JP6803399B2 - アスペルギルス属菌由来の補酵素を用いるアントシアニジンオリゴマー製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、アスペルギルス属菌からの補酵素を用いるアントシアニジンオリゴマー製造方法に関し、さらに詳細には、アントシアニンモノマーを、アスペルギルス属菌の一種である黒カビ（アスペルギルス・ニガー）の補酵素と、該補酵素に含まれている個別酵素であるグルコシダーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）で発酵させてアントシアニジンオリゴマーを製造する方法に関する。
アントシアニンは、天然色素としての機能に加えて、例えば、抗酸化、コレステロール低下、視力改善効果、血管保護機能、動脈硬化・心臓病の予防、抗潰瘍機能、抗がん、抗炎症、糖尿病抑制、紫外線からの保護機能などのさまざまな生理活性を示し、医薬品にも積極的に活用されており、健康食品及び新医薬品の創出の新たな対象として注目を浴びている。
アントシアニンは、中性またはアルカリ溶液で不安定であり、酸性溶液においても光に晒されると色が徐々に脱色する現象を示し、構造的に最も不安定な物質の一つに挙げられる。特にアントシアニン色素の安定性に影響を与える要因としては、アントシアニンの化学構造、色素の濃度、溶液のｐＨ、温度、共存色素の有無、金属イオン、酵素、酸素、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）、糖などが挙げられるが、これらの要因の違いによって色度の維持、すなわち構造的安定性が異なる。この構造的不安定性のため、食品及び医薬品としての積極的活用には多くの困難さが発生しているので、安定性を高めるための研究が進められている。
アントシアニンは、中性またはアルカリ溶液で不安定であり、酸性溶液においても光に晒されると色が徐々に脱色する現象を示し、構造的に最も不安定な物質の一つに挙げられる。特にアントシアニン色素の安定性に影響を与える要因としては、アントシアニンの化学構造、色素の濃度、溶液のｐＨ、温度、共存色素の有無、金属イオン、酵素、酸素、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）、糖などが挙げられるが、これらの要因の違いによって色度の維持、すなわち構造的安定性が異なる。この構造的不安定性のため、食品及び医薬品としての積極的活用には多くの困難さが発生しているので、安定性を高めるための研究が進められている。
ほとんどの食材に含まれているアントシアニンは、単量体形態であるが、この形態は、中性及びアルカリ性に不安定で、光と熱に不安定であるという欠点がある。重合体形態は、食品中に少量存在するが、単量体よりも機能性及び安定度が高く、既存の代表的な抗酸化機能も倍加することになる。最近、近視と弱視の問題において、主観的な症状及びコントラスト感度を改善するアントシアニジンオリゴマーに関する研究が報告されている。
関連従来技術としては、特許文献１（韓国登録特許第１０−１１８２６３０号，２０１２年９月７日）及び特許文献２（韓国公開特許第１０−２０１２−００７９０４０号，２０１２年７月１１日）などがある。
関連従来技術としては、特許文献１（韓国登録特許第１０−１１８２６３０号，２０１２年９月７日）及び特許文献２（韓国公開特許第１０−２０１２−００７９０４０号，２０１２年７月１１日）などがある。
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属糸状菌は、酵素、有機酸および薬理活性のある代謝産物を生産する有用な微生物であって、食品産業、酒類産業、医薬業だけでなく、農業にも有用に用いられてきたとともに、古くから伝統的な発酵食品の生産に用いられてきたから、安全な菌株として認識されている。また、菌類は、外部へ排出する外酵素（ｅｘｏｅｎｚｙｍｅ）が多く、機能が多様であるため、これを利用すれば、有用な物質を、天然酵素を用いて経済性よく生産することができる。従来、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属糸状菌を用いてアントシアニジンオリゴマーを生産した研究が報告されているが、菌株を直接用いると、アントシアニジンオリゴマーを生産する過程で汚染が生じるという欠点があった。
本発明者らは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌を直接用いず、外部へ排出する酵素を用いて、アントシアニジンオリゴマーを製造することができるかを確認するために、黒カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、アスペルギルス・ニガー）菌を培養した培養液から抽出した補酵素と、該補酵素を分析して得られたグルコシダーゼ（ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）及びビスコザイムＬ（Ｖｉｓｃｏｚｙｍｅ Ｌ）酵素を用いた製造方法を考案し、その効能を確認することにより、本発明を完成した。
本発明者らは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌を直接用いず、外部へ排出する酵素を用いて、アントシアニジンオリゴマーを製造することができるかを確認するために、黒カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、アスペルギルス・ニガー）菌を培養した培養液から抽出した補酵素と、該補酵素を分析して得られたグルコシダーゼ（ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）及びビスコザイムＬ（Ｖｉｓｃｏｚｙｍｅ Ｌ）酵素を用いた製造方法を考案し、その効能を確認することにより、本発明を完成した。
本発明の目的は、黒カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、アスペルギルス・ニガー）の補酵素、該補酵素を分析して得られたグルコシダーゼ（ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）及びビスコザイムＬ（Ｖｉｓｃｏｚｙｍｅ Ｌ）酵素を用いてアントシアニジンオリゴマーを合成することにより、前記アントシアニジンオリゴマーを経済的に生産する製造方法を提供することにある。
