con dióxido de carbono super-crítico para remover impurezas, dejando una masa de frijol. La masa de frijol entonces se incuba con agua desionizada para obtener una primera suspensión de frijol que contiene un primer componente sólido y un primer componente líquido. El primer componente sólido se separa de la primera suspensión de frijol, mientras que se retiene el primer componente líquido. El primer componente sólido entonces se incuba con agua desionizada para obtener una segunda suspensión de frijol que contiene un segundo componente sólido y un segundo componente líquido. El segundo componente sólido se separa de la segunda suspensión de frijol, mientras que se retiene el segundo componente líquido. Los primero y segundo componentes líquidos entonces se combinan para obtener una solución líquida final. La solución líquida final entonces se sujeta a intercambio de calor para obtener un extracto de frijol concentrado. El extracto de frijol concentrado se seca y un inhibidor de amilasa purificado se obtiene. La invención también proporciona un método para inducir pérdida de peso en un mamífero en necesidad de la misma comprendiendo suministrar al mamífero una cantidad efectiva de un inhibidor de amilasa obtenido por el proceso superior. Un método para mejorar la tolerancia de glucosa post-prandial en un mamífero diabético comprendiendo suministrar al mamífero una cantidad efectiva de un inhibidor de amilasa obtenido por el proceso superior, también se proporciona.
Descripción Detallada de la Invención Los solicitantes han descubierto de manera sorprendente que un inhibidor de amilasa purificado se puede obtener por el proceso novedoso de la invención. Los inhibidores de amilasa son glicoproteínas que inhiben a la enzima responsable por la desintegración de carbohidratos, a decir, amilasa. El inhibidor de amilasa de la invención se deriva de frijoles. Frijoles adecuados para uso con la invención pertenecen a la familia Phaseolus vulgaris que incluye, por ejemplo, habichuelas. De preferencia, el inhibidor de amilasa se deriva de alubias. El inhibidor de amilasa de alubias en ocasiones es referido como "faseolamina" . De preferencia, los frijoles no son frijoles modificados genéticamente. Los frijoles son típicamente frijoles pequeños, intactos. El inhibidor de amilasa de la invención es superior a otros inhibidores de amilasa debido a su mayor grado de pureza que los inhibidores de amilasa obtenidos por métodos de extracción convencionales, es decir, calor y químicos. Debido al alto grado de pureza, el inhibidor de amilasa exhibe estabilidad y potencia mejoradas in vitro e in vivo sobre los inhibidores de amilasa del estado de la técnica. El inhibidor de amilasa de la presente invención permanece estable a temperaturas elevadas, tales como, por ejemplo, 120-200°F. Tal estabilidad al calor permite que el inhibidor de amilasa se utilice en, por ejemplo, productos alimenticios que son cocidos, sin perder los efectos benéficos, de bloqueo de almidón. El inhibidor de amilasa también permanece intacto a valores de pH extremos. Por ejemplo, el estómago puede tener un pH de aproximadamente 1-2. El inhibidor de amilasa de la invención permanece principalmente intacto bajo tales condiciones de pH. Además, el inhibidor de amilasa es mas potente que los inhibidores de amilasa derivados de métodos con calor/solvente convencionales. Sin ligarse por la teoría, se propone que por medio de evitar el uso de solventes químicos, la estructura terciaria importante del inhibidor de amilasa no se rompe. De acuerdo con la invención, alubias son sujetas a molienda para producir frijoles molidos de manera gruesa. Los frijoles se muelen por cualquier método conocido por los técnicos en la materia. Por ejemplo, los frijoles pueden ser molidos por medios manuales o mecánicos. Un ejemplo de un método manual para moler incluye un mortero y un pistadero. Un ejemplo de un método mecánico para moler incluye un molino de molienda, tal como un molino Fitzpatrick fabricado por obinson. Los frijoles molidos de manera gruesa se sujetan a extracción para remover impurezas como será discutido mas adelante. El paso de extracción involucra el uso de dióxido de carbono supercrítico . El dióxido de carbono existe bajo condiciones normales, es decir, temperatura ambiente y presión, como un gas. La temperatura