KR102623811B1 - 고려엉겅퀴 잎 발효추출분획물을 포함하는 항당뇨용 약학적 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents
고려엉겅퀴 잎 발효추출분획물을 포함하는 항당뇨용 약학적 조성물 및 그 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 고려엉겅퀴를 균주로 발효하고, 단일용매로 추출하고, 혼합 용매로 추출한 것을 층별로 분획하여 얻어지며, 항당뇨 효과가 향상되도록 한 고려엉겅퀴 잎 발효추출분획물을 포함하는 항당뇨용 약학적 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 고려엉겅퀴 잎 발효추출분물을 포함하는 항당뇨용 약학적 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는, 고려엉겅퀴를 균주로 발효하고, 단일용매로 추출하고, 혼합 용매로 추출한 것을 층별로 분획하여 얻어지며, 항당뇨 효과가 향상되도록 한 고려엉겅퀴 잎 발효추출분획물을 포함하는 항당뇨용 약학적 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
당뇨병(DM)은 인슐린 분비 결핍(제1형 DM) 또는 인슐린 저항성(제2형 DM)에 의해 유발되는 지속적으로 상승된 혈당 수준(고혈당증)을 특징으로 하는 대사 질환이다. 단백질, 지질 및 탄수화물 대사의 손상은 스트레스, 더 많은 칼로리 소비 및 현대 생활 방식으로 인해 제2형 당뇨병을 유발한다(Kaku 2010). 인간의 대사 과정에서 α-아밀라아제와 α-글루코시다아제는 전분을 단일 당으로 전환하는 데 관여하고 p53 경로와 포도당 절단을 조절하므로 이러한 효소를 억제하면 당뇨병의 위험을 줄일 수 있다(Yu et al. 2012). 현재 DM은 메트포르민, 디펩티딜 펩티다제-4 억제제, 메글리티니드, 티아졸리딘디온, 글루카곤 유사 펩티드-1 수용체 작용제, 보글리보스, 미글리톨, 아카보스 등의 약물을 사용하여 의학적으로 치료되고 있다(Maideen 2019; Wang et al. 2019). 여러 인간 질병을 치료하기 위한 치료제로 얻은 천연 자원의 효소 억제제(Llorent-Mart
nez et al. 2020). 그러나 이러한 명상의 대부분은 체중 증가, 설사, 헛배부름, 위장 팽만 등의 부작용을 유발하며 간 질환 환자에게는 투여하지 않는다(Schernthaner et al. 2014). 따라서 폴리페놀과 플라보노이드가 풍부한 기능성 식품의 섭취는 대사 과정을 개선하고 DM의 위험을 줄일 수 있다(Johnston et al. 2002). 예를 들어, 한국에서는 C. setidens 잎의 잎은 식이섬유, 비타민 C, 베타카로틴, 칼슘 및 철분이 풍부하고 건강을 제공하는 기능성 식품 역할을 하는 전통 음식인 "곤드레 반찬 밥"을 준비하는 데 사용된다. 변비, 빈혈, 지혈, 암, 고혈압, 혈뇨를 예방하고 독소를 제거하는 등의 건강상의 이점이 있다(Jeong et al. 2018; Sener et al. 2021).
북아프리카, 유라시아, 유럽, 아시아에 자생하는 세슘속(국화과) 총 60종(Jeong et al. 2018). 그러나 C. setidens는 100~120cm 높이까지 자라는 한국의 산과 아산지대에 분포하는 여러해살이풀로 알려져 있다(Huifang et al. 2015; Nugroho et al. 2011). 연구자들은 이 나물의 공중 부분에 비타민, 페놀, 단백질이 풍부하여 전통적으로 민간 요법으로 사용되었으며 혈뇨, 지혈 및 고혈압 치료제로 사용되었다고 보고했다(Lee 1966). 또한, 잎의 식물화학적 분석에서 quinic acid, flavonoids 및 phenylpropanoids가 나타났으며 지역 부분에는 지방산, steroids 및 terpenoids가 포함된 것으로 보고되었다(Lee et al. 2002). C. setidens에서 유래한 배당체 및 linarin과 같은 화합물은 간 보호 활성을 나타낸다(Nugroho et al. 2011). 또한, 최근 연구에 따르면 C. setidens의 기공 부분에서 분리된 화합물(setidenosides A, B)이 유망한 최종 당화 산물과 항산화 활성을 보인다고 보고했다(Jeong et al. 2018). 또한, 우리 그룹은 n-BuOH 분획 C. setidens의 항산화 및 간 보호 특성을 보고했다(Lee et al. 2008). 일부 연구에서는 C. setidens의 분획, 추출물 또는 순수 화합물의 생물학적 활성을 특성화했지만 C. setidens 잎의 다양한 용매 분획의 식물화학적 조성을 효소 억제, 항산화 및 항당뇨병 활성과 비교한 연구는 없다. 따라서 본 연구의 목적은 C. setidens의 3가지 용매 분획(메탄올 분획, 헥산 분획 및 에틸 아세테이트 분획)의 식물화학적 조성, 항산화 활성 및 항당뇨 활성을 조사하는 것이다. 또한 STZ 유도 당뇨병 마우스 모델을 사용하여 추정 분획의 항당뇨 활성을 평가하였다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 고려엉겅퀴를 발효하고, 단일용매로 추출하고, 혼합 용매로 추출한 것을 층별로 분획하여 얻어지며, 항당뇨 효과가 증진되도록 한 고려엉겅퀴 잎 발효추출분획물을 포함하는 항당뇨용 약학적 조성물 및 그 제조방법을 제공하는데 목적이 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 고려엉겅퀴의 잎에 트리코델마 하지아눔 균주를 접종하고 발효하는 발효 단계(S10); 상기 발효 단계(S10)에서 발효된 고려엉겅퀴 잎을 건조하고 분쇄하여 고려엉겅퀴 잎 발효분말을 제조하는 건조분쇄 단계(S20); 상기 건조분쇄 단계(S20)에서 건조되고 분쇄된 고려엉겅퀴 잎 발효분말에 제1추출용매를 가해 제1 고려엉겅퀴 잎 발효추출물을 추출하는 제1 추출단계(S30); 상기 제1 추출단계(S30)에서 추출된 제1 고려엉겅퀴 잎 발효추출물에 제2추출용매를 가해 제2 고려엉겅퀴 잎 발효추출물을 추출하는 제2 추출단계(S40); 상기 제2 추출단계(S40)에서 추출된 제2 고려엉겅퀴 잎 발효추출물의 상층액을 취해 분별하는 분획 단계(S50)를 포함하는 것을 특징으로 하는 고려엉겅퀴 잎 발효추출분획물을 포함하는 항당뇨용 약학적 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한, 상기 제1 추출단계(S30)는 고려엉겅퀴 잎 발효분말에 제1 추출용매를 가하고, 자기교반기를 이용해 500 ~ 700rpm교반하여 제 1고려엉겅퀴 잎 발효추출물을 제조하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 제1 추출단계(S30)는 고려엉겅퀴 잎 발효분말에 제1 추출용매를 가하고, 자기교반기를 이용해 48 ~ 96시간 동안 교반하여 제 1고려엉겅퀴 잎 발효추출물을 제조하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 제1 추출단계(S30)에서의 제1 추출용매는 메탄올인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 제2 추출단계(S40)에서의 제2 추출용매는 메탄올, 정제수 및 에틸 아세테이트를 5 : 3 : 7의 중량비로 혼합한 혼합용매인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 분획 단계(S50)에서 메탄올과 정제수는 각각 중층액 및 하층액을 형성하고, 헥산 또는 에틸 아세테이트는 상층액을 형성하며, 상층액만을 취해 분별하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 트리코델마 하지아눔 균주를 접종하고 발효한 고려엉겅퀴의 잎을 건조하고 분쇄하여 형성된 고려엉겅퀴 잎 발효분말에; 제1추출용매를 가해 추출하여 제1 고려엉겅퀴 잎 발효추출물;을 형성하고, 제2추출용매를 가해 추출하여 제2 고려엉겅퀴 잎 발효추출물;을 형성하고, 분획하여 상층액을 취한 것을 특징으로 하는 고려엉겅퀴 잎 발효추출분획물을 포함하는 항당뇨용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 상기 제1 고려엉겅퀴 잎 발효추출물은, 고려엉겅퀴 잎 발효분말에 제1 추출용매를 가하고, 자기교반기를 이용해 500 ~ 700rpm의 속도로 교반하여 형성된 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 제1 고려엉겅퀴 잎 발효추출물은, 고려엉겅퀴 잎 발효분말에 제1 추출용매를 가하고, 자기교반기를 이용해 548 ~ 96시간 동안 교반하여 형성된 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 제1 추출용매는 메탄올인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 제2 추출용매는 메탄올, 정제수 및 에틸 아세테이트를 5 : 3 : 7의 중량비로 혼합한 혼합용매인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 메탄올과 정제수는 각각 중층액 및 하층액을 형성하고, 에틸 아세테이트는 상층액을 형성하며, 상층액만을 취한 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제조방법에 따라 제조된 발효추출분획물을 포함하는 항당뇨용 약학적 조성물은 고려엉겅퀴를 발효하고, 단일용매로 추출하고, 혼합 용매로 추출한 것을 층별로 분획하여 얻어지며, 일반 용매 추출물에 비해, 항당뇨 효과가 향상된다.
도 1은 C. setidens에서 얻은 다양한 분획물 및 추출물(MF-CS, HF-CS 및 EAF-CS)에 대한 UHPLC-ESI-qTOF-MS/MS 분석을 나타낸 이미지.
도 2는 마우스 섬유아세포 세포주에 대한 C. setidens 유래 분획물 및 추출물(MF-CS, HF-CS 및 EAF-CS)의 세포독성을 나타낸 WST 분석 그래프(a), 및 NIH3T3 세포에 대해 상이한 분획물 및 추출물(MF-CS, HF-CS 및 EAF-CS)의 고농도(100mg/mL) 투여에 따른 변화를 AO/EB 염색 분석으로 나타낸 이미지.
도 3은 간세포 암종(HepG 2)에 대한 C. setidens의 다양한 분획물 및 추출물(MF-CS, HF-CS 및 EAF-CS)의 세포독성을 나타낸 이미지.
도 4는 C. setidens의 에틸아세테이트 분획물(EAF-CS)이 당뇨병 마우스의 주요 장기(간, 신장, 췌장)의 조직병리학적 치료에 따른 변화를 나타낸 이미지.
