KR20090084575A - 항당뇨 활성을 가지는 한국산 겨우살이 유래 단백질 및 그추출방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 한국산 겨우살이에서 유래한 단백질, 상기 단백질을 유효성분으로 하며 항당뇨 활성을 갖는 약학 조성물, 기능성 식품 및 상기 단백질의 추출방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 최적온도 22 내지 25 ℃, 최적 pH 6.4 내지 7.5, 온도 37 ℃ 및 pH 6.0에서 5시간 이상 안정, 등전점 pI 6.8 내지 7.0, 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동법(SDS-PAGE) 측정 분자량 65 내지 67 kDa인 한국산 겨우살이(Viscun album Coloratum)에서 유래한 단백질, 상기 단백질을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 약학 조성물, 상기 단백질을 유효성분으로 포함하는 항당뇨 효과를 갖는 기능성 식품 및 한국산 겨우살이(Viscun album Coloratum) 추출물로부터 알파-젖당 수지를 이용하여 비렉틴 단백질 분획을 분리하는 단계, 상기 단계에서 얻은 용액을 유기용매 추출하는 단계, 상기 추출액을 음이온 교환 수지에 통과시키는 단계, 상기 음이온 교환 수지에 용리액을 흘려주는 단계, 상기 단계에서 얻은 분획을 셉팩(Sep-Pak) 수지에 통과시키는 단계, 상기 셉팩 수지에 용리액을 흘려주는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 한국산 겨우살이에서 유래한 단백질의 추출방법에 관한 것이다.
겨우살이는 항암효과와 고혈압 및 당뇨 치료효과 등을 갖는다고 알려져 있으나, 특히 당뇨병과 관련하여 어떠한 분자적인 기전에 의해 인슐린 분비가 유도되는지는 알려져 있지 않다. 따라서 한국산 겨우살이 추출물 내에 있는 단백질의 인슐 린 분비 효능 및 그 기전을 규명하고 단일 유효성분인 단백질을 분리함으로써 이를 기능성 식품, 식품 첨가물 등에 이용할 수 있다.
겨우살이, 항당뇨, 단백질, 혈당 억제, 이온교환수지, 염화나트륨, 셉팩(Sep-pak)수지, 에탄올
Description
본 발명은 한국산 겨우살이(Viscun album Coloratum)에서 유래한 항당뇨 활성을 가지는 단백질 및 그 추출 방법에 관한 것으로서, 당뇨 치료 효과가 있다고 알려진 한국산 겨우살이로부터 혈당 억제 활성을 가지는 단일의 유효성분 단백질을 분리하여 항당뇨 효과를 가지는 기능성 식품, 식품 첨가물, 약학 조성물 등에 이용하기 위한 것이다.
우리나라의 경우, 사회경제가 발전하면서 현대인의 식생활 양식이 바뀌어 동물성 식품의 섭취 증가와 함께 식물성 식품의 섭취가 감소하고, 이로 인해 동맥 경화, 고혈압, 당뇨병 등 성인병 유발 빈도가 날로 심각하게 증가하고 있다. 당뇨병을 비롯한 성인병의 원인은 아직 확실하게 밝혀지지 않았는데, 성인병 중에서도 당뇨병의 발병률은 점점 증가하고 있다.
당뇨병은 인슐린의 절대적 또는 상대적 결핍 및 여러 조직에서의 인슐린 작용 저하에 기인한 탄수화물, 지방 및 단백질 대사 장애와 병리학적인 변화를 초래하는 질환으로 제1형인 인슐린 의존형 당뇨병(Insulin dependent diabetes mellitus, IDDM)과 제2형인 인슐린 비의존형 당뇨병 (Non-insulin dependent diabetes mellitus, NIDDM)으로 분류하고 있다. 당뇨병은 고혈당의 지속화와 만성화로 혈관 내 자유 라디칼(free radical)의 발생을 촉진하여 체내 방어기전 저하와 조직 손상을 야기한다. 따라서 이로 인한 여러 가지 합병증을 유발하며, 합병증으로 인한 심각한 결과를 초래할 수 있다.
