BRPI0620054A2 - extrato obtenìvel por extração de phaseolus so. com misturas de etanol e água, processo para a preparação deste, uso e composições dos mesmos - Google Patents
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Abstract
EXTRATO OBTENíVEL POR EXTRAçãO DE PHASEOLUS SP. COM MISTURAS DE ETANOL E áGUA, PROCESSO PARA A PREPARAçãO DESTE, USO E COMPOSIçõES DOS MESMOS. A presente invenção refere-se a extratos obteníveis por extração de Phaseolus sp. com misturas de etanol e água, distinguidos por um teor de inibidores de <244>-amiIase entre 1.000 e 1.600 USP/mg (título por HPLC entre 6 e 14% em peso) e um teor de fitoemaglutininas entre 8.000 e 30.000 HAU/g, e um processo para sua preparação.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "EXTRATO OBTENÍVEL POR EXTRAÇÃO DE PHASEOLUS SP. COM MISTURAS DE ETANOL E ÁGUA, PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DESTE, USO E COMPOSIÇÕES DOS MESMOS".
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a extratos obtidos a partir de se- mentes de plantas do gênero Phaseolus, e o processo para sua preparação.
Mais particularmente, a invenção refere-se a extratos de semen- tes de Phaseolus vulgaris, distinguidos por um teor de inibidores de a- amilase e fitoemaglutininas em proporções estabelecidas, que reduzem a absorção de glicose originada de amidos na dieta, e reduzem o apetite de- pois de administração repetida.
ANTECEDENTES DA TÉCNICA
Um inibidor de α-amilase (ocAI) é uma glicoproteína contida nas sementes de feijão-comum (Phaseolus vulgaris), que inibe a atividade enzi- mática de amilase de origem animal, e especialmente amilase humana, de uma maneira diferenciada dependente da espécie. Este inibidor, que foi puri- ficado pela primeira vez por Marshall e Lauda em 1974 (J. Biol. Chem. 250(20):8030-8037 (1975)), tem atraído interesse por causa dos efeitos que sua atividade inibidora de amilase pancreática pode exercer sobre a absor- ção intestinal de glicose (derivada da hidrólise enzimática de amido), e aci- ma de tudo, pela sua aplicação potencial na indústria dietética. Os carboidra- tos são uma fonte importante de calorias e contribuem para a síntese de gorduras em indivíduos predispostos à obesidade ou diabetes Tipo II. Na natureza, na evolução das espécies, a disponibilidade de alimentos para so- brevivência era intermitente, de modo que a capacidade de acumular ener- gia além da quantidade necessária para uso imediato era essencial. As célu- las adiposas, desenvolvidas em diferentes partes do corpo, estão entre os locais onde a energia é acumulada, de tal modo que ela esteja facilmente disponível quando o corpo a necessita. Este sistema fisiológico, orquestrado por secreções endócrinas e neuronais, permite que os seres humanos so- brevivam por longos períodos, mesmo na ausência de alimento. Entretanto, no caso de alimento abundante, o estilo de vida sedentário e razões genéti- cas associadas a estilos de vida de países industrializados, o sistema au- menta descontroladamente os depósitos de energia adiposa com conse- qüências adversas, tais como imperfeições cosméticas, e em seguida, uma sobrecarga do sistema cardiocirculatório. Um dos principais problemas é a obesidade, que atingiu níveis altos em alguns países, tal como nos Estados Unidos da América. A obesidade é a principal causa de doença cardiovascu- lar, hipertensão e diabetes. O excesso de peso, que é comum entre homens e também mulheres, faz com que o indivíduo coma quantidades cada vez maiores de comida, e o resultado é uma deterioração da saúde. Um excesso de glicose no sangue leva a um aumento em depósitos de energia, e a dis- ponibilidade de substâncias que reduzem a absorção de glicose é muito im- 1,1 portante.
A demanda mundial por substâncias contra a obesidade levou à pesquisa e estudo de alimentos que contrabalançam a acumulação progres- siva do peso corporal.
Os inibidores de α-amilase foram identificados há muito tempo em diferentes legumes e no milho, e ensaios clínicos específicos foram con- duzidos nos últimos anos, com resultados dúbios. Dependendo do processo de preparação usado para a concentração e isolamento desses inibidores, os resultados foram contraditórios, pois muitas preparações comerciais de- monstraram falta de atividade eficaz in vivo. De acordo com os primeiros estudos de Layer, Carlson e Di Magno (Gastroenterology 88(6):1895-1902 (1985)), este problema deve-se aparentemente ao alto grau de diluição do inibidor em preparações altamente impuras; de fato, as preparações de ini- bidor purificado comprovam ser ativas sobre a α-amilase quando são intro- duzidas diretamente dentro do lúmen intestinal.
