CN114209721B - 一种降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种降糖控脂的辣木叶多酚‑多糖组合物及其制备方法与应用。以干辣木叶为原料分段提取、精制辣木叶多酚与多糖，再进行复配制备降糖控脂的辣木叶多酚‑多糖组合物。该组合物中总酚含量>6％，多糖含量>48％，抗氧化活性强，胆酸盐吸附能力强，能有效延缓淀粉水解、阻滞葡萄糖扩散，具有预防和改善2型糖尿病的潜力。本发明工艺流程达到食品级要求，极大程度上实现了辣木叶中主效活性因子的全利用，可应用于保健品或食品等中。

Description

一种降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于辣木叶精深加工领域，具体涉及一种降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物及其制备方法与应用。
背景技术
目前，随着生活水平的提高，人们糖脂代谢紊乱的问题日益严重。流行病学数据显示，至2019年，中国成人血脂异常患病率>40％。2020年《中国2型糖尿病防治指南》显示，据世界卫生组织(WHO)诊断标准，我国糖尿病患病率为11.2％，至少3亿人处于糖尿病前期，大量研究证明在糖尿病前期及新发2 型糖尿病1年以内的人群，只要前期加强管理、干预，多数患者病情能得到有效控制与改善。目前预防、改善2型糖尿病的途径包括抑制葡萄糖生成、缓解胰岛素抵抗、控制肝糖转化、促进胰岛素分泌、促进肝脏和外周组织摄取利用葡萄糖、调控脂质代谢以及拮抗氧化应激等。因此，干预糖脂消化吸收、拮抗氧化应激是预防和改善2型糖尿病的有效途径与重要方法。天然产物富含降糖控脂因子，多糖类、多酚类功能成分因其显著的生理活性已成为开发降糖控脂食品配料的重点。
辣木(Moringa oleifera Lam.)，是辣木科辣木属多年生热带落叶乔木，原产于印度，广泛种植于亚洲和非洲热带和亚热带地区，在我国广东、广西、云南、福建等地多有引种栽培。辣木有环境适应性强、生长快速、营养丰富等优点。2012年，辣木叶被我国卫生部批准作为新资源食品。辣木叶含有丰富的蛋白质、多酚类及糖类物质。本团队采用粉碎过筛、碱法处理、蛋白酶酶解、纤维素酶酶解、高压均质、高温提取、低温高速离心、超滤分离浓缩、蛋白酶酶解、低温高速离心、二次超滤分离浓缩、冷冻干燥等工艺，得到一种具有降血糖活性的辣木叶提取物。该提取物多糖含量>30％，具有良好的降血糖功效，该制备方法能够有效提取辣木叶中具有降血糖功能的多糖，并除去蛋白、保留多糖成分(专利申请号：CN201811006140.4)；此外，本研究团队采用粉碎过筛、乙醇热回流去杂、加水匀浆、超声波处理、纤维素酶酶解、高温提取、离心分离、减压浓缩、乙醇分级沉淀、加水复溶、二次减压浓缩、冷冻干燥工艺，得到一种具有胆酸盐吸附能力的辣木叶提取物(专利申请号：CN201811536815.6)。该提取物总糖含量>50％，具有良好的胆酸盐吸附能力。该制备方法能够有效提取辣木叶中具有胆酸盐吸附能力(降血脂潜力功能)的多糖，相比于专利(专利申请号：CN201811006140.4)，多糖含量更高、功能不同。其他研究团队也前后制备出具有降糖功能/潜力的辣木叶提取物：(1)通过水浸提、乙醇沉淀及复合酶制剂反复提取后再醇沉，最后采用柱层析分离出的辣木叶多糖粉末对α-葡萄糖苷酶具有显著抑制作用，且在动物水平上验证其具有降血糖功效(专利申请号：CN201710738449.1)；(2)一种超声辅助乙醇提取辣木叶干粉后通过石油醚、乙酸乙酯等分级萃取，再经层析柱纯化得到辣木叶提取物粉末的多酚纯度较高，对α-葡萄糖苷酶具有显著抑制作用(专利申请号：CN201610378444.8)。综上所述，辣木叶是制备降糖控脂食品配料的优质原料，其中的多糖、多酚类物质是其发挥降糖控脂作用的主效成分；但现有技术除了针对辣木叶多糖进行高效提取、精制，还针对辣木叶多酚进行提取、分离、纯化；获取多糖的时候，往往将多酚作为杂质弃去，获取多酚的时候，往往将多糖作为杂质或废渣丢弃，辣木叶中主效活性因子未被充分利用，导致活性成分的浪费。总的说来，现有技术忽略了辣木叶多酚、多糖的协同作用，辣木叶提取物制备过程中废渣多、浪费多、活性成分全利用度低。
鉴于此，本发明针对现有技术中的问题，本专利采用分段提取技术，先后高效提取辣木叶中的多酚、多糖，再将其进行科学配伍，获得一种降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物，减少生产废渣，实现多酚、多糖全利用，为具有“双控功能”的辣木叶提取物的规模化制备提供技术支持。
发明内容
本发明目的在于提供一种降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物及其制备方法，该制备方法以降糖控脂活性为导向，分段提取辣木叶多酚与多糖，两种提取物按比例组合得到一种降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物。该组合物中总酚含量>6％，多糖含量>48％，抗氧化活性强，通过INFOGEST静态消化模型验证该组合物具有较好的降糖控脂功效，具有预防和改善2型糖尿病的潜力。本发明整个工艺流程均可达食品级要求，可应用于药物、保健品或食品等领域当中。
本发明的技术方案如下：
一种降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物的制备方法，以干辣木叶为原料分段提取、精制辣木叶多酚与多糖，再进行复配制备降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物，首先以干辣木叶为原料，采用乙醇回流提取、大孔树脂分离纯化得到一种辣木叶精制多酚；去酚辣木叶残渣经烘干去除乙醇后，采用酸法耦合酶法前处理、加热提取、酶法耦合超滤-醇沉-透析除杂后处理得到一种辣木叶精制多糖，将辣木叶精制多酚、辣木叶精制多糖按比例复配组合得到一种降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物，该组合物中总酚含量>6％，多糖含量>48％，抗氧化活性强，胆酸盐吸附能力强，能有效延缓淀粉水解、阻滞葡萄糖扩散，具有预防和改善2型糖尿病的潜力，具体包括以下步骤：
