KR20080080127A

KR20080080127A - 파세러스 불가리스 추출물, 그 용도 및 이를 함유하는배합물

Info

Publication number: KR20080080127A
Application number: KR1020087014705A
Authority: KR
Inventors: 데이빗 베를란다; 마르코 베르타니; 에지오 봄버델리; 파비오 돈젤리; 안드레아 가르디; 체자레 폰존
Original assignee: 인데나 에스피아
Priority date: 2005-12-22
Filing date: 2006-12-13
Publication date: 2008-09-02
Also published as: NO346419B1; AU2006328983A1; WO2007071334A2; NO20082729L; CN101340923A; ITMI20052450A1; ES2813929T3; RU2008124974A; BRPI0620054A2; CA2634345A1; PT1962877T; HK1127995A1; RU2426552C2; WO2007071334A3; US20170333508A1; DK1962877T3; US11241470B2; CA2634345C; IL192292A; CN101340923B

Abstract

본 발명은 파세러스 에스피.(Phaseolus sp .)로부터 에탄올과 물의 혼합물로 추출하여 수득가능하고, 1,000 내지 1,600 USP/mg 범위내의 α-아밀라아제 억제제 함량 (HPLC 적정량: 6 내지 14% w/w) 및 8,000 내지 30,000 HAU/g 범위내의 피토헤마글루티닌(phytohaemagglutinin) 함량에 의해 특징지어지는, 추출물 및 그 제조방법을 제공한다.

파세러스 에스피, 아밀라아제, 피토네마글루티닌

Description

파세러스 불가리스 추출물, 그 용도 및 이를 함유하는 배합물 {PHASEOLUS VULGARIS EXTRACTS, THEIR USE, AND FORMULATIONS CONTAINING THEM}

본 발명은 파세러스(Phaseolus) 속 식물의 종자로부터 수득되는 추출물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로, 본 발명은 건식으로 생성되는 글루코오스의 흡수를 저감시키고, 반복 투여후 식욕을 저감시키는 설정 비로 α-아밀라아제 억제제와 피토헤마글리티닌 함량으로 특징지워지는 파세러스 불가리스 종자 추출물에 관한 것이다.

α-아밀라아제 억제제 (AI)는 차별화되고, 종-의존 방식으로 동물기관의 아밀라이제, 특히 인간 아밀라아제의 효소활성을 억제하는 강낭콩(파세러스 불가리스)의 종자내에 함유된 당단백질이다. 이들 억제제는, 1974년경 Marshall and Lauda에 의해 최초로 정제된 것으로(J. Biol. Chem., 250 (20), 8030-8037, 1975), 그 췌장 아밀라아제 억제 활성은 (전분의 효소 가수분해로부터 유래된) 글루코오스의 장내 흡수로 발현될 수 있는 효과분 아니라 무엇보다도 다이어트 산업내 잠재력인 적용처이므로 매력적이다. 탄수화물은 열량을 내는 중요한 공급원이고, 비만 혹은 2형 당뇨병에 걸리기 쉬운 개인내에서 지방의 합성에 기여한다. 자연적으로, 종의 진화에 있어, 생존을 위한 식량의 입수가능성은 간헐적이었고, 따라서 중간 사 용시 필요한 것보다 과량의 에너지를 축적시키는 능력이 필요시되었다. 신체의 다른 부분내에서 발달된 지방세포는 에너지가 축적되는 장소에 있어서 신체가 필요로 할 때 쉽게 이용케한다. 이같은 생리시스템은 내분비 및 신경 분비에 의해 조직화되어 식량부재시에도 인체가 장시간 생존케한다. 그러나, 식량이 풍부한 경우에도, 줄곧 앉아있는 생활방식과 산업화된 국가의 라이프스타일과 연관된 유전적 요인으로 인하여, 상기 시스템은 악 결과를 낳는 미적 결합과 같은 지방에너지를 조절불가능하게 증가시키고: 이어서 심장혈관계의 과부하를 낳는다. 주된 문제중 일종은 비만으로서, 이는 미국과 같은 몇몇 국가에서 높은 레벨에 도달해있다. 비만은 심장혈관계 질환, 고혈압 및 당뇨병의 주된 원인이다. 남성 및 여성 모두에서 통상적으로 가지고 있는 과체중은 식품의 과량을 섭취하게끔 하고, 그 결과 건강을 해치게 된다. 과다한 혈당은 에너지 축적 증가를 유발하므로, 당 흡수를 저감시키는 인자의 이용가능성은 매우 중요한 것이다.

