DE112016006312B4 - Verfahren zur Herstellung von Anthocyaninoligomeren unter Verwendung von Coenzym, das von Aspergillus Sp.-Stamm abgeleitet ist - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Anthocyaninoligomeren unter Verwendung von Coenzym, das von Aspergillus Sp.-Stamm abgeleitet ist Download PDF

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Abstract

Verfahren zur Herstellung eines Anthocyaninoligomers, umfassend: (1) Fermentieren eines Anthocyaninmonomers mit Viscozym L.

Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Anthocyaninoligomer unter Verwendung eines Coenzyms, das von einem Aspergillus sp.-Stamm abgeleitet ist, und insbesondere ein Verfahren zur Herstellung eines Anthocyaninoligomers durch Fermentierung eines Anthocyaninmonomers mit einem Coenzym von Aspergillus niger, welches eine Art vom Aspergillus sp.-Stamm ist, und mit Glucosidase, welches ein Enzym ist, das in dem Coenzym enthalten ist.
  • Fachlicher Hintergrund
  • Anthocyanin fungiert als ein natürliches Pigment und zeigt auch verschiedene physiologische Aktivitäten, wie eine antioxidante Funktion, Reduzierung eines Cholesterinspiegels, Verbesserung der Sehkraft, Gefäßschutz, Prävention von Arteriosklerose und Herzerkrankungen, eine Antigeschwürfunktion, eine Antikrebsfunktion, entzündungshemmende Funktion, Diabetes-Unterdrückung, Schutz vor UV-Strahlung, etc. Darüber hinaus wird Anthocyanin aktiv in Medikamenten verwendet und erhält somit die Aufmerksamkeit als ein neues Material für die Herstellung von Lebensmittelprodukten und neuen Medikamenten.
  • Anthocyanin ist in neutralen oder alkalischen Lösungen instabil und wird allmählich entfärbt, wenn es an Licht ausgesetzt wird, und gilt damit als ein strukturell instabiles Material. Insbesondere schließen Faktoren, die die Stabilität eines Anthocyaninpigments beeinflussen, die chemische Struktur von Anthocyanin, die Konzentration des Pigments, den pH-Wert der Lösung, die Temperatur, das Vorhandensein oder Fehlen eines koexistierenden Pigments, Metallions, Enzyms, Sauerstoff, Ascorbinsäure, Zucker und dergleichen ein, und die Beibehaltung von Chromatizität, das heißt, dies strukturelle Stabilität davon kann in Abhängigkeit von einer Variation bei diesen Faktoren variieren. Wegen dieser strukturellen Instabilität stößt man auf zahlreiche Schwierigkeiten bei der aktiven Nutzung als Lebensmittel und Medikamente, und es laufen derzeit Studien zur Verbesserung der Stabilität von Anthocyanin.
  • Anthocyanin, das in den meisten Lebensmittelmaterialien in einer Monomerform enthalten ist, die bei neutralem und alkalischem pH-Wert instabil ist und auch gegen Licht und Wärme nur leicht beständig ist. Die Polymerform liegt in kleinen Mengen in Lebensmitteln vor, besitzt aber eine höhere Funktionalität und Stabilität als das Monomer, und die typische antioxidante Funktion davon ist ebenfalls verdoppelt. Vor kurzem wurde von Forschung bezüglich Anthocyaninoligomeren berichtet, die subjektive Symptome und Kontrastempfindlichkeit in Fällen von Myopia und Amblyopie verbessern.
  • Verwandte Techniken schließen das Koreanische Patent Nr. 10-1182630 (7. September 2012), die Koreanische Patentanmeldungs-Veröffentlichung Nr. 10-2012-0079040 (11. Juli 2012), etc. ein.
