CN111560057B - 一种从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于天然植物提取技术领域，具体涉及一种从白芸豆中提取α‑淀粉酶抑制剂的方法。一种从白芸豆中提取α‑淀粉酶抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1)白芸豆的预处理；S2)白芸豆粗提液的制备；S3)初步纯化α‑淀粉酶抑制剂的制备；S4)α‑淀粉酶抑制剂的制备。本发明的方法能够从白芸豆中得到α‑淀粉酶抑制剂，具有较高的提取率，且α‑淀粉酶抑制剂具有较高的抑制率，适应了社会的需求。

Description

一种从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法
技术领域
本发明属于天然植物提取技术领域，具体涉及一种从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法。
背景技术
α-淀粉酶抑制剂(α-A1)是一种能够特异性抑制人体唾液和肠道内α-淀粉酶活力的蛋白质，分子量为30.0～36.0ku，属于糖苷水解酶抑制剂。近年来，α-淀粉酶抑制剂已成为研究的热点，研究者已从许多植物种子的胚乳和微生物的代谢产物中分离得到了α-淀粉酶抑制剂。白芸豆生物学名为多花菜豆，是一种世界范围内广泛种植的豆类作物，其营养丰富，1945年Browman在白芸豆中发现了α-淀粉酶抑制剂，而更多的研究发现：从白芸豆中提取的α-淀粉酶抑制剂具有更高的抑制活性、安全无副作用等。
目前，虽然α-淀粉酶抑制剂是研究的热点，但是有关白芸豆α-淀粉酶抑制剂的产品很少被提起，这可能是现有从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法主要为色谱层析柱，工艺复杂，如中国专利CN103638089A公开了一种利用微波-复合酶耦合法从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法，将白芸豆粉碎后通过微波-复合酶耦合处理将白芸豆中α-淀粉酶抑制剂加速从白芸豆粉中溶解析出，再经超滤、离子柱层析精制可得。还有可能是由于现有的工艺不能得到活性较高的α-淀粉酶抑制剂，该原因可能为白芸豆中的植物凝集素(PHA)和胰蛋白酶抑制剂(TI)的存在会降低α-淀粉酶抑制剂的抑制效果，从而限制了其实际的应用。因此，开发一种可工业化提取白芸豆中α-淀粉酶抑制剂的方法具有十分重要的意义。
发明内容
本发明旨在提供一种从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法，本发明的方法能够从白芸豆中得到α-淀粉酶抑制剂，具有较高的提取率，提取率达到7％以上，且α-淀粉酶抑制剂具有较高的抑制率，抑制率达到75％以上。
一种从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法，包括以下步骤：
S1)白芸豆的预处理；取白芸豆过筛去除杂质，再粉碎过筛后置于35～40℃烘箱中干燥，得到白芸豆粉；
S2)白芸豆粗提液的制备；将步骤S1中的白芸豆粉加提取溶剂进行提取，离心取上清液，0.22μm滤膜超滤，得到白芸豆粗提液；
S3)初步纯化α-淀粉酶抑制剂的制备；将步骤S2中的白芸豆粗提液的pH调至3.6，沉降1～1.5h，离心，收集上清液，再将上清液的pH调至6.8后，用无水乙醇将上清液中的乙醇浓度调至70％，搅拌，离心，收集沉淀物，将沉淀物用pH为6.9的磷酸缓冲盐溶液溶解得到初步纯化α-淀粉酶抑制剂。
S4)α-淀粉酶抑制剂的制备；将步骤S3中的初步纯化α-淀粉酶抑制剂用超滤管超滤，得到截留液，再将截流液置于双层透析袋中透析，真空冷冻干燥，即得。
发明人通过检索后得知α-淀粉酶抑制剂在等电点附近基本不沉降，而植物凝集素和胰蛋白酶抑制剂在pH为3.6时会发生显著沉降，因而在本发明中，通过步骤S2来除去植物凝集素和胰蛋白酶抑制剂，减少对α-淀粉酶抑制剂抑制率的影响。
另外，为了提高α-淀粉酶抑制剂的抑制率，发明人从提高提取率进行研究，经过大量创造性试验筛选，发现提取溶剂中加入卵磷脂后，能够提高α-淀粉酶抑制剂的提取率，但在实验二中测得的抑制率并没有得到很好的提高，推测是由于在对步骤S2中白芸豆粗提液的pH进行调节过程时，过酸过碱的环境对α-淀粉酶抑制剂的抑制率造成影响。为此，为了进一步能够同时提高α-淀粉酶抑制剂的提取率和抑制率，发明人发现在提取溶剂中加入脱氧胆酸钠后，提高了α-淀粉酶抑制剂的提取率和抑制率，且在与卵磷脂按照一定的比例配比后，该效果更为显著。对于上述的机理，发明人推测是脱氧胆酸钠在步骤S2对α-淀粉酶抑制剂起到了保护作用，而卵磷脂对这种保护作用起到了增强的效果。