(1)乙醇回流提取：将干辣木叶粉碎后过筛，得到辣木叶干粉M，在所得辣木叶干粉中加入乙醇溶液，进行回流提取，得混悬液S1，冷却至室温后，离心，取上清液得提取液E1，取残渣烘干得去酚辣木叶粉D，提取液E1经减压浓缩去除乙醇，得提取液E2；
(2)大孔树脂分离纯化：将步骤(1)所得提取液E2上样到大孔树脂层析柱中，将流出管接入到提取液E2中，循环上样。用水洗脱去杂后，采用乙醇溶液进行动态解吸，收集乙醇洗脱组分，得提取液E3。提取液E3减压浓缩去除乙醇，得提取液E4，将提取液E4进行冷冻干燥，得到辣木叶精制多酚F；
(3)酸法耦合酶法前处理：将步骤(1)所得去酚辣木叶粉D与水按比例混合，匀速搅拌，调节pH值至酸性，升温后保温，得混悬液S2，加入果胶酶，恒温搅拌进行酶解，得混悬液S3；
(4)高温提取：将步骤(3)中所得混悬液S3升温后保温，得混悬液S4，冷却至室温后，离心，取上清液得提取液E5；
(5)酶法耦合超滤-醇沉-透析除杂后处理：调节步骤(4)所得提取液E5 的pH值，搅拌均匀，得提取液E6，加入蛋白酶，加热搅拌进行酶解，得提取液E7，加热灭酶，得提取液E8，冷却至室温后，离心，取上清液得提取液E9。提取液E9采用超滤膜进行超滤浓缩，得提取液E10，加入乙醇溶液，充分混匀，冷却静置得混悬液S5，离心后得沉淀P1，向沉淀P1中加入水，升温后保温匀速搅拌，得提取液E11，减压浓缩，得提取液E12，低温透析得提取液E13，进行冷冻干燥，得到辣木叶精制多糖P；
(6)复配组合：将步骤(2)所得辣木叶精制多酚F与步骤(5)所得辣木叶精制多糖P按比例进行复配，得降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物FP。
进一步地，步骤(1)中，所述过筛是过40目筛，所述辣木叶干粉与乙醇溶液的料液比为1:15～1:25g/mL，所述乙醇溶液的浓度为35％～65％(v/v)，所述回流提取的温度为55～85℃，回流提取的时间为45～75min，所述离心的离心力为4000～8000g，离心的时间为15～25min，所述烘干的温度为55～75℃，所述减压浓缩的温度为40～60℃，所述提取液E2中固形物含量为10wt％～20wt％。
进一步地，步骤(2)中，所述大孔树脂是指型号为XAD-16的大孔树脂，所述上样的流速为0.6～1.0mL/min，所述循环上样的时间为4～6h，所述用水洗脱的体积为4～6个柱体积，用水洗脱的的流速为1～3mL/min，所述乙醇洗脱的条件为：乙醇浓度为30％～50％(v/v)，洗脱体积为3～5个柱体积，乙醇溶液洗脱流速为1～3mL/min，减压浓缩的温度为40～60℃，所述提取液E4中固形物含量为20wt％～30wt％。
进一步地，步骤(3)中，所述去酚辣木叶粉D与水的料液比为1:5～1:15g/mL，所述搅拌的速率为120～180r/min，搅拌的时间为30～60min；所述调节pH值的方法是：用柠檬酸调节pH值为4～5；所述升温温度为50～60℃，所述保温的时间为30～60min，所述果胶酶的加入量为去酚辣木叶粉质量的0.6％～1.2％(w/w)，所述酶解的时间为4～8h，酶解的温度为50～60℃，所述搅拌的速率为120～180 r/min。
进一步地，步骤(4)中，所述升温的温度为95～115℃，所述保温的时间为 75～105min，所述离心的离心力为4000～8000g，离心的时间为15～25min。
进一步地，步骤(5)中，所述pH值的调节方法是：使用氢氧化钠调节pH 值为6～8，所述搅拌的速率为120～180r/min，所述蛋白酶为胰酶，所述蛋白酶的加入量为提取液E6蛋白含量的0.5％～1.5％(w/w)，所述酶解的温度为50～60℃，酶解的时间为7～9h，所述搅拌的速率为120～180r/min，所述灭酶的温度为 90～100℃，灭酶的时间为10～20min，所述离心的离心力为4000～8000g，离心的时间为15～25min，所述超滤膜分子量为10000Da，所述超滤的次数为2～4次，所述提取液E10为分子量>10000Da的超滤截留液，所述醇沉时乙醇的终浓度为65％～85％(v/v)，所述静置的温度为4～10℃，静置的时间为6～10h。
进一步地，步骤(5)中，所述沉淀P1与去离子水的料液比为1:10～1:15g/mL，所述升温的温度为50～60℃，所述保温的时间为30～60min，所述搅拌的速率为 200～400r/min，所述减压浓缩的温度为50～70℃，浓缩液中固形物含量为20 wt％～30wt％，所述透析是将提取液E12装进分子量为500Da的透析袋中，在温度为4～10℃的离子水中透析10～16h，每隔1～2h换一次水。
进一步地，步骤(6)中，所述精制多酚F与精制多糖P的复配比例为1:3。
一种由上述的制备方法制备得到的降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物。
一种降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物在制备降糖控脂保健品或药物中的应用。
一种降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物在具有降糖控脂作用的保健品或食品中的应用。
本发明具有如下优点和效果：
