WO2017131305A1 - 아스퍼질러스 속 균 유래의 조효소를 이용하는 안토시아닌 올리고머의 제조 방법 - Google Patents

아스퍼질러스 속 균 유래의 조효소를 이용하는 안토시아닌 올리고머의 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2017131305A1
WO2017131305A1 PCT/KR2016/008429 KR2016008429W WO2017131305A1 WO 2017131305 A1 WO2017131305 A1 WO 2017131305A1 KR 2016008429 W KR2016008429 W KR 2016008429W WO 2017131305 A1 WO2017131305 A1 WO 2017131305A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
anthocyanin
coenzyme
aspergillus
oligomer
strain
Prior art date
Application number
PCT/KR2016/008429
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
박표잠
정특래
양현필
황진우
Original Assignee
주식회사 키토라이프
건국대학교 글로컬산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 키토라이프, 건국대학교 글로컬산학협력단 filed Critical 주식회사 키토라이프
Priority to DE112016006312.1T priority Critical patent/DE112016006312B4/de
Priority to CN201680080097.9A priority patent/CN108603212B/zh
Priority to JP2018558098A priority patent/JP6803399B2/ja
Publication of WO2017131305A1 publication Critical patent/WO2017131305A1/ko
Priority to US16/046,012 priority patent/US10774351B2/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
    • C12P17/162—Heterorings having oxygen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. Lasalocid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus
    • C12R2001/685—Aspergillus niger

Abstract

본 발명은 아스퍼질러스 속 균으로부터의 조효소를 이용하는 안토시아닌 올리고머의 제조 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 안토시아닌 모노머를 아스퍼질러스 속 균의 일종인 검정곰팡이(Aspergillus niger, 아스퍼질러스 나이저)의 조효소로 발효시켜 안토시아닌 올리고머를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기와 같은 본 발명에 따르면, 검정곰팡이(Aspergillus niger, 아스퍼질러스 나이저)를 이용한 배양 과정상에서 발생하는 오염 문제를 극복하기 위해 검정곰팡이(Aspergillus niger, 아스퍼질러스 나이저)의 조효소를 추출하고 이를 이용하여 발효과정을 거침으로써, 기존 안토시아닌 모노머에 비해, 오염의 우려가 적고 라디칼 소거 효과가 우수한, 안토시아닌 올리고머를 제조하는 효과를 확인하였다. 또한 조효소에 포함된 효소 중 Glucosidase를 이용해 발효시킨 안토시아닌 올리고머가 발효 효율 및 라디칼 소거 능력이 뛰어난 것을 확인하였고, Glucosidase를 포함한 효소의 발효에서도 안토시아닌 올리고머의 중합을 확인하였다.