항-비만 물질의 세계적인 수요는 체중 축적을 방해하는 식품에 대한 관찰 및 연구를 이끌었다.

α-아밀라아제 억제제는 오랫동안 다른 콩과식물 및 옥수수내에서 식별되어 왔고, 특정 임상 실험이 지난 몇 년간 수행되어 왔으며, 혼합된 결과를 낳았다. 이들 억제제의 농축 및 분리에 사용된 제조공정에 따라, 결과는 많은 상업적 제조물이 생체내에서 부족한 유효활성을 증명함에 따라 상반되었다. Layer, Carlson 및 Di Magno의 일차 연구(Gastroenterology, 88(6): 1895, 1902, 1985)에 따르면, 이같은 문제는 고순도 제조물내에서 억제제의 고도 희석으로 인한 것으로; 실제로, 정제된 억제제 제조물은 장내 내강(lumen)내로 직접 유도될 때 α-아밀라아제상에서 활성있는 것으로 판명되었다.

α-아밀라아제 억제제 제조를 위해 문헌에 기술된 단편적 공정에는 포스페이트 완충액으로 추출하는 공정과 단백질을 암모늄 설페이트로 단백질을 insolubilisation하는 공정을 포함할 뿐 어떠한 선택성도 제공하지 않는다. 이렇게 하여 얻어진 추출물은 고농도의 피토해마글루티닌을 포함하므로 수용가능한 레벨의 독성을 갖는 추출물을 수득하기 위하여는 희석시켜야만 한다. 생물학적 견지와는 별도로, 공지된 공정들은 활성 및 안정성을 모두 갖는 생성물을 제조하기 어려운 몇몇 단계를 포함하게 된다. 다른 이온강도 및 pH로된 완충액으로 추출하는 동안 일어나는 이같은 문제점은 고농도의 단백질과 다당류 오염균으로 말미암은 것으로, 이는 매우 점성이 높게 만들어 낮은 여과력과 장시간의 가공 시간의 문제를 유발하게 된다. 또한 수성 추출이므로 단백질 추출물의 세균 오염에 대한 위험이 매우 높게 되므로, 특히 매우 점성있게 제조시 제어하기 어려운 문제가 있다. 모든 이같은 조건들은 생성물의 손실로 이어지고 낮은 피토해마글루티닌 적정량 및 이에 상응하는 다성분 표준화(standardisation)를 갖는 최종 추출물을 얻기 어렵다. 다수의 공정들이 열처리를 포함한 피토해마글루티닌을 제한하는 문제를 풀기 위해 사용되어 왔고, 그 결과 피토해마글루티닌뿐 아니라 α-아밀라아제 억제제까지 붕괴하기에 이르러 얻어진 생성물은 간신히 활성을 갖는 정도가 되었다. 실제로, 시판되는 생성물들은 매우 낮은 AI 함량을 갖는다. α-아밀라아제 억제제내에서 매우 풍부한 다른 생성물은 다량으로 투여시 받아들이기 힘든 문제를 유발할 수 있다.

본 발명에 따른 생성물은 수성 혹은 수에탄올(hydroethanolic) 매질로 추출하고 에탄올과 물의 적절한 혼합물로 침전시켜 제조되는 것을 일 특징으로 한다.

강낭콩의 적절하게 농축된 수성 추출물에 대하여 수에탄올 혼합물을 사용함으로써 1,000 내지 1,600 USP/mg 범위내의 α-아밀라아제 억제제 함량 (HPLC 적정량: 6 내지 14% w/w) 및 8,000 내지 30,000 HAU/g 범위내의 피토헤마글루티닌(phytohaemagglutinin) 함량을 갖는 풍부한 추출물을 생성하는 것은 놀라운 것으로, 그 결과 원하는 결과를 얻기 위하여 다이어트용 생성물내에 현저하게 저감된 투여량으로 배합될 수 있다. 이같은 주된 잇점에 부가하여, 본 발명에 의한 공정은 미생물 계수에 있어서도 현저한 저감을 낳는다. 추가 고려가능한 잇점으로는 피토해마글루티닌 비로 정의되는 (AI) 억제제가 풍부한 최종 생성물을 수득할 수 있다는데 있다.

본 발명의 공정은 pH 3 내지 6.5, 바람직하게는 pH 3.5 내지 5.5, 보다 바람직하게는 pH 4를 갖는 완충액으로 2 내지 25°C, 바람직하게는 4 내지 18°C의 온도에서 바이오매스를 추출하고, 이어서 원심분리에 의해 바이오매스로부터 추출물을 분리하는 것을 일 특징으로 한다.