(1)针对辣木叶中化学成分复杂的特点，利用多酚、多糖结构与性质的区别，采用乙醇提取醇溶性多酚、酶法提取水溶性多糖的分段提取模式，实现不同结构、性质的辣木叶活性成分高效提取。此外，本发明利用酸法耦合酶法前处理，极大程度上促进了多糖溶出、有效规避了辣木叶中蛋白溶出，并通过蛋白酶酶解、超滤除杂的方式，进一步去除辣木叶蛋白，提升辣木叶多糖纯度。依据多酚-多糖协同增效作用，按比例进行配伍，实现辣木叶活性成分的有效拆分与重组。
(2)本发明不涉及有毒危化品的使用，整个制备工艺流程可达食品级要求。
(3)本发明所得降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物总酚含量>6％，多糖含量>48％，既具备多酚的性能——强抗氧化活性，又兼具多糖的性能——强胆酸盐吸附活性、葡萄糖扩散阻滞活性、延缓淀粉水解活性，有效抑制脂质、糖类消化与吸收，拮抗氧化应激，能通过多途径改善2型糖尿病，适用于保健品、药物或食品。
附图说明
图1为降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物的ABTS·+清除率柱状图。
图2为降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物对淀粉消化产物麦芽糖生成量的影响柱状图。
图3为降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物对淀粉消化产物麦芽三糖生成量的影响柱状图。
图4为降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物对葡萄糖扩散的影响柱状图。
图5为降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物的胆酸盐吸附能力柱状图。
具体实施方案
为更好地理解本发明，下面将具体阐明ABTS·+清除实验和INFOGEST静态消化模型的操作并结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的实施方式不限于此。
1、ABTS·+清除实验：
在96孔微孔板中加入50μL的0.1mg/mL样品溶液，然后用移液器快速地加入150μLABTS·+溶液，反应混合液在30℃下保温30min，测定其在734nm 处的吸光度值，记为Asample。用50μL磷酸盐缓冲溶液作为对照组，其对应的吸光度值记为Acontrol。
根据下列公式计算样品对ABTS·+的清除率：
Figure BDA0003352735410000071
2、INFOGEST静态消化模型评价控糖降脂活性：
(1)模拟口腔液(Simulated salivary fluid，SSF)：包含15.1mmol/L KCl、3.7mmol/L KH2PO4、13.6mmol/L NaHCO3、0.15mmol/L MgCl2(H2O)6、0.06 mmol/L(NH4)2CO3、1.1mmol/LHCl和1.5mmol/L CaCl2(H2O)2。
(2)模拟胃液(Simulated gastric fluid，SGF)：包含6.9mmol/L KCl、0.9 mmol/LKH2PO4、25mmol/L NaHCO3、47.2mmol/L NaCl、0.12mmol/L MgCl2(H2O)6、0.5mmol/L(NH4)2CO3、15.6mmol/L HCl和0.15mmol/L CaCl2(H2O)2。
(3)模拟肠液(Simulated intestinal fluid，SIF)：包含6.8mmol/L KCl、0.8mmol/L KH2PO4、85mmol/L NaHCO3、38.4mmol/L NaCl、0.33mmol/L MgCl2(H2O)6、8.4mmol/LHCl和0.6mmol/L CaCl2(H2O)2。
样品在INFOGEST模型中的消化过程如下：
(1)口腔消化：称取0.2g样品，溶于2mL SSF，加入0.00625mL 0.3mmol/L CaCl2(H2O)2和0.245mL去离子水，用氢氧化钠调pH至7.0，37℃恒温振荡2min。口腔消化终体积为2.5mL。
(2)胃消化：在口腔消化物中加入2mL SGF，40mg胃蛋白酶用0.17mL 去离子水溶解后加入(至终浓度2000U/mL)，再加入0.23mL去离子水，用盐酸调pH至3.0，37℃恒温振荡2h。胃消化终体积为5mL。
(3)小肠消化：在胃消化物中加入4mL SIF和0.01mL 0.3mmol/L CaCl2(H2O)2，用1.25mL SIF溶解5mg胰酶(至终浓度100U/mL)后加入，用 0.75mL SIF溶解66.4mg猪胆盐(胆酸盐含量为80％)，再加入0.79mL去离子水，调pH至7.0，37℃恒温振荡2h。保持肠消化终体积为10mL。
2.1、延缓淀粉水解能力测定步骤：
取1g熟米饭均质呈糊状，加入0.2g样品，按照上述进行模拟胃消化、小肠消化。消化结束后冰浴5min，10000g离心10min取上清液，过0.22μm滤膜，使用高效液相色谱法测定淀粉消化产物麦芽糖、麦芽三糖的含量。
色谱条件：BIO-RADAminex HPX-87P色谱柱(7.8mm×300mm，9μm)，流动相为超纯水，柱温80℃，示差折光显示器流通池温度：50℃，流速0.6mL/min，进样量10μL。
2.2、葡萄糖阻滞能力测定步骤：
取180mg葡萄糖(消化终浓度100mmol/L)与0.2g样品混合均匀，按照上述方法进行模拟口腔和胃消化。模拟小肠消化开始后，将全部消化液转移至透析袋(Mw 3000)中，将透析袋置于装有100mL SIF的容器中，于37℃透析2h。在透析15、30、60、90、120min等时间点分别收集2mL透析袋外液，过0.22μm滤膜，使用高效液相色谱法测定葡萄糖含量。
2.3、胆酸盐吸附能力测定步骤：