上記目的を達成するために、本発明は、（１）アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌株を培養した培養液から水溶性補酵素を分離する段階と、（２）アントシアニンモノマーに、前記（１）段階で分離した補酵素を添加して発酵させる段階とを含む、アントシアニジンオリゴマー製造方法を提供する。
好ましくは、前記（１）段階のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌株はアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）である。
好ましくは、前記（１）段階の菌株は１５〜３０℃の温度で４〜８日間培養される。
好ましくは、前記（１）段階の補酵素は、培養液に有機溶媒を入れて沈殿させた後に得られる沈殿物から蒸留水に溶解して酵素として分離される。
好ましくは、前記（２）段階の発酵は、アントシアニンモノマーと蒸留水とを１：８乃至１：１５の質量比で混合してアントシアニンモノマー溶液を用意した後、前記アントシアニンモノマー溶液と前記（１）段階で分離した補酵素とを基質対酵素比４０：１〜６０：１の質量比で混合して行われる。
好ましくは、前記（２）段階の発酵は１５〜３０℃の温度で５〜１０日間行われる。
また、本発明は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌株を培養した培養液にある、グルコシダーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）を有効成分として含む補酵素とビスコザイムＬ（Ｖｉｓｃｏｚｙｍｅ Ｌ）を、アントシアニンモノマーに添加して発酵させる段階を含む、アントシアニジンオリゴマー製造方法を提供する。
好ましくは、前記（１）段階のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌株はアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）である。
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好ましくは、前記（１）段階の補酵素は、培養液に有機溶媒を入れて沈殿させた後に得られる沈殿物から蒸留水に溶解して酵素として分離される。
好ましくは、前記（２）段階の発酵は、アントシアニンモノマーと蒸留水とを１：８乃至１：１５の質量比で混合してアントシアニンモノマー溶液を用意した後、前記アントシアニンモノマー溶液と前記（１）段階で分離した補酵素とを基質対酵素比４０：１〜６０：１の質量比で混合して行われる。
好ましくは、前記（２）段階の発酵は１５〜３０℃の温度で５〜１０日間行われる。
また、本発明は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌株を培養した培養液にある、グルコシダーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）を有効成分として含む補酵素とビスコザイムＬ（Ｖｉｓｃｏｚｙｍｅ Ｌ）を、アントシアニンモノマーに添加して発酵させる段階を含む、アントシアニジンオリゴマー製造方法を提供する。
上述した本発明によれば、黒カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、アスペルギルス・ニガー）を用いた培養過程上で生じる汚染問題を克服するために、黒カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、アスペルギルス・ニガー）の補酵素を抽出し、これを用いて発酵過程を経ることにより、既存のアントシアニンモノマーに比べて、汚染のおそれが少なく、ラジカル消去効果に優れる、アントシアニジンオリゴマーを製造する効果を確認した。
また、補酵素に含まれている酵素のうちグルコシダーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）を用いて発酵させたアントシアニジンオリゴマーが発酵効率及びラジカル消去能力に優れていることを確認したとともに、グルコシダーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）を含む酵素の発酵においてもアントシアニジンオリゴマーの重合を確認した。
また、補酵素に含まれている酵素のうちグルコシダーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）を用いて発酵させたアントシアニジンオリゴマーが発酵効率及びラジカル消去能力に優れていることを確認したとともに、グルコシダーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）を含む酵素の発酵においてもアントシアニジンオリゴマーの重合を確認した。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、（１）アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌株を培養した培養液から水溶性補酵素を分離する段階と、（２）アントシアニンモノマーに、前記（１）段階で分離した補酵素を添加して発酵させる段階とを含む、アントシアニジンオリゴマー製造方法を提供する。
前記（１）段階のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌株は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）であることが好ましい。
前記（１）段階の菌株は１５〜３０℃の温度で４〜８日間培養することが好ましい。さらに好ましくは、２５℃の温度で５日間培養する。
前記（１）段階の補酵素は、培養液に有機溶媒を入れて沈殿させた後に得られる沈殿物から、蒸留水に溶解して酵素として分離されることが好ましい。
前記（２）段階の発酵は、アントシアニンモノマーと蒸留水とを１：８乃至１：１５の質量比で混合してアントシアニンモノマー溶液を用意した後、前記アントシアニンモノマー溶液と前記（１）段階で分離した補酵素とを基質対酵素比４０：１乃至６０：１の質量比で混合して行われることが好ましい。基質はアントシアニンモノマーである。さらに好ましくは、アントシアニンモノマーと蒸留水とを１：１０の質量比で混合してアントシアニンモノマー溶液を用意した後、前記アントシアニンモノマー溶液と前記（１）段階で分離した補酵素とを５０：１の質量比で混合して行う。