Os processos fragmentários descritos na literatura para a prepa- ração de inibidores de α-amilase envolvem a extração com tampão de fosfa- to e a insolubilização de proteínas com sulfato de amônio, e não proporcio- nam qualquer seletividade. Os extratos obtidos contêm altas concentrações de fitoemaglutininas, e devem ser diluídos para obter extratos com um nível aceitável de toxidez. Além do aspecto biológico, os processos conhecidos incluem algumas etapas que tornam difícil preparar um produto que é ativo e também seguro. Os problemas que advêm durante a extração com tampões de diferentes intensidades iônicas e pH devem-se à alta concentração de contaminantes protéicos e de polissacarídeos, que os tornam altamente vis- cosos, levando a problemas de baixa capacidade de filtração e tempos mais longos de processamento. Como elas são extrações aquosas, há também um alto risco de contaminação microbiana do extrato protéico, que é difícil de controlar, especialmente no caso de preparações altamente viscosas. Todas estas condições levam a uma perda de produto e tornam difícil obter extratos finais com um baixo teor de fitoemaglutininas e a correspondente padronização de multicomponentes. Vários processos foram usados para solucionar o problema de limitar fitoemaglutininas, incluindo tratamentos térmicos, que levam à degradação não apenas de fitoemaglutininas, mas também de inibidores de α-amilase, com o resultado de que os produtos ob- tidos são parcamente ativos. Na prática, os produtos existentes no mercado têm um teor muito baixo de inibidores de α-amilase. Outros produtos que são enriquecidos demais em inibidores de α-amilase causam problemas de- sagradáveis de flatulência quando administrados em doses grandes.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Os produtos de acordo com a invenção são preparados por ex- tração com um meio aquoso ou hidroetanólico e precipitação com misturas apropriadas de etanol e água.
Descobriu-se surpreendentemente que o uso de misturas hidroetanó- licas em extratos aquosos adequadamente concentrados de feijão-comum produz extratos enriquecidos com um teor de inibidores de α-amilase, tendo uma atividade entre 1.000 e 1.600 USP/mg (título por HPLC entre 6 e 14% em peso) e um teor de fitoemaglutininas entre 8.000 e 30.000 HAU/g, de tal modo que eles possam ser formulados em produtos para uso dietético em doses suficientemente baixas, para obter o resultado desejado. Além desta vantagem importante, o processo da invenção produz uma redução significa- tiva na contagem microbiana. Outra vantagem considerável é a possibilidade de obter um produto final enriquecido em inibidor de α-amilase, com propor- ções definidas de fitoemaglutininas.
O processo da invenção compreende a extração da biomassa com tampões que têm um pH na faixa entre 3 e 6,5, de preferência pH 3,5- 5,5, e ainda mais preferivelmente pH 4, em temperaturas entre 2 e 25 ºC, de preferência entre 4 e 18 ºC, e a subseqüente separação do extrato da bio- massa por centrifugação.
Os tampões apropriados para a extração são tipicamente os tampões de fosfato, citrato ou acetato ou tampões de aminoácidos dicarboxí- licos, de preferência tampão de fosfato ou citrato. Misturas de água/álcool tamponadas também podem ser usadas como solvente de extração.
Dependendo dos extratores usados e do ciclo de extração, são 1,1 usados 5 a 20 volumes de tampão por parte de fármaco, de preferência ??- ? 2,5 partes, e a mistura é agitada por 1-4 horas, de preferência 2 horas; a biomassa pode ser extraída adicionalmente mais três vezes com uma quan- tidade apropriada de tampão, e em qualquer caso até que seu teor de inibi- dor de a-amilase e fitoemaglutininas seja exaurido.
Os extratos são combinados são clarificados por filtração ou centrifugação, e concentrados sob vácuo em uma temperatura entre 25 ºC e 35 ºC, de preferência 30 ºC, ou por uItrafiItração (corte em 10.000 Da) até um volume correspondente a aproximadamente 10% do peso do extrato de- pois da centrifugação.
O extrato aquoso concentrado é então precipitado com etanol adicionado até uma concentração final entre 60 e 70% em volume, de prefe- rência 65% em volume, operando em uma temperatura entre 18 ºC e 30 ºC, e de preferência entre 20 ºC e 25 ºC.
O precipitado obtido pode ser centrifugado e/ou filtrado, redissol- vido em água desmineralizada e precipitado novamente em etanol a 60% para reduzir a parte de solução salina. Alternativamente, ele pode ser diafil- trado através de uma membrana com um corte de 10.000 Da. O sedimento da precipitação, que constitui o extrato de acordo com a invenção, é secado.
Caso estes processos sejam usados, pode ser obtido um extrato com as seguintes características: - título por HPLC: > 6% < 14% em peso
- atividade inibitória de α-amilase: > 1.000 < 1.600 USP/mg
- atividade hemaglutinante: > 8.000 < 30.00 HAU/g
A eficácia dos extratos foi comprovada em ratos tratados com doses de 200 e 400 mg/kg por dia, com acesso livre ao alimento, consistindo em uma dieta especial enriquecida em amido. Durante o tratamento, os ex- tratos de acordo com a invenção reduzem significativamente o consumo de alimento, enquanto que o consumo de água permanece inalterado.