도 5는 C. setidens의 식물 화합물과 α-아밀라아제(5E0F) 간의 촉매 상호작용에 대한 분자 도킹 분석을 나타낸 이미지.
도 6은 C. setidens의 식물 화합물과 α-아밀라아제(5E0F) 간의 촉매 상호작용에 대한 분자 도킹 분석을 나타낸 이미지.
도 7은 UHPLC-ESI-qTOF-MS/MS 분석으로 분석된 EAF-CS의 대표 화합물에 관한 이미지.
도 8은 STZ 유도 당뇨병 모델의 설정 실험을 나타난 이미지.
도 9는 Crisium setidens의 에틸 아세테이트 분획물(EAF-CS) 처리가 당뇨병 마우스의 간 조직에 미치는 영향을 나타낸 이미지.
도 10은 Crisium setidens의 에틸 아세테이트 분획물(EAF-CS) 처리가 당뇨병 마우스의 신장 조직에 미치는 영향을 나타낸 이미지.
도 11은 Crisium setidens의 에틸 아세테이트 분획물(EAF-CS) 처리가 당뇨병 마우스의 췌장 조직에 미치는 영향을 나타낸 이미지.
도 2는 마우스 섬유아세포 세포주에 대한 C. setidens 유래 분획물 및 추출물(MF-CS, HF-CS 및 EAF-CS)의 세포독성을 나타낸 WST 분석 그래프(a), 및 NIH3T3 세포에 대해 상이한 분획물 및 추출물(MF-CS, HF-CS 및 EAF-CS)의 고농도(100mg/mL) 투여에 따른 변화를 AO/EB 염색 분석으로 나타낸 이미지.
도 3은 간세포 암종(HepG 2)에 대한 C. setidens의 다양한 분획물 및 추출물(MF-CS, HF-CS 및 EAF-CS)의 세포독성을 나타낸 이미지.
도 4는 C. setidens의 에틸아세테이트 분획물(EAF-CS)이 당뇨병 마우스의 주요 장기(간, 신장, 췌장)의 조직병리학적 치료에 따른 변화를 나타낸 이미지.
도 5는 C. setidens의 식물 화합물과 α-아밀라아제(5E0F) 간의 촉매 상호작용에 대한 분자 도킹 분석을 나타낸 이미지.
도 6은 C. setidens의 식물 화합물과 α-아밀라아제(5E0F) 간의 촉매 상호작용에 대한 분자 도킹 분석을 나타낸 이미지.
도 7은 UHPLC-ESI-qTOF-MS/MS 분석으로 분석된 EAF-CS의 대표 화합물에 관한 이미지.
도 8은 STZ 유도 당뇨병 모델의 설정 실험을 나타난 이미지.
도 9는 Crisium setidens의 에틸 아세테이트 분획물(EAF-CS) 처리가 당뇨병 마우스의 간 조직에 미치는 영향을 나타낸 이미지.
도 10은 Crisium setidens의 에틸 아세테이트 분획물(EAF-CS) 처리가 당뇨병 마우스의 신장 조직에 미치는 영향을 나타낸 이미지.
도 11은 Crisium setidens의 에틸 아세테이트 분획물(EAF-CS) 처리가 당뇨병 마우스의 췌장 조직에 미치는 영향을 나타낸 이미지.
이하의 본 발명에 관한 상세한 설명들은 본 발명이 실시될 수 있는 실시 예이고 해당 실시 예의 예시로써 도시된 첨부 도면을 참조한다.
이들 실시 예는 당 업자가 본 발명의 실시에 충분하도록 상세히 설명된다. 본 발명의 다양한 실시 예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다.
예를 들어, 여기에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 일 실시 예에 관련하여 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다른 실시 예로 구현될 수 있다.
각각의 기재된 실시 예 내의 개별 구성요소의 위치 또는 배치는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 변경될 수 있음이 이해되어야 한다.
후술되는 상세한 설명은 한정적인 의미로서 취하려는 것이 아니며, 본 발명의 범위는 적절하게 설명된다면 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 도면에서 유사한 참조부호는 여러 측면에 걸쳐서 동일하거나 유사한 기능을 지칭한다.
본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
본 발명에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.
이하, 본 발명에 따른 고려엉겅퀴 잎 발효추출분획물을 포함하는 항당뇨용 약학적 조성물의 제조방법에 대하여 자세히 설명한다.
본 발명에 따른 고려엉겅퀴 잎 발효추출분획물을 포함하는 항당뇨용 약학적 조성물의 제조방법은 고려엉겅퀴의 잎에 트리코델마 하지아눔 균주를 접종하고 발효하는 발효 단계(S10); 상기 발효 단계(S10)에서 발효된 고려엉겅퀴 잎을 건조하고 분쇄하여 고려엉겅퀴 잎 발효분말을 제조하는 건조분쇄 단계(S20); 상기 건조분쇄 단계(S20)에서 건조되고 분쇄된 고려엉겅퀴 잎 발효분말에 제1추출용매를 가해 제1 고려엉겅퀴 잎 발효추출물을 추출하는 제1 추출단계(S30); 상기 제1 추출단계(S30)에서 추출된 제1 고려엉겅퀴 잎 발효추출물에 제2추출용매를 가해 제2 고려엉겅퀴 잎 발효추출물을 추출하는 제2 추출단계(S40); 상기 제2 추출단계(S40)에서 추출된 제2 고려엉겅퀴 잎 발효추출물의 상층액을 취해 분별하는 분획 단계(S50)를 포함한다.
상기 발효 단계(S10)에서는 고려엉겅퀴의 잎에 트리코델마 하지아눔 균주를 접종하고 발효한다.
상기 고려엉겅퀴(Cirsium setidens)는 구멍이·도깨비엉겅퀴·고려가시나물·곤드레나물라고도 한다. 상기 고려엉겅퀴는 산과 들에서 높이 약 1m로 자란다. 상기 고려엉겅퀴는 뿌리가 곧으며 가지가 사방으로 퍼진다. 상기 고려엉겅퀴의 뿌리에 달린 잎과 밑부분의 잎은 꽃이 필 때 시든다. 상기 고려엉겅퀴의 줄기에 달린 잎은 타원 모양 바소꼴 또는 달걀 모양으로 밑쪽 잎은 잎자루가 길고 위쪽 잎은 잎자루가 짧다. 상기 고려엉겅퀴 잎의 앞면은 녹색에 털이 약간 나며 뒷면은 흰색에 털이 없고 가장자리가 밋밋하거나 가시 같은 톱니가 있다. 상기 고려엉겅퀴는 7∼10월에 지름 3∼4cm의 붉은 자줏빛 관상화(管狀花)가 원줄기와 가지 끝에 한 송이씩 핀다. 상기 고려엉겅퀴의 총포는 둥근 종 모양으로 길이 약 2cm이고 털이 빽빽이 난다. 상기 고려엉겅퀴의 화관은 자줏빛이고 길이 15∼19mm이다. 상기 고려엉겅퀴의 열매는 수과로 길이 3.5∼4mm의 긴 타원형이며 11월에 익는다. 상기 고려엉겅퀴의 관모는 갈색이다. 상기 고려엉겅퀴는 어린 잎을 먹는다. 상기 고려엉겅퀴는 한국 특산종으로 전국에 분포한다.
상기 트리코델마 하지아눔 균주(trichoderma harzianum)는 공시된 균주로서 시중에서의 구입을 통해 얻을 수 있다. 또는, 본 발명의 일 실시예 있어서 상기 트리코델마 하지아눔 균주는 Trichoderma harzianum(SKCGW008)(한국생명공학연구원 기탁번호: KCTC18900P)일 수 있다. 다만, 이는 트리코델마 하지아눔 균주(trichoderma harzianum)의 일 실시예에 사용된 실험적 예시일뿐, 본 발명에서 트리코델마 하지아눔 균주(trichoderma harzianum) 중 특정한 종 또는 아종을 한정하는 것은 아니다.
상기 고려엉겅퀴(Cirsium setidens)를 트리코델마 하지아눔 균주(trichoderma harzianum)로 발효하는 기간은 1 ~ 2주 가량인 것이 적절하다. e도한, 상기 고려엉겅퀴를 트리코델마 하지아눔 균주로 발효하는 온도는 5 ~ 40℃인 것이 바람직할 것이다.
가장 구체적으로, 상기 발효 단계(S10)에서는 고려엉겅퀴(Cirsium setidens)의 잎에 Trichoderma harzianum(SKCGW008)(한국생명공학연구원 기탁번호: KCTC18900P) 균주를 접종하고 10일 동안 15℃의 온도로 발효하는 것이 바람직하다.
상기 건조분쇄 단계(S20)에서는 상기 발효 단계(S10)에서 발효된 고려엉겅퀴 잎을 건조하고 분쇄하여 고려엉겅퀴 잎 발효분말을 제조한다.
상기 건조분쇄 단계(S20)에서 발효된 고려엉겅퀴 잎은 5 ~ 40℃의 온도로 직사광선이 들지않는 음지에서 건조되는 것이 바람직하다.
상기 건조분쇄 단계(S20)에서 발효된 고려엉겅퀴 잎은 100 ~ 200mesh 이하의 입자로 분쇄되는 것이 바람직하다.
가장 구체적으로, 상기 건조분쇄 단계(S20)에서는 상기 발효 단계(S10)에서 발효된 고려엉겅퀴 잎을 5 ~ 40℃의 온도로 직사광선이 들지않는 음지에서 건조하고 100 ~ 200mesh 이하의 입자로 분쇄하여 고려엉겅퀴 잎 발효분말을 제조하는 것이 바람직하다.
상기 제1 추출단계(S30)에서는 상기 건조분쇄 단계(S20)에서 건조되고 분쇄된 고려엉겅퀴 잎 발효분말에 제1추출용매를 가해 제1 고려엉겅퀴 잎 발효추출물을 추출한다.
상기 제1 추출단계(S30)는 고려엉겅퀴 잎 발효분말에 제1 추출용매를 가하고, 자기교반기를 이용해 500 ~ 700rpm의 속도로 교반하여 제 1고려엉겅퀴 잎 발효추출물을 제조하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 제1 추출단계(S30)는 고려엉겅퀴 잎 발효분말에 제1 추출용매를 가하고, 자기교반기를 이용해 48 ~ 96시간 동안 교반하여 제 1고려엉겅퀴 잎 발효추출물을 제조하는 것을 특징으로 한다.
상기 제1 추출단계(S30)에서의 제1 추출용매는 메탄올인 것을 특징으로 한다.