样品按照上述方法进行模拟口腔和胃消化。模拟肠消化1h后，将全部消化液转移至透析袋(Mw 3000)中，将透析袋置于装有100mL SIF的容器中，37℃透析1h，消化结束后使用总胆汁酸试剂盒测定透析袋外液胆酸盐含量。按下列公式计算胆酸盐吸附率(％)：
Figure BDA0003352735410000081
其中，C空白＝空白对照组中胆酸盐浓度；C样品＝样品组中胆酸盐浓度。
使用上述方法测定实施例、对比例所得辣木叶加工品的抗氧化活性、延缓淀粉水解能力、葡萄糖阻滞能力及胆酸盐吸附能力。
实施例1
一种降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物，具体包括如下步骤：
(1)乙醇回流提取：将干辣木叶粉碎后过40目筛，得到辣木叶干粉M，以1:15g/mL的料液比向所得辣木叶干粉加入35％(v/v)的乙醇溶液，在55℃下进行回流提取45min，得混悬液S1A，待冷却至室温后，于4000g离心15min，取上清液得提取液E1A，在40℃下减压浓缩去除乙醇，至浓缩液中固形物含量为10wt％，得提取液E2A，取残渣在55℃下烘干得去酚辣木叶粉DA。
(2)大孔树脂分离纯化：将步骤(1)所得提取液E2A以流速为0.6mL/min 上样到型号为XAD-16的大孔树脂层析柱中，将流出管接入到提取液E2A中，循环上样时间为4h；去离子水洗脱体积为4个柱体积，去离子水洗脱流速为1 mL/min，乙醇洗脱条件为：乙醇浓度为30％(v/v)，洗脱体积为3个柱体积，乙醇溶液洗脱流速为1mL/min，收集乙醇洗脱组分，得提取液E3A，在40℃下减压浓缩至浓缩液中固形物含量为20wt％，得提取液E4A，再进行冷冻干燥，得到辣木叶精制多酚FA。
(3)酸法耦合酶法前处理：将步骤(3)所得去酚辣木叶粉DA与去离子水以1:5g/mL混合，120r/min搅拌30min，用柠檬酸调节至pH值为4；升温至 50℃后保温30min。得混悬液S2A，向其中加入辣木叶粉质量的0.6％(w/w) 果胶酶，50℃下以120r/min恒温搅拌4h进行酶解，得混悬液S3A。
(4)加热提取：将步骤(3)中所得混悬液S3A在升温至95℃后保温75min，得混悬液S4A，待冷却至室温后，4000g离心15min，取上清液得提取液E5A。
(5)酶法耦合超滤-醇沉-透析除杂后处理：使用氢氧化钠调节步骤(4)所得提取液E5A至pH值为6，搅拌速率为120r/min，得提取液E6A，向其中加入提取液E6A蛋白含量的0.5％(w/w)蛋白酶，在50℃下以120r/min搅拌7h 进行酶解，得提取液E7A，于90℃下灭酶10min，得提取液E8A，待冷却至室温后，于4000g离心15min，取上清液得提取液E9A，采用分子量为10000Da 的超滤膜进行超滤浓缩，超滤2次，得提取液E10A为分子量>10000Da的超滤截留液，再加入乙醇，使得乙醇的终浓度为65％(v/v)，充分混匀后在4℃下静置6h，得混悬液S5A，经4000g离心25min后，取下层得沉淀P1A，所得沉淀P1A以1:10g/mL的料液比加入去离子水，升温至50℃后保温30min，200 r/min匀速搅拌，得提取液E11A，在50℃下减压浓缩至浓缩液中固形物含量为 20wt％，得提取液E12A，装进分子量为500Da的透析袋，在4℃的离子水中透析10h，每隔1h换一次水，得提取液E13A，进行冷冻干燥，得到辣木叶精制多糖PA。
(6)复配组合：将步骤(2)所得辣木叶精制多酚FA与步骤(5)所得辣木叶精制多糖PA按1:3进行复配，得降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物FPA。
实施例2
一种降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物，具体包括如下步骤：
(1)乙醇回流提取：将干辣木叶粉碎后过40目筛，得到辣木叶干粉M，以1:20g/mL的料液比向所得辣木叶干粉加入50％(v/v)的乙醇溶液，在70℃下进行回流提取60min，得混悬液S1B，待冷却至室温后，于6000g离心20min，取上清液得提取液E1B，在50℃下减压浓缩去除乙醇，至浓缩液中固形物含量为15wt％，得提取液E2B，取残渣在65℃下烘干得去酚辣木叶粉DB。
(2)大孔树脂分离纯化：将步骤(1)所得提取液E2B以流速为0.8mL/min 上样到型号为XAD-16的大孔树脂层析柱中，将流出管接入到提取液E2B中，循环上样时间为5h；去离子水洗脱体积为5个柱体积，去离子水洗脱流速为2 mL/min，乙醇洗脱条件为：乙醇浓度为40％(v/v)，洗脱体积为4个柱体积，乙醇溶液洗脱流速为2mL/min，收集乙醇洗脱组分，得提取液E3B，在50℃下减压浓缩至浓缩液中固形物含量为25wt％，得提取液E4B，再进行冷冻干燥，得到辣木叶精制多酚FB。
(3)酸法耦合酶法前处理：将步骤(1)所得去酚辣木叶粉DB与去离子水以1:10g/mL混合，150r/min搅拌45min，用柠檬酸调节至pH值为4.5；升温至55℃后保温45min。得混悬液S2B，向其中加入辣木叶粉质量的0.9％(w/w) 果胶酶，55℃下以150r/min恒温搅拌6h进行酶解，得混悬液S3B。
(4)加热提取：将步骤(3)中所得混悬液S3B在升温至105℃后保温90min，得混悬液S4B，待冷却至室温后，6000g离心20min，取上清液得提取液E5B。