겨우살이는 여러 종류의 나무를 숙주로 하여 생장하는 반기생식물로서 세계 전역에는 30속 1,500종의 식물이 있는 것으로 알려져 있으며, 독일을 중심으로 한 유럽 지역에서 뿐 아니라, 우리나라에서도 오래전부터 여러 가지 질병에 대한 민간 약제로 사용되어 왔다. 한국산 겨우살이(Korean mistletoe; Viscum album Coloratum)는 한국을 비롯하여 일본, 대만, 중국 등지에서 서식하는 겨우살이로서 유럽산 겨우살이와는 주(strain)가 다른 것으로 알려져 있다. 특히, 1990년도 중반에 들어오면서 많은 연구진들에 의해 한국산 겨우살이에 대한 연구가 활성화되면서 한국산 겨우살이의 약리 효능 연구가 많이 이루어지고 있다. 겨우살이의 주요 성분으로 알려져 있는 렉틴은 이황화 결합(disulfide bond)을 통해 A와 B 사슬로 이루어져 있고 면역기능을 증진시키며 암세포에 대한 아포토시스(apoptosis)를 유도하 는 효과가 있음이 알려 있으며, 특히 한국산 겨우살이 렉틴은 유럽산 겨우살이 렉틴에 비해 항암 및 면역증진 효과에 있어서 매우 탁월한 것으로 알려져 있다. 이 외에도 겨우살이의 여러 생리학적 활성에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 특히 당뇨에 대한 겨우살이의 생리적 활성에 관한 연구가 많이 보고되고 있다. 하지만, 겨우살이의 항당뇨 효과에 대한 생리학적 활성은 겨우살이 추출물이 인슐린 분비에 관여하는 것만 밝혀졌을 뿐, 아직까지 겨우살이 내의 어떠한 물질에 의해 인슐린 분비가 유도되고, 어떠한 분자적인 기전에 의한 인슐린 분비가 유도되는 지는 보고되고 있지 않다. 따라서 한국산 겨우살이 추출물 내에 있는 단백질의 인슐린 분비 효능 및 그 기전의 규명이 요구된다.
본 발명자들은 한국산 겨우살이에서 항당뇨 활성을 갖는 특정의 비렉틴 단백질 분획을 발견하였는바, 당뇨에 탁월한 효과를 가지는 신약이 개발되어 있지 않은 현시점에서 항당뇨 효과를 갖는 상기 단백질 분획을 이용하여 당뇨병의 예방 및 치료에 활용할 수 있는 원료로서 사용될 수 있을 것이다.
이에 본 발명의 한 측면은 한국산 겨우살이로부터 유래 된 특정 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 단백질을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 단백질을 유효성분으로 포함하는 항당뇨 효과를 갖는 기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 한국산 겨우살이로부터 유래된 특정 단백질을 추출하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 견지에 의하면, 하기 (a) 내지 (e)의 특성을 가지며, 한국산 겨우살이(Viscun album Coloratum)에서 유래한 단백질이 제공된다:
(a) 최적온도 22 내지 25 ℃;
(b) 최적 pH 6.4 내지 7.5;
(c) 온도 37 ℃ 및 pH 6.0에서 5시간 이상 안정;
(d) 등전점 pI 6.8 내지 7.0;
(e) 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동법(SDS-PAGE) 측정 분자량 65 내지 67 kDa.
본 발명의 또 다른 견지에 의하면, 상기의 단백질을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 약학 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 견지에 의하면, 상기의 단백질을 유효성분으로 포함하는 항당뇨 효과를 갖는 기능성 식품 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 견지에 의하면, 한국산 겨우살이(Viscun album Coloratum) 추출물로부터 알파-젖당 수지를 이용하여 비렉틴 분획을 분리하는 단계;
상기 단계에서 얻은 용액을 유기용매로 추출하는 단계;
상기 추출액을 음이온 교환 수지에 통과시키는 단계;
상기 음이온 교환 수지에 용리액을 흘려주는 단계;
상기 단계에서 얻은 분획을 셉팩(Sep-Pak) 수지에 통과시키는 단계; 및
상기 셉팩 수지에 용리액을 흘려주는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 한국산 겨우살이에서 유래한 항당뇨 활성을 갖는 단백질의 추출방법이 제공된다.