  • Aspergillus sp.-Schimmelpilz ist ein nützlicher Mikroorganismus für die Herstellung von Enzymen, organischen Säuren und Metaboliten mit pharmakologischer Aktivität. Er wurde in nutzbringender Weise in der Landwirtschaft sowie in der Lebensmittelindustrie, der Alkoholindustrie und der pharmazeutischen Industrie eingesetzt und ist für die Herstellung von traditionellen fermentierten Lebensmitteln über lange Zeit verwendet worden und ist daher als ein sicherer Stamm anerkannt. Da darüber hinaus Pilze viele Exoenzyme aufweisen, die nach außen ausgeschieden werden und eine Vielzahl an Funktion besitzen, können sie für die wirtschaftliche Produktion von nützlichen Materialien mittels natürlicher Enzyme verwendet werden. Es gab gängige Berichte für die Produktion von Anthocyaninoligomeren unter Einsatz von Aspergillus sp.-Schimmelpilz, doch ist die direkte Verwendung des Stamms problematisch, dadurch dass es zu einer Kontamination kommen kann im Verlauf der Produktion von Anthocyaninoligomeren.
  • Um zu bestätigen, ob ein Anthocyaninoligomer unter Verwendung eines Enzyms, das nach außen ohne direkten Einsatz eines Aspergillus sp.-Stamms ausgeschieden wird, hergestellt werden kann, haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung Verfahren für die Produktion eines Anthocyaninoligomers unter Verwendung eines Coenzyms ausgearbeitet, das aus einem Kulturmedium eines Aspergillus niger-Stamms extrahiert wird, und auch unter Verwendung als ein Enzym von Glucosidase, erhalten durch Analysieren des Coenzyms, und Viscozym L, und haben dessen Wirksamkeit festgestellt, was somit in der vorliegenden Erfindung gipfelte.
  • Der im J.Agric. Food Chem., 2009, 57, 1006-4012, von S. Pricelius et al. veröffentlichte Artikel offenbart die Gegenwart von hochspezifischen Anthocyanin-β-Glucosidasen in den getesteten Pectinasen-Zubereitungen.
  • Offenbarung
  • Technisches Problem
  • Dem entsprechend soll die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur wirtschaftlichen Produktion eines Anthocyaninoligomers durch Synthetisieren eines Anthocyaninoligomers unter Verwendung von Viscozym L.
  • Technische Lösung
  • Deshalb sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Anthocyaninoligomers vor, umfassend: (1) Fermentieren eines Anthocyaninmonomers mit Viscozym L.
  • Bevorzugterweise schließt die Fermentierung in Schritt (1) das Mischen von dem Anthocyaninmonomer und destilliertem Wasser bei einem Massenverhältnis von 1:8 bis 1:15, um eine Anthocyaninmonomerlösung herzustellen, und anschließendes Mischen von der Anthocyaninmonomerlösung und des Viscozyms L bei einem Substrat-zu-Enzym-Massenverhältnis von 40:1 bis 60:1 ein.
  • Bevorzugterweise wird die Fermentierung in Schritt (1) bei einer Temperatur von 15 bis 30°C für 5 bis 10 Tage durchgeführt.
  • Vorteilhafte Effekte
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird, um Kontaminationsprobleme während des Kultivierungsverfahrens unter Einsatz von Aspergillus niger zu überwinden, Viscozym L verwendet und das Fermentationsverfahren wird unter Verwendung von selbigem durchgeführt, wodurch ein Anthocyaninoligomer, das durch weniger Bedenken einer Kontamination und überlegene Radikalabfangeffekte gekennzeichnet ist im Vergleich zu existierenden Anthocyaninmonomeren, produziert werden kann.
