CN104857062A - 一种安全高效白芸豆α-淀粉酶抑制剂的工业化制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种安全高效白芸豆α-淀粉酶抑制剂的工业化制备方法，属于植物有效成分的制备领域。本方面首先将白芸豆磨粉，碱水提取，然后将离心所得的上清液调至酸性，灭酶、碱处理、超滤得到截留液，将截留液干燥，即得不含植物凝集素和胰蛋白酶抑制剂的白芸豆α-淀粉酶抑制剂产品。本发明制备的α-淀粉酶抑制剂产品中无植物凝集素活力和胰蛋白酶抑制剂活力，α-淀粉酶抑制剂活力较高，因而所得白芸豆α-淀粉酶抑制剂产品安全高效，而且本发明工艺简单、成本低，可用于工业化大规模生产，有着较好的经济效益和社会效益。

Description

一种安全高效白芸豆α-淀粉酶抑制剂的工业化制备方法

技术领域

本发明涉及一种安全高效白芸豆α-淀粉酶抑制剂的工业化制备方法，属于植物有效成分的制备领域。

背景技术

随着社会经济的高速发展，糖尿病日益流行，并已呈低龄化发展趋势。糖尿病是一种以糖代谢紊乱为主的全身性疾病，其典型特征之一是餐后高血糖。餐后血糖的持续升高会产生葡萄糖毒性，损伤心血管系统，最终对人体造成不可逆的伤害。因此，控制餐后血糖升高，对于控制和延缓糖尿病的发生和发展至关重要。白芸豆α-淀粉酶抑制剂是一种能特异性抑制人体唾液和肠道淀粉酶活力的糖蛋白，能够通过阻碍或延缓淀粉的水解来降低餐后血糖高峰，因而在糖尿病的预防和控制方面有着较好的应用前景。白芸豆是一种短日照植物，春秋两季均可栽培，在我国各省区均有种植，尤其在云南、四川、贵州等省份种植面积较大，一般产量在1020～1125kg/hm²。因此白芸豆α-淀粉酶抑制剂产品的工业化制备有着重大的现实意义和良好的物质基础。

然而，尽管白芸豆有着较高的α-淀粉酶抑制剂含量(0.4～0.5mg/g)，而且白芸豆α-淀粉酶抑制剂的生物安全性较高，不会引起如腹泻、哮喘等不良反应，但白芸豆也含有较为显著的植物凝集素活力(43×10^-3HU/g)和胰蛋白酶抑制剂活力(42×10^-3TIU/g)。相关研究报道，白芸豆植物凝集素对小白鼠的LD₅₀为140.24mg/kg，具有中等毒性，而胰蛋白酶抑制剂不仅会阻碍胰蛋白酶对蛋白质的消化，导致腹泻和营养不良，还会刺激肠道内淀粉酶的分泌，造成α-淀粉酶抑制剂在肠道内无法有效地发挥其生理作用。因此有必要在白芸豆α-淀粉酶抑制剂的制备过程中尽可能地去除植物凝集素和胰蛋白酶抑制剂，得到安全高效的白芸豆α-淀粉酶抑制剂产品。

目前报道的诸多白芸豆α-淀粉酶抑制剂制备方法，或者未考虑植物凝集素和胰蛋白酶抑制剂的去除情况，难以保证白芸豆α-淀粉酶抑制剂产品的安全性和有效性，或者采用了盐析、透析、色谱分离等工艺，不适宜白芸豆α-淀粉酶抑制剂的工业化大规模生产。因此，实现不含植物凝集素和胰蛋白酶抑制剂的白芸豆α-淀粉酶抑制剂的工业化制备，不仅对糖尿病的预防和控制有着积极的作用，而且有利于促进白芸豆等农产品的综合利用。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一种低含或不含植物凝集素和胰蛋白酶抑制剂的白芸豆α-淀粉酶抑制剂的工业化制备方法，有助于白芸豆α-淀粉酶抑制剂的实际生产和应用。