본 발명의 한국산 겨우살이에서 유래한 단백질 및 그 단백질을 추출하는 방법을 이용하여 인슐린 분비를 유도할 수 있는 단일의 단백질 분획을 획득함으로써 이를 유효성분으로 포함하는 기능성 식품 조성물, 식품 첨가물, 약학 조성물 등을 제조하여 제1형 당뇨병에 있어서 긍정적인 효과를 기대할 수 있을 것이며, 향후 항 당뇨 효능을 갖는 한국산 겨우살이 내 단일 지표물질 탐색 및 제1형 당뇨병의 치료제 개발에 있어서 기반이 될 수 있을 것이다.
본 발명은 한국산 겨우살이(Viscun album Coloratum)에서 유래한 단백질, 상기 단백질을 유효성분으로 하며 항당뇨 활성을 갖는 약학 조성물, 기능성 식품 및 한국산 겨우살이 추출물에서 알파-젖당 수지를 이용하여 상기 추출물 내의 렉틴 성분을 제거하여 비렉틴 성분을 획득한 후 유기용매로 추출하고 이 후 유기용매로 추출된 추출액을 음이온 교환 수지 및 셉팩(Sep-Pak) 수지에 의해 후속적으로 분리하여 획득한 한국산 겨우살이에서 유래한 단백질의 추출 방법에 관한 것이다.
더욱 상세하게 본 발명의 한국산 겨우살이에서 유래한 항당뇨 활성을 가지는 단백질은 최적온도가 22 내지 25 ℃, 최적 pH가 6.4 내지 7.5이며, 온도 37 ℃ 및 pH 6.0에서 5시간 이상 안정하다. 또한, 등전점은 pI 6.8 내지 7.0이며, 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동법(SDS-PAGE)으로 6% 및 15%의 폴리아크릴아미드 젤을 사용하여 150볼트에서 1시간 30분간 전기영동하여 측정한 분자량은 65 내지 67 kDa인 특성을 나타낸다.
본 발명은 상기 단백질을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.01 내지 0.1 중량%로 포함하는 것이 바람직하며, 0.01 미만일 경우 상기 단백질에 의한 혈당 감소 효과가 미비하여 다량의 투여량을 처리하여야 하며, 1%를 초과할 경우 예기치 못한 부작용을 수반할 수 있다. 그러나 가장 바람직한 단백질의 유효 함량은 조성물의 사용방법 및 목적에 따라 적절히 조절한다. 또한, 본 발명의 약학 조성물을 본 발명의 단백질 외에 담체, 보존제, 습윤제, 유화제 등 약학적으로 허용 가능한 다른 구성성분을 포함할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 정제, 환제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 멸균 주사제 등으로 제형화하여 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 상기 단백질을 유효성분으로 포함하는 항당뇨 효과를 갖는 기능성 식품을 제공한다. 본 발명의 기능성 식품은 기능성 식품의 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.01 내지 0.1 %로 포함하는 것이 바람직하며, 0.01 미만일 경우 상기 단백질에 의한 혈당 감소 효과가 미비하며, 1%를 초과할 경우 예기치 못한 부작용을 수반할 수 있다. 그러나 가장 바람직한 단백질의 유효 함량은 식품의 사용방법 및 목적에 따라 적절히 조절한다. 또한, 본 발명의 기능성 식품은 본 발명의 단백질 외에 식품학적으로 허용 가능한 다른 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 본 발명에서의 식품은 통상의 가공식품, 천연식품을 포함하고 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어 각종 음료, 건강 보조 식품류, 식품 첨가제인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태로 제조될 수 있다.