  • Figurenliste
    • Die 1 zeigt ein Verfahren zur Herstellung eines Anthocyaninoligomers durch Fermentierung eines Anthocyaninmonomers mit einem Aspergillus niger-Kulturmedium in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung;
    • Die 2 ist eine Grafik, die die Resultate der ESI-Massenspektrometrie eines Anthocyaninmonomers, das als eine Kontrolle in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung dient, zeigt;
    • Die 3 ist eine Grafik, die zeigt, ob eine Synthese eines Anthocyaninoligomers in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung durch ESI-Massenspektrometrie erfolgte;
    • Die 4 ist eine Grafik, die die Hydroxylradikal-Abfangaktivität des Anthocyaninoligomers, das durch Fermentierung des Anthocyaninmonomers mit einem Aspergillus niger-Kulturmedium in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung synthetisiert wurde, in Abhängigkeit von der Konzentration zeigt;
    • Die 5 zeigt ein Verfahren für den Erhalt eines Coenzyms von einem Aspergillus niger-Kulturmedium in Beispiel 2 der vorliegenden Erfindung;
    • Die 6 zeigt ein Verfahren zur Herstellung eines Anthocyaninoligomers durch Fermentierung eines Anthocyaninmonomers mit dem von Aspergillus niger in Beispiel 2 der vorliegenden Erfindung erhaltenen Coenzym;
    • Die 7 ist eine Grafik, die die Resultate der ESI-Massenspektrometrie eines Anthocyaninmonomers, das als eine Kontrolle in Beispiel 2 der vorliegenden Erfindung dient, zeigt;
    • Die 8 ist eine Grafik, die zeigt, ob die Synthese eines Anthocyaninoligomers in Beispiel 2 der vorliegenden Erfindung durch ESI-Massenspektrometrie erfolgte;
    • Die 9 ist eine SDS-PAGE-Aufnahme, welche die Expression eines Aspergillus niger-Coenzymproteins in Abhängigkeit von dem Kultivierungszeitraum in Beispiel 2 der vorliegenden Erfindung zeigt;
    • Die 10 ist eine SDS-PAGE-Aufnahme für die Analyse des im Aspergillus niger-Coenzym enthaltenen Enzyms in Beispiel 2 der vorliegenden Erfindung;
    • Die 11 zeigt ein Verfahren zur Herstellung eines Anthocyaninoligomers durch Fermentierung eines Anthocyaninmonomers mit Glucosidase, die ein von Aspergillus niger erhaltenes Enzym ist, und mit Viscozym L in Beispiel 3 der vorliegenden Erfindung;
    • Die 12 zeigt die Resultate einer ESI-Massenspektrometrie eines Anthocyaninmonomers, das als eine Kontrolle in Beispiel 3 der vorliegenden Erfindung dient;
    • Die 13 ist eine Grafik, die zeigt, ob die Synthese eines Anthocyaninoligomers bei der Verwendung von Glucosidase als ein Enzym in Beispiel 3 der vorliegenden Erfindung durch ESI-Massenspektrometrie erfolgte;
    • Die 14 ist eine Grafik, die zeigt, ob die Synthese eines Anthocyaninoligomers bei der Verwendung von Viscozym L als ein Enzym in Beispiel 3 der vorliegenden Erfindung durch ESI-Massenspektrometrie erfolgte; und
    • Die 15 ist eine Grafik, die die Hydroxylradikal-Abfangaktivität von zwei Arten von Anthocyaninoligomeren, die durch Fermentation mit Glucosidase, die ein aus Aspergillus niger erhaltenes Enzym ist, und mit Viscozym L in Beispiel 3 der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, in Abhängigkeit von der Konzentration zeigt.
  • Bester Modus
  • Nachfolgend wird eine detaillierte Beschreibung der vorliegenden Erfindung angeführt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Anthocyaninoligomer, umfassend ((1) Fermentieren eines Anthocyaninmonomers mit Viscoenzym L.
  • Die Fermentierung in Schritt (1) schließt bevorzugterweise das Mischen von dem Anthocyaninmonomer und destilliertem Wasser bei einem Massenverhältnis von 1:8 bis 1:15, um eine Anthocyaninmonomerlösung herzustellen, und anschließendes Mischen von der Anthocyaninmonomerlösung und des Viscozyms L bei einem Substrat-zu-Enzym-Massenverhältnis von 40:1 bis 60:1 ein. Das Substrat ist eine Anthocyaninmonomer. Stärker bevorzugt werden das Anthocyaninmonomer und destilliertes Wasser in einem Massenverhältnis von 1:10 gemischt, um eine Anthocyaninmonomerlösung herzustellen, wonach die Anthocyaninmonomerlösung und das in Schritt (1) isolierte Coenzym in einem Massenverhältnis von 50:1 gemischt werden.