本发明提供了一种安全高效白芸豆α-淀粉酶抑制剂的工业化制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)磨粉：将白芸豆磨粉，过筛；

(2)碱水提取：将豆粉与水混合后，调节pH至碱性，搅拌提取；

(3)离心：将混合液离心取上清液，调节上清液的pH至酸性；

(4)灭酶：将上清液灭酶，然后离心取上清液；

(5)碱处理：将上一步得到的上清液调至碱性，室温搅拌，然后将pH调至6.5-7.5，离心取上清液；

(6)超滤：将上清液进行超滤，收集截留液；

(7)干燥：将截留液干燥，即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品。

所述步骤(1)中过筛条件，在本发明的一种实施方式中是：40-60目筛。

所述步骤(2)中豆粉与水，在本发明的一种实施方式中是按照1:5-1:10(m/v)的比例混合。

所述步骤(2)、(5)中碱性条件，在本发明的一种实施方式中是pH8.0-10.0。

所述步骤(2)、(5)中的搅拌，在本发明的一种实施方式中是搅拌2-4h以上。

所述步骤(3)中酸性条件，在本发明的一种实施方式中是pH3.0-5.0。

所述步骤(3)中离心条件，在本发明的一种实施方式中是：4℃，5000-8000r/min，30-60min。

所述步骤(4)中的灭酶，在本发明的一种实施方式中是在60-80℃水浴处理。

所述步骤(4)、(5)中的离心条件，在本发明的一种实施方式中是：5000-8000r/min，10min。

所述步骤(6)中超滤条件，在本发明的一种实施方式中是：超滤膜10-30kDa。

所述方法，在本发明的一种实施方式中，步骤(2)、(5)的碱性是指pH10，步骤(3)的酸性是指pH4，步骤(6)的超滤是采用30kDa超滤膜。

所述方法，在本发明的一种实施方式中，包括如下步骤：

(1)磨粉：将白芸豆磨粉，过筛；

(2)碱水提取：将豆粉与蒸馏水按1:5-1:10(w/v)混合，调节pH至碱性，室温搅拌提取2-4h；

(3)离心：将混合液离心取上清液，调节上清液的pH至酸性；

(4)灭酶：将上清液在60-80℃水浴灭酶20min，然后离心(5000-8000r/min，10min)取上清液；

(5)碱处理：将上清液调至碱性，室温搅拌2-4h后将pH调至6.9，离心(5000-8000r/min，10min)取上清液；

(6)超滤：将上清液进行超滤，收集截留液；

(7)干燥：将截留液冷冻干燥或喷雾干燥，超微粉碎后即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品。

所述方法，在本发明的一种实施方式中，豆粉：水＝1:5，步骤(2)、(5)的碱性是指pH10，步骤(3)的酸性是指pH4，步骤(6)的超滤是采用30kDa超滤膜。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)白芸豆有着较高的α-淀粉酶抑制剂含量，但同时也含有对人体有害的植物凝集素和不利于α-淀粉酶抑制剂在人体中发挥生理功能的胰蛋白酶抑制剂。本发明采用磨粉、碱水提取、离心、灭酶、碱处理、超滤、冷冻干燥的方法，得到的α-淀粉酶抑制剂产品低含或者不含植物凝集素和胰蛋白酶抑制剂，安全、高效，对于糖尿病和肥胖症的预防和控制具有现实意义；(2)本发明方法，不需要采用盐析、透析、色谱分离等工艺，适合工业化大规模生产白芸豆α-淀粉酶抑制剂；(3)本发明方法能够从白芸豆中制备不含植物凝集素和胰蛋白酶抑制剂的白芸豆α-淀粉酶抑制剂产品，产品低含或不含植物凝集素活力和胰蛋白酶抑制剂活力，α-淀粉酶抑制剂活力高达1350U/g。