한국산 겨우살이 추출물의 획득은 당해 기술 분야에 알려진 어떠한 추출 방법을 이용하여 이루어질 수 있으며, 예를 들어 참나무를 숙주로 하는 한국산 겨우살이를 1월 중에 채취하여 약 100g을 정량한 후, 증류수로 4 내지 5회 세척한 후 분쇄기를 이용하여 분쇄하고 그 분쇄물을 0.5 내지 1.5%식염수 1000 mL 내지 2000mL에 침출시키고 이 추출물을 0.7 내지 0.9㎛의 막필터를 거쳐 제균한 후, 상기 용액에 50 내지 90%의 황산암모늄을 1L당 500g 내지 700g 첨가하여 단백질만을 추출하고, 그 결과 얻은 단백질 추출물을 인산완충 용액 100mL 내지 500mL으로 용해시켜 투석한 용액을 다시 0.1 내지 0.5㎛ 막필터를 거쳐 제균하는 방법을 통하여 한국산 겨우살이 추출물을 획득할 수 있다.
상기 한국산 겨우살이 추출물에서 항당뇨 활성을 갖는 단백질을 추출하기 위해서, 먼저 상기 추출물 중에 존재하는 렉틴은 높은 항암성 및 세포독성을 가지며 당뇨에 대한 활성은 가지고 있지 아니하므로, 상기 추출물로부터 렉틴을 제거한 비렉틴 분획을 추출한다. 한국산 겨우살이에 존재하는 렉틴은 젖당 결합 수지에 특이적으로 반응하는 성질이 있기 때문에(lactose affinity column) 젖당 결합 수지에 상기 겨우살이 추출물을 통과시키면 비렉틴 단백질 분획을 얻을 수 있다. 보다 상세하게는 상기 추출물을 알파-젖당 수지에 2 내지 6회 반복하여 통과시켜 비렉틴 단백질 분획을 획득할 수 있다. 알파-젖당 수지는 아가로즈에 젖당이 공유결합을 이루고 있는 수지로 예를 들어 SIGMA-Aldrich® 사의 제품을 상업적으로 구매할 수 있다. 이렇게 획득한 비렉틴 단백질 분획을 단백질 전기영동 상에서 확인하여 렉틴이 제거되었음을 확인한다. 렉틴은 이중 황 결합으로 이루어진 단백질로 전기영동 상에서 4개의 선으로 나타나기 때문에 추출물에 첨가되어 있는지에 대해 쉽게 판별할 수 있다.
렉틴이 존재하지 않음을 확인한 후, 비렉틴 분획만을 포함하는 한국산 겨우살이 추출물을 유기용매에 첨가하여 유기용매 추출한다. 유기용매로는 클로로포름, 디클로로메탄, 에틸 아세테이트, 아세톤 등이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 클로로포름을 사용한다. 보다 상세하게는, 상기 비렉틴 추출물을 클로로포름에 1:1의 비율로 혼합하여 반응시킨 후 분별 깔때기로 상층의 수용액 부분만을 추출한다.
상기에서 획득한 유기용매 추출액을 음이온 교환 수지에 통과시켜 수지에 접착되지 않은 단백질 분획은 모두 제거하고 전기적 특성별로 분획을 분리한다. 상기 음이온 교환 수지로는 아미노에틸, 디에틸아미노에틸, 폴리에틸렌이민, 파라-아미노벤질, 아가로즈, 세파로즈 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나 바람직하게는 디에틸아미노에틸 수지를 사용한다. 음이온 교환 수지에 대한 용리액으로는 염화나트륨 용액, 생리식염수, 염산 용액 등이 사용될 수 있으며, 이에 제 한되는 것은 아니나 바람직하게는 염화나트륨 용액을 사용하여 분리하고, 이 경우 상기 염화나트륨 용액의 농도는 0.1 내지 1M의 염화나트륨 용액을 사용하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 0.5M의 염화나트륨을 이용한다. 염화나트륨 용액의 농도가 0.1 미만인 경우에는 물질의 분리시, 표적 단백질이 추출되지 않는 문제가 있으며, 1M 을 초과하는 경우에는 추출된 단백질의 특이성이 현저히 떨어지는 문제가 있다. 상기 분획 중 0.5M의 염화나트륨 용액으로 분리한 분획은 도 3에서 확인 할 수 있는 바와 같이 가장 높은 활성을 갖는다. 상기의 결과로 목적 단백질은 수용성이며, 음전하를 띄는 것을 알 수 있다. 후속적으로 음이온 교환 수지에 용리액을 흘려주어 분리한 상기 분획을 셉팩(Sep-Pak) 수지를 사용하여 더욱 분리 정제한다.