가장 구체적으로, 상기 제1 추출단계(S30)에서는 상기 건조분쇄 단계(S20)에서 건조되고 분쇄된 고려엉겅퀴 잎 발효분말에 메탄올를 가하고, 자기교반기를 이용해 600rpm의 속도로 72시간 동안 교반하여 제1 고려엉겅퀴 잎 발효추출물을 추출한다.
상기 제2 추출단계(S40)에서는 상기 제1 추출단계(S30)에서 추출된 제1 고려엉겅퀴 잎 발효추출물에 제2추출용매를 가해 제2 고려엉겅퀴 잎 발효추출물을 추출한다.
상기 제2 추출단계(S40)에서의 제2 추출용매는 메탄올, 정제수 및 에틸 아세테이트를 5 : 3 : 7의 중량비로 혼합한 혼합용매인 것을 특징으로 한다.
가장 구체적으로, 상기 제2 추출단계(S40)에서는 상기 제1 추출단계(S30)에서 추출된 제1 고려엉겅퀴 잎 발효추출물에 메탄올, 정제수 및 에틸 아세테이트를 5 : 3 : 7의 중량비로 혼합한 혼합용매를 가하고 자기교반기를 이용해 600rpm의 속도로 72시간 동안 교반하여 제2 고려엉겅퀴 잎 발효추출물을 추출하는 것이 바람직하다.
상기 분획 단계(S50)에서는 상기 제2 추출단계(S40)에서 추출된 제2 고려엉겅퀴 잎 발효추출물의 상층액을 취해 분별한다.
상기 분획 단계(S50)에서 메탄올과 정제수는 각각 중층액 및 하층액을 형성하고, 에틸 아세테이트는 상층액을 형성하며, 상층액만을 취해 분별하는 것을 특징으로 한다.
가장 구체적으로, 상기 분획 단계(S50)에서는 상기 제2 추출단계(S40)에서 추출된 제2 고려엉겅퀴 잎 발효추출물을 1시간 동안 흔들어 섞고 방치하여, 메탄올과 정제수가 각각 중층액 및 하층액을 형성하고, 에틸 아세테이트는 상층액을 형성하도록 하며, 상층액을 취해 분별한다.
또한, 본 발명은 트리코델마 하지아눔 균주를 접종하고 발효한 고려엉겅퀴의 잎을 건조하고 분쇄하여 형성된 고려엉겅퀴 잎 발효분말에; 제1추출용매를 가해 추출하여 제1 고려엉겅퀴 잎 발효추출물;을 형성하고, 제2추출용매를 가해 추출하여 제2 고려엉겅퀴 잎 발효추출물;을 형성하고, 분획하여 상층액을 취한 것을 특징으로 하는 고려엉겅퀴 잎 발효추출분획물을 포함하는 항당뇨용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 상기 제1 고려엉겅퀴 잎 발효추출물은, 고려엉겅퀴 잎 발효분말에 제1 추출용매를 가하고, 자기교반기를 이용해 500 ~ 700rpm의 속도로 교반하여 형성된 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 제1 고려엉겅퀴 잎 발효추출물은, 고려엉겅퀴 잎 발효분말에 제1 추출용매를 가하고, 자기교반기를 이용해 548 ~ 96시간 동안 교반하여 형성된 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 제1 추출용매는 메탄올인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 제2 추출용매는 메탄올, 정제수 및 에틸 아세테이트를 5 : 3 : 7의 중량비로 혼합한 혼합용매인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 메탄올과 정제수는 각각 중층액 및 하층액을 형성하고, 헥산 또는 에틸 아세테이트는 상층액을 형성하며, 상층액만을 취한 것을 특징으로 한다.
그 외의, 세부적인 기술적 특징은 본 발명에 따른 고려엉겅퀴 잎 발효추출분획물을 포함하는 항당뇨용 약학적 조성물의 제조방법에 기술된 내용을 적용할 수 있을 것이다.
이하, 하기의 실시예, 비교예 및 실험예를 통하여, 본 발명에 따른 고려엉겅퀴 잎 발효추출분획물을 포함하는 항당뇨용 약학적 조성물에 대하여 자세히 설명한다.
1. 재료 및 제조방법
1.1. 재료
마우스 섬유아세포 세포주(NIH3T3) 및 간 간세포 암종(El-Sherbiny et al. 2021)(HepG2)과 같은 세포주는 대한민국 서울에 있는 한국 세포주 은행(KCLB)에서 구입했다. 고려엉겅퀴 잎귀는 강원도 춘천시에서 구입하였다. 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH), dichlorofluorescein diacetate(DCFH-DA), acridine orange(AO), ethidium bromide(EB), rhodamine 123(Rh123)은 대한민국 Sigma-Aldrich사로부터 입수하였다. Roswell Park Memorial Institute Medium(RPMI), Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), penicillin-streptomycin(PS), FITC annexin, PI kit는 대한민국 ThermoFisher Scientific에서 구입했다. 세포독성 분석 키트(WST-CELLO MAX™는 대한민국 메디팹(MediFab)에서 구입했다.
1.2. 시료의 제조
1.2.1.
실시예
1. 에틸아세테이트를 이용한 고려엉겅퀴 잎
발효추출분획물(EAF-CS)의
제조
하기의 제조공정에 따라, 실시예 1에 따른, 에틸아세테이트를 이용한 고려엉겅퀴 잎 발효추출분획물(EAF-CS)을 제조하였다.
발효 단계(S10): 고려엉겅퀴(Cirsium setidens)의 잎에 Trichoderma harzianum(SKCGW008)(한국생명공학연구원 기탁번호: KCTC18900P) 균주를 접종하고 10일 동안 15℃의 온도로 발효하였다.
건조분쇄 단계(S20): 상기 발효 단계(S10)에서 발효된 고려엉겅퀴 잎을 15℃의 온도로 직사광선이 들지않는 음지에서 건조하고 100mesh 이하의 입자로 분쇄하여 고려엉겅퀴 잎 발효분말을 제조하였다.
제1 추출단계(S30): 상기 건조분쇄 단계(S20)에서 건조되고 분쇄된 고려엉겅퀴 잎 발효분말에 메탄올를 가하고, 자기교반기를 이용해 600rpm의 속도로 72시간 동안 교반하여 제1 고려엉겅퀴 잎 발효추출물을 추출하였다.
제2 추출단계(S40): 상기 제1 추출단계(S30)에서 추출된 제1 고려엉겅퀴 잎 발효추출물에 메탄올, 정제수 및 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 5 : 3 : 7의 중량비로 혼합한 혼합용매를 가하고 자기교반기를 이용해 600rpm의 속도로 72시간 동안 교반하여 제2 고려엉겅퀴 잎 발효추출물을 추출하였다.
분획 단계(S50): 상기 제2 추출단계(S40)에서 추출된 제2 고려엉겅퀴 잎 발효추출물을 1시간 동안 흔들어 섞고 방치하여, 메탄올과 정제수가 각각 중층액 및 하층액을 형성하고, 에틸아세테이트(ethyl acetate)는 상층액을 형성하도록 하였으며, 상층액을 취해 분별하여 EAF-CS로 명명하였다.
1.2.2.
비교예
1.
헥산을
이용한 고려엉겅퀴 잎
발효추출분획물(HF-CS)의
제조
하기의 제조공정에 따라, 비교예 1에 따른, 헥산을 이용한 고려엉겅퀴 잎 발효추출분획물(EAF-CS)을 제조하였다.
발효 단계(S10): 고려엉겅퀴(Cirsium setidens)의 잎에 Trichoderma harzianum(SKCGW008)(한국생명공학연구원 기탁번호: KCTC18900P) 균주를 접종하고 10일 동안 15℃의 온도로 발효하였다.
건조분쇄 단계(S20): 상기 발효 단계(S10)에서 발효된 고려엉겅퀴 잎을 15℃의 온도로 직사광선이 들지않는 음지에서 건조하고 100mesh 이하의 입자로 분쇄하여 고려엉겅퀴 잎 발효분말을 제조하였다.
제1 추출단계(S30): 상기 건조분쇄 단계(S20)에서 건조되고 분쇄된 고려엉겅퀴 잎 발효분말에 메탄올를 가하고, 자기교반기를 이용해 600rpm의 속도로 72시간 동안 교반하여 제1 고려엉겅퀴 잎 발효추출물을 추출하였다.
제2 추출단계(S40): 상기 제1 추출단계(S30)에서 추출된 제1 고려엉겅퀴 잎 발효추출물에 메탄올, 정제수 및 헥산(hexane)를 5 : 3 : 7의 중량비로 혼합한 혼합용매를 가하고 자기교반기를 이용해 600rpm의 속도로 72시간 동안 교반하여 제2 고려엉겅퀴 잎 발효추출물을 추출하였다.
분획 단계(S50): 상기 제2 추출단계(S40)에서 추출된 제2 고려엉겅퀴 잎 발효추출물을 1시간 동안 흔들어 섞고 방치하여, 메탄올과 정제수가 각각 중층액 및 하층액을 형성하고, 헥산(hexane)은 상층액을 형성하도록 하였으며, 상층액을 취해 분별하여, HF-CS로 명명하였다.
1.2.3.
비교예
2.
고려엉컹퀴
잎 메탄올 추출물의 제조
하기의 제조공정에 따라, 비교예 2에 따른, 고려엉컹퀴 잎 메탄올 추출물(MF-CS)을 제조하였다.
건조분쇄 단계(S10): 고려엉겅퀴 잎을 150℃의 온도로 직사광선이 들지않는 음지에서 건조하고 100mesh 이하의 입자로 분쇄하여 고려엉겅퀴 잎 발효분말을 제조하였다.
추출단계(S20): 상기 건조분쇄 단계(S20)에서 건조되고 분쇄된 고려엉겅퀴 잎 발효분말에 메탄올를 가하고, 자기교반기를 이용해 600rpm의 속도로 72시간 동안 교반하여 고려엉컹퀴 잎 메탄올 추출물을 추출하였으며 이를 MF-CS로 명명하였다.