Description

아스퍼질러스 속 균 유래의 조효소를 이용하는 안토시아닌 올리고머의 제조 방법
본 발명은 아스퍼질러스 속 균으로부터의 조효소를 이용하는 안토시아닌 올리고머의 제조 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 안토시아닌 모노머를,아스퍼질러스 속 균의 일종인 검정곰팡이(아스퍼질러스 나이저)의 조효소와, 상기 조효소에 포함된 개별 효소인 Glucosidase로 발효시켜 안토이사닌 올리고머를 제조하는 방법에 관한 것이다.
안토시아닌은 천연색소로서의 기능 외에도 다양한 생리활성을 나타내어 항산화, 콜레스테롤저하, 시력개선효과, 혈관보호기능, 동맥경화, 심장병예방, 항궤양기능, 항암, 항염증, 당뇨억제, 자외선으로부터의 보호기능 등 다양한 생리활성을 나타내며 의약품에도 적극 활용되고 있어 건강식품 및 신 의약품 창출의 새로운 대상으로 조명을 받고 있다.
안토시아닌은 중성 또는 알칼리 용액에서 불안정하며, 산성용액에서도 빛에 노출되면 색이 서서히 탈색되는 현상을 나타내어 구조적으로 가장 불안정한 물질 중 하나로 꼽힌다. 특히 안토시아닌 색소의 안정성에 영향을 주는 요인으로서는 안토시아닌의 화학적 구조, 색소의 농도, 용액의 pH, 온도, 공존색소의 유무, 금속이온, 효소, 산소, 아스코르빅산(ascorbic acid), 당 등을 들 수 있으며, 이들 요인의 차이에 의해 색도의 유지, 즉 구조적 안정성에 차이를 나타낸다. 이 구조적 불안정성 때문에 식품 및 의약품으로서의 적극적 활용에 많은 어려움이 발생되고 있으므로, 안정성을 높이기 위한 연구가 진행되고 있는 바이다.
대부분 식재료에 함유되어 있는 안토시아닌은 단량체 형태인데, 이 형태는 중성 및 알카리성에 불안정하고 빛과 열에 불안정한 단점이 있다. 중합체 형태는 식품 중에 소량 존재하지만 단량체보다 기능성과 안정도가 높으며, 기존에 가지고 있는 대표적인 항산화 기능도 배로 증가하게 된다. 최근 근시와 약시의 문제에 있어서 주관적인 증상 및 대비 민감도를 개선하는 안토시아닌 올리고머에 대한 연구가 보고된 바 있다.
관련 종래 기술로는 한국등록특허 제10-1182630호(2012.09.07), 한국공개특허 제10-2012-0079040호(2012.07.11) 등이 있다.
Aspergillus 속 사상균은 효소, 유기산 및 약리활성이 있는 대사산물을 생산하는 유용한 미생물로 식품산업, 주류산업, 의약업뿐만 아니라 농업에도 유용하게 이용되어 왔으며, 오래 전부터 전통발효식품 생산에 사용되었기 때문에 안전한 균주로 인식되고 있다. 또한 균류는 외부로 배출하는 Exo-enzyme이 많고 기능이 다양하기 때문에, 이를 이용하면 유용한 물질을 천연 효소를 이용하여 경제성있게 생산할 수 있다. 기존에 Aspergillus 속 사상균을 이용하여 안토시아닌 올리고머를 생산한 연구들이 보고된 바 있으나, 균주를 직접 사용하면 안토시아닌 올리고머를 생산하는 과정에서 오염이 발생한다는 단점이 있었다.
본 발명자들은 Aspergillus 속 균을 직접적으로 사용하지 않고 외부로 배출하는 효소를 이용하여 안토시아닌 올리고머를 제조할 수 있는지 확인하기 위해, 검정곰팡이(Aspergillus niger, 아스퍼질러스 나이저)균을 배양한 배양액에서 추출한 조효소와 조효소를 분석하여 얻은 glucosidase 및 Viscozyme L 효소를 이용한 제조 방법을 고안하고 그 효능을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, 검정곰팡이(Aspergillus niger, 아스퍼질러스 나이저)의 조효소와 조효소를 분석하여 얻은 Glucosidase 및 Viscozyme L 효소를 이용하여 안토시아닌 올리고머를 합성함으로써, 상기 안토시아닌 올리고머를 경제적으로 생산하는 제조 방법을 제공하고자 함에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 균주를 배양한 배양액에서 수용성 조효소를 분리하는 단계; 및 (2) 안토시아닌 모노머에 상기 (1)단계에서 분리한 조효소를 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는 안토시아닌 올리고머의 제조 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 (1)단계의 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 균주는, 아스퍼질러스 나이저(Aspergillus niger)이다.
바람직하게는, 상기 (1)단계의 균주는 15~30℃의 온도에서 4~8일 동안 배양된다.
바람직하게는, 상기 (1)단계의 조효소는 배양액에 유기 용매를 넣어 침전시킨 후 얻은 침전물에서 증류수에 용해되어 효소로서 분리된다.
바람직하게는, 상기 (2)단계의 발효는 안토시아닌 모노머와 증류수를 1:8 내지 1: 15의 질량비로 혼합하여 안토시아닌 모노머 용액을 준비한 뒤, 상기 안토시아닌 모노머 용액과 상기 (1)단계에서 분리한 조효소를 기질 대 효소 비 40:1 내지 60:1 의 질량비로 혼합하여 수행된다.