crítica (Te) para C02 es 31.06°C (88°F) y la presión critica (Pe) es 73.8 bar. C02 está en un estado supercrí-tico cuando tanto la temperatura y presión son mayores que su Te y Pe. En un estado supercrítico, el C02 es esencialmente un fluido comprimido, de alta densidad. Los frijoles molidos de manera gruesa se colocan en un recipiente de extracción (es decir, un extractor) y se extraen con C02 supercrítico bajo presión de vacío. La presión de vacío es típicamente cualquier presión que está por debajo de la presión atmosférica. En una forma de realización, la extracción ocurre a una temperatura de alrededor de 120 a 200°F por alrededor de dos horas. De preferencia, el paso de extracción se lleva a cabo a una temperatura de alrededor de 135 a 160 °F por alrededor de dos horas. Mas preferentemente, el paso de extracción se lleva a cabo a una temperatura de alrededor de 145 °F por alrededor de dos horas . Durante el paso de extracción, el fluido de C02 supercrítico pasa a través de los frijoles molidos y disuelve y extrae las impurezas de los frijoles para formar una solución supercrítica . Así, la solución supercrítica contiene impurezas del frijol. Las impurezas son típicamente constituyentes no polares de los frijoles e incluyen, por ejemplo, lípidos, aceites, grasas, y sabores. Después de que la extracción se ha completado, la solución supercrítica se remueve del extractor por vía de una válvula de reducción de presión. La presión y la energía de disolución del fluido supercrítico se reducen, con ello ocasionando que las impurezas del frijol se precipiten en un separador. Para propósitos de esta invención, el producto restante, sustancialmente libre de impurezas, se le refiere la masa de frijol. La masa de frijol contiene las glicoproteinas , es decir, inhibidores de amilasa. La masa de frijol entonces se incuba en agua desionizada para formar una primera suspensión de frijol. El agua desionizada es típicamente agua en la cual iones han sido removidos. La temperatura del agua desionizada de preferencia es de alrededor de 120 a alrededor de 160 °F, mas preferentemente, el agua desionizada es de alrededor de 140 °F. La masa de frijol se incuba en el agua desionizada por hasta alrededor de 6 horas, mas preferentemente por alrededor de 4 horas. Durante la incubación, glicoproteinas se extraen de la masa de frijol. Como se menciona anteriormente, después de la incubación, una primera suspensión de frijol se obtiene. La primera suspensión de frijol contiene un primer componente sólido y un primer componente liquido. El primer componente líquido contiene agua desionizada y glicoproteinas (es decir, inhibidor de amilasa) de la masa de frijol. El primer componente sólido contiene cualquier componente no extraído restante que incluye, por ejemplo, impurezas. El primer componente sólido entonces se separa del primer componente líquido. El primer componente líquido se retiene en un recipiente separado. La separación se hace por cualquier medio conocido en la materia. Por ejemplo, la separación se logra por centrifugación o filtración. La filtración por un filtro prensa se prefiere. Por ejemplo, en filtración la primera suspensión de frijol se derrama sobre un material poroso (v.gr. , filtro), tal como un papel filtro. El filtro permite el paso del componente liquido a través del filtro e impide el paso del componente sólido . La centrifugación usa fuerza centrífuga para promover la separación de sólidos y líquidos. Por ejemplo, en la centrifugación la primera suspensión de frijol se coloca en un tubo. El tubo entonces se coloca en una centrífuga y la fuerza centrífuga se aplica. Como resultado, el componente sólido se acumula en la porción inferior del tubo (es decir, pelotilla) , mientras que el componente líquido permanece en la porción superior (es decir, sobrenadante) del tubo. El componente líquido entonces se derrama y se retiene en un recipiente separado. Una vez que el primer componente sólido se separa del primer componente líquido, el primer componente sólido se incuba, como se describe anteriormente, en agua desionízada para formar una segunda suspensión de frijol. La segunda suspensión de frijol contiene un segundo componente líquido y un segundo componente sólido. El segundo componente líquido contiene agua desionizada y glicoproteínas (es decir, inhibidor de