进一步地，所述步骤S2中的白芸豆粉与提取溶剂的料液比为1：(8～10)。
进一步地，所述提取溶剂由水、脱氧胆酸钠和卵磷脂按照质量比1：(0.2～0.3)：(0.25～0.55)组成。
进一步地，所述脱氧胆酸钠和卵磷脂的质量比为1：(1.3～1.8)。
进一步地，所述提取溶剂由水、脱氧胆酸钠和卵磷脂按照质量比1：0.25：0.35组成。
进一步地，所述提取溶剂的制备方法为：将脱氧胆酸钠和卵磷脂加入水中，于100r/min及室温下混合搅拌，得到提取溶剂。
进一步地，所述步骤S1的提取温度为38～45℃，提取时间为60～150min。
进一步地，所述将步骤S2中的白芸豆粗提液的pH用0.5mol/L HCl调至3.6，上清液的pH用0.5mol/L NaOH调至6.8。
进一步地，所述步骤S4中初步纯化α-淀粉酶抑制剂先用截留分子量为50ku的超滤管超滤，再用截留分子量为30ku的超滤管超滤。
进一步地，所述步骤S4中双层透析袋的内层截留分子量为35ku，外层截留分子量为14ku。
进一步地，所述步骤S3中真空冷冻干燥的温度为-5～-15℃，真空压力为50～60Pa，时间为1～2h。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的方法能够从白芸豆中得到α-淀粉酶抑制剂，除去植物凝集素和胰蛋白酶抑制剂，具有较高的提取率，且抑制率达到75％以上。
(2)本发明的方法条件可控，工艺较为简单，适应了社会的需求。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。
实施例1、一种从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法
S1)白芸豆的预处理；取白芸豆过筛去除杂质，再粉碎过筛后置于40℃烘箱中干燥，得到白芸豆粉；
S2)白芸豆粗提液的制备；将步骤S1中的白芸豆粉加提取溶剂进行提取，提取温度为38℃，提取时间为90min，离心取上清液，0.22μm滤膜超滤，得到白芸豆粗提液；
S3)α-淀粉酶抑制剂的制备；将步骤S2中的白芸豆粗提液的pH用0.5mol/L HCl调至3.6，沉降1h，离心，收集上清液，再将上清液的pH用0.5mol/L NaOH调至6.8调至6.8后，用无水乙醇将上清液中的乙醇浓度调至70％，搅拌，离心，收集沉淀物，将沉淀物用pH为6.9的磷酸缓冲盐溶液溶解得到初步纯化α-淀粉酶抑制剂。
S4)α-淀粉酶抑制剂的制备；将步骤S3中的初步纯化α-淀粉酶抑制剂先用截留分子量为50ku的超滤管超滤，再用截留分子量为30ku的超滤管超滤，得到截留液，再将截流液置于双层透析袋中透析，内层截留分子量为35ku，外层截留分子量为14ku，冷冻干燥，即得。
其中，提取溶剂由水、脱氧胆酸钠和卵磷脂按照质量比1：0.2：0.26组成；脱氧胆酸钠和卵磷脂的质量比为1：1.3。
实施例2、一种从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法
S1)白芸豆的预处理；取白芸豆过筛去除杂质，再粉碎过筛后置于40℃烘箱中干燥，得到白芸豆粉；
S2)白芸豆粗提液的制备；将步骤S1中的白芸豆粉加提取溶剂进行提取，提取温度为38℃，提取时间为90min，离心取上清液，0.22μm滤膜超滤，得到白芸豆粗提液；
S3)初步纯化α-淀粉酶抑制剂的制备；将步骤S2中的白芸豆粗提液的pH用0.5mol/L HCl调至3.6，沉降1.2h，离心，收集上清液，再将上清液的pH用0.5mol/L NaOH调至6.8调至6.8后，用无水乙醇将上清液中的乙醇浓度调至70％，搅拌，离心，收集沉淀物，将沉淀物用pH为6.9的磷酸缓冲盐溶液溶解得到初步纯化α-淀粉酶抑制剂。
S4)α-淀粉酶抑制剂的制备；将步骤S3中的初步纯化α-淀粉酶抑制剂先用截留分子量为50ku的超滤管超滤，再用截留分子量为30ku的超滤管超滤，得到截留液，再将截流液置于双层透析袋中透析，内层截留分子量为35ku，外层截留分子量为14ku，冷冻干燥，即得。
其中，提取溶剂由水、脱氧胆酸钠和卵磷脂按照质量比1：0.25：0.35组成；脱氧胆酸钠和卵磷脂的质量比为1：1.4。
实施例3、一种从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法