바람직하게는, 상기 (2)단계의 발효는 15~30℃의 온도에서 5~10일 동안 수행된다.
또한 본 발명은 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 균주를 배양한 배양액에 있고, 글루코시다제(Glucosidase)를 유효성분으로 포함하는 조효소와 비스코자임 L(Viscozyme L)을, 안토시아닌 모노머에 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는 안토시아닌 올리고머의 제조 방법을 제공한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 검정곰팡이(Aspergillus niger, 아스퍼질러스 나이저)를 이용한 배양 과정상에서 발생하는 오염 문제를 극복하기 위해 검정곰팡이(Aspergillus niger, 아스퍼질러스 나이저)의 조효소를 추출하고 이를 이용하여 발효과정을 거침으로써, 기존 안토시아닌 모노머에 비해, 오염의 우려가 적고 라디칼 소거 효과가 우수한, 안토시아닌 올리고머를 제조하는 효과를 확인하였다.
또한 조효소에 포함된 효소 중 Glucosidase를 이용해 발효시킨 안토시아닌 올리고머가 발효 효율 및 라디칼 소거 능력이 뛰어난 것을 확인하였고, Glucosidase를 포함한 효소의 발효에서도 안토시아닌 올리고머의 중합을 확인하였다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 따라, 안토시아닌 모노머를 검정곰팡이(아스퍼질러스 나이저) 배양액으로 발효시켜 안토시아닌 올리고머를 제조하는 과정도.
도 2는 본 발명의 실시예 1에 따라, 안토시아닌 모노머를 대조군으로 하여 ESI mass 결과를 확인한 그래프.
도 3은 본 발명의 실시예 1에 따라, 안토시아닌 올리고머의 결과적인 합성 여부를 ESI mass 통해 확인한 그래프.
도 4는 본 발명의 실시예 1에 따라, 안토시아닌 모노머와 검정곰팡이(아스퍼질러스 나이저) 배양액으로 발효시켜 제조한 안토시아닌 올리고머의 하이드록시 라디칼 소거 능력을 농도별로 비교한 그래프.
도 5는 본 발명의 실시예 2에 따라, 검정곰팡이(아스퍼질러스 나이저) 배양액에서 조효소를 획득하는 과정도.
도 6은 본 발명의 실시예 2에 따라, 안토시아닌 모노머를 검정곰팡이(아스퍼질러스 나이저)에서 획득한 조효소로 발효시켜 안토시아닌 올리고머를 제조하는 과정도.
도 7은 본 발명의 실시예 2에 따라, 안토시아닌 모노머를 대조군으로 하여 ESI mass 결과를 확인한 그래프.
도 8은 본 발명의 실시예 2에 따라, 안토시아닌 올리고머의 결과적인 합성 여부를 ESI mass 통해 확인한 그래프.
도 9는 본 발명의 실시예 2에 따라, 검정곰팡이(아스퍼질러스 나이저) 조효소 단백질을 배양 기간별로 SDS-PAGE로 분리하여 발현을 확인한 사진.
도 10은 본 발명의 실시예 2에 따라, 검정곰팡이(아스퍼질러스 나이저) 조효소에 포함된 효소을 분석하기 위하여 SDS-PAGE를 나눈 사진.
도 11은 본 발명의 실시예 3에 따라, 안토시아닌 모노머를 검정곰팡이(아스퍼질러스 나이저)에서 획득한 효소 Glucosidase와 Viscozyme L로 발효시켜 안토시아닌 올리고머를 제조하는 과정도.
도 12는 본 발명의 실시예 3에 따라, 안토시아닌 모노머를 대조군으로 하여 ESI mass 결과를 확인한 그래프.
도 13은 본 발명의 실시예 3에 따라, Glucosidase 효소를 이용했을 때, 안토시아닌 올리고머의 결과적인 합성 여부를 ESI mass 통해 확인한 그래프.
도 14는 본 발명의 실시예 3에 따라, Viscozyme L 효소를 이용했을 때, 안토시아닌 올리고머의 결과적인 합성 여부를 ESI mass 통해 확인한 그래프.
도 15는 본 발명의 실시예 3에 따라, 검정곰팡이(아스퍼질러스 나이저)에서 획득한 효소 Glucosidase와 Viscozyme L로 발효시켜 제조한 안토시아닌 올리고머 2종류의 하이드록시 라디칼 소거 능력을 농도별로 비교한 그래프.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 (1) 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 균주를 배양한 배양액에서 수용성 조효소를 분리하는 단계; 및 (2) 안토시아닌 모노머에 상기 (1)단계에서 분리한 조효소를 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는 안토시아닌 올리고머의 제조 방법을 제공한다.
상기 (1)단계의 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 균주는, 아스퍼질러스 나이저(Aspergillus niger)인 것이 바람직하다.
상기 (1)단계의 균주는 15~30℃의 온도에서 4~8일 동안 배양하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 25℃의 온도에서 5일간 배양한다.
상기 (1)단계의 조효소는 배양액에 유기 용매를 넣어 침전시킨 후 얻은 침전물에서 증류수에 용해되어 효소로서 분리되는 것이 바람직하다.