amilasa) a partir del primer componente sólido. El segundo componente sólido contiene cualquier componente no extraído restante que incluye, por ejemplo, impurezas. El segundo componente sólido entonces se separa del segundo componente líquido por cualquier medio adecuado, incluyendo aquellos discutidos anteriormente. El segundo componente liquido se retiene en un recipiente separado. El primer componente líquido y el segundo componente líquido entonces se combinan para obtener una solución líquida final. La solución líquida final entonces se sujeta a intercambio de calor. El intercambio de calor es un proceso de destilación, el cual remueve agua. El intercambio de calor de preferencia ocurre bajo presión de vacío. Aparatos adecuados para intercambio de calor son conocidos en la materia. Como resultado del paso de intercambio de calor, agua se remueve de la solución de líquido final para obtener un extracto de frijol concentrado. El extracto de frijol concentrado puede contener aproximadamente 25-50% de agua. Mas preferentemente, el extracto de frijol concentrado contiene aproximadamente 35% de agua. El extracto de frijol concentrado entonces se seca. El secado del concentrado de frijol final puede lograrse por cualquier medio adecuado en la materia. Por ejemplo, en una forma de realización, el paso de secado se lleva a cabo por liofiliza-ción, es decir, secado por congelación. El proceso de secado por congelación remueve agua residual del extracto de frijol concentrado por sublimación y desorción. Durante la liofilización, el extracto de frijol concentrado se transporta en un recipiente enfriado a un secador por congelación para secar. Un condensador en la cámara de secado del secador por congelación atrapa agua removida del extracto de frijol concentrado, mientras que un sistema de vacío reduce presión para facilitar el proceso de secado. Una vez que el proceso de liofilización se completa, un inhibidor de amilasa purificado se obtiene. En otra forma de realización, el paso de secado se lleva a cabo por medio de utilizar un secador por rocío. El secador por rocío consiste de una bomba de alimentación, un atomizador, un calentador de aire, un dispensador de aire, una cámara de secado, y sistemas para limpieza de aire de salida y recuperación de polvos . Aire o gas pueden usarse en el secado por rocío. Un ejemplo de un gas caliente que puede usarse en un secador por rocío incluye, pero no se limita a, nitrógeno. La boquilla usada en el proceso de secado por rocío puede ser, por ejemplo, una boquilla de rueda centrífuga o una boquilla de alta presión. La temperatura de entrada (la entrada) de aire caliente usada para secado por rocío es de alrededor de 400 a alrededor de 500 °F, y de preferencia alrededor de 440 °F. La temperatura de salida (la salida) del aire caliente usado para secado por rocío es de alrededor de 150 a alrededor de 250 °F, y de preferencia alrededor de 210 °F. En el proceso de secado por roclo, el extracto de frijol concentrado se rocía sobre gas caliente, con ello convirtiendo al extracto de frijol concentrado en un extracto de frijol seco en partículas, fluyendo libre. Después de secar por rocío, el extracto de frijol seco se re-hidrata para obtener un extracto de frijol re-hidratado. La re-hidratación se logra por la adición de agua al extracto de frijol seco. De preferencia, el agua es desionizada. En una forma de realización preferida, aproximadamente 40-70% del extracto de frijol seco se re-hidrata. Mas preferentemente, aproximadamente 60% del extracto de frijol seco se re-hidrata. El extracto de frijol re-hidratado entonces se liofiliza, es decir, se seca por congelación, como se describe anteriormente. El extracto de frijol re-hidratado se sujeta a secado por congelación para obtener el inhibidor de amilasa purificado . La función primaria de los inhibidores de amilasa es ocasionar mala absorción de almidón dietético libre de efectos secundarios, segura, temporal. Sin limitarse por la teoría, se cree que el inhibidor de amilasa de la invención se liga a, y neutraliza, alfa-amilasa . Por medio de neutralizar la alfa-amilasa, la absorción de carbohidratos se inhibe. Como será discutido mas adelante, el inhibidor de amilasa es efectivo para inducir pérdida de peso. Como se discute anteriormente, la alfa-amilasa es una enzima para almidón que ocurre