(5)酶法耦合超滤-醇沉-透析除杂后处理：使用氢氧化钠调节步骤(4)所得提取液E5B至pH值为7，搅拌速率为150r/min，得提取液E6B，向其中加入提取液E6B蛋白含量的1.0％(w/w)蛋白酶，在55℃下以150r/min搅拌8h 进行酶解，得提取液E7B，于95℃下灭酶15min，得提取液E8B，待冷却至室温后，于6000g离心20min，取上清液得提取液E9B，采用分子量为10000Da 的超滤膜进行超滤浓缩，超滤3次，得提取液E10B为分子量>10000Da的超滤截留液，再加入乙醇，使得乙醇的终浓度为75％(v/v)，充分混匀后在7℃下静置8h，得混悬液S5B，经6000g离心30min后，取下层得沉淀P1B，所得沉淀P1B以1:12.5g/mL的料液比加入去离子水，升温至55℃后保温45min，300 r/min匀速搅拌，得提取液E11B，在60℃下减压浓缩至浓缩液中固形物含量为 25wt％，得提取液E12B装进分子量为500Da的透析袋，在7℃的离子水中透析 13h，每隔1.5h换一次水，得提取液E13B进行冷冻干燥，得到辣木叶精制多糖PB。
(6)复配组合：将步骤(2)所得辣木叶精制多酚FB与步骤(5)所得辣木叶精制多糖PB按1:3进行复配，得降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物FPB。
实施例3
一种降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物，具体包括如下步骤：
(1)乙醇回流提取：将干辣木叶粉碎后过40目筛，得到辣木叶干粉M，以1:25g/mL的料液比向所得辣木叶干粉加入65％(v/v)的乙醇溶液，在85℃下进行回流提取75min，得混悬液S1C，待冷却至室温后，于8000g离心25min，取上清液得提取液E1C，在60℃下减压浓缩去除乙醇，至浓缩液中固形物含量为20wt％，得提取液E2C，取残渣在75℃下烘干得去酚辣木叶粉DB。
(2)大孔树脂分离纯化：将步骤(1)所得提取液E2C以流速为1.0mL/min 上样到型号为XAD-16的大孔树脂层析柱中，将流出管接入到提取液E2C中，循环上样时间为6h；去离子水洗脱体积为6个柱体积，去离子水洗脱流速为3 mL/min，乙醇洗脱条件为：乙醇浓度为50％(v/v)，洗脱体积为5个柱体积，乙醇溶液洗脱流速为3mL/min，收集乙醇洗脱组分，得提取液E3C，在60℃下减压浓缩至浓缩液中固形物含量为30wt％，得提取液E4C，再进行冷冻干燥，得到辣木叶精制多酚FC。
(3)酸法耦合酶法前处理：将步骤(1)所得去酚辣木叶粉DC与去离子水以1:15g/mL混合，180r/min搅拌60min，用柠檬酸调节至pH值为5；升温至 60℃后保温60min。得混悬液S2C，向其中加入辣木叶粉质量的1.2％(w/w) 果胶酶，60℃下以180r/min恒温搅拌8h进行酶解，得混悬液S3C。
(4)加热提取：将步骤(3)中所得混悬液S3C在升温至115℃后保温105 min，得混悬液S4C，待冷却至室温后，8000g离心25min，取上清液得提取液 E5C。
(5)酶法耦合超滤-醇沉-透析除杂后处理：使用氢氧化钠调节步骤(4)所得提取液E5C至pH值为8，搅拌速率为180r/min，得提取液E6C，向其中加入提取液E6C蛋白含量的1.5％(w/w)蛋白酶，在60℃下以180r/min搅拌9h 进行酶解，得提取液E7C，于100℃下灭酶20min，得提取液E8C，待冷却至室温后，于8000g离心25min，取上清液得提取液E9C，采用分子量为10000Da 的超滤膜进行超滤浓缩，超滤4次，得提取液E10C为分子量>10000Da的超滤截留液，再加入乙醇，使得乙醇的终浓度为85％(v/v)，充分混匀后在10℃下静置10h，得混悬液S5C，经8000g离心35min后，取下层得沉淀P1C，所得沉淀P1C以1:15g/mL的料液比加入去离子水，升温至60℃后保温60min，400 r/min匀速搅拌，得提取液E11C，在70℃下减压浓缩至浓缩液中固形物含量为 30wt％，得提取液E12C装进分子量为500Da的透析袋，在10℃的离子水中透析16h，每隔2h换一次水，得提取液E13C进行冷冻干燥，得到辣木叶精制多糖PC。
(6)复配组合：将步骤(2)所得辣木叶精制多酚FC与步骤(5)所得辣木叶精制多糖PB按1:3进行复配，得降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物FPC。
对比例1
一种辣木叶多酚-多糖组合物，具体包括如下步骤：
(1)乙醇回流提取：将干辣木叶粉碎后过40目筛，得到辣木叶干粉M，以1:20g/mL的料液比向所得辣木叶干粉加入50％(v/v)的乙醇溶液，在70℃下进行回流提取60min，得混悬液S1B，待冷却至室温后，于6000g离心20min，取上清液得提取液E1B，在50℃下减压浓缩去除乙醇，至浓缩液中固形物含量为15wt％，得提取液E2B，取残渣在65℃下烘干得去酚辣木叶粉DB。
(2)大孔树脂分离纯化：将步骤(1)所得提取液E2B以流速为0.8mL/min 上样到型号为XAD-16的大孔树脂层析柱中，将流出管接入到提取液E2B中，循环上样时间为5h；去离子水洗脱体积为5个柱体积，去离子水洗脱流速为2 mL/min，乙醇洗脱条件为：乙醇浓度为40％(v/v)，洗脱体积为4个柱体积，乙醇溶液洗脱流速为2mL/min，收集乙醇洗脱组分，得提取液E3B，在50℃下减压浓缩至浓缩液中固形物含量为25wt％，得提取液E4B，再进行冷冻干燥，得到辣木叶精制多酚FB。
(3)酸法耦合酶法前处理：将步骤(1)所得去酚辣木叶粉DB与去离子水以1:10g/mL混合，150r/min搅拌45min，用柠檬酸调节至pH值为4.5；升温至55℃后保温45min。得混悬液S2B，向其中加入辣木叶粉质量的0.9％(w/w) 果胶酶，55℃下以150r/min恒温搅拌6h进行酶解，得混悬液S3B。
(4)加热提取：将步骤(3)中所得混悬液S3B在升温至105℃后保温90min，得混悬液S4B，待冷却至室温后，6000g离心20min，取上清液得提取液E5B。