具体实施方式

通过以下具体实施例对本发明作进一步的具体说明，但应该理解本发明并不受这些内容所限制。

α-淀粉酶抑制剂活力的测定方法

将0.25mLα-淀粉酶液(1unit/mL)和0.25mL样品(适当稀释)加入到0.5mL0.1mol/LPBS(pH6.9)中，于37℃水浴10min后，加入0.5mL1％(w/v)的可溶性淀粉溶液，精确反应5min后加入lmLDNS试剂，沸水浴10min后迅速冷却，适当稀释后，在540nm波长下测定吸光值。对照管中不加α-淀粉酶液(以同体积PBS补足)，其他与抑制剂管相同，其反应体系如表1所示。

表1 α-淀粉酶抑制率测定体系

样品对α-淀粉酶的抑制率可按下式计算：

式中A₁、A₂、A₃和A₄分别为540nm下空白管、空白对照管、抑制管和背景对照管的吸光值。通过稀释倍数即可将样品对α-淀粉酶的抑制率转换为样品对α-淀粉酶的抑制活力。

胰蛋白酶抑制剂活力的测定方法

(1)试剂的配制：

BApNA溶液的配制：将30mgBApNA溶于0.5mL二甲亚砜，加0.5mL乙醇使BApNA充分溶解，然后用含有0.03mol/LCaCl₂的0.05mol/LTris-HCl溶液，pH约为8.2，定容至100mL。

胰蛋白酶溶液的配制：将2mg胰蛋白酶溶于100mL0.001mol/L的HCl即得。

(2)胰蛋白酶抑制剂活力的测定

将0.4mL样品(适当稀释)加入0.4mL的胰蛋白酶溶液中，于37℃水浴振荡保温15min后，加入2.8mLBApNA溶液，水浴振荡保温15min。加入1mL30％(v/w)的冰醋酸终止反应，定容至10mL，于室温下410nm测吸光度。以不加胰蛋白酶的试样为空白，只加入胰蛋白酶而不加提取物的试样为对照。胰蛋白酶抑制剂抑制活力(TIU)用其抑制的胰蛋白酶活力来表征：

TIU＝AU*(A₀-A)/A₀*100％*稀释倍数

抑制率(％)＝(A₀-A)/A*100％

其中A为加入样品的吸光值，A₀为对照组的吸光值，AU为对照组中胰蛋白酶的活力。胰蛋白酶的活力为10mL测定体系中吸光度每增加0.01个单位为一个单位的AU。AU的绝对活性则通过测定单位时间内胰蛋白酶分解底物BApNA产生对硝基苯胺的微摩尔数来获得。

植物凝集素活力的测定

(1)试剂的配制

Alsever’s液(血球缓冲液)的配制；称取葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.80g、柠檬酸0.05g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，加热溶解后调pH值至7.2，高压灭菌后，置4℃冰箱保存备用。

红血球悬液的配制；利用采血管抽取兔耳静脉血，将新鲜血液倒入离心管，并于离心机中3000r/min离心3min。用移液枪去除上层血清，向沉淀中添加生理盐水以清洗血红细胞。轻轻颠倒摇匀洗涤，然后再次3000r/min离心3min，去除上清液，如此重复操作洗涤3次。根据红细胞压积，按照离心出的红细胞体积，加入生理盐水配成2％(w/v)浓度的红血球悬液，4℃保存备用。

(2)植物凝集素活力的测定

将50μL样品于96V孔板中进行倍比稀释，然后向加有样品的孔中加入50μL红血球悬液，于4℃下静置2h后观察凝血情况。凝血活力按下式计算：

凝血活力(HU)＝2ⁿ×1000μL/mL×体积(mL)/每孔添加体积(μL)

实施例1

将白芸豆粉碎，收集过50目筛网的豆粉；

取100g豆粉与500mL蒸馏水混合，用1mol/LNaOH溶液调节pH至8.0，室温搅拌提取2h；

将混合液于4℃，8000r/min下离心40min，收集上清液；

用1mol/LHCl溶液调节上清液pH至3.0，于60℃水浴灭酶20min，离心(5000r/min，10min)取上清液；

用1mol/LNaOH溶液将上清液pH调至8.0，室温搅拌2h后，用1mol/LHCl溶液调节上清液pH至6.9，离心(5000r/min，10min)取上清液；