  • Die Fermentierung in Schritt (1) erfolgt bevorzugterweise bei einer Temperatur von 15 bis 30°C für 5 bis 10 Tage und stärker bevorzugt bei 25°C für 7 Tage. Die Menge des Anthocyaninoligomers, das synthetisiert wird, erhöht sich bis zu 7 Tagen, aber verändert sich nicht weiter, selbst mit der Zeit unter Bedingungen nach 8 Tagen.
  • Ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung ist durch die nachstehenden Beispiele gegeben, die lediglich zur Veranschaulichung der vorliegende Erfindung angegeben sind, aber nicht als eine Einschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung auszulegen sind, wie für Fachleute auf dem Gebiet ersichtlich wird.
  • Beispiel 1. Evaluierung der Fähigkeit von Kulturmedium vom Aspergillus sp.-Stamm zum Synthetisieren von Oligomer
  • Wie in der 1 zusammengefasst, wurden Anthocyaninmonomer und destilliertes Wasser in einem Massenverhältnis von 1:10 gemischt für den Erhalt einer Anthocyaninmonomerlösung. Dann wurden die Anthocyaninmonomerlösung und ein Kulturmedium vom Aspergillus niger-Stamm in einem Massenverhältnis von 95:5 gemischt und bei 25°C 5 Tage lang fermentiert. Das Stammkulturmedium wurde durch Kultivieren eines Aspergillus niger-Stamms in 1 L einer Mediumlösung bei 25°C 5 Tage lang hergestellt.
  • Nach der Fermentierung wurde ein Filtrationsprozess unter Verwendung von Filterpapier durchgeführt, wodurch andere Materialien als Anthocyanin, wie der Stamm und dergleichen, filtriert wurden, und auf diese Weise wurde Anthocyaninoligomer isoliert und lyophilisiert, wodurch ein Anthocyaninoligomer erhalten wurde. Um das Anthocyaninoligomer zu reinigen, wird die Filtration bevorzugterweise unter Verwendung einer röhrenförmigen, kapillaren, spiralförmig gewundenen oder flachen Membran durchgeführt.
  • Ein Anthocyaninmonomer, das als eine Kontrolle dient, wurde einer Peakbeobachtung durch ESI-Massenspektrometrie unterworfen. Wie in der 2 gezeigt, war der Peak nahe dem Molekulargewicht von 300 sehr hoch. Dagegen wurde auf Basis der Resultate der Peakbeobachtung des erhaltenen Anthocyaninoligomers durch ESI-Massenspektrometrie, wie in der 3 gezeigt, ein hoher Peak nahe einem Molekulargewicht von 600 beobachtet, und Peaks wurden ebenfalls nahe 900 und 1200 beobachtet. Dies bedeutet, dass das Anthocyaninmonomer fermentiert wurde und somit zu einem Anthocyaninoligomer, wie einem Dimer, einem Trimer, einem Tetramer, etc., umgewandelt wurde, aus dem festgestellt werden konnte, dass das Anthocyaninmonomer synthetisiert wurde.
  • Um die Wirksamkeit des Anthocyaninmonomers mit derjenigen des Anthocyaninoligomers zu vergleichen, wie in der 4 gezeigt, wurde die Hydroxylradikal-Abfangaktivität unter Verwendung des Monomers und des Oligomers bei verschiedenen Konzentrationen untersucht. Basierend auf den Testresultaten war die hemmende Konzentration (IC50) des Oligomers nur etwa die Hälfte von derjenigen des Monomers, aus dem festgestellt werden kann, dass das Anthocyaninoligomer Radikalabfangaktivität selbst bei geringer Konzentration zeigt.