2. 실험방법
2.1. C.
setidens의
다양한 분획에서 식물성 화합물 분석
UHPLC-QTOF-MS/MS는 종래에 수행되었던 프로토콜(Saravanakumar et al. 2021b)에 따라 C.setidens의 세 가지 다른 분획물 및 추출물(EAF-CS, HF-CS, MF-CS)에서 화학 성분을 검사하는 데 사용되었다. 본 실험예에 사용된 UHPLC-QTOF-MS/MS에는 Waters Xevo G2 QTOF MS(Waters MS Technologies, Manchester, UK)와 ESI(electrospray ionization)가 결합된 water acquity UPLC I-Class 시스템(Water Corp., Milford, MA, USA)이 장착되어 있다. 간단히 말해서, CS의 각 분획물 및 추출물(EAF-CS, HF-CS, MF-CS)을 70% 에탄올에 용해시키고 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 필터(0.2μm)를 통해 여과하였다. 20ppm의 샘플을 300μL/min의 유속으로 주입했다. 이동상 A는 H2O 중 0.1% 포름산으로 구성되었으며 이동상 B는 아세토니트릴 중 0.1%였다. 분석은 Acquity UPLC BEH C18 컬럼(50 × 2.1 mm, 1.7 μm)(Waters Co., USA)에 의해 수행되었다. 크로마토그래피 데이터는 MassLynx V4.1로 분석되었으며 사내 라이브러리(UNIFI 1.8; Waters Corp.)를 사용하여 분획의 화합물을 예측했다.
2.2. 시험관 내 분석
EAF-CS, HF-CS, MF-CS를 포함한 시료의 총 페놀량, 총 플라보노이드량, 1,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 소거 분석 및 효소(α-amylase 및 α-glucosidase) 억제 활성은 종래의 연구(Blois 1958; Cano et al. 1998; Saravanakumar et al. 2021c; Sathiyaseelan et al. 2020)에서 설명한 자세한 프로토콜을 적용하여 수행했다.
2.2.1. 시험관 내 세포독성 분석
WST-CELLO MAX™세포 생존율 키트를 사용하여 NIH3T3 및 HepG2 세포에서 CS 분획물 및 추출물의 세포독성을 평가했다. NIH3T3 및 HepG2 세포를 5% CO2 인큐베이터에서 37℃로 24시간 동안 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) 및 10% Fatal bovine serum(FBS)이 포함된 Dulbecco의 Modified Eagle Medium(DMEM) 배지에서 배양했다. 세포 성장이 ~80-90% confluence에 도달한 후, 멸균 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수확하고 농도를 1 x 104cell/mL로 조정했다. 그 후, 100 μL/웰(1 x 104 세포/mL) 세포를 96-웰 플레이트에 시드하고 ~80% confluence에 도달할 때까지 5% CO2 인큐베이터에서 37℃로 보관한 다음, 16시간 동안 세포를 다양한 농도(0, 3.12, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/mL)를 갖는 10μL의 분획물 및 추출물(EAF-CS, HF-CS, MF-CS)로 처리했다. 그런 다음, 10 μL의 WST-CELLO MAX™시약을 각 웰에 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 SpectraMax®Plus Microplate Reader(Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 사용하여 450nm에서 광학 밀도를 측정했다. 세포 생존율은 백분율로 표시하였다.
2.2.2. 포도당 흡수 분석
포도당 흡수 분석은 인슐린 저항성 HepG2(IR-HepG2) 세포주를 사용하여 분석되었다. IR-HepG2 세포주는 5% CO2에서 10% FBS 및 1% P&S와 함께 고글루코스 DMEM 배지에서 성장시켰다. ~80-90%의 confluences에 도달한 후, 세포를 수집하고 농도를 1 X 104 cells/mL로 조정하고 high glucose DMEM 배지에 용해시켰다. 100 μL/웰의 세포(1 X 104 cells/mL)를 96 웰 플레이트에 접종하고 24시간 동안 성장하도록 인큐베이션했다. 그 후, CS의 상이한 농도를 갖는 분획물 및 추출물을 상이한 농도로 16시간 동안 세포에 처리하였다. 그 후, SpectraMax®Plus Microplate Reader(Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 사용하여 포도당 섭취를 측정했다. 본 분석에서는 비-IR HepG2 세포를 양성 대조군으로 사용했다. 또한, IR-HepG2 세포에서 CS의 분획물 및 추출물의 세포 독성 예방 효과는 ethidium bromide(EB), acridine orange(AO), rhodamine 123(Rh123), propidium iodide(PI), 및 dichlorofluorescein diacetate(DCFH-DA)를 사용하여, 세포 사멸 단계, 미토콘드리아 막 손실, 핵 손상 및 ROS 생성의 측면에서 현미경 분석에 의해 조사되었다.
2.3. 분자 도킹
다양한 CS 분획물 및 추출물(EAF-CS, HF-CS, MF-CS)에서 확인된 파이토케미칼과, 당뇨병 관련 단백질(lysosomal acid-α-glucosidase (PDB: 5NN8) 및, human pancreatic α12 amylase (PDB: 5E0F)) 사이의 분자 상호작용은 인실리코 분자 도킹 실험을 통해 조사되었습니다. 리간드(phytochemicals) 구조는 ACD/ChemSketch를 사용하여 준비되었으며 그 에너지는 Chimera 1.15를 사용하여 최소화되었다. 5NN8 및 5E0F의 PDB는 RSCB(https://www.rcsb.org/)에서 다운로드 되었으며, 이전에 보고된 대로 수용체 준비가 수행되었다(Aispuro-Perez et al. 2020). 도킹은 Autodock Vina 1.1.2에서 수행되었으며, Discovery Studio 2021을 사용하여 결과를 조사했다.
2.4. 생체 내 연구
2.4.1. 동물 모델 실험
CS-EAF의 항당뇨 활성은 기관 윤리 위원회(KW-200819-5)의 윤리적 승인을 받아 춘천 강원대학교 실험동물센터에 구축된 streptozotocin(STZ) 유도 당뇨병 마우스 모델에서 테스트되었다. 마우스 모델 실험은 나라바이오텍(주)에서 구입한 8주령 수컷 ICR 마우스(30-31g)를 대상으로 수행하였다. 마우스를 22±2℃, 60% 습도 및 14/10시간 명암 주기에서 1주 동안 순응시켰다. 적응 기간 후 STZ(40 mg/kg/day)를 복강내 주사하여 5일 동안 당뇨병 마우스를 발달시켰다. 혈당 수치(BGL)는 간격의 24시간마다 그리고 BGL이 >250 mg/dl에 도달했을 때 측정되었다. 당뇨병 마우스를 T1(대조군), T2(STZ), T3(STZ+Metformin) 및 T4(EAF-CS 단독) 및 T5(STZ-EAF-CS)의 5개 그룹으로 나누었다(도 8). 급성 독성 분석에 근거하여 최적 농도의 EAF-CS(35 mg/kg/day)를 21일 동안 24시간 간격으로 마우스에 경구 투여했다. 그 후, 실험 쥐를 cervical decapitation으로 희생시키고 혈액학적 및 생화학 분석을 위해 cardiac puncture를 통해 혈액 샘플을 얻었고, H&E 염색 검사를 위해 주요 장기(간, 신장 및 췌장)를 수집했다.
3. 결과 및 논의
3.1. 식물 화합물 조성
세 가지 분획 모두의 식물 화합물 조성은 UHPLC-QTOF-MS/MS로 분석되었으며 결과는 표 1 및 도 1에 나와 있다.
| RT (min) | Componen t name |
Formula | m/z[M-H] | Mass err or(ppm) |
Response | Fragment ation (m/z) |
||
| MF-CS | HF-CS | EAF-CS | ||||||
| 1.20 | Phenylalanine | C9H11NO2 | 164.0718 | 0.7 | 4467 | 147.0454, 103.0578 | ||
| 1.36 | Syringic acid hexose | C15H20O10 | 359.0981 | -0.6 | 3658 | 178.0511, 182.0219, 197.0451 | ||
| 1.40 | Vanillic acid | C8H8O4 | 167.0350 | 0.2 | 4187 | 123.0459 | ||
| 1.41 | Dihydroxyphenyl alcohol O-glucoside | C14H20O8 | 315.1082 | -1.0 | 7815 | 1895 | 117462 | 153.0558 |
| 1.51 | Neochlorogenic acid | C16H18O9 | 353.0876 | -0.5 | 3501 | 373 | 3510 | 179.0347, 191.0560 |
| 1.59 | Protocatechuic acid | C7H6O4 | 153.0196 | 1.9 | 7469 | 37709 | 109.0301, 138.0321 | |
| 1.67 | Ferulic acid hexoside | C16H20O9 | 355.1035 | 0.1 | 3202 | 134.0380, 177.0192, 193.0502 | ||
| 1.72 | Caffeoyl glucopyranoside | C15H18O9 | 341.0880 | 0.5 | 3208 | 179.0348 | ||
| 1.76 | Tryptophan | C11H12N2O2 | 203.0823 | -1.6 | 10402 | 116.0516 | ||
| 1.90 | Coumaroylquinic acid | C16H18O8 | 337.0924 | -1.4 | 21060 | 37848 | 163.0401, 173.0456, 191.0559 | |
| 1.90 | Sinapyl alcohol | C11H14O4 | 209.0812 | -3.4 | 4062 | 179.0348 | ||
| 1.91 | Syringin | C17H24O9 | 371.1340 | -1.1 | 251795 | 7391 | 487679 | 179.0347, 209.0812 |
| 1.93 | Chlorogenic acid | C16H18O9 | 353.0873 | -1.4 | 43000 | 3959 | 106110 | 119.0512, 179.0348, 191.0559 |
| 2.09 | Hydroxycinnamic acid O-glucoside | C15H18O8 | 325.0928 | -0.3 | 6216 | 408 | 13284 | 119.0511, 163.0401 |
| 2.13 | Ferulic acid | C10H10O4 | 193.0508 | -1.3 | 209308 | 135.0452, 179.0349 | ||
| 2.22 | Coumaroyl hexose | C15H18O8 | 325.0925 | -1.1 | 6233 | 119.0511, 145.0299, 163.0400 | ||
| 2.34 | Ferulic acid hexoside | C15H18O8 | 355.1034 | -0.2 | 3957 | 5147 | 134.0380, 177.0192, 193.0502 | |
| 2.47 | Coumaroylquinic acid | C16H18O8 | 337.0926 | -0.9 | 24061 | 72160 | 119.0511, 163.0399, 173.0454 | |
| 2.57 | Coumaroylquinic acid | C16H18O8 | 337.0923 | -1.8 | 97710 | 6006 | 247406 | 119.0510, 163.0399, 173.0453 |