将上清液超滤，所用超滤膜孔径为10kDa，收集截留液；

将截留液冷冻干燥，超微粉碎后即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品。

将α-淀粉酶抑制剂产品溶于0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.9)中，测定α-淀粉酶抑制剂产品中α-淀粉酶抑制剂活力、植物凝集素活力和胰蛋白酶抑制剂活力。测定结果显示，α-淀粉酶抑制剂产品中α-淀粉酶抑制剂活力为1200U/g，植物凝集素活力为9.89×10^-3HU/g，胰蛋白酶抑制剂活力为21×10^-3TIU/g。

实施例2

将白芸豆粉碎，收集过40目筛网的豆粉；

取100g豆粉与500mL蒸馏水混合，用1mol/LNaOH溶液调节pH至9.0，室温搅拌提取2h；

将混合液于4℃，8000r/min下离心60min，收集上清液；

用1mol/LHCl溶液调节上清液pH至5.0，于60℃水浴灭酶20min，离心(5000r/min，10min)取上清液；

用1mol/LNaOH溶液将上清液pH调至9.0，室温搅拌2h后，用1mol/LHCl溶液调节上清液pH至6.9，离心(5000r/min，10min)取上清液；

将上清液超滤，所用超滤膜孔径为20kDa，收集截留液；

将截留液喷雾干燥，超微粉碎后即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品。

将α-淀粉酶抑制剂产品溶于0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.9)中，测定α-淀粉酶抑制剂产品中α-淀粉酶抑制剂活力、植物凝集素活力和胰蛋白酶抑制剂活力。测定结果显示，α-淀粉酶抑制剂产品中α-淀粉酶抑制剂活力为1000U/g，植物凝集素活力为4.09×10^-3HU/g，未检测到胰蛋白酶抑制剂活力。

实施例3

将白芸豆粉碎，收集过60目筛网的豆粉；

取100g豆粉与500mL蒸馏水混合，用1mol/LNaOH溶液调节pH至10.0，室温搅拌提取2h；

将混合液于4℃，8000r/min下离心30min，收集上清液；

用1mol/LHCl溶液调节上清液pH至4.0，于60℃水浴灭酶20min，离心(5000r/min，10min)取上清液；

用1mol/LNaOH溶液将上清液pH调至10.0，室温搅拌2h后，用1mol/LHCl溶液调节上清液pH至6.9，离心(5000r/min，10min)取上清液；

将上清液超滤，所用超滤膜孔径为30kDa，收集截留液；

将截留液冷冻干燥，超微粉碎后即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品。

测定所得产品性质，结果显示，α-淀粉酶抑制剂产品中α-淀粉酶抑制剂活力为1350U/g，未检测到植物凝集素活力和胰蛋白酶抑制剂活力。

实施例4

采用以下方法制备安全高效的α-淀粉酶抑制剂：

(1)磨粉：将白芸豆磨粉，过筛；

(2)碱水提取：将豆粉与水按1:10(w/v)混合，调节pH至10，室温搅拌提取4h；

(3)离心：将混合液离心取上清液，调节上清液的pH至4；

(4)灭酶：将上清液在80℃水浴灭酶，然后8000r/min离心取上清液；

(5)碱处理：将上清液调至pH10，室温搅拌4h，然后调节pH至6.5-7.5，离心(8000r/min)取上清液；

(6)超滤：将上清液进行超滤，所用超滤膜孔径为30kDa，收集截留液；

(7)干燥：将截留液冷冻干燥或喷雾干燥，即得α-淀粉酶抑制剂产品。

得到的产品中α-淀粉酶抑制剂活力为1250U/g，未检测到植物凝集素活力和胰蛋白酶抑制剂活力。

实施例5对照例

参照《一种可工业化提取白芸豆中α-淀粉酶抑制剂的方法》制备白芸豆α-淀粉酶抑制剂，具体实施步骤如下：

(1)取100g白芸豆于400mL蒸馏水中在室温下浸泡9h后手工去皮；

(2)用高速组织捣碎机将去皮白芸豆用400mL蒸馏水磨浆后过100目筛，将筛上物用200mL蒸馏水再次磨浆后过100目筛，弃去筛上物，合并滤液，室温下静置2.5h后，于4℃下9000r/min离心20min，取上清液；