  • Beispiel 2. Evaluierung der Fähigkeit von aus Aspergillus sp.-Stamm-Kulturmedium erhaltenem Coenzym zum Synthetisieren von Oligomer
  • Wie in der 5 zusammengefasst, wurde, um ein Coenzym von einem Aspergillus niger-Stamm-Kulturmedium zu erhalten, ein Aspergillus niger-Stamm in 2 L einer Mediumlösung bei 25°C 5 Tage lang kultiviert, wodurch ein Kulturmedium erhalten wurde, woraufhin der Stamm durch Filtration unter Verwendung von Filterpapier entfernt wurde und eine Präzipitation bei 4°C 8 bis 12 h lang unter Zugabe von Aceton durchgeführt wurde. Anschließend wurde eine Zentrifugation bei 3000 U/min 20 min lang durchgeführt für den Erhalt eines Kulturpräzipitats, durchgeführt, und das Enzym des Kulturpräzipitats, das in entionisiertem Wasser gelöst wurde, wurde isoliert und lyophilisiert, wodurch das Coenzym hergestellt wurde.
  • Als nächstes, wie in der 6 zusammengefasst, wurden das Anthocyaninmonomer und destilliertes Wasser in einem Massenverhältnis von 1:10 gemischt, um eine Anthocyaninmonomerlösung zu erhalten. Ferner wurden die Anthocyaninmonomerlösung und das Coenzym bei einem Massenverhältnis von 500:1 gemischt und bei 25°C für 5 Tage fermentiert.
  • Nach der Fermentation wurde ein Filtrationsverfahren unter Verwendung von Filterpapier durchgeführt, wodurch andere Materialien als Anthocyanin filtriert wurden, und auf diese Weise wurde das Anthocyaninoligomer isoliert und lyophilisiert, wodurch ein Anthocyaninoligomer erhalten wurde. Um das Anthocyaninoligomer zu reinigen, wird eine Filtration bevorzugterweise unter Verwendung einer röhrenförmigen, kapillaren, spiralförmig gewundenen oder flachen Membran durchgeführt.
  • Ein Anthocyaninmonomer, das als eine Kontrolle dient, wurde einer Peakbeobachtung durch ESI-Massenspektrometrie unterworfen. Die Resultate sind in der 7 gezeigt. Auf Basis der Resultate der Peakbeobachtung des erhaltenen Anthocyaninoligomers durch ESI-Massenspektrometrie, wie in der 8 gezeigt, wurden hohe Peaks nahe den Molekulargewichten von 600, 900 und 1200 beobachtet im Vergleich zu den in 7 gezeigten Resultaten. Dies bedeutet, dass das Anthocyaninmonomer fermentiert wurde und somit zu einem Anthocyaninoligomer, wie einem Dimer, einem Trimer, einem Tetramer, etc., umgewandelt wurde, wodurch festgestellt werden konnte, dass das Anthocyaninooligomer synthetisiert wurde.
  • Um die Eigenschaften des isolierten Coenzyms zum Synthetisieren eines Anthocyaninoligomers und die Kulturbedingungen davon zu untersuchen, wurde SDS-PAGE durchgeführt. Die Resultate sind in der 9 gezeigt. Basierend auf den Resultaten von SDS-PAGE für die Menge an extrahiertem Coenzym nach dem Kultivieren für 4 bis 8 Tage, war die Menge des Coenzyms, die extrahiert wurde, sogar im Zeitverlauf unter den Bedingungen von 6 bis 8 Tagen ähnlich. Somit erwies sich zur Herstellung des Coenzyms, das zum Synthetisieren eines Anthocyaninoligomers erforderlich ist, das Kultivieren von Aspergillus niger für 5 Tage als optimal.