S1)白芸豆的预处理；取白芸豆过筛去除杂质，再粉碎过筛后置于40℃烘箱中干燥，得到白芸豆粉；
S2)白芸豆粗提液的制备；将步骤S1中的白芸豆粉加提取溶剂进行提取，提取温度为40℃，提取时间为100min，离心取上清液，0.22μm滤膜超滤，得到白芸豆粗提液；
S3)初步纯化α-淀粉酶抑制剂的制备；将步骤S2中的白芸豆粗提液的pH用0.5mol/L HCl调至3.6，沉降1.2h，离心，收集上清液，再将上清液的pH用0.5mol/L NaOH调至6.8调至6.8后，用无水乙醇将上清液中的乙醇浓度调至70％，搅拌，离心，收集沉淀物，将沉淀物用pH为6.9的磷酸缓冲盐溶液溶解得到初步纯化α-淀粉酶抑制剂。
S4)α-淀粉酶抑制剂的制备；将步骤S3中的初步纯化α-淀粉酶抑制剂先用截留分子量为50ku的超滤管超滤，再用截留分子量为30ku的超滤管超滤，得到截留液，再将截流液置于双层透析袋中透析，内层截留分子量为35ku，外层截留分子量为14ku，冷冻干燥，即得。
其中，提取溶剂由水、脱氧胆酸钠和卵磷脂按照质量比1：0.25：0.375组成；脱氧胆酸钠和卵磷脂的质量比为1：1.5。
实施例4、一种从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法
S1)白芸豆的预处理；取白芸豆过筛去除杂质，再粉碎过筛后置于40℃烘箱中干燥，得到白芸豆粉；
S2)白芸豆粗提液的制备；将步骤S1中的白芸豆粉加提取溶剂进行提取，提取温度为40℃，提取时间为110min，离心取上清液，0.22μm滤膜超滤，得到白芸豆粗提液；
S3)初步纯化α-淀粉酶抑制剂的制备；将步骤S2中的白芸豆粗提液的pH用0.5mol/L HCl调至3.6，沉降1.2h，离心，收集上清液，再将上清液的pH用0.5mol/L NaOH调至6.8调至6.8后，用无水乙醇将上清液中的乙醇浓度调至70％，搅拌，离心，收集沉淀物，将沉淀物用pH为6.9的磷酸缓冲盐溶液溶解得到初步纯化α-淀粉酶抑制剂。
S4)α-淀粉酶抑制剂的制备；将步骤S3中的初步纯化α-淀粉酶抑制剂先用截留分子量为50ku的超滤管超滤，再用截留分子量为30ku的超滤管超滤，得到截留液，再将截流液置于双层透析袋中透析，内层截留分子量为35ku，外层截留分子量为14ku，冷冻干燥，即得。
其中，提取溶剂由水、脱氧胆酸钠和卵磷脂按照质量比1：0.3：0.54组成；脱氧胆酸钠和卵磷脂的质量比为1：1.8。
对比例1、一种从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法
与实施例2相比，本对比例的区别仅在于：提取溶剂为水。
对比例2、一种从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法
与实施例2相比，本对比例的区别仅在于：提取溶剂由水和卵磷脂按照质量比1：0.35组成。
对比例3、一种从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法
与实施例2相比，本对比例的区别仅在于：提取溶剂由水和脱氧胆酸钠按照质量比1：0.25组成。
对比例4、一种从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法
与实施例2相比，本对比例的区别仅在于：提取溶剂由水、脱氧胆酸钠和卵磷脂按照质量比1：0.5：0.5组成。
实验一、α-淀粉酶抑制剂提取率的测定
1.1实验对象：实施例1～4和对比例1～5。
1.2实验步骤：称取步骤S1中白芸豆粉的质量W0，而本次实验中实施例和对比例的W0均为5.0g。当提取完，称取α-淀粉酶抑制剂的质量W1，再计算出提取率。
1.3计算公式：提取率
Figure GDA0003004436150000071
1.4实验结果
表1
组别 W<sub>0</sub>/g W<sub>1</sub>/g 提取率/％
实施例1 5.0 0.0144 0.00288
实施例2 5.0 0.0149 0.00298
实施例3 5.0 0.0147 0.00294
实施例4 5.0 0.0144 0.00288
对比例1 5.0 0.0041 0.00082
对比例2 5.0 0.0116 0.00232
对比例3 5.0 0.0119 0.00238
对比例4 5.0 0.0182 0.00364