상기 (2)단계의 발효는, 안토시아닌 모노머와 증류수를 1:8 내지 1:15의 질량비로 혼합하여 안토시아닌 모노머 용액을 준비한 뒤, 상기 안토시아닌 모노머 용액과 상기 (1)단계에서 분리한 조효소를 기질 대 효소 비 40:1 내지 60:1의 질량비로 혼합하여 수행되는 것이 바람직하다. 기질은 안토시아닌 모노머이다. 더욱 바람직하게는 안토시아닌 모노머와 증류수를 1:10의 질량비로 혼합하여 안토시아닌 모노머 용액을 준비한 뒤, 상기 안토시아닌 모노머 용액과 상기 (1)단계에서 분리한 조효소를 50:1의 질량비로 혼합하여 수행한다.
상기 (2)단계의 발효는 15~30℃의 온도에서 5~10일 동안 수행되는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 25℃의 온도에서 7일간 배양한다. 7일에 이를때까지는 안토시아닌 올리고머 합성량이 증가하였지만, 8일 이후의 조건에서는 시간이 지나도 안토시아닌 올리고머 합성량이 비슷함을 확인하였다.
상기 (1)단계에서 분리한 조효소는 글루코시다제(Glucosidase)를 유효성분으로 포함한다.
또한 본 발명은 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 균주를 배양한 배양액에 있고, 글루코시다제(Glucosidase)를 유효성분으로 포함하는 조효소와 비스코자임 L(Viscozyme L)을, 안토시아닌 모노머에 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는 안토시아닌 올리고머의 제조 방법을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 아스퍼질러스 속 균 배양액의 올리고머 합성 능력 확인
(도 1)에서 정리한 대로, 안토시아닌 모노머와 증류수를 1:10의 질량비로 혼합하여 안토시아닌 모노머 용액을 준비했다. 그리고 안토시아닌 모노머 용액과 검정곰팡이(Aspergillus niger, 아스퍼질러스 나이저) 균주 배양액을 95:5의 질량비로 혼합하여 25℃의 온도에서 5일 동안 발효시켰다. 상기 균주 배양액은 검정곰팡이 균주를 배지용액 1 ℓ에서 25℃ 조건으로 5일간 배양하여 만들어 두었다.
발효시킨 후, 이를 여과지(filter paper)에 여과하여 균주 등 안토시아닌 외의 다른 물질들을 여과하여 안토시아닌 올리고머를 분리하였고 동결건조하여 안토시아닌 올리고머를 수득하였다. 안토시아닌 올리고머를 정제하기 위해서는 tubular, capillary, coiled spiral, place membrane을 이용하여 여과하는 것이 바람직하다.
안토시아닌 모노머를 대조군으로 하여 ESI mass를 걸어 피크를 관찰하였다. (도 2)와 같이 분자량 300부근의 피크가 아주 높은 것을 확인할 수 있었다. 이에 비해 수득한 안토시아닌 올리고머를 대상으로 ESI mass를 걸어 피크를 관찰한 결과, (도 3)과 같이 분자량 600 부근에서 높은 피크가 관찰되었고, 이어서 900과 1200 부근에서도 피크가 관찰되었다. 이는 안토시아닌 모노머가 발효의 결과로 다이머(dimer), 트리머(trimer), 테트라머(tetramer) 등 안토시아닌 올리고머(oligomer)로 변환되었음을 의미하는 것으로, 합성되었음이 확인되었다.
안토시아닌 모노머와 올리고머의 효능을 비교하기 위해, (도 4)와 같이 모노머와 올리고머의 농도를 달리하여, 하이드록실 라디칼을 소거하는 효능을 실험하였다. 실험 결과 올리고머의 저해 중간값(inhibitory concentration, IC50)이 모노머에 비해 절반 정도 밖에 되지 않아서, 낮은 농도로도 라디칼 소거 효능이 있음이 확인되었다.
실시예 2. 아스퍼질러스 속 균 배양액에서 얻은 조효소의 올리고머 합성 능력 확인
(도 5)에 정리한 대로, 검정곰팡이(Aspergillus niger, 아스퍼질러스 나이저) 균주 배양액에서 조효소를 얻기 위해, 검정곰팡이 균주를 배지용액 2 ℓ에서 25℃ 조건으로 5일간 배양하여 배양액을 얻고, 배지를 여과지(filter paper)에 여과하여 균주를 제거하고, 아세톤을 투입하여 4℃에서 8 ~ 12시간 동안 침전시켰다. 3000 rpm으로 20분 동안 원심분리 후 배양 침전물을 획득하고, 배양 침전물 중 3차 증류수로 용해되는 효소를 분리하고 동결 건조하여 조효소를 준비하였다.
다음으로는 (도 6)에 정리한 대로, 안토시아닌 모노머와 증류수를 1:10의 질량비로 혼합하여 안토시아닌 모노머 용액을 준비했다. 그리고 안토시아닌 모노머 용액과 조효소를 500:1의 질량비로 혼합하여 25℃의 온도에서 5일 동안 발효시켰다.
발효시킨 후, 이를 여과지(filter paper)에 여과하여 안토시아닌 외의 다른 물질들을 여과하여 안토시아닌 올리고머를 분리하였고 동결건조하여 안토시아닌 올리고머를 수득하였다. 안토시아닌 올리고머를 정제하기 위해서는 tubular, capillary, coiled spiral, place membrane을 이용하여 여과하는 것이 바람직하다.