  • Wie durch das Rechteck in der 10 angegeben, wurden neun dünne Fragmente erhalten, mit Trypsinprotease verdaut und durch LC-MS/MS in einem Q-STAR Pulsar ESI-Hybrid Q-TOF-Instrument analysiert. Als Resultate davon wurden zig Proteine validiert, und die MS/MS-Spektrum-Peaks davon wurden mit Analyst QS (v1.1, Applied Biosystems) analysiert zur Identifizierung von Proteinen. Die identifizierten Proteine sind in den nachstehenden Tabellen gezeigt. Aspergillus niger erhält derzeit die Aufmerksamkeit als ein industriell nützlicher Modellpilz, und diese Pilze scheiden bekanntermaßen hydrolytische Proteine aus, die sehr nützlich sind für die Herstellung von verschiedenen Lebensmittelzusätzen, Pharmazeutika und industriellen Enzymen. Unter den identifizierten Proteinen der nachstehenden Tabellen 1 und 2 wurden einige Proteine, die am Anthocyaninoligomer-Metabolismus beteiligt sein sollen, ausgewählt und in Kursivschrift angegeben. [Tabelle 1]
    Gen I.D. Proteinname Wahrscheinlichkeit Molekulargewicht
    gi/224027 Glucoamylase G1 627 65448
    gi/134081727 unbenanntes Proteinprodukt [Aspergillus niger] 274 75190
    gi/765328 Säurephosphatase, Orthophosphorsäuremonoesterphosphohydrolase, APase {EC3.1.3.2.} [Aspergillus ficuum, NRRL 3135, Peptid, 583 aa] 265 64211
    gi/257187 Alpha-glucosidase-P2-Untereinheit, ANP-P2-Untereinheit {EC 3.2.1.20} [Aspergillus niger, Peptid, 719 aa] 181 79656
    gi/2344 Preproglucoamylase G2 [Aspergillus niger] 531 56695
    gi/145242978 hypothetisches Protein ANI_1_1546094 [Aspergillus niger CBS 513.88] 351 59208
    gi/145231236 Phospholipase C PLC-C [Aspergillus niger CBS 513.88] 410 49652
    gi/145235505 Serin-Carboxypeptidase [Aspergillus niger CBS 513.88] 297 62560
    gi/14525338 Phosphatidylglycerol-spezifische Phospholipase [Aspergillus niger CBX 513.88] 261 53895
    gi/4185610 Phytase [Aspergillus niger] 218 50997
    gi/145241119 3-Phytase B [Aspergillus niger CBS 513.88] 256 52453
    gi/145241490 1,3-beta-Glucanosyltransferase gel3 [Aspergillus niger CBS 513.88] 161 56721
    gi/83655609 Säurephosphatase [Aspergillus niger] 142 52725
    gi/145242970 hypothetisches Protein ANI_1_1540094 [Aspergillus niger CBS 513.88] 128 45753
    gi/145256696 Proteinecm33 [Aspergillus niger CBS 513.88] 125 41026
    gi/317026828 Carboxypeptidase F vom Serintyp [Aspergillus niger CBS 513.88] 118 57756
    gi/145248273 Polyaminoxidase [Aspergillus niger CBS 513.88] 110 58728
    gi/145248205 Endopeptidase opsB vom Asparaginsäuretyp [Aspergillus niger CBS 513.88] 104 50958
    gi/145234270 Glutaminase GtaA [Aspergillus niger CBS 513.88] 99 75470
    gi/350633205 hypothetisches Protein ASPNIDRAFT_55058 [Aspergillus niger ATCC 1015] 87 22487
    gi/350631594 hypothetisches Protein ASPNIDRAFT_53033 [Aspergillus niger ATCC 1015] 63 57162
    gi/145235707 FAD-Bindungsdomänen-Protein [Aspergillus niger CBS 513.88] 59 61292
    gi/145233743 Alpha-Galactosidase B [Aspergillus niger CBS 513.88] 392 48796
    gi/317031802 Histidinsäure-Phosphatase [Aspergillus niger CBS 513.88] 153 53047