从表1可以看出，实施例1～4中α-淀粉酶抑制剂的提取率较高。与实施例2相比，对比例1的提取溶剂为水，提取率低于实施例2的提取率；对比例2的提取溶剂由提取溶剂由水和卵磷脂按照质量比1：0.35组成，相对于对比例1，能够提高α-淀粉酶抑制剂的提取率，但相对于实施例2，其提取率不高；对比例3的提取溶剂由水和脱氧胆酸钠按照质量比1：0.25组成，其提取率低于实施例2的提取率；对比例4的提取溶剂由水、脱氧胆酸钠和卵磷脂按照质量比1：1：1组成，其提取率高于实施例2的提取率。
实验二、α-淀粉酶抑制剂抑制率的测定
2.1实验对象：实施例1～4和对比例1～5。
2.2实验步骤：样品管：精确吸取0.5ml实施例/对比例双层透析袋中透析后的α-淀粉酶抑制剂和0.5mLα-淀粉酶溶液，充分混匀，在37℃水浴反应10min，然后加入1mL质量分数的2％的可溶性淀粉溶液，在37℃水浴中反应5min，再加入2mL 3,5二硝基水杨酸，在沸水浴中反应5min，之后立即用流动自来水冷却(终止反应)，适量稀释，在波长470nm处测定吸光度值，记为OD470nm。对照组：用蒸馏水替代α-淀粉酶抑制剂，其他条件同上，记为OD’470nm。空白管：用蒸馏水替代α-淀粉酶抑制剂和α-淀粉酶，其他条件同上。
2.3计算公式：抑制率
Figure GDA0003004436150000081
2.4实验结果
表2
Figure GDA0003004436150000082
Figure GDA0003004436150000091
从表2可以看出，实施例1～4的α-淀粉酶抑制剂具有较高的抑制率。对比例1的抑制率不高。相对于对比例1，对比例2中α-淀粉酶抑制剂的抑制率较高，可能是对比例2的含量增加而导致的。对比例3中α-淀粉酶抑制剂的抑制率有了较为显著的提高，说了对比例2的提取溶剂对α-淀粉酶抑制剂的抑制率起到积极作用。对比例4中调整了水、脱氧胆酸钠和卵磷脂之间的比例，而其抑制率发生降低，说明提取溶剂中需要对提取溶剂的比例进行控制。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (5)

1.一种从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1)白芸豆的预处理；取白芸豆过筛去除杂质，再粉碎过筛后置于35～40℃烘箱中干燥，得到白芸豆粉；
S2)白芸豆粗提液的制备；将步骤S1中的白芸豆粉加提取溶剂进行提取，离心取上清液，0.22μm滤膜超滤，得到白芸豆粗提液；
S3)初步纯化α-淀粉酶抑制剂的制备；将步骤S2中的白芸豆粗提液的pH调至3.6，沉降1～1.5h，离心，收集上清液，再将上清液的pH调至6.8后，用无水乙醇将上清液中的乙醇浓度调至70％，搅拌，离心，收集沉淀物，将沉淀物用pH为6.9的磷酸缓冲盐溶液溶解得到初步纯化α-淀粉酶抑制剂；
S4)α-淀粉酶抑制剂的制备；将步骤S3中的初步纯化α-淀粉酶抑制剂用超滤管超滤，得到截留液，再将截流液置于双层透析袋中透析，真空冷冻干燥，即得；
所述步骤S2中的提取溶剂由水、脱氧胆酸钠和卵磷脂按照质量比1：(0.2～0.3)：(0.25～0.55)组成；
所述提取溶剂的制备方法为：将脱氧胆酸钠和卵磷脂加入水中，于100r/min及室温下混合搅拌，得到提取溶剂；
所述步骤S4中初步纯化α-淀粉酶抑制剂先用截留分子量为50ku的超滤管超滤，再用截留分子量为30ku的超滤管超滤；
所述步骤S4中双层透析袋的内层截留分子量为35ku，外层截留分子量为14ku。
2.根据权利要求1所述从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法，其特征在于，所述白芸豆粉与提取溶剂的料液比为1：(8～10)。
3.根据权利要求1所述从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法，其特征在于，所述脱氧胆酸钠和卵磷脂的质量比为1：(1.3～1.8)。
4.根据权利要求1所述从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法，其特征在于，所述提取溶剂由水、脱氧胆酸钠和卵磷脂按照质量比1：0.25：0.35组成。
5.根据权利要求1所述从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法，其特征在于，所述步骤S2的提取温度为38～45℃，提取时间为60～150min。
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