(5)酶法耦合超滤-醇沉-透析除杂后处理：使用氢氧化钠调节步骤(4)所得提取液E5B至pH值为7，搅拌速率为150r/min，得提取液E6B，向其中加入提取液E6B蛋白含量的1.0％(w/w)蛋白酶，在55℃下以150r/min搅拌8h 进行酶解，得提取液E7B，于95℃下灭酶15min，得提取液E8B，待冷却至室温后，于6000g离心20min，取上清液得提取液E9B，采用分子量为10000Da 的超滤膜进行超滤浓缩，超滤3次，得提取液E10B为分子量>10000Da的超滤截留液，再加入乙醇，使得乙醇的终浓度为75％(v/v)，充分混匀后在7℃下静置8h，得混悬液S5B，经6000g离心30min后，取下层得沉淀P1B，所得沉淀P1B以1:12.5g/mL的料液比加入去离子水，升温至55℃后保温45min，300 r/min匀速搅拌，得提取液E11B，在60℃下减压浓缩至浓缩液中固形物含量为 25wt％，得提取液E12B装进分子量为500Da的透析袋，在7℃的离子水中透析 13h，每隔1.5h换一次水，得提取液E13B进行冷冻干燥，得到辣木叶精制多糖PB。
(6)复配组合：将步骤(2)所得辣木叶精制多酚FB与步骤(5)所得辣木叶精制多糖PB按3:1进行复配，得辣木叶多酚-多糖组合物FPD。
对比例2
一种辣木叶精制多酚，具体包括如下步骤：
(1)乙醇回流提取：将干辣木叶粉碎后过40目筛，得到辣木叶干粉M，以1:20g/mL的料液比向所得辣木叶干粉加入50％(v/v)的乙醇溶液，在70℃下进行回流提取60min，得混悬液S1B，待冷却至室温后，于6000g离心20min，取上清液得提取液E1B，在50℃下减压浓缩去除乙醇，至浓缩液中固形物含量为15wt％，得提取液E2B，取残渣在65℃下烘干得去酚辣木叶粉DB。
(2)大孔树脂分离纯化：将步骤(1)所得提取液E2B以流速为0.8mL/min 上样到型号为XAD-16的大孔树脂层析柱中，将流出管接入到提取液E2B中，循环上样时间为5h；去离子水洗脱体积为5个柱体积，去离子水洗脱流速为2 mL/min，乙醇洗脱条件为：乙醇浓度为40％(v/v)，洗脱体积为4个柱体积，乙醇溶液洗脱流速为2mL/min，收集乙醇洗脱组分，得提取液E3B，在50℃下减压浓缩至浓缩液中固形物含量为25wt％，得提取液E4B，再进行冷冻干燥，得到辣木叶精制多酚FB。
对比例3
一种辣木叶精制多糖，具体包括如下步骤：
(1)乙醇回流提取：将干辣木叶粉碎后过40目筛，得到辣木叶干粉M，以1:20g/mL的料液比向所得辣木叶干粉加入50％(v/v)的乙醇溶液，在70℃下进行回流提取60min，得混悬液S1B，待冷却至室温后，于6000g离心20min，取上清液得提取液E1B，在50℃下减压浓缩去除乙醇，至浓缩液中固形物含量为15wt％，得提取液E2B，取残渣在65℃下烘干得去酚辣木叶粉DB。
(2)酸法耦合酶法前处理：将步骤(1)所得去酚辣木叶粉DB与去离子水以1:10g/mL混合，150r/min搅拌45min，用柠檬酸调节至pH值为4.5；升温至55℃后保温45min。得混悬液S2B，向其中加入辣木叶粉质量的0.9％(w/w) 果胶酶，55℃下以150r/min恒温搅拌6h进行酶解，得混悬液S3B。
(3)加热提取：将步骤(3)中所得混悬液S3B在升温至105℃后保温90min，得混悬液S4B，待冷却至室温后，6000g离心20min，取上清液得提取液E3B。
(4)酶法耦合超滤-醇沉-透析除杂后处理：使用氢氧化钠调节步骤(4)所得提取液E3B至pH值为7，搅拌速率为150r/min，得提取液E4B，向其中加入提取液E4B蛋白含量的1.0％(w/w)蛋白酶，在55℃下以150r/min搅拌8h 进行酶解，得提取液E5B，于95℃下灭酶15min，得提取液E6B，待冷却至室温后，于6000g离心20min，取上清液得提取液E7B，采用分子量为10000Da 的超滤膜进行超滤浓缩，超滤3次，得提取液E8B为分子量>10000Da的超滤截留液，再加入乙醇，使得乙醇的终浓度为75％(v/v)，充分混匀后在7℃下静置 8h，得混悬液S5B，经6000g离心30min后，取下层得沉淀P1B，所得沉淀 P1B以1:12.5g/mL的料液比加入去离子水，升温至55℃后保温45min，300r/min 匀速搅拌，得提取液E9B，在60℃下减压浓缩至浓缩液中固形物含量为25wt％，得提取液E10B装进分子量为500Da的透析袋，在7℃的离子水中透析13h，每隔1.5h换一次水，得提取液E11B进行冷冻干燥，得到辣木叶精制多糖PB。
对比例4
一种去酚辣木叶粉，具体包括如下步骤：
乙醇回流提取：将干辣木叶粉碎后过40目筛，得到辣木叶干粉M，以1:20 g/mL的料液比向所得辣木叶干粉加入50％(v/v)的乙醇溶液，在70℃下进行回流提取60min，得混悬液S1B，待冷却至室温后，于6000g离心20min，取上清液得提取液E1B，在50℃下浓缩去除乙醇，至浓缩液中固形物含量为15wt％，得提取液E2B，取残渣在65℃下烘干得去酚辣木叶粉DB。
对比例5
一种辣木叶干粉，具体包括如下步骤：
将干辣木叶粉碎后过40目筛，得到辣木叶干粉M。
结果分析
1、化学组成分析
由表1可知，辣木叶粉M、去酚辣木叶粉DB这两种初级加工品蛋白含量高，分别为30.09％和32.92％，同时含有糖类、多酚类物质。
表1辣木叶粗产品化学成分分析
Figure BDA0003352735410000161
由表2可知，辣木叶经分级提取精制后，分别得到辣木叶精制多糖与精制多酚，其中，精制多糖PB多糖含量为65.14％；精制多酚FB多酚含量为27.25％。实施例得到的是以多糖为主、含多酚的降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物，总酚含量>6％，多糖含量>48％。对比例1得到的是多酚占比较高、含多糖的辣木叶多酚-多糖组合物，多酚含量为20.70％，多糖含量为16.15％。
表2辣木叶精制品化学成分分析
Figure BDA0003352735410000162
Figure BDA0003352735410000171