| 2.61 | Caffeic acid | C9H8O4 | 179.0354 | 2.5 | 149 | 135.0459 | ||
| 2.75 | Syringenin | C11H14O4 | 209.0813 | -3.0 | 10237 | 160.0167, 175.0398 | ||
| 2.87 | 3-Feruloylquinic acid | C17H20O9 | 367.1027 | -2.0 | 12080 | 191.0562, 193.0503 | ||
| 3.09 | Coumaroylquinic acid | C16H18O8 | 337.0923 | -1.9 | 15192 | 163.0399, 191.0558 | ||
| 3.23 | Coumaric acid | C9H8O3 | 163.0401 | 0.1 | 1734 | 6936 | 119.0511 | |
| 3.30 | Rutin | C27H30O16 | 609.1459 | -0.4 | 36701 | 2413 | 652281 | 300.0273 |
| 3.54 | Quercetin glucopyranoside | C21H20O12 | 463.0882 | 0.0 | 11834 | 166467 | 300.0274 | |
| 3.63 | kaempferol rhanmnosyl glucose | C27H30O15 | 593.1514 | 0.4 | 188890 | 284.0324 | ||
| 3.67 | Patuletin-3-O-glucoside | C22H22O13 | 493.0993 | 1.1 | 153990 | 315.0147, 330.0380 | ||
| 3.79 | Isorhamnetin rhamnosyl glucose | C28H32O16 | 623.1618 | 0.0 | 128615 | 299.0197, 314.0430 | ||
| 3.84 | nicotiflorin | C27H30O15 | 593.1510 | -0.3 | 24628 | 2554 | 588930 | 285.0396 |
| 3.97 | Isorhamnetin-3-O-B-rutinoside | C28H32O16 | 623.1619 | 0.2 | 43983 | 381933 | 300.0270, 314.0432 | |
| 4.23 | Isorhamnetin glucopyranoside | C22H22O12 | 477.1043 | 0.9 | 43104 | 2399 | 575924 | 299.0198, 314.0430 |
| 4.29 | Diosmetin rhamnosyl glucose | C28H32O15 | 607.1672 | 0.5 | 4781 | 14433 | 284.0326, 299.0557 | |
| 5.30 | Diosmetin-7-O-rutinoside (Diosmin) | C28H32O15 | 607.1667 | -0.2 | 15792 | 284.0326, 299.0557 | ||
| 5.86 | Linarin | C28H32O14 | 591.1714 | -0.1 | 251603 | 898599 | 1790763 | 268.0374, 283.0612 |
| 5.93 | Pectolinarigenin | C17H14O6 | 313.0716 | -0.6 | 125806 | 462551 | 777910 | 283.0256, 298.0482 |
| 5.93 | Pectolinarin | C29H34O15 | 621.1818 | 0.0 | 973446 | 2097430 | 2815706 | 283.0256, 298.0482, 313.0716 |
| 6.35 | Pectolinarigenin-O-glucoside | C23H24O11 | 475.1242 | -0.6 | 3388 | 3335 | 46062 | 283.0250, 298.0476, 313.0713 |
| 9.48 | Acacetin | C16H12O5 | 283.0613 | 0.5 | 2338 | 2133 | 268.0372 | |
| 12.13 | Stearidonic acid | C18H28O2 | 275.2011 | -1.9 | 11878 | |||
| 12.22 | (E,E)-9-Oxooctadeca-10,12-dienoic acid | C18H30O3 | 293.2116 | -2.1 | 141219 | 455487 | 277.2163 | |
| 13.00 | Palmitic acid | C16H32O2 | 255.2317 | 0.3 | 992 | |||
| 14.22 | Linolenic acid | C18H30O2 | 277.2182 | 3.1 | 16631 | 147801 | 104 | |
| 14.41 | n-Pentadecanal | C15H30O | 225.2223 | -1.7 | 20956 | 46707 | 4824 | |
| 14.96 | Linoleic acid | C18H32O2 | 279.2322 | -2.6 | 66594 | |||
디히드록시페닐알코올 O-글루코시드(RT: 1.41분), 네오클로로겐산(RT: 1.51분), 시린진(RT: 1.91분), 클로로겐산(RT: 1.93분), 히드록시신남산 O-글루코시드(RT: 2.09분), 쿠마로일퀸산(RT: 2.57분), 루틴(RT: 3.30분), 니코티플로린(RT: 3.84분), 이소르함네틴 글루코피라노사이드(RT: 4.23분), 리나린(RT: 5.86분), 펙토리나리 5.93분), 펙토리나린(RT: 5.93분), 펙토리나리게닌-O-글루코사이드(RT: 6.35분), 리놀렌산(RT: 14.22분) 및 n-펜타데카날(RT: 14.41분)은 세 분획 모두에서 나타났지만 syringic acid hexose (RT:1.36 min), vanillic acid (RT: 1.40 min), ferulic acid hexoside (RT: 1.67 min), caffeoyl glucopyranoside (RT:1.72 min), 시린지닌 (RT: 2.75 min), 3- 페룰로일퀸산(RT: 2.87분), 쿠마로일퀴닉산(RT: 3.09분), 캠페롤 람노실 글루코스(RT: 3.63분), 파툴레틴-3-O-글루코사이드(RT: 3.67분), 이소르함네틴 람노실 글루코스(9 RT: 3.67분)는 EAF-CS에서만 발견되었다.
한편, 추출물 중 EAF-CS는 syringin (area: 487679), rutin (area: 652281), nicotiflorin (area: 588930), isorhamnetin-3-O-B rutinoside (area: 381933), isorhamnetin glucopyranoside (area: 575924), linarin (area: 1790763), pectolinarigenin (777910), pectolinarin (area: 2815706)과 같이 면적면에서 높은 레벨의 화합물을 나타냈다.
3.2. 총 페놀 및 플라보노이드
페놀과 플라보노이드는 명백한 식물 성분이며 몇 가지 건강에 유익한 특성을 제공한다. 이러한 주요 식물 화학 물질(페놀 및 플라보노이드)의 구성은 항산화, 효소 억제 및 추출물의 항당뇨 활성을 포함한 생물학적 특성에 중요한 역할을 한다. 총 페놀릭(TPC) 및 플라보노이드 함량(TFC)과 같은 주요 식물 성분을 CS의 다른 분획물 및 추출물(EAF-CS, HF-CS, MF-CS)에서 평가하고 그 결과를 표 2에 제시했다.
| Solvent fractions | Phytoconstituents | Inhibition concentration (IC50:㎍/mL) | |||
| TPC (mg of TAE/g of extract) | TFC (mg of QE/g of extract) | DPPH scavenging | α-amylase | α-glucosidase | |
| HF-CS | 122.61±0.64a | 88.23±1.08a | 162.23±1.17c | 319.23±1.11b | 505.02±1.58c |
| EAF-CS | 236.72±2.25c | 137.15±1.42b | 75.23±2.06b | 149.14±0.70a | 184.25±0.21a |
| MF-CS | 191.87±1.05b | 109.23±2.22a | 45.14±1.04a | 292.84±1.44c | 254.26±1.67b |
결과는 EAF-CS에서 더 높은 TPC(236.72±2.25)가 발견되었음을 입증했다. 유사하게, TFC는 EAF-CS(137.15±1.42)에서 더 많이 발견되었고, HF-CS(88.23±1.08)에서 가장 적었다. EAF-CS에서 TPC와 TFC의 높은 농도는 실험에 사용된 용매의 극성과 관련이 있다.
3.3.
DPPH
소거 활성
DPPH 분석은 식물 추출물의 항산화 능력을 결정하는 데 널리 사용된다. CS의 3개 분획 모두 상당한 DPPH 소거능을 나타냈다(표 2). 이것은 이들 분획에서 항라디칼 제제의 존재와 H-공여 페놀 화합물이 더 높은 항산화 활성에 기인할 수 있다는 이전 연구에 따른 것이다. 이 연구는 또한 DPPH 소거 활성이 C. setidens의 잎과 뿌리 샘플에서 파생된 에틸 아세테이트 분획에서 더 높게 발견된 반면 n-Hexane 분획에서는 더 적은 것으로 보고된 이전 연구와 일치한다(Lee et al. 2008).
3.4. 효소 억제 활성
α-아밀라아제와 α-글루코시다아제는 탄수화물 대사에서 다당류를 단순당 또는 올리고당으로 가수분해하여 혈당 수치를 증가시킨다. 따라서 이러한 효소의 억제는 포도당의 위장 흡수를 감소시켜 결국 식후 혈당 수준을 감소시키고 당뇨병의 위험을 감소시킨다. 모든 분획은 유의하게 α-아밀라아제 및 α-글루코시다아제 억제 활성을 나타냈다(표 2). α-아밀라제 억제의 IC50은 HF-CS, EAF-CS 및 MF-CS에 대해 각각 319.23±1.11, 149.14±0.70 및 292.84±1.44였다. α-글루코시다아제 억제의 IC50 은 HF-CS, EAF-CS 및 MF-CS에 대해 각각 505.02±1.58, 184.25±0.21 및 254.26±1.67이었다. 전반적으로, 분획 중에서 EAF-CS가 낮은 IC50 농도로도 효소억제 활성을 나타내었다.
3.5. 세포독성 및 포도당 흡수
CS의 다른 분획의 세포독성 효과는 WST 분석에 의해 마우스 섬유아세포(NIH3T3) 및 간 간세포 암종(HepG 2) 세포주에서 테스트되었다. CS의 세 가지 용매 분획물 및 추출물은 모두 각 분획물 및 추출물의 25μg/mL까지 NIH3T3 세포에 대해 유의한 세포독성(>20%)을 나타내지 않았다(도 2A). 다양한 용매 분획물 및 추출물(25μg/mL)로 처리된 NIH3T3 세포의 AO/EB 염색에서 정상적인 형태 및, 손상되지 않은 온화한 녹색 세포가 관찰되었다(도 2B). 전반적으로, WST 세포독성 분석과 AO/EB 염색 분석은 CS에서 얻은 분획의 무독성을 확인했다(도 2A 및 B). 유사하게, 25μg/mL의 협력에서 이들 분획의 처리는 HepG2 세포에 대한 유의한 독성(>20)을 유발하지 않는 것을 WST 세포독성 분석에 의해 입증하였다.(도 3A). 또한, 이들 분획물 및 추출물의 처리는 용량 의존적으로 IR HepG2 세포에서 포도당 흡수를 유의하게 증가시키는 것으로 관찰되었다(도 3B). 추출물 중 EAF-CS(25μg/mL)는 다른 분획 처리된 세포에 비해 IR-HepG2 세포에서 포도당 흡수를 80% 증가시키는 더 높은 효율을 나타냈다. 또한, AO/EB 염색은 EAF-CS, HF-CS 및 MF-CS의 24시간 처리 후 건강하고 생존 가능한 IR-HepG2 세포를 보여주었으며, 이는 이들 분획의 무독성 효과를 나타낸다(도 3C). 유사하게, Rh123 염색 분석은 CS 유래 분획물 및 추출물(EAF-CS, HF-CS, 및 MF-CS) 중 하나를 처리한 HepG2 세포에서 강한 적색 형광 방출을 나타냈다(도 3D). PI 염색은 죽은 세포와 결합하는 것으로 알려져 있으며, DCFH-DA 염색 방출은 활성 산소 종 생성을 나타낸다. 본 연구에서 시험된 분획 중에서 MF-CS는 각각 PI 및 DCFH-DA 염색에 대한 형광 방출 반응에 의해 입증되는 중간 정도의 핵 손상 및 ROS 생성을 나타내었다(도 3E 및 F).