de manera natural la cual es responsable por la desintegración de almidones. Por ejemplo, en humanos, almidones dietéticos deben desintegrarse hacia componentes mas pequeños, tales como glucosa, para ser utilizados por el cuerpo. Los almidones que se consumen, pero que no se desintegran hacia componentes mas pequeños, tales como glucosa, no se utilizan in vivo. Por lo tanto, por medio de neutralizar la alfa-amilasa del cuerpo, la habilidad del cuerpo para usar almidones se obstruye, y finalmente los almidones no usados se excretan. La digestión, o desintegración de almidón hacia glucosa, dispara la producción de insulina. Por lo tanto, consumir una ración rica en almidones ocasiona un aumento inusual en insulina. El exceso de insulina dispara hambre y antojos, creando un círculo vicioso. Una manera de terminar el ciclo es reducir o eliminar la toma de almidones. Este enfoque ha tenido poco o ningún éxito en inducir pérdida de peso por un tiempo largo . En una forma de realización de la invención, un método para inducir pérdida de peso en un mamífero en necesidad de la misma se proporciona. El método comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva del inhibidor de amilasa de la invención. Un mamífero en necesidad de pérdida de peso es, por ejemplo, un mamífero cuyo peso es perjudicial a su salud. Otro ejemplo de un mamífero en necesidad de pérdida de peso es, por ejemplo, un mamífero que está a disgusto con su apariencia debido al peso en exceso. El peso en exceso de un mamífero es subjetivo.
Algunos ejemplos de mamíferos en necesidad de pérdida de peso incluyen, pero no se limitan a, mamíferos que sufren de diabetes mellitus y/u obesidad. Sin limitarse por la teoría, se cree que el inhibidor de amilasa altamente puro de la invención induce pérdida de peso por medio de inhibir la absorción de almidones. Además, el inhibidor de amilasa controla antojos asociados con la absorción de carbohidratos. Por medio de inhibir la absorción de almidón dietético y controlar los antojos asociados con la absorción de carbohidratos, el inhibidor de amilasa es efectivo para inducir pérdida de peso. El inhibidor de amilasa de la invención presente también se usa en un mamífero que sufre de un deterioro de utilización de glucosa, por ejemplo, diabetes mellitus. El deterioro de utilización de glucosa puede ocurrir como resultado de una deficiencia en la producción de insulina por el páncreas, o por falta de efectividad de la insulina producida para utilizar glucosa. Como será discutido mas adelante, la insulina es necesaria parra el transporte de glucosa a partir de la sangre a las células . La insulina es una hormona producida de manera natural por el cuerpo que es clave para controlar los niveles de glucosa en la sangre. La sangre circulante lleva glucosa que proporciona combustible para las células. Obtener glucosa dentro de las células requiere insulina, la cual se produce en el páncreas por células beta. Normalmente, el páncreas produce suficiente insulina para manejar las necesidades del cuerpo. Este no es el caso de desórdenes de hiperglicemia, tales como diabetes mellitus (DM) , como será discutido mas adelante. En DM, la insulina ya sea está ausente, en poca disponibilidad o incapaz de llevar a cabo su trabajo de manera eficiente. Si la glucosa no puede llegar a las células, se acumula en la sangre creando glucosa en sangre. La cantidad de glucosa en la sangre después del consumo de un alimento es el nivel de glucosa post-prandial . Por ejemplo, en personas que no tienen DM, los niveles de glucosa de plasma hacen un pico alrededor de una hora después de un alimento y regresan a niveles pre-alimento dentro de las dos a tres horas después de un alimento. En contraste, aquellos que sufren de DM, la glucosa post-prandial aumenta a un nivel mayor y dura mas comparado con aquellos individuos sin diabetes. Un deterioro en la tolerancia de glucosa post-prandial puede llevar al desarrollo de, por ejemplo, enfermedades cardiovasculares . Individuos que sufren de DM usualmente necesitan ingerir insulina para ayudar a la absorción de glucosa en sangre hacia las células. Frecuentemente, después de consumir un alimento rico en carbohidratos, los requerimientos de insulina de un diabético pueden incrementarse marcadamente para tratar con los niveles de glucosa en sangre altos .