상기 셉팩 수지는 당해 기술분야에 알려진 어떠한 것을 이용할 수 있으며, 예를 들어 혐수성 상호 반응 수지가 사용될 수 있다. 음이온 교환수지로 분리한 분획을 상기 셉팩 수지에 통과시킨 후 수지에 접착되지 않은 단백질 분획을 모두 제거하고, 상기 수지에 용리액을 흘려준다. 용리액으로는 에탄올, 메탄올, 부탄올 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 바람직하게는 에탄올 용액을 사용한다. 에탄올 용액을 사용하는 경우 10 내지 30 %의 에탄올 용액 또는 50 내지 70 % 에탄올 용액을 사용하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 20% 및 60%의 에탄올 용액을 용리액으로 사용한다. 10 내지 30 % 또는 50 내지 70 %의 농도 범위를 벗어나는 에탄올 용액의 경우 단백질의 변성 우려가 있으며, 기대하지 않은 단 백질 분획이 첨가될 수 있다.
도 1은 단백질이 점차 단일 밴드로 분리되어 가는 과정을 나타내는 것으로서 각 단백질의 분획 별 전기영동 결과를 나타내며, 상기 방법으로 추출한 최종 추출물(즉, Sep-Pak 20% 및 Sep-Pak 60%)은 단일한 단백질 성분으로 이루어져 있음을 도 1 및 2에서 알 수 있다. 또한 도 3에서는 유기 용매로 추출한 비렉틴 분획보다 이를 음이온 교환수지에서 염화나트륨을 용리액으로 사용하여 더욱 추출한 추출물 중 특히 약 0.5M의 염화나트륨 용액을 사용하는 경우보다 높은 인슐린 분비능을 보이며, 나아가 상기 음이온 교환 수지 추출에 더하여 셉팩 수지에서 에탄올을 용리액으로 사용하여 추출한 추출물 중 특히 약 20% 및 약 60%의 에탄올을 사용하는 경우의 최종 추출물인 단일의 단백질이 가장 높은 인슐린 분비능을 가지고 있음을 확인할 수 있다.
이렇게 분리된 분획을 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동법(SDS-PAGE)을 이용하여 6%, 15%의 폴리아크릴아미드 젤을 사용하여, 150볼트에서 1시간 30분간 전기영동 하여 측정하면 65 내지 67 kD, 즉 약 66kD 크기의 단일 단백질인 것을 확인할 수 있다.
또한, 알록산에 의해 고혈당이 유발된 마우스의 췌장에 본 발명의 분리된 단백질을 투여하여 혈당강하 효과 및 자유 음수량을 측정하였다. 도 4는 당뇨 유발 마우스에서 혈당을 조사한 결과를 나타내며, 셉팩 수지로 최종 추출한 그룹을 나타내는 Sep-pack 20%, Sep-pack 60%의 경우 1차 투여 후 9일이 경화하면서부터 현저하게 혈당을 감소시키며, 나아가 2차 투여 후 21일경에 그 효과를 보다 명확히 확인할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명의 범위가 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 한국산 겨우살이로부터 비렉틴 단백질 분획의 획득
1. 한국산 겨우살이 추출물의 획득
한국산 겨우살이(Viscun album Coloratum)의 뿌리를 제외한 잎, 줄기를 정량하여 100g 분쇄하고 그 분쇄물을 0.9% 식염수 1,000 mL 또는 10 배에 침출시킨 후, 이 추출물을 0.45㎛ (Amersham Pharmacia Biotech)필터를 거쳐 제균한 후, 상기 용액에 70%의 황산암모늄을 650g 첨가하여 단백질만을 추출하였다. 그 결과 얻은 단백질 추출물을 인산완충 용액 150mL으로 용해시켜 투석한 용액을 다시 0.45㎛ (Amersham Pharmacia Biotech) 필터를 거쳐 제균하여 한국산 겨우살이 추출물을 획득하였다.