안토시아닌 모노머를 대조군으로 하여 ESI mass를 걸어 피크를 관찰하였다. (도 7)이 그 결과이다. 이에 비해 수득한 안토시아닌 올리고머를 대상으로 ESI mass를 걸어 피크를 관찰한 결과, (도 8)과 같이 (도 7)에 비해 분자량 600, 900 및 1200 부근에서 피크가 높아지는 것이 관찰되었다. 이는 안토시아닌 모노머가 발효의 결과로 다이머(dimer), 트리머(trimer), 테트라머(tetramer) 등 안토시아닌 올리고머(oligomer)로 변환되었음을 의미하는 것으로, 합성되었음이 확인되었다.
안토시아닌 올리고머를 만드는 조효소를 분리하고 그 특성과 배양조건을 확인하기 위해, (도 9)와 같은 SDS-PAGE 결과 사진을 얻을 수 있었다. 배양 기간을 4 ~ 8일로 다양하게 하여 추출되는 조효소의 양을 SDS-PAGE를 통해 비교한 결과, 6 ~ 8일의 조건에서는 시간이 지나도 조효소의 양이 비슷하게 추출되었다. 따라서 안토시아닌 올리고머의 합성을 위한 조효소를 마련하기 위해 검정곰팡이(Aspergillus niger, 아스퍼질러스 나이저)를 5일간 배양하는 것이 최적임을 확인할 수 있다.
또한 (도 10)에서 사각형으로 표시한 대로, 9개의 얇은 조각을 얻어 각각 트립신 단백질 분해 효소를 이용하여 분해 한 후 Q-STAR Pulsar ESI-hybrid Q-TOF 기기에서 LC-MS/MS분석을 실시하였다. 이 결과 수 십개의 단백질들을 확인하고 이들을 MS/MS spectra 피크를 Analyst QS (v1.1, Applied Biosystems)로 분석해 단백질들을 동정하였다. 동정한 단백질은 아래의 표 내용과 같다. 검정곰팡이(Aspergillus niger, 아스퍼질러스 나이저)의 경우 현재 산업적으로 유용한 모델 균류로 각광받고 있으므로 이들 균류는 여러 가지 식품 첨가물이나 의약품, 산업 효소들의 생산에 매우 적합한 가수분해 단백질 (hydrolytic proteins)들을 분비하는 것이 알려져 있다. 아래 표 1 내지 표 2에서 동정된 단백질들 중, 일부 안토시아닌 올리고머 대사와 관계있을 것으로 예상되는 단백질들을 선택하여 기울림꼴로 표기하였다.
[표 1]
Figure PCTKR2016008429-appb-I000001
[표 2]
Figure PCTKR2016008429-appb-I000002
실시예 3. 아스퍼질러스 속 균 배양액에서 얻은 조효소 중 Glucosidase와 Viscozyme L 의 올리고머 합성 능력 확인
(도 11)에서 정리한 대로, 안토시아닌 모노머와 증류수를 1:10의 질량비로 혼합하여 안토시아닌 모노머 용액을 준비했다. 그리고 안토시아닌 모노머 용액과 검정곰팡이(Aspergillus niger, 아스퍼질러스 나이저) 균주 조효소에서 분리한 효소인 glucosidase와 viscozyme L을 각각 1000:1과 500:1의 질량비로 혼합(도 11에 100:1로 도시되어 있는 것은, 용액이 아닌 안토시아닌 모노머 자체와 효소의 질량 비율임. Glucosidase가 효소 효율이 더 좋기 때문에 비슷한 효율을 보기위해서 Viscozyme L을 2배 많은 양으로 혼합함.)하여 25℃의 온도에서 5일 동안 발효시켰다.
Viscozyme L은 Glucosidase를 포함하는 효소이며 판매되는 효소이다.
발효시킨 후, 이를 여과지(filter paper)에 여과하여 안토시아닌 외의 다른 물질들을 여과하여 안토시아닌 올리고머를 분리하였고 동결건조하여 안토시아닌 올리고머를 수득하였다. 안토시아닌 올리고머를 정제하기 위해서는 tubular, capillary, coiled spiral, place membrane을 이용하여 여과하는 것이 바람직하다.
안토시아닌 모노머를 대조군으로 하여 ESI mass를 걸어 피크를 관찰하였다. (도 12)가 그 결과이다. 이에 비해 검정곰팡이(Aspergillus niger, 아스퍼질러스 나이저) 균주 조효소에서 분리한 효소인 glucosidase와 viscozyme L를 이용해 얻은 안토시아닌 올리고머를 대상으로 ESI mass를 걸어 피크를 관찰한 결과, (도 13) 및 (도 14)와 같이 (도 12)에 비해 분자량 600, 900 및 1200 부근에서 피크가 높아지는 것이 관찰되었다. 이는 안토시아닌 모노머가 발효의 결과로 다이머(dimer), 트리머(trimer), 테트라머(tetramer) 등 안토시아닌 올리고머(oligomer)로 변환되었음을 의미하는 것으로, 합성되었음이 확인되었다. 추가로, 효소를 glucosidase를 사용한 (도 13)의 경우 올리고머의 비율이 viscozyme L를 사용한 (도 14)의 경우보다 높은 것을 확인하였다.
각 효소로 얻은 안토시아닌 올리고머의 효능을 비교하기 위해, (도 15)와 같이 Glucosidase로 얻은 올리고머와 Viscozyme L로 얻은 올리고머의 농도를 달리하여, 하이드록실 라디칼을 소거하는 효능을 실험하였다. 실험 결과 Glucosidase로 얻은 올리고머의 저해 중간값(inhibitory concentration, IC50)인 0.217 ㎎/㎖이 Viscoayme L로 얻은 올리고머의 저해 중간값인 0.278 ㎎/㎖에 비해 훨씬 낮은 값이므로, 낮은 농도로도 라디칼 소거 효능이 있음이 확인되었다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