(3)将上清液于70℃水浴灭酶30min，在4℃下9000r/min离心20min，收集上清液；

(4)向上清液中加入无水乙醇至终浓度为70％，4℃下搅拌2h后，于4℃下9000rpm离心20min，收集沉淀，该沉淀为蛋白质；

(5)将蛋白质在通风橱中放置1h后，用400mL0.02M、pH6.9的磷酸盐缓冲液溶解后得到蛋白液；

(6)将蛋白液的浓度调为20mg/mL后取该蛋白液400mL于酶反应器中，调节温度至60℃，调节pH至7.5，加入1.5mL碱性蛋白酶2.4L酶解4h后得到蛋白酶解液；

(7)将蛋白酶解液的pH调至5.5，于4℃下静置2h，在4℃下9000r/min离心20min，收集上清液；

(8)向上清液中加入无水乙醇至终浓度为70％，4℃下搅拌2h后，于4℃下9000rpm离心20min，收集沉淀物；

(9)冷冻干燥：将沉淀物在通风橱中放置1-2h后，于-80℃冷冻干燥48h，超微粉碎后即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品。

对照产品的性质：

按上述方法制备得到的α-淀粉酶抑制剂中，植物凝集素活力为38.42×10^-3HU/g，胰蛋白酶抑制剂活力为39.17×10^-3TIU/g，分别是白芸豆种子中植物凝集素活力和胰蛋白酶抑制剂活力的89.35％和93.26％。由于已有研究表明，白芸豆植物凝集素对小白鼠具有中等毒性，且胰蛋白酶抑制剂会阻碍胰蛋白酶对蛋白质的消化、刺激肠道内淀粉酶的分泌、造成α-淀粉酶抑制剂在肠道内无法有效地发挥其生理作用，所以对照产品还需要进一步分离纯化，才能达到安全高效。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种安全高效白芸豆α-淀粉酶抑制剂的工业化制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)磨粉：将白芸豆磨粉，过筛；

(2)碱水提取：将豆粉与水混合后，调节pH至碱性，搅拌提取；

(3)离心：将混合液离心取上清液，调节上清液的pH至酸性；

(4)灭酶：将上清液灭酶，然后离心取上清液；

(5)碱处理：将上一步得到的上清液调至碱性，室温搅拌，然后将pH调至6.5-7.5，离心取上清液；

(6)超滤：将上一步得到的上清液进行超滤，收集截留液；

(7)干燥：将截留液干燥，即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)、(5)中碱性条件是pH8.0-10.0；所述步骤(3)中酸性条件是pH 3.0-5.0。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中超滤条件是：超滤膜10-30kDa。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)、(5)中的搅拌，是搅拌2-4h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中离心条件是：4℃，5000-8000r/min，30-60min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)、(5)中的离心条件是：5000-8000r/min，10min。

7.据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的灭酶，是在60-80℃水浴处理。

8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述方法是：

(1)磨粉：将白芸豆磨粉，过筛；

(2)碱水提取：将豆粉与蒸馏水按质量体积比1:5-1:10混合，调节pH至碱性，室温搅拌提取2-4h；

(3)离心：将混合液离心取上清液，调节上清液的pH至酸性；

(4)灭酶：将上清液在60-80℃水浴灭酶20min，然后5000-8000r/min离心10min，取上清液；

(5)碱处理：将上清液调至碱性，室温搅拌2h后将pH调至6.9，5000-8000r/min离心10min取上清液；

(6)超滤：将上清液进行超滤，收集截留液；

(7)干燥：将截留液干燥，超微粉碎后即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中过筛条件是：40-60目筛。

10.根据权利要求1-9任一所述方法得到的α-淀粉酶抑制剂。