2. 한국산 겨우살이 추출물로부터 비렉틴 추출물의 획득
한국산 겨우살이에 존재하는 렉틴은 높은 항암성을 가지며 세포독성이 있는 것으로 알려져 있다. 하지만 렉틴은 당뇨에 대한 활성을 가지고 있지 않으며, 세포독성으로 인해 의도치 않은 인슐린 분비가 일어날 가능성이 높아 추출액에서부터 제거할 필요가 있다. 따라서, 상기 1에서 획득한 한국산 겨우살이 추출물을 알파-젖당 수지에 3회 반복하여 통과시켜 비렉틴 추출물을 획득하였다. 알파-젖당 수지는 아가로즈에 젖당이 공유결합을 이루고 있는 수지로 SIGMA-Aldrich®사의 제품을 상업적으로 구매하였다. 상기에서 얻어진 비렉틴 추출물에 대한 전기영동 사진은 도 1과 같으며, 도 1은 단백질이 점차 단일 밴드로 분리되어 가는 과정은 나타낸다.
실시예 2: 항당뇨 활성을 가지는 단백질 분획의 추출
1. 음이온 교환 수지
실시예 1의 방법으로 분리한 비렉틴 추출물 100mg을 클로로포름 100mg 에 첨가하여 유기용매 추출을 실시하였다. 비렉틴 추출물과 클로로포름을 1:1의 비율로 혼합하여 분별 깔때기로 4℃에서 4시간 동안 반응시킨 후 수용액 부분만을 추출하여 -20℃에 보관하였다.
상기와 같이 분리한 추출물 10mL를 음이온 교환 수지에 통과시켜 수지에 접 착되지 않은 단백질 분획은 모두 제거한 후, 용리액으로서 0.1M, 0.5M, 1M의 염화나트륨 용액을 차례로 흘려주어 각각에 대한 분획을 수집하였다. 본 실시예에서 사용한 음이온교환수지는 디에틸아미노에틸(DEAE)-세파로즈 수지이며 Amersham Pharmacia Biotech의 제품을 사용하였다. 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이 용리액으로서 0.5M의 염화나트륨 용액을 음이온 교환 수지에 흘려주어 획득한 분획(DEAE(0.5M))이 가장 높은 인슐린 분비 활성을 나타내었으며, 따라서 상기 분획을 이용하여 후속적인 추출 단계를 실시하였다.
2. Sep-Pak 교환 수지
상기 1에서 획득한 결과물 중 가장 높은 인슐린 분비 활성을 나타낸, 0.5M의 염화나트륨 용액으로 분리한 추출물 10mL 를 셉팩 수지(Waters Corporation)에 통과시킨 후, 수지에 접착되지 않은 단백질 분획을 모두 제거한다. 이 후, 20% 에탄올 용액과 60% 에탄올 용액을 순차적으로 처리하여 각각의 분획을 수집하였다. 20%와 60% 이외의 농도에서는 항당뇨 활성이 거의 나타나지 않았고, 20%와 60%에서 동일한 단백질이 추출되었으며, 20%와 60%의 항당뇨 활성이 거의 흡사하게 나타남을 도 3에서 확인할 수 있다(Sep-pak(20%) 및 Sep-pak(60%)). 따라서 상기 단백질 분획을 대상으로 인슐린 분비능을 조사하였다
실시예 3: 인슐린 분비능의 조사
상기에서 획득한 시료를 췌장에서 분리한 RINm5F 세포에 처리하여 인슐린 분 비능을 측정한다. 4x105 농도의 RINm5F 세포 1mL을 각각 24공 플레이트에 접종하고, 11.1mM의 포도당이 첨가된 RPMI-1640 배지에 12시간 배양한다. 12시간 후, 세포가 플레이트에 정착된 것을 확인하고 크랩-링거(Krebs-Ringer-Bicarbonate, KBR) 완충제로 3회 세척한다. 그 후, 1mL의 크랩-링커 완충제로 37℃ 30분간 전배양시켰다. 이 플레이트에 음성대조군으로서 크랩-링거 완충제를 처리하고 양성 대조군으로 액티빈(activin) A를 처리한다. 실험군으로는 상기의 방법으로 분리한 추출물을 처리하였다. 실험군은 표 1과 같다. 각 실험군과 대조군으로부터 상등액을 추출하여 -20℃에서 24시간 보관한 후, 인슐린 정량 키트를 사용하여 실험을 진행하였다. 인슐린 정량 키트는 시바야기사의 제품을 사용하였고 흡광도 450nm에서 측정하였다. 상기의 실험 결과는 도 3과 같다.