3.6. 활성 분획
EAF
-
CS의
항당뇨
효과
CS에서 분리된 총 3종의 분획물 및 추출물(EAF-CS, MF-CS 및 HF-CS)에 대해 항산화, 효소 억제, 세포독성 및 포도당 흡수 분석을 포함한 시험관 내 스크리닝 연구를 수행했다. 결과는 분획 중에서 EAF-CS가 다른 두 분획(HF-CS 및 MF-CS)과 비교하여 잠재적인 시험관내 생체 활성을 나타내어 생체내-항당뇨병 실험을 위해 선택되었음을 입증했다. 본 연구에서 당뇨병 마우스 모델은 췌장 β세포의 세포 손상을 유도하여 당뇨병을 유발하는 것으로 알려진 STZ의 복강 내 주사를 통해 개발되었다.
3.6.1.
STZ
유도 당뇨병 마우스에서 혈당 및 인슐린 수준에 대한
EAF
-
CS의
효과
인슐린 호르몬은 조직 세포와 당 생성을 조절하여 포도당을 흡수하거나 활용하고 혈당 수준을 유지함으로써 균형 잡힌 인슐린 수준을 유지하는 것이 당뇨병의 위험을 줄이는 궁극적인 접근법이다.
| Group | Treatments | Blood glucose (mg/dl) | Plasma insulin (ng/mL) | |
| Initial | Final | |||
| I | Control | 98.25±8.64a | 105.78±11.88a | 10.86±0.47c |
| II | STZ | 336.1±84.64c | 397.10±64.07e | 3.24±0.32a |
| III | STZ+ Metformin | 323.76±19.28b | 300.76±15.08c | 7.25±0.17b |
| IV | EAF-CS | 100.41±9.78a | 133.27±10.86b | 10.01±0.74c |
| V | STZ+ EAF-CS | 337.56±50.75c | 337.15±21.54d | 6.56±0.96a |
포도당 흡수 및 인슐린 분비 수준은 치료(그룹 I-V)와 치료 날짜(p<0.05) 사이에 유의하게 다양했다. EAF-CS의 경구 투여에 의해 상승된 인슐린을 통해 당뇨병 마우스에서 혈당 수준이 감소되었지만(그룹 II), 치료되지 않은 당뇨병 마우스(그룹 II)에 비해. 인슐린 분비 및 포도당 흡수 수준은 다른 치료(그룹 V) 및 처리되지 않은 당뇨병 마우스(그룹 I; 표 3)에 비해 메타포르민 처리 마우스(그룹 III)에서 더 높은 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과는 EAF-CS가 STZ를 파괴함으로써 항고지혈증 및 항당뇨 효과를 나타내는 것으로 나타났다. STZ는 인슐린의 생합성을 억제하고, 당화 헤모글로빈을 유발하고, 췌장 β세포의 조직 손상을 유도하고, 포도당 산화를 약화시키는 것으로 알려져 있다.
3.6.2.
STZ
유도 당뇨병 마우스에서 신체, 간, 신장 중량에 대한
EAF
-
CS의
효과
EAF-CS 처리가 당뇨병 마우스의 체중, 간 중량, 신장 중량 및 상대 간 중량에 미치는 영향을 메트포르민을 처리한 다른 비당뇨병 및 당뇨병 마우스 군과 비교하였다(표 4).
| Group | Treatments | Body weight (g) | Liver weight (g) | Kidney weight (g) | Relative liver weight (g/100 g BW) |
||
| Initial | Final | Weight gain | |||||
| I | Control | 31.94±3.7b | 33.85±2.0c | 1.06±0.1b | 1.52±0.3c | 0.65±0.1c | 4.49±0.7c |
| II | STZ | 30.67±2.3a | 27.41±2.0a | -3.26±0.1a | 1.34±0.4a | 0.64±0.2b | 4.88±0.2a |
| III | STZ+ Metformin | 30.58±2.8a | 32.07±2.6b | 1.49±0.1d | 1.41±0.6b | 0.63±0.9a | 4.39±0.5b |
| IV | EAF-CS | 31.82±0.02b | 33.09±1.0c | 1.27±0.3c | 1.50±0.9c | 0.65±0.1b | 4.53±0.9c |
| V | STZ+EAF-CS | 31.16±2.4b | 32.59±2.6b | 1.46±0.1d | 1.39±0.7b | 0.62±0.2a | 4.21±0.2d |
그 결과 체중, 체중 증가, 간 중량, 친절 체중이 실험군 사이에 유의한 차이를 보였다(I-V군, p<0.05). 최종 체중의 범위는 27.41±2.0g에서 33.85±2.0g이며 당뇨병이 없는 마우스(그룹 I)에서 더 높고 당뇨병 마우스(그룹 II)에서 더 낮은 것으로 나타났다. 이는 당뇨병 마우스가 비-당뇨병 마우스에 비해 상당한 체중 감소를 나타낸다는 것을 입증한다. 간 중량은 I군에서 낮고 신장 중량은 I군에서 더 높게 나타났다. 이러한 결과는 당뇨병의 유도가 간 체중 감소를 유발하는 반면 신장 중량 및 상대 간 중량을 증가시킴을 나타낸다(표 4). 그러나 체중, 간 중량, 신장 중량 및 상대 간 중량은 EAF-CS 또는 메트포르민의 경구 투여에 의해 회복되었다. 이것은 또한 식물 추출물 또는 메트포르민의 처리가 체질량 특성에서 당뇨병 마우스를 회복시키는 능력이 있다는 초기 연구에서 보고되었다(Lin et al. 2018b).
3.6.3.
STZ
유도 당뇨병 마우스에서
TC
, TG, HDL 및 LDL 수준에 대한
EAF
-
CS
의 효과
STZ 유도 당뇨병 마우스에 EAF-CS를 반복 경구 투여한 후 총 콜레스테롤(TC), 트리글리세리드(TG), 고밀도 지단백질(HDL) 및 저밀도 지단백질(LDL)의 수준을 측정하여 나타내었다(표 5)
| Group | Treatments | Total cholesterol (mg/dL) | Triglycerides (mg/dL) | HDL (mg/dL) | LDL (mg/dL) |
| I | Control | 67.94±9.82a | 147.03±13.48a | 32.37±2.05d | 22.08±1.21a |
| II | STZ | 100.16±10.63d | 255.94±19.42d | 20.85±2.06 b | 61.06±2.27e |
| III | STZ+ Metformin | 75.78±3.06b | 183.86±14.23b | 24.58±2.09a | 32.85±3.97c |
| IV | EAF-CS | 63.51±15.27a | 140.39±9.25a | 30.17±1.81c | 23.01±1.55b |
| V | STZ+ EAF-CS | 94.17±7.83c | 210.37±23.84c | 29.49±1.97c | 43.71±3.06d |
TC, TG, HDL, LDL의 수치는 실험군에 따라 유의한 차이가 있었다(p<0.05). TC 수준은 당뇨병 마우스 그룹(100.16±10.63 mg/dL)에서 더 높았고 EAF-CS 처리 비당뇨병 마우스 그룹(63.51±15.27 mg/dL)에서 더 낮은 것으로 나타났다. 유사하게, TG는 또한 당뇨병 마우스(255.94±19.42 mg/dL)에서 더 높았고 EAF-CS 처리된 비-당뇨병 마우스 그룹(140.39±9.25 mg/dL)에서 더 낮은 것으로 나타났다. 당뇨병은 지질 대사의 핵심 효소에 영향을 미치는 이상지질혈증 및 인슐린 상승 장애로 특징지어진다. STZ 유도 산화 스트레스 및 췌장 β세포 손상으로 인해 당뇨병 마우스에서 더 높은 수준의 TC 및 TG가 유도되었다. 그러나 metformin과 EAF-CS의 투여는 STZ 유도 산화 스트레스 관련 세포 손상을 방지하고 지질 대사를 조절하여 적절한 수준의 TG 및 TC를 유도하였다(표 5). HDL의 경우 그룹 I(32.37±2.05 mg/dL)에서 더 많이 관찰된 반면 그룹 II(20.85±2.06 mg/dL)에서 더 적게 관찰되었다. LDL 수치는 II군에서 최대값(61.06±2.27 mg/dL), I군에서 최소값(22.08±1.21 mg/dL)을 나타냈다.
3.6.4.
STZ
유도 당뇨병 마우스에서 주요 기관의 조직 병리학에 대한
EAF
-
CS
의 효과
신장, 췌장 및 간과 같은 주요 장기의 조직학적 변화는 당뇨병 상태와 유의한 상관관계가 있다. 따라서 본 연구에서는 hematoxylin과 eosin(H&E) 염색 실험을 통해 신장, 췌장 및 간의 세포 구조를 조사하였다(도 9, 도 10, 도 11). 5개 그룹 모두에서 장기를 수집하고 H&E 염색 분석을 위해 절단했다.
H&E 염색 결과는 도 4 A-C에 나와 있다. 그 결과 비당뇨병 쥐 그룹(그룹 I)에서 테스트한 모든 기관이 정상 또는 건강한 세포 구조 모양을 보인 반면, 당뇨병 쥐(그룹 II)는 비정상적인 기관 구조 및 간 염증 세포와 같은 명백한 조직학적 변화를 나타냈다(도 4A - 4C). STZ의 복강 내 주사는 주요 기관에서 산화 스트레스 매개 세포 손상을 유도하여 포도당 산화를 유도하고 인슐린을 손상시켜 마우스의 당뇨병 상태를 초래하는 것으로 알려져 있다. 그러나 EAF-CS(그룹 V)의 경구 투여는 STZ 유발 산화 스트레스를 방지하여 장기를 회복했다(도 4).