  1. (1) 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 균주를 배양한 배양액에서 수용성 조효소를 분리하는 단계; 및
    (2) 안토시아닌 모노머에 상기 (1)단계에서 분리한 조효소를 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는 안토시아닌 올리고머의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 (1)단계의 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 균주는,
    아스퍼질러스 나이저(Aspergillus niger)인 것을 특징으로 하는 안토시아닌 올리고머의 제조방법
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 (1)단계의 균주는 15~30℃의 온도에서 4~8일 동안 배양되는 것을 특징으로 하는 안토시아닌 올리고머의 제조 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 (1)단계의 조효소는 배양액에 유기 용매를 넣어 침전시킨 후 얻은 침전물에서 증류수에 용해되어 효소로서 분리되는 것을 특징으로 하는 안토시아닌 올리고머의 제조 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 (2)단계의 발효는 안토시아닌 모노머와 증류수를 1:8 내지 1:15의 질량비로 혼합하여 안토시아닌 모노머 용액을 준비한 뒤, 상기 안토시아닌 모노머 용액과 상기 (1)단계에서 분리한 조효소를 기질 대 효소 비 40:1 내지 60:1의 질량비로 혼합하여 수행되는 것을 특징으로 하는 안토시아닌 올리고머의 제조 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 (2)단계의 발효는 15~30℃의 온도에서 5~10일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 안토시아닌 올리고머의 제조 방법.
  7. 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 균주를 배양한 배양액에 있고, 글루코시다제(Glucosidase)를 유효성분으로 포함하는 조효소와 비스코자임 L(Viscozyme L)을, 안토시아닌 모노머에 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는 안토시아닌 올리고머의 제조 방법.
PCT/KR2016/008429 2016-01-27 2016-08-01 아스퍼질러스 속 균 유래의 조효소를 이용하는 안토시아닌 올리고머의 제조 방법 WO2017131305A1 (ko)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE112016006312.1T DE112016006312B4 (de) 2016-01-27 2016-08-01 Verfahren zur Herstellung von Anthocyaninoligomeren unter Verwendung von Coenzym, das von Aspergillus Sp.-Stamm abgeleitet ist
CN201680080097.9A CN108603212B (zh) 2016-01-27 2016-08-01 利用来自曲霉属菌的辅酶的花色素苷低聚物的制造方法
JP2018558098A JP6803399B2 (ja) 2016-01-27 2016-08-01 アスペルギルス属菌由来の補酵素を用いるアントシアニジンオリゴマー製造方法
US16/046,012 US10774351B2 (en) 2016-01-27 2018-07-26 Method for preparing anthocyanin oligomers by using coenzyme derived from Aspergillus sp. strain