    [Tabelle 2]
    gi/317025146 Asparginsäureendopeptidase (AP1) [Aspergillus niger CBS 513.88] 483 46701
    gi/145242664 Sulphydryl-Oxidase [Aspergillus niger CBS 513.88] 264 43471
    gi/74626383 RecName: Voll = Wahrscheinlich alpha-Galactosidase B; 175 48753
    AltName: Voll = Melibiase B;
    Fähnchen: Vorstufe
    gi/134083538 unbenanntes Proteinprodukt [Aspergillus niger] 173 45226
    gi/400801 RecName: Voll = Pectirdyase A; Kurz = PLA; 135 39830
    AltName: Voll = Pectirdyase II; Kurz = PLII; Fähnchen: Vorstufe
    gi/145235303 hypothetisches Protein ANI_1_496034 [Aspergillus niger CBS 513.88] 103 52301
    gi/134055991 unbenanntes Proteinprodukt [Aspergillus niger] 85 41620
    gi/134076313 unbenanntes Proteinprodukt [Aspergillus niger] 85 45581
    gi/145251519 Protein der Phosphoglycerat-Mutase-Familie 79 19282
    [Aspergillus niger CBS 513.88]
    gi/350633205 hypothetisches Protein ASPNIDRAFT_55058 73 22487
    [Aspergillus niger ATCC 1015]
    gi/145232359 Endopolygalacturonase C [Aspergillus niger CBS 513.88] 241 37796
    gi/145235523 Glucan-endo-1,3-beta-glucosidase eglC [Aspergillus niger CBS 513.88] 129 46778
    gi/145230419 Glucosidase crf1 {[Aspergillus niger CBS 513.88] 107 39862
    gi/129935 RecName: Voll = Endopolygalacturonase II; 89 37489
    Kurz = EPG-II,- AltName: Voll = Pectinase 2;
    AltName: Voll = Polygalacturnoase II; Kurz = PG-II, AltName: Voll = Polygalacturonase X2; Fähnchen: Vorstufe
    gi/133176 RecName: Voll = Ribonuclease M; Kurz = RNase M 89 26590
    gi/134055750 unbenanntes Proteinprodukt [Aspergillus niger] 84 27072
    gi/145229151 Endo-1,3(4)-beta-glucanase [Aspergillus niger CBS 513.88] 83 46311
    gi/134075575 hypothetisches Protein An07g00170 [Aspergillus niger] 69 90993
    gi/134083538 unbenanntes Proteinprodukt [Aspergillus niger] 67 45226
    gi/145252266 GPI-verankertes Zellwandprotein [Aspergillus niger CBS 513.88] 64 19022
    gi/83638302 Xylanase [Aspergillus phoenicis] 117 10944
    gi/350633205 hypothetisches Protein ASPNIDRAFT:55058 [Aspergillus niger ATCC 1015] 92 22487
  • Erfindungsgemäßes Beispiel 3. Evaluierung der Fähigkeit von Glucosidase in Coenzym, erhalten von Aspergillus sp.-Stamm-Kulturmedium, und von Viscozym L zum Synthetisieren von Oligomer
  • Wie in der 11 zusammengefasst, wurden ein Anthocyaninmonomer und destilliertes Wasser in einem Massenverhältnis von 1:10 vermischt, um eine Anthocyaninmonomerlösung zu erhalten. Dann wurde die Anthocyaninmonomerlösung jeweils mit Glucosidase, welches ein Enzym ist, das aus dem Aspergillus niger-Stamm-Coenzym isoliert wurde, und Viscozym L bei einem Massenverhältnis von 1000:1 bzw. 500:1 („100:1“ von 11 ist vielmehr das Massenverhältnis vom Anthocyaninmonomer selbst als von der Lösung, zu dem Enzym, und Viscozym L wurde in doppelter Menge verwendet, um ähnliche Effekte aufgrund der hohen Enzymeffizienz von Glucosidase sicherzustellen) gemischt und bei 25°C für 5 Tage fermentiert.
  • Viscozym L ist ein Enzym, das Glucosidase einschließt und kommerziell verfügbar ist.