3.7. 분자 도킹 연구
CS의 다양한 분획물 및 추출물에서 확인된 화합물의 당뇨병 관련 효소 촉매 활성은 virtual tools구를 사용하여 분자 도킹 연구에서 테스트되었습니다. 분자 도킹 연구에 앞서 SwissADME에서 분석한 Lipinski의 role five를 적용하여 화합물의 약물 유사성을 테스트했다(Lipinski 2004). diosmetin rhamnosylglucose, glucosyringic acid, isorhamnetin glucopyranoside, isorhamnetin rhamnosyl glucose, kaempferol rhanmnosyl glucose, linarin, linaroside, patuletin-3-o-glucoside, pectolinarin, quercetin 등의 화합물을 제외한 나머지 화합물들은 Lipinski의 역할 5개 중 4개를 만족하였다(표 6).
| Compound name | Molecular weight (g/mol) < 500Da |
H-bond | mlLogP ( < 5 ) |
Molar Refractivity (40-130 |
Rank satisfactory | |
| Donors ( < 5 ) |
Acceptors ( < 10 ) |
|||||
| 3-Feruloylquinic acid | 368.34 | 5 | 9 | 0.92 | 87.97 | 4/5 |
| Acacetin | 284.26 | 2 | 5 | 2.56 | 78.46 | 5/5 |
| Caffeoyl glucopyranoside | 342.3 | 6 | 9 | 0.98 | 79.28 | 4/5 |
| Coumaric acid | 164.16 | 2 | 3 | 0.95 | 45.13 | 5/5 |
| Coumaroyl hexose | 326.3 | 5 | 8 | 1.57 | 77.11 | 4/5 |
| Coumaroylquinic acid | 338.31 | 5 | 8 | 0.87 | 81.48 | 4/5 |
| Diosmetin rhamnosyl glucose | 608.54 | 8 | 15 | 2.66 | 143.82 | 1/5 |
| Ferulic acid hexoside | 356.32 | 5 | 9 | 1.3 | 83.75 | 4/5 |
| Ferulic acid | 194.18 | 2 | 4 | 1.62 | 51.63 | 5/5 |
| Glucosyringic acid | 360.31 | 5 | 10 | 2.39 | 80.53 | 3/5 |
| hydroxytyrosol 1-O-glucopyranoside | 316.3 | 6 | 8 | 1.41 | 73.81 | 4/5 |
| Isorhamnetin glucopyranoside | 478.4 | 7 | 12 | 2.58 | 114.63 | 3/5 |
| Isorhamnetin rhamnosyl glucose | 624.54 | 9 | 16 | 2.65 | 145.85 | 1/5 |
| kaempferol rhanmnosyl glucose | 594.52 | 9 | 15 | 0.79 | 139.36 | 1/5 |
| Linarin | 592.55 | 7 | 14 | 2.17 | 141.8 | 1/5 |
| Linaroside | 476.43 | 5 | 11 | 3.32 | 117.07 | 3/5 |
| Linoleic acid | 280.45 | 1 | 2 | 4.13 | 89.46 | 5/5 |
| Linolenic acid | 278.43 | 1 | 2 | 3.36 | 88.99 | 5/5 |
| Methyl chlorogenate | 368.34 | 5 | 9 | 1.64 | 87.82 | 4/5 |
| Neochlorogenic acid | 354.31 | 6 | 9 | 0.56 | 83.5 | 4/5 |
| nicotphenol A | 392.4 | 4 | 8 | 2.33 | 100.53 | 4/5 |
| Palmitic acid | 256.42 | 1 | 2 | 3.85 | 80.8 | 5/5 |
| Patuletin-3-O-glucoside | 494.4 | 8 | 13 | 2 | 116.65 | 3/5 |
| Pectolinarigenin | 314.29 | 2 | 6 | 2.58 | 84.95 | 4/5 |
| Pectolinarin | 622.57 | 7 | 15 | 3.41 | 148.29 | 1/5 |
| Pentadecanal | 226.4 | 0 | 1 | 3.84 | 74.42 | 5/5 |
| Phenylalanine | 165.19 | 2 | 3 | 1.08 | 45.5 | 5/5 |
| Quercetin glucopyranoside | 464.38 | 8 | 12 | 0.94 | 110.16 | 3/5 |
| Rutin | 610.52 | 10 | 16 | 0.46 | 141.38 | 1/5 |
| Sinapyl alcohol | 210.23 | 2 | 4 | 2.19 | 57.51 | 5/5 |
| Syringenin | 210.23 | 2 | 4 | 2.19 | 57.51 | 5/5 |
| Syringin | 372.37 | 5 | 9 | 1.87 | 89.63 | 3/5 |
| Tryptophan | 204.23 | 3 | 3 | 0.99 | 57.36 | 5/5 |
| Vanillic Acid | 168.15 | 2 | 4 | 1.4 | 41.92 | 5/5 |
총 34개의 화합물이 Lipinski의 역할에 의해 약물 유사성에 대해 스크리닝되었지만, 22개 화합물만이 >4를 만족하여 분자 도킹 연구를 위해 선택되었습니다.
3.7.1.
In
silico
α-
amylase
촉매 활성
도킹 연구는 22개의 모든 화합물이 α-아밀라아제를 촉매하는 능력을 가지고 있음을 보여주었지만 3-feruloylquinic acid, caffeoyl glucopyranoside, coumaroyl hexose, coumaroylquinic acid, hydroxytyrosol 1-0-glucopyranoside 및 neochlorogenic acid와 같은 화합물은 높은 수의 Hbonding 및 binding affinity에 의해 α-amylase에 대한 강력한 촉매 활성을 보여주었다(표 7).
| Compound | α-Amylase | α-Glucosidase | ||||
| No. H Bonds | H Bond Interacting Amino Acids | Binding Affinity (kcal/mol) |
No. H Bonds | H Bond Interacting Amino Acids | Binding Affinity (kcal/mol |
|
| 3-Feruloylquinic acid | 4 | ARG252,ARG398, ASP402, GLY403 | -8.6 | 5 | Met 363, VAL 867, GLU 866 |
-7.8 |
| Acacetin | 3 | ASP197,HIS299, GLN63 | -8.6 | - | - | -7.1 |
| Caffeoyl glucopyranoside | 2 | GLN63, HIS201 | -8.1 | 5 | ARG608, GLU866, HIS584, TYR360 | -7.4 |
| Coumaric acid | 3 | GLN63, HIS299, THR163 | -6.4 | 3 | ALA749, GLU748, HIS708 | -6.2 |
| Coumaroyl hexose | 7 | ARG398,ARG421, GLY334, SER289, THR336 | -8.3 | 5 | ARG608, HIS584, LEU868, VAL867 |
-7.4 |
| Coumaroylquinic acid | 4 | ASP300 , GLN63, HIS201,HIS299 | -8.2 | 1 | ARG608 | -7.5 |
| Ferulic acid hexoside | 5 | ARG398,ARG421, GLY403,SER3 | -8.0 | 5 | ARG594, GLU869, LEU868, MET363, TYR360 | -7.9 |
| Ferulic acid | 2 | GLN63, HIS299 | -6.1 | 3 | HIS584, LEU868, MET363 | -6.1 |
| Hydroxytyrosol 1-O-glucopyranoside | 7 | ARG10,ARG398, ARG421,GLY9, GLY403 | -7.5 | 5 | ARG331, CYS127, TRP126 | -7.2 |
| Linoleic acid | - | - | -6.7 | 2 | ARG594, GLU866 | -6.4 |
| Linolenic acid | - | - | -6.6 | - | - | -9.7 |
| Methyl chlorogenate | 2 | HIS299,HIS305 | -8.4 | 6 | ARG594,ARG608, GLU866, HIS584, SER864 | -8.1 |
| Neochlorogenic acid | 8 | ARG398,ARG421, GLY334,GLY403, SER289,THR336 | -8.9 | 2 | ARG608, LEU868 | -7.9 |
| Nicotphenol A | 3 | GLU233,THR163, TRP59 | -7.8 | 3 | ARG608, MET363, VAL867 | -6.6 |
| Palmitic acid | - | - | -6.1 | - | - | -6.2 |
| Pectolinarigenin | - | - | -8.0 | 1 | ILE780 | -7.2 |
| Pentadecanal | 2 | ALA106,ASN105 | -6.4 | - | - | -6 |
| Phenylalanine | 4 | GLN63,THR163, TRP59 | -6.1 | 4 | ARG594, GLU866, VAL867 | -7.9 |
| Sinapyl alcohol | 3 | ARG252,ARG421 | -6.2 | 2 | ARG594, LEU868 | -9.2 |
| Syringenin | 3 | ARG252,ARG421 | -6.5 | - | - | -8.6 |
| Tryptophan | 1 | HIS299 | -6.7 | 1 | LYS697 | -6.6 |
| Vanillic Acid | 2 | ASP300,GLU233 | -5.9 | 1 | ARG594 | -7.6 |
3-feruloylquinic acid는 ARG252, ARG398, ASP402, GLY403과 같은 아미노산을 결합하여 α-amylase와 촉매적 상호작용에 대해 -8.6 kcal/mol의 결합 친화도를 보였다.
caffeoyl glucopyranoside와 α-amylase 촉매 반응은 -8.1 kcal/mol의 결합 친화력으로 수소 결합에 의한 GLN63과 HIS201의 상호작용을 통해 일어났다.
coumaroyl hexose는 ARG398, ARG421, GLY334, SER289, THR336과 같은 아미노산과 7개의 수소 결합 상호작용을 통해 α-아밀라아제와 -8.3 kcal/mol의 강한 결합 친화력을 가졌다.
coumaroylquinic acid와 α-amylase의 상호작용은 수소결합에 의한 ASP300, GLN63, HIS201, HIS299 등 아미노산 잔기와의 상호작용을 통해 -8.2 kcal/mol의 결합 친화도를 나타내었다.
hydroxytyrosol 1-O-glucopyranoside와 α-amylase 상호작용의 경우 -7.5 kcal/mol의 결합 친화력을 나타내었고 이 상호작용은 ARG398, ARG421, GLY334, GLY403, SER289, THR336의 아미노산 잔기와의 수소결합을 통해 입증되었다.
3.7.2.
In
silico
α- 글루코시다아제 촉매 활성
본 연구의 22개 화합물 연구 중 총 6개 화합물(3-feruloylquinic acid, ferulic acid hexoside, methyl chlorogenate, neochlorogenic acid, phenylalanine, sinapyl alcohol)은 친화도 및 수소 결합 상호작용으로 인하여 결합 측면에서 강력한 α-glucosidase 촉매 효율을 보였다(표 7).