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160010085A KR101756123B1 (ko) 2016-01-27 2016-01-27 아스퍼질러스 속 균 유래의 조효소를 이용하는 안토시아닌 올리고머의 제조 방법
KR10-2016-0010085 2016-01-27

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US16/046,012 Continuation US10774351B2 (en) 2016-01-27 2018-07-26 Method for preparing anthocyanin oligomers by using coenzyme derived from Aspergillus sp. strain

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017131305A1 true WO2017131305A1 (ko) 2017-08-03

Family

ID=59398117

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2016/008429 WO2017131305A1 (ko) 2016-01-27 2016-08-01 아스퍼질러스 속 균 유래의 조효소를 이용하는 안토시아닌 올리고머의 제조 방법

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10774351B2 (ko)
JP (1) JP6803399B2 (ko)
KR (1) KR101756123B1 (ko)
CN (1) CN108603212B (ko)
DE (1) DE112016006312B4 (ko)
WO (1) WO2017131305A1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200019082A (ko) * 2018-08-13 2020-02-21 주식회사 키토라이프 비스코자임 l을 이용한 안토시아닌 올리고머 제조방법
KR102176783B1 (ko) * 2019-06-14 2020-11-10 정특래 안토시아닌 올리고머를 포함하는 전립선 비대증 치료 조성물