  • Nach der Fermentation wurde ein Filtrationsverfahren unter Verwendung von Filterpapier durchgeführt, wodurch andere Materialien als Anthocyanin filtriert wurden, und auf diese Weise wurde das Anthocyaninoligomer isoliert und lyophilisiert, wodurch ein Anthocyaninoligomer erhalten wurde. Um das Anthocyaninoligomer zu reinigen, wird eine Filtration bevorzugterweise unter Verwendung einer röhrenförmigen, kapillaren, spiralförmig gewundenen oder flachen Membran durchgeführt.
  • Ein Anthocyaninmonomer, das als eine Kontrolle dient, wurde einer Peakbeobachtung durch ESI-Massenspektrometrie unterworfen. Die Resultate sind in der 12 gezeigt. Jedoch wurden auf Basis der Resultate der Peakbeobachtung durch ESI-Massenspektrometrie der erhaltenen Anthocyaninoligomere unter Verwendung von Glucosidase, die ein von dem Aspergillus niger-Stamm-Coenzym isoliertes Enzym ist, und Viscozym L, wie in den 13 und 14 gezeigt, hohe Peaks nahe den Molekulargewichten von 600, 900 und 1200 beobachtet im Vergleich zu den in 12 gezeigten Resultaten. Dies bedeutet, dass das Anthocyaninmonomer fermentiert wurde und somit zu einem Anthocyaninoligomer, wie einem Dimer, einem Trimer, einem Tetramer, etc., umgewandelt wurde, wodurch festgestellt werden konnte, dass das Anthocyaninooligomer synthetisiert wurde. Außerdem war die Menge des synthetisierten Oligomers hoch bei der Verwendung von Glucosidase als das Enzym (13) im Vergleich zu der Verwendung von Viscozym L (14).
  • Um die Wirksamkeiten der unter Verwendung von einzelnen Enzymen erhaltenen Anthocyaninoligomere zu vergleichen, wie in 15 gezeigt, wurde das unter Verwendung von Glucosidase erhaltene Oligomer und das unter Verwendung von Viscozym L erhaltene Oligomer auf verschiedene Konzentrationen eingestellt und auf die Hydroxylradikal-Abfangaktivität hin untersucht. Basierend auf den Testresultaten zeigte das unter Verwendung von Glucosidase erhaltene Oligomer eine hemmende Konzentration (IC50) von 0,217 mg/ml, was viel niedriger ist als 0,278 mg/ml, welches die hemmende Konzentration (IC50) des unter Verwendung von Viscozym L erhaltenen Oligomers ist und woraus daher die Schlussfolgerung gezogen wurde, dass dieses Radikalabfangaktivität selbst bei einer niedrigen Konzentration zeigt.
  • Nachdem spezifische Teilbereiche der vorliegenden Erfindung im Detail beschrieben wurden, werden Fachleute auf dem Gebiet würdigen, dass diese spezifischen Ausführungsformen lediglich bevorzugte Ausführungsformen sind und dass der Umfang der vorliegenden Erfindung dadurch nicht eingeschränkt ist. Demzufolge ist der tatsächliche Umfang der vorliegenden Erfindung durch die anhängigen Ansprüche definiert.

Claims (3)

  1. Verfahren zur Herstellung eines Anthocyaninoligomers, umfassend: (1) Fermentieren eines Anthocyaninmonomers mit Viscozym L.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Fermentierung in Schritt (1) das Mischen von dem Anthocyaninmonomer und destilliertem Wasser bei einem Massenverhältnis von 1:8 bis 1:15, um eine Anthocyaninmonomerlösung herzustellen, und anschließendes Mischen von der Anthocyaninmonomerlösung und des Viscozyms L bei einem Substrat-zu-Enzym-Massenverhältnis von 40:1 bis 60:1 einschließt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Fermentierung in Schritt (1) bei einer Temperatur von 15 bis 30°C für 5 bis 10 Tage durchgeführt wird.
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