De manera acorde, por medio de inhibir la absorción de almidón dietético, el inhibidor de amilasa de la presente invención disminuye de manera efectiva los requerimientos de insulina de un mamífero diabético. Además, el inhibidor de amilasa de la presente invención también será inferior al nivel de glucosa post-prandial en la sangre, con ello mejorando la tolerancia a glucosa post-prandial. Por lo tanto, en otra forma de realización de la invención, un método para mejorar la tolerancia a glucosa post-prandial en un mamífero diabético se proporciona . De preferencia, el inhibidor de amilasa se administra de manera sistemática. La administración sistémica puede ser entérica o parentérica. La administración entérica se prefiere. Por ejemplo, el inhibidor de amilasa se administra oralmente. Formulaciones líquidas o sólidas (v.gr. , tabletas, cápsulas de gelatina) pueden emplearse. Las formulaciones pueden incluir excipientes, adyuvantes, diluyentes o vehículos , farmacéuticamente aceptables. El inhibidor de amilasa también se administra en granulaciones de tableta masticables, con o sin azúcar, en mezclas de bebidas en polvo, goma de mascar y productos horneados. En una forma de realización preferida, debido a que el inhibidor de amilasa es estable a temperaturas de horneado, es administrado de manera efectiva en mezclas de horneado tales como panqueques, wafles, panes, bizcochos o galletas.
De acuerdo con la presente invención, una cantidad efectiva del inhibidor de amilasa es cualquier cantidad conocida por los técnicos en la materia para inhibir de manera efectiva la desintegración de almidón dietético. De preferencia, una cantidad efectiva se administra a un mamífero justo previo a, durante, o poco después de, consumir un alimento rico en almidón. Por ejemplo, una dosis pre-alimento típica del inhibidor de amilasa es aproximadamente 500 a 1,500 mg. De acuerdo con la invención, mamíferos incluyen, por ejemplo, humanos, así como mascotas tales como perros y gatos, animales de laboratorio tales como ratas y ratones, y animales de granja tales como caballos y vacas. Los humanos son los mas preferidos . Ejemplo 1 Purificación de Inhibidor de Amilasa por Secado por Rocío
1. Molienda Frijoles Phaseolus vulgaris, organismo no modificado genéticamente (no GMO) , secos, enteros, se inspeccionaron para limpieza. Ante la aprobación de control de calidad de los frijoles, 1,000 g de los frijoles secos se colocaron en un molino de molienda Fitzpatrick. Una malla #4 (tamaño de molienda grueso) se usó en el molino de molienda. La molienda continuó hasta que los frijoles fueron del tamaño apropiado. 2. Extracción Los frijoles molidos gruesos se colocaron en un recipiente de extracción con C02 supercrítico . El proceso de extracción ocurrió bajo presión de vacío a alrededor de 145 °F por alrededor de dos horas. El C02 supercritico remueve las impurezas (v.gr. , lipidos, aceites, grasas, y sabores, etc.) de los frijoles molidos gruesos, dejando una masa de frijol. La presión en el recipiente de extracción entonces se redujo. La reducción ocasiona que las impurezas del frijol se precipiten de la solución super-crítica y hacia un separador.