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101255453A (zh) * 2007-11-26 2008-09-03 杨蕴力 应用发酵法提取紫甘薯花青素色素的方法
JP2012213358A (ja) * 2011-03-31 2012-11-08 Fujikin Inc アントシアニンの生産方法
JP2013159603A (ja) * 2012-02-09 2013-08-19 Yoshihiro Futamura 皮膚美白作用を有するアントシアニン誘導体の製造方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH666906A5 (fr) * 1985-07-09 1988-08-31 Debiopharm Sa Procede pour l'obtention de polymeres d'anthocyanosides de raisins vitis vinifera l.
ES2305981T3 (es) * 1999-04-23 2008-11-01 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Un procedimiento para la purificacion de oligomeros de proantocianidina.
JP4251388B2 (ja) 2002-04-17 2009-04-08 財団法人くまもとテクノ産業財団 アントシアンを含有する発酵酒の製造方法
CN100467586C (zh) * 2006-06-14 2009-03-11 浙江工业大学 一种同时高产柚苷酶和橙皮苷酶的黑曲霉菌wz001及其应用
KR101182630B1 (ko) 2012-05-29 2012-09-14 강원대학교산학협력단 구조적 안정성이 강화된 안토시아닌 유도체 및 그의 합성방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101255453A (zh) * 2007-11-26 2008-09-03 杨蕴力 应用发酵法提取紫甘薯花青素色素的方法
JP2012213358A (ja) * 2011-03-31 2012-11-08 Fujikin Inc アントシアニンの生産方法
JP2013159603A (ja) * 2012-02-09 2013-08-19 Yoshihiro Futamura 皮膚美白作用を有するアントシアニン誘導体の製造方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PRICELIUS, SINA ET AL.: "Substrate Specificities of Glycosidases from Aspergillus Species Pectinase Preparations on Elderberry Anthocyanins", JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY, vol. 57, no. 3, 2009, pages 1006 - 1012, XP055402692 *
YAN, YAJUN ET AL.: "Metabolic Engineering of Anthocyanin Biosynthesis in Escherichia Coli", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 71, no. 7, 2005, pages 3617 - 3623, XP002733533 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200019082A (ko) * 2018-08-13 2020-02-21 주식회사 키토라이프 비스코자임 l을 이용한 안토시아닌 올리고머 제조방법
KR102272352B1 (ko) 2018-08-13 2021-07-02 주식회사 키토라이프 비스코자임 l을 이용한 안토시아닌 올리고머 제조방법
KR102176783B1 (ko) * 2019-06-14 2020-11-10 정특래 안토시아닌 올리고머를 포함하는 전립선 비대증 치료 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
JP2019505234A (ja) 2019-02-28
KR101756123B1 (ko) 2017-07-17
JP6803399B2 (ja) 2020-12-23
US20180327795A1 (en) 2018-11-15
CN108603212A (zh) 2018-09-28
CN108603212B (zh) 2021-07-16
US10774351B2 (en) 2020-09-15
DE112016006312T5 (de) 2018-10-25
DE112016006312B4 (de) 2019-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2017160010A1 (ko) 포도나무 조직의 세포배양으로부터 스테비오사이드를 이용한 비니페린을 대량생산하는 방법
CN112807253A (zh) 一种裂褶菌发酵产物及其制备方法、护肤品
WO2017131305A1 (ko) 아스퍼질러스 속 균 유래의 조효소를 이용하는 안토시아닌 올리고머의 제조 방법
Tatum et al. Naphthoquinones produced by Fusarium oxysporum isolated from citrus
US4056615A (en) Lucknomycin and process for producing same
WO2016085290A1 (ko) 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체를 유효성분으로 함유하는 항산화용 조성물
WO2017023070A1 (ko) 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체를 유효성분으로 함유하는 피로회복 증진용 조성물
WO2016072697A1 (ko) 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체를 유효성분으로 함유하는 혈압강하용 조성물
KR100397793B1 (ko) 느릅나무로부터 분리된 신규의 미생물 및 그를 이용한항암 면역활성의 세포밖 당화합물의 제조방법
US20100152467A1 (en) Method for producing cercosporamide
US4503152A (en) Process for preparing antibiotic AM-2604-A
US3190801A (en) Antibiotic distamycin and method of production
CN113501887B (zh) 具有活性的感应草多糖及其制备方法
Trussell et al. Actinomycin from a new Streptomyces
CN108503534A (zh) 对羟基苯甲酸的提取方法及应用
CN110790846B (zh) 具有生物活性的紫花苜蓿茎叶多糖及其硒化改性多糖的制备
Ballio et al. A nitrosophenol cobalt chelate produced by a streptomycete
WO2021167166A1 (ko) 리사이클 액체크로마토그래피를 이용한 동충하초로부터 고순도 코디세핀의 대량정제 방법
EP0420470B1 (en) Naphthopyran compounds
JPS63218681A (ja) オリゴマイシンｅ
WO2020101371A1 (ko) 식물의 캘러스 배양액을 이용한 이합체 스틸벤 생산 방법
KR100455905B1 (ko) 색소생산능이 높은 모나스커스 퍼퍼러스 klhs4
CN116283727A (zh) 一种chaetoglobosin类化合物及其制备方法和应用
US4753959A (en) Antibiotic lactone compound
WO2020055082A2 (ko) 페오닥틸럼 분획물을 대량 생산하는 방법

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16888281

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018558098

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 112016006312

Country of ref document: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 16888281

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1