| 시료 | |
| 1 | 비렉틴 단백질 분획 |
| 2 | 클로로포름 추출액 |
| 3 | 0.1M 염화나트륨 추출액 |
| 4 | 0.5M 염화나트륨 추출액 |
| 5 | 1M 염화나트륨 추출액 |
| 6 | 10% 셉팩 수지 추출액 |
| 7 | 20% 셉팩 수지 추출액 |
| 8 | 6% 셉팩 수지 추출액 |
| 9 | 8% 셉팩 수지 추출액 |
실시예 3: 당뇨 유발 마우스에서의 혈당 조사
세포 실험으로 인슐린 분비능을 확인한 후, 후천적으로 당뇨를 유발한 마우스로부터 혈당 저하능력을 조사하였다. 이를 위해 ICR 마우스를 사용한다. 췌장 베타 세포 선택적 공격 물질인 알록산을 70mg/kg의 농도로 마우스의 정맥에 주사한다. 알록산 투여 다음날부터 하기 표 2와 같은 시료를 마우스에게 경구 투여하고 1주 후 혈당 측정 키트를 이용하여 혈당을 측정하였다. 혈당 측정 키트는 Assan Pharmacia사의 제품을 사용하였다.
| NLF(non-lectin fraction) 시료군 | |
| 1-1 | NLF 200㎕ |
| 1-2 | NLF 100㎕ |
| 1-3 | NLF 50㎕ |
| 1-4 | NLF 10㎕ |
| 1-5 | NLF 1㎕ |
| 클로로포름 시료군 | |
| 2-1 | 클로로포름 200㎕ |
| 2-2 | 클로로포름 100㎕ |
| 2-3 | 클로로포름 50㎕ |
| 2-4 | 클로로포름 10㎕ |
| DEAE 0.5M 시료군 | |
| 3-1 | DEAE 0.5M 200㎕ |
| 3-2 | DEAE 0.5M 100㎕ |
| 3-3 | DEAE 0.5M 50㎕ |
| 3-4 | DEAE 0.5M 10㎕ |
| Sep-pak 20% 시료군 | |
| 4-1 | Sep-pak 20% 200㎕ |
| 4-2 | Sep-pak 20% 100㎕ |
| 4-3 | Sep-pak 20% 50㎕ |
| 4-4 | Sep-pak 20% 10㎕ |
| Sep-pak 60% 시료군 | |
| 5-1 | Sep-pak 60% 200㎕ |
| 5-2 | Sep-pak 60% 100㎕ |
| 5-3 | Sep-pak 60% 50㎕ |
| 5-4 | Sep-pak 60% 10㎕ |
한 시료 군은 다섯 마리의 마우스를 사용하였으며 각 시료군 당 가장 활성이 높은 200㎕ 농도의 실험 결과는 도 4와 같다. 상기 실험에서 인산완충 용액만을 투여한 마우스를 대조군으로 사용하였다.
상기 실시예를 통해 클로로포름 시료군은 단백질 전체를 포함하고 있기 때문에 높은 활성을 가지지만 이를 더욱 분리 정제해 나갔을 때, 활성이 더욱 높은 단일의 단백질이 획득되는 것을 확인할 수 있다.
도 1은 단백질이 점차 단일 밴드로 분리되어 가는 과정을 나타내는 각 단백질의 분획 별 전기영동 결과이다. 본 도면에서 NLF(non-lectin fraction)는 비렉틴 분획, DEAE 1M, 0.5M은 각각 음이온 교환 수지에서 1M, 0.5M의 염화나트륨으로 추출한 추출물, Sep-Pak 20%, 60%는 각각 셉팩 수지에서 20%, 60% 에탄올 용액으로 추출한 추출물을 나타낸다.