상기 추출을 위한 적절한 완충액으로는 포스페이트, 시트레이트 혹은 아세테이트 완충액 혹은 디카복시 아미노산 완충액이 통상 사용되며, 바람직하게는 포스페이트 혹은 시트레이트 완충액이 사용될 수 있다. 완충된 물-알코올 혼합물 또한 추출 용매로 사용될 수 있다.

사용된 추출기 혹은 추출 사이클에 따라, 약제 1부, 바람직하게는 약제 10 내지 12.5부당 완충액 5 내지 20 부피가 사용되며, 상기 혼합물은 1 내지 4시간동안, 바람직하게는 2시간동안 교반되고; 바이오매스는 적절한 양의 완충액으로 추가로 3회 더 추출될 수 있고, 어떠한 경우에는 α-아밀라아제 억제제 및 피토해마글루티닌 함량이 고갈될 때까지 추출될 수도 있다.

혼합된 추출물은 여과 혹은 원심분리에 의해 clarify하고 진공하에 25 내지 35°C, 바람직하게는 30°C의 온도에서 농축하거나, 혹은 원심분리후 추출물의 중량이 대략 10%에 상응하는 부피까지 정용추출(ultrafiltration) (10,000 Da 컷오프)한다.

그런 다음 농축된 수성 추출물은 최종 농도 60 내지 70% v/v, 바람직하게는 65% v/v로 첨가된 에탄올로 18 내지 30°C, 바람직하게는 20 내지 25°C하에 침전된다.

얻어진 침전물은 원심분리 및/또는 여과할 수 있고, 탈염수로 재용해시키고 60% 에탄올내에서 재침전시켜 염수 부분을 저감시킬 수 있다. 혹은 10,000 Da 컷오프를 갖는 막을 통해 정용여과시킬 수도 있다. 본 발명에 의한 추출물을 구성하는 침전 앙금은 건조된다.

이들 공정이 사용되었다면, 다음과 같은 특성을 갖는 추출물이 얻어질 것이다:

- HPLC 적정량: 6% 14% w/w

- α-아밀라아제 억제 활성값: 1,000 내지 1,600 USP/mg

- 해마글루틴화 활성값: 8,000 내지 30,000 HAU/g

상기 추출물의 효능은 특정 전분-풍부한 식이를 포함하는 식량에 대한 자유로운 접근과 함께 상기 추출물을 1일 200 내지 400 mg/Kg의 투여량으로 랫트에 처치하여 증명하였다. 본 발명에 따라 얻어진 추출물의 처치도중, 식품 소비가 현저하게 저감된 반면, 물 흡수량은 변함없었다.

본 발명에 의해 생성물은 완벽하게 효과적이었으며, 50 내지 1,000 mg의 투여량 범위에서 주된 식사로서 약제학적 혹은 다이어트 배합물내로 편입될 수 있다. 상기 추출물은 식욕 억제제로서 음료 형태로 편입될 수도 있다.

하기 실시예는 본 발명의 준비 및 잇점등을 예시하기 위한 것이다.

실시예 1: 시트르산 완충액으로 추출하고 에탄올로 침전시켜 얻어지는 AI 가 풍부한 강낭콩 추출물의 제조.

시트르산 5.75 g/L의 1.5 L 내에 강낭콩 분말 150g의 현탁액을 +4°C에서 3시간동안 교반시켰다.

상기 현탁액을 원심분리하고, 수성 원심분리물을 7.5배까지(건조 잔류물: 15.0% w/w) 농축시켰다. 상기 농축물을 95% 에탄올로부터 65% 에탄올의 농도까지 희석시켜 +22°C에서 원심분리에 의해 회수되는 침전물을 수득하였다. 수집된 고형 분을 진공하에 50°C를 넘지않는 온도로 건조시켰다. 수득된 생산물(수득율 2.36%)는 α-아밀라아제 억제 활성값 1,050 U/mg, 해마글루틴화 활성값 9,000 HAU/g, 및 HPLC 적정량 7.3% w/w을 갖는다.

실시예 2: 시트르산 완충액으로 추출하고 에탄올로 침전시켜 얻어진 AI 가 풍부한 강낭콩 추출물의 제조 2.

시트르산 5.75 g/L의 1.5 L 내에 강낭콩 분말 150g의 현탁액을 +22°C에서 2시간동안 교반시켰다.