3. Incubación Agua desionizada a 140 °F se añadió a la masa de frijol y se le permitió incubar por 4 horas. Durante la incubación, glicoproteínas se extrajeron de la masa de frijol. Una primera suspensión de frijol se obtuvo. . Separación La primera suspensión de frijol entonces se filtró por un filtro prensa para separar los componentes sólidos de la suspensión de frijol. El primer componente liquido (conteniendo glicoproteínas) se retuvo en un recipiente separado. El primer componente sólido entonces se incubó en agua desionizada como se expresa anteriormente para formar una segunda suspensión de frijol. La segunda suspensión de frijol entonces se filtró como anteriormente para separar los segundos componentes sólidos de los segundos componentes líquidos. Los primeros y segundos componentes líquidos entonces se combinaron para obtener una solución líquida final.
5. Intercambio de Calor La solución líquida final se sujetó a intercambio de calor para remover agua y obtener un extracto de frijol concentrado . 6. Secado El extracto de frijol concentrado entonces se sujetó a secado por roclo para remover el agua residual. Una boquilla de presión alta se usó para el procedimiento de secado por rocío . El extracto de frijol concentrado se sujetó a aire caliente con una temperatura de entrada de 440 °F y una temperatura de salida de 210 °F, hasta que un extracto de frijol seco se formó. Aproximadamente 40% (peso/peso) del extracto de frijol seco se re-hidrató con agua desionizada. El extracto de frijol re-hidratado entonces se liofilizó para obtener el inhibidor de amilasa purificado. A partir de los 1,000 g de frijoles secos, aproximadamente 120 g de inhibidor de amilasa purificado se obtuvo . Ejemplo 2 Purificación de Inhibidor de Amilasa por Secado con Liofilización 1. Molienda Frijoles Phaseolus vulgaris, organismo no modificado genéticamente (no GMO) , secos, enteros, se inspeccionaron para limpieza. Ante la aprobación de control de calidad de los frijoles, 1,000 g de los frijoles secos se colocaron en un molino de molienda Fitzpatrick. Una malla #4 (tamaño de molienda grueso) se usó en el molino de molienda. La molienda continuó hasta que los frijoles fueron del tamaño apropiado. 2. Extracción Los frijoles molidos gruesos se colocaron en un recipiente de extracción con C02 supercrítico . El proceso de extracción ocurrió bajo presión de vacio a alrededor de 145 °F por alrededor de dos horas. El C02 supercrítico remueve las impurezas (v.gr., lípidos, aceites, grasas, y sabores, etc.) de los frijoles molidos gruesos, dejando una masa de frijol. La presión en el recipiente de extracción entonces se redujo. La reducción ocasiona que las impurezas del frijol se precipiten de la solución super-crítica y hacia un separador.
3. Incubación Agua desionizada a 140 °F se añadió a la masa de frijol y se le permitió incubar por 4 horas. Durante la incubación, glicoproteínas se extrajeron de la masa de frijol. Una primera suspensión de frijol se obtuvo. 4. Separación La primera suspensión de frijol entonces se filtró por un filtro prensa para separar los componentes sólidos de la suspensión de frijol. El primer componente líquido (conteniendo glicoproteínas) se retuvo en un recipiente separado. El primer componente sólido entonces se incubó en agua desionizada como se expresa anteriormente para formar una segunda suspensión de frijol. La segunda suspensión de frijol entonces se filtró como anteriormente para separar los segundos componentes sólidos de los segundos componentes líquidos. Los primeros y segundos componentes líquidos entonces se combinaron para obtener una solución líquida final . 5. Intercambio de Calor La solución líquida final se sujetó a intercambio de calor para remover agua y obtener un extracto de frijol concentrado . 6. Secado El extracto de frijol concentrado entonces se secó por liofilización para obtener el inhibidor de amilasa purificado. Aproximadamente 120 g de inhibidor de amilasa purificado se obtuvieron a partir de los 1,000 g de frijoles iniciales.