同一列不同字母表示组间具有显著性差异(p<0.05)，相同字母表示组间没有显著性差异(p>0.05)。
2、ABTS·+清除能力评价
由图1(不同字母表示组间具有显著性差异(p<0.05)，相同字母表示组间没有显著性差异(p>0.05)。)可知，在样品浓度均为0.1mg/mL时，辣木叶多酚 -多糖组合物、辣木叶精制多糖PB的自由基清除率之间具有显著性差异(p<0.05)，实施例中组合物FPA、FPB、FPC自由基清除率约60％，抗氧化能力弱于对比例中精制多酚FB、多酚含量高的组合物FPD，但显著强于精制多糖PB。由此说明，本发明所得以多糖为主，含多酚的降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物能够有效清除自由基，具有良好的抗氧化活性。因对比例中辣木叶粉M和辣木叶去酚粉DB为初级加工品，不适合用于该评价方法，在此不作比较。
3、延缓淀粉水解能力评价
由图2(不同字母表示组间具有显著性差异(p<0.05)，相同字母表示组间没有显著性差异(p>0.05)。)可知，当所有样品浓度为20mg/mL时，实施例中组合物FPA、FPB、FPC和精制多糖PB抑制麦芽糖生成能力无显著性差异 (p>0.05)，说明实施例组合物抑制麦芽糖生成能力与精制多糖一致，强于对比例组合物FPD，辣木叶粉M及辣木叶去酚粉DB抑制麦芽糖生成能力显著弱于辣木叶精制多酚FB和精制多糖PB。
由图3(不同字母表示组间具有显著性差异(p<0.05)，相同字母表示组间没有显著性差异(p>0.05)。)可知，当所有样品浓度为20mg/mL时，实施例中组合物FPA、FPB、FPC抑制麦芽三糖生成能力强于其他组，说明实施例组合物抑制麦芽三糖生成能力强于对比例中的精制多糖、多酚及组合物FPD。辣木叶粉M、辣木叶去酚粉DB在一定浓度下也可显著降低麦芽三糖生成量，但显著弱于实施例中组合物FPA、FPB、FPC。
综上所述，本发明所得以多糖为主，含多酚的降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物能够有效延缓淀粉水解，能媲美或超过辣木叶精制多糖的抗淀粉消化能力。
4、葡萄糖阻滞能力评价
由图4(不同字母表示组间具有显著性差异(p<0.05)，相同字母表示组间没有显著性差异(p>0.05)。)可知，所有样品在20mg/mL浓度时均具有葡萄糖阻滞作用，在透析过程中，葡萄糖扩散到透析袋外液中的速率会逐渐降低。结果表明，在透析120min后，实施例中组合物FPA、FPB、FPC与辣木叶精制多糖PB的阻滞能力显著强于其他组。综上所述，本发明所得以多糖为主，含多酚的降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物能够有效阻滞葡萄糖扩散。
5、胆酸盐吸附能力评价
由图5(不同字母表示组间具有显著性差异(p<0.05)，相同字母表示组间没有显著性差异(p>0.05)。)可知，，所有样品在40mg/mL浓度时，实施例中组合物FPA、FPB、FPC的胆酸盐吸附能力强于FBD，显著强于辣木叶精制多酚(p<0.05)，组合物FPA、FPB、FPC与辣木叶精制多糖PB之间没有显著性差异(p>0.05)。辣木叶粉M和去酚粉DB有一定的吸附能力，但弱于实施例中组合物FPA、FPB、FPC。综上所述，本发明所得以多糖为主，含多酚的降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物能够有效吸附胆酸盐，具备较好的降血脂潜力，能媲美辣木叶精制多糖的降血脂潜力。
对比例中的以多酚为主，含多糖的组合物虽具有强抗氧化活性，但由于多糖含量低，其降糖控脂活性明显弱于本发明所得以多糖为主，含多酚的组合物，不恰当的配比会影响组合物的功能。对比例中辣木叶粉虽保留着辣木叶多酚、多糖；去酚辣木叶粉保留辣木膳食纤维，两者属于辣木叶初级加工品，虽显示出一定的降糖控脂活性，但却显著弱于经过提取、精制后的辣木叶多糖及本发明所得组合物。
本发明提供了一种降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物及其制备方法。该制备方法以降糖控脂活性为导向，采用乙醇提取醇溶性多酚、酶法提取水溶性多糖的分段提取模式，其中酸法耦合酶法前处理，在极大程度上促进了多糖溶出、有效规避了辣木叶中蛋白溶出，并通过蛋白酶酶解、超滤除杂的方式，进一步去除辣木叶蛋白，提升辣木叶多糖纯度。最后依据多酚-多糖协同增效作用，按比例进行配伍，实现辣木叶活性成分的有效拆分与重组，使得该组合物既具有多酚的抗氧化性，又具有多糖的抗淀粉消化能力、阻滞葡萄糖扩散能力、吸附胆酸盐能力，具有预防和改善2型糖尿病的潜力。该组合物的功能是单独多酚组分、多糖组分所不能兼具的。
本发明实施例可见，整个制备工艺流程简单、各环节均可达食品级要求，技术优势性、先进性明显，制备成本低。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护。

Claims (8)

1.一种降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物的制备方法，其特征在于，以干辣木叶为原料分段提取、精制辣木叶多酚与多糖，再进行复配制备降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物，首先以干辣木叶为原料，采用乙醇回流提取、大孔树脂分离纯化得到一种辣木叶精制多酚；去酚辣木叶残渣经烘干去除乙醇后，采用酸法耦合酶法前处理、加热提取、酶法耦合超滤-醇沉-透析除杂后处理得到一种辣木叶精制多糖，将辣木叶精制多酚、辣木叶精制多糖按比例复配组合得到一种降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物，该组合物中总酚含量>6％，多糖含量>48％，抗氧化活性强，胆酸盐吸附能力强，能有效延缓淀粉水解、阻滞葡萄糖扩散，具有预防和改善2型糖尿病的潜力，具体包括以下步骤：