효소는 화합물과 표적 효소 사이의 수소 결합 및 결합 친화력과 같은 촉매적 특성을 가지고 있다(p<0.05). 3-feruloylquinic acid 및 neochlorogenic acid와 같은 두 가지 화합물은 두 효소를 모두 촉매하는 강력한 능력을 보였다. 3-feruloylquinic acid는 -7.8 kcal/mol의 결합 친화도 점수로 Met 363, VAL 867 및 GLU 866의 아미노산 잔기를 통해 α-글루코시다아제와 잠재적인 상호작용을 나타냈다. ferulic acid hexoside와 α-glucosidase 간의 상호작용은 ARG594, GLU869, LEU868, MET363 및 TYR360의 아미노산 잔기를 통해 확립되었으며 결합 친화도 점수는 -7.9 kcal/mol였다. Methyl chlorogenate와 α-glucosidase 상호작용은 ARG594, ARG608, GLU866, HIS584, SER864의 아미노산 잔기와의 상호작용을 통해 -8.1 kcal/mol의 결합 친화도 값을 보였다. 네오클로로겐산은 -7.9 kcal/mol의 결합 친화도 값을 나타내어 α-글루코시다아제와의 강력한 상호작용을 입증했다. 페닐알라닌은 -7.9 kcal/mol의 결합 친화도로 ARG594, GLU866, VAL867의 아미노산 잔기에 의해 α-글루코시다아제와 촉매적 상호작용을 나타냈다. 유사하게, 시나필 알코올 및 α-글루코시다아제 상호작용은 도킹 친화도 점수가 -9.2 kcal/mol였으며, ARG594, LEU868의 아미노산 잔기와의 수소 결합 상호작용을 통해 확립되었다.
전반적으로 이러한 연구는 3-feruloylquinic acid, caffeoyl glucopyranoside, coumaroyl hexose, coumaroylquinic acid, ferulic acid hexoside, hydroxytyrosol 1-O-glucopyranoside, methyl chlorogenate, neochlorogenic acid, phenylalanine, sinapyl alcohol와 같은 화합물은 항당뇨병 약물의 추가 개발을 위한 표적 후보 분자가 될 수 있음을 입증한다.
4. 결론
요약하면, 이 작업은 HPLC/MS 및 STZ 유도 당뇨병 마우스 모델 실험에 의해 C. setidens의 세 가지 분획물 또는 추출물(EAF-CS, HF-CS, MF-CS)의 식물 화합물 조성 및 항당뇨 활성을 평가했다. 결과는 3개의 분획물 및 추출물 모두가 항산화 및 효소 억제 활성을 나타내어 시험관 내 포도당 흡수 분석을 위해 선택되었음을 나타낸다. 세 가지 분획 중에서 EAF-CS는 NIH3T3 및 HepG2 세포에 대한 세포독성을 방지하고 인슐린 저항성을 제거함으로써 IR-HepG2 세포가 포도당을 흡수하도록 유도하는데 HF-CS, MF-CS에 비해 더 높은 효율을 나타냈다. STZ 유도 당뇨병 동물 모델에서 EAF-CS의 항당뇨 활성을 평가하였다. EAF-CS의 반복적인 치료는 생화학적 및 조직학적 연구에 의해 입증된 주요 기관의 세포 손상을 방지함으로써 당뇨병 마우스의 주요 기관 및 지질 프로필 및 손상된 인슐린 수치를 회복시켰다. 분자 도킹 연구는 α-아밀라아제 및 α-글루코시다아제와의 강력한 촉매 활성을 기반으로 하는 후보 항당뇨 약물로서 두 가지 잠재적인 화합물(3-페룰로일퀸산 및 네오클로로겐산)을 나타냈다. 전반적으로 본 실험을 통하여 EAF-CS가 몇 가지 유효한 항당뇨병 분자를 합성하였음을 확인하였다.
본 발명에 따른 고려엉겅퀴 잎 발효추출분획물을 포함하는 항당뇨용 약학적 조성물은 일반 용매 추출물에 비해, 항당뇨 효과가 향상됨은 물론, 고려엉겅퀴의 새로운 사용 방법을 확립하여 소득 증진에 도움이 될 수 있을 것이다. 이에 본 발명은 고려엉겅퀴를 발효하고, 단일용매로 추출하고, 혼합 용매로 추출한 것을 층별로 분획하여 얻어지지는 신규한 약학 조성물로, 고려엉겅퀴 잎 발효추출분획물을 포함하는 항당뇨용 약학적 조성물을 개발하였음을 명시한다.
본 발명을 첨부된 도면과 함께 설명하였으나, 이는 본 발명의 요지를 포함하는 다양한 실시 형태 중의 하나의 실시 예에 불과하며, 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 하는 데에 그 목적이 있는 것으로, 본 발명은 상기 설명된 실시예에만 국한되는 것이 아님은 명확하다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 하기의 청구범위에 의해 해석되어야 하며, 본 발명의 요지를 벗어나지 않는 범위 내에서 변경, 치환, 대체 등에 의해 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리에 포함될 것이다. 또한, 도면의 일부 구성은 구성을 보다 명확하게 설명하기 위한 것으로 실제보다 과장되거나 축소되어 제공되는 것임을 명확히 한다.
(S10): 발효 단계
(S20): 건조분쇄 단계
(S30): 제1 추출단계
(S40): 제2 추출단계
(S50): 분획 단계
(S20): 건조분쇄 단계
(S30): 제1 추출단계
(S40): 제2 추출단계
(S50): 분획 단계
Claims (12)
- 고려엉겅퀴의 잎에 트리코델마 하지아눔 균주를 접종하고 발효하는 발효 단계(S10);
상기 발효 단계(S10)에서 발효된 고려엉겅퀴 잎을 건조하고 분쇄하여 고려엉겅퀴 잎 발효분말을 제조하는 건조분쇄 단계(S20);
상기 건조분쇄 단계(S20)에서 건조되고 분쇄된 고려엉겅퀴 잎 발효분말에 제1추출용매를 가해 제1 고려엉겅퀴 잎 발효추출물을 추출하는 제1 추출단계(S30);
상기 제1 추출단계(S30)에서 추출된 제1 고려엉겅퀴 잎 발효추출물에 제2추출용매를 가해 제2 고려엉겅퀴 잎 발효추출물을 추출하는 제2 추출단계(S40);
상기 제2 추출단계(S40)에서 추출된 제2 고려엉겅퀴 잎 발효추출물의 상층액을 취해 분별하는 분획 단계(S50)를 포함하는 것을 특징으로 하는 고려엉겅퀴 잎 발효추출분획물을 포함하는 항당뇨용 약학적 조성물의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 제1 추출단계(S30)는 고려엉겅퀴 잎 발효분말에 제1 추출용매를 가하고, 자기교반기를 이용해 500 ~ 700rpm교반하여 제 1고려엉겅퀴 잎 발효추출물을 제조하는 것을 특징으로 하는 고려엉겅퀴 잎 발효추출분획물을 포함하는 항당뇨용 약학적 조성물의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 제1 추출단계(S30)는 고려엉겅퀴 잎 발효분말에 제1 추출용매를 가하고, 자기교반기를 이용해 48 ~ 96시간 동안 교반하여 제 1고려엉겅퀴 잎 발효추출물을 제조하는 것을 특징으로 하는 고려엉겅퀴 잎 발효추출분획물을 포함하는 항당뇨용 약학적 조성물의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 제1 추출단계(S30)에서의 제1 추출용매는 메탄올인 것을 특징으로 하는 고려엉겅퀴 잎 발효추출분획물을 포함하는 항당뇨용 약학적 조성물의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 제2 추출단계(S40)에서의 제2 추출용매는 메탄올, 정제수 및 에틸 아세테이트를 5 : 3 : 7의 중량비로 혼합한 혼합용매인 것을 특징으로 하는 고려엉겅퀴 잎 발효추출분획물을 포함하는 항당뇨용 약학적 조성물의 제조방법. - 제5항에 있어서,
상기 분획 단계(S50)에서 메탄올과 정제수는 각각 중층액 및 하층액을 형성하고, 에틸 아세테이트는 상층액을 형성하며, 상층액만을 취해 분별하는 것을 특징으로 하는 고려엉겅퀴 잎 발효추출물을 포함하는 항당뇨용 약학적 조성물의 제조방법. - 트리코델마 하지아눔 균주를 접종하고 발효한 고려엉겅퀴의 잎을 건조하고 분쇄하여 형성된 고려엉겅퀴 잎 발효분말에; 제1추출용매를 가해 추출하여 제1 고려엉겅퀴 잎 발효추출물;을 형성하고, 제2추출용매를 가해 추출하여 제2 고려엉겅퀴 잎 발효추출물;을 형성하고, 분획하여 상층액을 취한 것을 특징으로 하는 고려엉겅퀴 잎 발효추출분획물을 포함하는 항당뇨용 약학적 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 제1 고려엉겅퀴 잎 발효추출물은, 고려엉겅퀴 잎 발효분말에 제1 추출용매를 가하고, 자기교반기를 이용해 500 ~ 700rpm의 속도로 교반하여 형성된 것을 특징으로 하는 고려엉겅퀴 잎 발효추출분획물을 포함하는 항당뇨용 약학적 조성물. - 제7항에 있어서,
상기 제1 고려엉겅퀴 잎 발효추출물은, 고려엉겅퀴 잎 발효분말에 제1 추출용매를 가하고, 자기교반기를 이용해 548 ~ 96시간 동안 교반하여 형성된 것을 특징으로 하는 고려엉겅퀴 잎 발효추출분획물을 포함하는 항당뇨용 약학적 조성물. - 제7항에 있어서,
상기 제1 추출용매는 메탄올인 것을 특징으로 하는 고려엉겅퀴 잎 발효추출분획물을 포함하는 항당뇨용 약학적 조성물. - 제7항에 있어서,
상기 제2 추출용매는 메탄올, 정제수 및 에틸 아세테이트를 5 : 3 : 7의 중량비로 혼합한 혼합용매인 것을 특징으로 하는 고려엉겅퀴 잎 발효추출분획물을 포함하는 항당뇨용 약학적 조성물. - 제11항에 있어서,
상기 메탄올과 정제수는 각각 중층액 및 하층액을 형성하고, 헥산 또는 에틸 아세테이트는 상층액을 형성하며, 상층액만을 취한 것을 특징으로 하는 고려엉겅퀴 잎 발효추출물을 포함하는 항당뇨용 약학적 조성물.
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