상기 현탁액을 원심분리하고, 수성 원심분리물을 10.5배까지(건조 잔류물: 17.1% w/w) 농축시켰다. 상기 농축물을 95% 에탄올로부터 65% 에탄올의 농도까지 희석시켜 +22°C에서 원심분리에 의해 회수되는 침전물을 수득하였다. 수집된 고형분을 진공하에 50°C를 넘지않는 온도로 건조시켰다. 수득된 생산물(수득율 3.5%)는 α-아밀라아제 억제 활성값 1,600 U/mg, 해마글루틴화 활성값 18,600 HAU/g, 및 HPLC 적정량 10.0% w/w을 갖는다.

실시예 3: 물-알코올 용액(30% 에탄올)로 2회 추출하고 에탄올로 침전시켜 얻어진 AI 가 풍부한 강낭콩 추출물의 제조.

시트르산 4.6 g/L을 포함하고, 물과 에탄올 70:30의 혼합물 1.0 L 내에서 강낭콩 분말 100g의 현탁액을 +22°C에서 2시간동안 교반시켰다.

상기 현탁액을 원심분리하고, 맑은 액체상은 버리고, 침전물에 물 750ml로 새로운 추출 사이클을 부여하였다. 2차 추출의 액체상을 1차 추출물에 혼합하고 4.3배까지(건조 잔류물: 4.78% w/w) 농축시켰다. 상기 농축물을 95% 에탄올로부터 70%의 에탄올 농도까지 희석시켜 +22°C에서 원심분리에 의해 회수되는 침전물을 수득하였다. 수집된 고형분을 진공하에 50°C를 넘지않는 온도로 건조시켰다. 수득된 생산물(수득율 0.88%)는 α-아밀라아제 억제 활성값 1,570 U/mg, 해마글루틴화 활성값 27,000 HAU/g, 및 HPLC 적정량 13.6% w/w을 갖는다.

상기 추출물들의 효능은 특정 전분-풍부한 식이를 포함하는 식량에 대한 자유로운 접근과 함께 상기 추출물을 1일 200 내지 400 mg/Kg의 투여량으로 랫트에 처치하여 증명하였다. 본 발명에 따라 얻어진 추출물의 처치도중, 식품 소비가 현저하게 저감된 반면, 물 흡수량은 변함없었다.

본 발명에 따르면, 파세러스 에스피 .( Phaseolus sp .)로부터 에탄올과 물의 혼합물로 추출하여 수득가능하고, 1,000 내지 1,600 USP/mg 범위내의 α-아밀라아제 억제제 함량 (HPLC 적정량: 6 내지 14% w/w) 및 8,000 내지 30,000 HAU/g 범위내의 피토헤마글루티닌(phytohaemagglutinin) 함량에 의해 특징지어지는, 추출물 및 그 제조방법을 제공할 수 있다.

Claims

파세러스 에스피.( Phaseolus sp .)로부터 에탄올과 물의 혼합물로 추출하여 수득가능하고, 1,000 내지 1,600 USP/mg 범위내의 α-아밀라아제 억제제 함량 (HPLC titre 6 내지 14% w/w) 및 8,000 내지 30,000 HAU/g 범위내의 피토헤마글루티닌(phytohaemagglutinin) 함량에 의해 특징지어지는, 추출물.
다음 공정을 포함하여 이루어지는 청구항 제1항의 추출물의 제조방법:

a) 파세러스 에스피.(Phaseolus sp.)를 pH 3-6.5 범위내인 수성 완충액으로 추출하고, 바이오매스로부터 상기 추출물을 순차 분리하고, α-아밀라아제 억제제와 피토헤마글루티닌(phytohaemagglutinin)이 고갈되는데 필요시되는 완충액을 추가 추출하고 추출물을 혼합하는 단계;

b) 혼합된 추출물을 여과 혹은 원심분리한 다음 원심분리후 대략 10중량%에 상응하는 부피가 되도록 농축하는 단계;

c) 농축된 수성 추출물을 에탄올 희석액으로 최종 알코올 농도 60 내지 70% v/v가 되도록 순차 침전시키는 단계; 및

d) 침전물 및 재침전물들을 60% 에탄올을 갖는 탈염수로 분리하거나, 10,000 Da 차단을 갖는 막을 통하여 정용여과(diafiltration)하고, 침전 잔류물을 건조시키는 단계.
제2항에 있어서, 상기 완충액으로는 포스페이트, 시트레이트 혹은 아세테이트 완충액, 디카복실 아미노산 완충액 혹은 완충된 물-알코올 용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항의 추출물을 식욕 억제제로 사용하기 위한 용도.
제1항의 추출물을 포함하여 이루어지는 식욕 억제용 조성물.