(1)乙醇回流提取：将干辣木叶粉碎后过筛，得到辣木叶干粉M，在所得辣木叶干粉中加入乙醇溶液，进行回流提取，得混悬液S1，冷却至室温后，离心，取上清液得提取液E1，取残渣烘干得去酚辣木叶粉D，提取液E1经减压浓缩去除乙醇，得提取液E2，所述回流提取的温度为55～85℃，回流提取的时间为45～75min；
(2)大孔树脂分离纯化：将步骤(1)所得提取液E2上样到大孔树脂层析柱中，将流出管接入到提取液E2中，循环上样，用水洗脱去杂后，采用乙醇溶液进行动态解吸，收集乙醇洗脱组分，得提取液E3，提取液E3减压浓缩去除乙醇，得提取液E4，将提取液E4进行冷冻干燥，得到辣木叶精制多酚F；
(3)酸法耦合酶法前处理：将步骤(1)所得去酚辣木叶粉D与水按比例混合，匀速搅拌，调节pH值至4～5，升温后保温，得混悬液S2，加入果胶酶，恒温搅拌进行酶解，得混悬液S3，所述升温的温度为50～60℃，所述保温的时间为30～60min，所述果胶酶的加入量为去酚辣木叶粉质量的0.6％～1.2％(w/w)，所述酶解的时间为4～8h，酶解的温度为50～60℃；
(4)加热提取：将步骤(3)中所得混悬液S3升温后保温，得混悬液S4，冷却至室温后，离心，取上清液得提取液E5，所述升温的温度为95～115℃，所述保温的时间为75～105min；
(5)酶法耦合超滤-醇沉-透析除杂后处理：调节步骤(4)所得提取液E5的pH值为6～8，搅拌均匀，得提取液E6，加入蛋白酶，加热搅拌进行酶解，得提取液E7，加热灭酶，得提取液E8，冷却至室温后，离心，取上清液得提取液E9，提取液E9采用超滤膜进行超滤浓缩，得提取液E10，加入乙醇溶液，充分混匀，冷却静置得混悬液S5，离心后得沉淀P1，向沉淀P1中加入水，升温后保温匀速搅拌，得提取液E11，减压浓缩，得提取液E12，低温透析得提取液E13，进行冷冻干燥，得到辣木叶精制多糖P，所述蛋白酶的加入量为提取液E6蛋白含量的0.5％～1.5％(w/w)，所述酶解的温度为50～60℃，酶解的时间为7～9h；
(6)复配组合：将步骤(2)所得辣木叶精制多酚F与步骤(5)所得辣木叶精制多糖P按比例进行复配，得降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物FP，所述辣木叶精制多酚F与辣木叶精制多糖P的复配比例为1:3。
2.根据权利要求1所述一种降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述过筛是过40目筛，所述辣木叶干粉与乙醇溶液的料液比为1:15～1:25g/mL，所述乙醇溶液的浓度为35％～65％(v/v)，所述离心的离心力为4000～8000g，离心的时间为15～25min，所述烘干的温度为55～75℃，所述减压浓缩的温度为40～60℃，所述提取液E2中固形物含量为10wt％～20wt％。
3.根据权利要求1所述一种降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述大孔树脂是指型号为XAD-16的大孔树脂，所述上样的流速为0.6～1.0mL/min，所述循环上样的时间为4～6h，所述用水洗脱的体积为4～6个柱体积，用水洗脱的流速为1～3mL/min，乙醇动态解吸的条件为：乙醇浓度为30％～50％(v/v)，洗脱体积为3～5个柱体积，乙醇溶液洗脱流速为1～3mL/min，减压浓缩的温度为40～60℃，所述提取液E4中固形物含量为20wt％～30wt％。
4.根据权利要求1所述一种降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述去酚辣木叶粉D与水的料液比为1:5～1:15g/mL，所述搅拌的速率为120～180r/min，搅拌的时间为30～60min；所述调节pH值的方法是：用柠檬酸调节pH值为4～5；所述搅拌的速率为120～180r/min。
5.根据权利要求1所述一种降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述离心的离心力为4000～8000g，离心的时间为15～25min。
6.根据权利要求1所述一种降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述pH值的调节方法是：使用氢氧化钠调节pH值为6～8，所述搅拌的速率为120～180r/min，所述蛋白酶为胰酶，所述搅拌的速率为120～180r/min，所述灭酶的温度为90～100℃，灭酶的时间为10～20min，所述离心的离心力为4000～8000g，离心的时间为15～25min，所述超滤膜分子量为10000Da，所述超滤的次数为2～4次，所述提取液E10为分子量>10000Da的超滤截留液，所述醇沉时乙醇的终浓度为65％～85％(v/v)，所述静置的温度为4～10℃，静置的时间为6～10h。
7.根据权利要求1所述一种降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述沉淀P1与去离子水的料液比为1:10～1:15g/mL，所述升温的温度为50～60℃，所述保温的时间为30～60min，所述搅拌的速率为200～400r/min，所述减压浓缩的温度为50～70℃，浓缩液中固形物含量为20wt％～30wt％，所述透析是将提取液E12装进分子量为500Da的透析袋中，在温度为4～10℃的离子水中透析10～16h，每隔1～2h换一次水。
8.一种由权利要求1～7任一项所述的制备方法制备得到的降糖控脂的辣木叶多酚-多糖组合物。
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