O produto de acordo com a invenção é perfeitamente tolerado, e podem ser incorporados em formulações farmacêuticas ou dietéticas em doses na faixa entre 50 e 1.000 mg, para serem tomadas nas principais re- feições. O extrato pode ser incorporado em formas bebíveis ou similares, para serem tomadas como supressores do apetite.
Os exemplos abaixo ilustram a preparação e as vantagens da invenção.
Exemplo 1
Preparação de um Extrato de Feijão-comum Enriquecido em Inibidor de a- Amilase por Extração com Tampão de Citrato e Precipitação com Etanol
Uma suspensão de 150 g de farinha de feijão-comum em 1,5 L de ácido cítrico a 5,75 g/L foi agitada por 3 horas a +4 °C.
A suspensão foi centrifugada, e o centrifugado aquoso foi con- centrado 7,5 vezes (resíduo seco, 15,0% em peso). O concentrado foi diluí- do com etanol a 95% até uma concentração de 65% de etanol, para obter um precipitado que foi recuperado por centrifugação a +22 °C. O sólido cole- tado foi secado sob vácuo em uma temperatura abaixo de 50 °C. O produto obtido (rendimento de 2,36%) tem uma atividade inibitória de α-amilase de 1.050 U/mg, uma atividade hemaglutinante de 9.000 HAU/g e um título por HPLC de 7,3% em peso).
Exemplo 2
Preparação de um Extrato de Feijão-comum Enriquecido em Inibidor de a- Amilase por Extração com Tampão de Citrato e Precipitação com Etanol
Uma suspensão de 150 g de farinha de feijão-comum em 1,5 L de ácido cítrico a 5,75 g/L foi agitada por 2 horas a +22°C.
A suspensão foi centrifugada, e o centrifugado aquoso foi con- centrado 10,5 vezes (resíduo seco, 17,1% em peso). O concentrado foi dilu- ído com etanol a 95% até uma concentração de 65% de etanol, para obter um precipitado que foi recuperado por centrifugação a +22 0C. O sólido cole- tado foi secado sob vácuo em uma temperatura abaixo de 50 0C. O produto obtido (rendimento de 3,5%) tem uma atividade inibitória de α-amilase de 1.600 U/mg, uma atividade hemaglutinante de 18.600 HAU/g e um título por HPLC de 10,0% em peso). Exemplo 3
Preparação de um Extrato de Feijão-comum Enriquecido em Inibidor de a- u Amilase por Extração Dupla com Solução de Ácido Cítrico em Água/Etanol (30% de Etanol) e Precipitação com Etanol
Uma suspensão de 100 g de farinha de feijão-comum em 1,0 L de uma mistura 70:30 de água e etanol, contendo ácido cítrico a 4,6 g/L, foi agitada por 2 horas a +22 0C.
A suspensão foi centrifugada, a fase líquida límpida foi descarta- da, e o sedimento foi submetido a um novo ciclo de extração com 750 mL de água. A fase líquida da segunda extração foi combinada com a primeira, e concentrada 4,3 vezes (resíduo seco: 4,78% em peso). O concentrado foi diluído com etanol a 95% até uma concentração de 70% de etanol, para ob- ter precipitado que foi recuperado por centrifugação a +22 0C. O sólido cole- tado foi secado sob vácuo em uma temperatura abaixo de 50 0C. O produto obtido (rendimento de 0,88%) tem uma atividade inibitória de α-amilase de 1.570 U/mg, uma atividade hemaglutinante de 27.000 HAU/g e um título por HPLC de 13,6% em peso).
Claims (5)
1. Extrato obtenível por extração de Phaseolus sp. com misturas de etanol e água, caracterizado pelo fato de que tem um teor de inibidor de α-amilase entre 1.000 e 1.600 USP/mg (título por HPLC entre 6 e 14% em peso) e um teor de fitoemaglutininas entre 8.000 e 30.000 HAU/g.
2. Processo para a preparação do extrato como definido na rei- vindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: Extração de Phaseolus sp. com tampões aquosos que têm um pH na faixa entre 3 e 6,5, e subseqüente separação do extrato da biomassa, que pode ser extraída adicionalmente com o tampão, caso necessário, até que os inibidores de cx-amilase e as fitoemaglutininas sejam exauridos; Filtração ou centrifugação dos extratos combinados, e concen- tração até um volume correspondente a aproximadamente 10% do peso do extrato depois da centrifugação; Precipitação diferencial do extrato aquoso concentrado com eta- nol diluído, em uma concentração final de álcool entre 60 e 70% em volume; Separação do precipitado e reprecipitação a partir de água des- mineralizada com etanol a 60%, ou diafiltração através de uma membrana com corte em 10.000 Da, e secagem do resíduo da precipitação.
3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que são usados tampões de fosfato, citrato ou acetato, tampões de aminoácidos dicarboxílicos ou soluções de água/álcool tamponadas.
4. Uso dos extratos como definido na reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de ser para preparar supressores do apetite.
5. Composições, caracterizadas pelo fato de que contêm os ex- tratos como definidos na reivindicação 1.
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