도 2 는 비렉틴 분획과 클로로포름 추출물, 음이온 수지 추출물, 셉팩 수지 추출물의 단백질 전기영동 결과(A)와 웨스턴 블롯(western-blotting)의 결과(B)이다.
도 3은 비렉틴 분획과 클로로포름 추출물, 음이온 수지 추출물, 셉팩 수지 추출물의 인슐린 분비 정도를 나타낸 그래프이다.
도 4 는 각 시료 군을 마우스에게 경구 투여했을 때 경과일에 따른 혈당 변화를 나타낸 그래프이다.
Claims (6)
- 하기 (a) 내지 (e)의 특성을 가지며, 한국산 겨우살이(Viscun album Coloratum)에서 유래한 항당뇨 활성을 갖는 단백질:(a) 최적온도 22 내지 25 ℃;(b) 최적 pH 6.4 내지 7.5;(c) 온도 37 ℃ 및 pH 6.0에서 5시간 이상 안정;(d) 등전점 pI 6.8 내지 7.0;(e) 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동법(SDS-PAGE) 측정 분자량 65 내지 67 kDa.
- 제 1항의 단백질 0.01 내지 0.1 중량%를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 약학 조성물.
- 제 1항의 단백질 0.01 내지 0.1 중량%를 유효성분으로 포함하는 항당뇨 효과를 갖는 기능성 식품.
- 한국산 겨우살이(Viscun album Coloratum) 추출물로부터 알파-젖당 수지를 이용하여 비렉틴 단백질 분획을 분리하는 단계;상기 단계에서 얻은 용액을 유기용매 추출하는 단계;상기 추출액을 음이온 교환 수지에 통과시키는 단계;상기 음이온 교환 수지에 용리액을 흘려주는 단계;상기 단계에서 얻은 분획을 셉팩(Sep-Pak) 수지에 통과시키는 단계; 및상기 셉팩 수지에 용리액을 흘려주는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 한국산 겨우살이에서 유래한 항당뇨 활성을 갖는 단백질의 추출방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 음이온 교환 수지의 용리액은 0.1M 내지 1M의 염화나트륨인 것을 특징으로 하는, 한국산 겨우살이에서 유래한 항당뇨 활성을 갖는 단백질의 추출방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 셉팩 수지의 용리액은 10 내지 30 % 에탄올 또는 50 내지 70% 에탄올인 것을 특징으로 하는, 한국산 겨우살이에서 유래한 항당뇨 활성을 갖는 단백질의 추출방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020080010834A KR20090084575A (ko) | 2008-02-01 | 2008-02-01 | 항당뇨 활성을 가지는 한국산 겨우살이 유래 단백질 및 그추출방법 |
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| KR20090084575A true KR20090084575A (ko) | 2009-08-05 |
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ID=41205102
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Country Status (1)
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| KR (1) | KR20090084575A (ko) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101440399B1 (ko) * | 2013-07-19 | 2014-09-12 | 한국원자력연구원 | 방사선 조사를 이용하여 항당뇨 효과가 증진된 겨우살이 열수 추출물을 유효성분으로 하는 조성물 및 이의 제조방법 |
| KR101490365B1 (ko) * | 2013-07-19 | 2015-02-11 | 한국원자력연구원 | 겨우살이 비스코사이오닌을 유효성분으로 하는 항당뇨 겨우살이 추출물 또는 이로부터 분리된 비스코사이오닌을 포함하는 항당뇨 조성물 |
| WO2018080032A1 (ko) * | 2016-10-31 | 2018-05-03 | 한동대학교 산학협력단 | 한국산 겨우살이 추출물을 유효성분으로 함유하는 근 위축 억제 및 근 비대 활성을 갖는 조성물 |
-
2008
- 2008-02-01 KR KR1020080010834A patent/KR20090084575A/ko not_active Application Discontinuation
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