前記（２）段階の発酵は１５〜３０℃の温度で５〜１０日間行われることが好ましい。さらに好ましくは、２５℃の温度で７日間培養する。７日に至るまではアントシアニジンオリゴマー合成量が増加したが、８日以後の条件では時間が経ってもアントシアニジンオリゴマー合成量が横ばいであることを確認した。
前記（１）段階で分離した補酵素は、グルコシダーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）を有効成分として含む。
また、本発明は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌株を培養した培養液にある、グルコシダーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）を有効成分として含む補酵素とビスコザイムＬ（Ｖｉｓｃｏｚｙｍｅ Ｌ）を、アントシアニンモノマーに添加して発酵させる段階を含む、アントシアニジンオリゴマー製造方法を提供する。
本発明は、（１）アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌株を培養した培養液から水溶性補酵素を分離する段階と、（２）アントシアニンモノマーに、前記（１）段階で分離した補酵素を添加して発酵させる段階とを含む、アントシアニジンオリゴマー製造方法を提供する。
前記（１）段階のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌株は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）であることが好ましい。
前記（１）段階の菌株は１５〜３０℃の温度で４〜８日間培養することが好ましい。さらに好ましくは、２５℃の温度で５日間培養する。
前記（１）段階の補酵素は、培養液に有機溶媒を入れて沈殿させた後に得られる沈殿物から、蒸留水に溶解して酵素として分離されることが好ましい。
前記（２）段階の発酵は、アントシアニンモノマーと蒸留水とを１：８乃至１：１５の質量比で混合してアントシアニンモノマー溶液を用意した後、前記アントシアニンモノマー溶液と前記（１）段階で分離した補酵素とを基質対酵素比４０：１乃至６０：１の質量比で混合して行われることが好ましい。基質はアントシアニンモノマーである。さらに好ましくは、アントシアニンモノマーと蒸留水とを１：１０の質量比で混合してアントシアニンモノマー溶液を用意した後、前記アントシアニンモノマー溶液と前記（１）段階で分離した補酵素とを５０：１の質量比で混合して行う。
前記（２）段階の発酵は１５〜３０℃の温度で５〜１０日間行われることが好ましい。さらに好ましくは、２５℃の温度で７日間培養する。７日に至るまではアントシアニジンオリゴマー合成量が増加したが、８日以後の条件では時間が経ってもアントシアニジンオリゴマー合成量が横ばいであることを確認した。
前記（１）段階で分離した補酵素は、グルコシダーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）を有効成分として含む。
また、本発明は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌株を培養した培養液にある、グルコシダーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）を有効成分として含む補酵素とビスコザイムＬ（Ｖｉｓｃｏｚｙｍｅ Ｌ）を、アントシアニンモノマーに添加して発酵させる段階を含む、アントシアニジンオリゴマー製造方法を提供する。
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されるものと解釈されないことは、当業分野における通常の知識を有する者にとって自明である。
実施例１．アスペルギルス属菌培養液のオリゴマー合成能力の確認
図１にまとめたとおり、アントシアニンモノマーと蒸留水とを１：１０の質量比で混合してアントシアニンモノマー溶液を用意した。そして、アントシアニンモノマー溶液と黒カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、アスペルギルス・ニガー）菌株培養液を９５：５の質量比で混合して２５℃の温度で５日間発酵させた。前記菌株培養液は、黒カビ菌株を培地溶液１Ｌで２５℃の条件下に５日間培養して作っておいた。
発酵させた後、これをろ紙（ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ）で濾過して菌株など、アントシアニン以外の物質を濾過することによりアントシアニジンオリゴマーを分離し、凍結乾燥させてアントシアニジンオリゴマーを得た。アントシアニジンオリゴマーを精製するためには、チューブラー（ｔｕｂｕｌａｒ）、キャピラリー（ｃａｐｉｌｌａｒｙ）、コイル状スパイラル（ｃｏｉｌｅｄ ｓｐｉｒａｌ）、平面膜（ｐｌａｎｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を用いて濾過することが好ましい。
図１にまとめたとおり、アントシアニンモノマーと蒸留水とを１：１０の質量比で混合してアントシアニンモノマー溶液を用意した。そして、アントシアニンモノマー溶液と黒カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、アスペルギルス・ニガー）菌株培養液を９５：５の質量比で混合して２５℃の温度で５日間発酵させた。前記菌株培養液は、黒カビ菌株を培地溶液１Ｌで２５℃の条件下に５日間培養して作っておいた。
発酵させた後、これをろ紙（ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ）で濾過して菌株など、アントシアニン以外の物質を濾過することによりアントシアニジンオリゴマーを分離し、凍結乾燥させてアントシアニジンオリゴマーを得た。アントシアニジンオリゴマーを精製するためには、チューブラー（ｔｕｂｕｌａｒ）、キャピラリー（ｃａｐｉｌｌａｒｙ）、コイル状スパイラル（ｃｏｉｌｅｄ ｓｐｉｒａｌ）、平面膜（ｐｌａｎｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を用いて濾過することが好ましい。
アントシアニンモノマーを対照群とし、ＥＳＩ ｍａｓｓをかけてピークを観察した。図２に示すように、分子量３００付近のピークが非常に高いことを確認することができた。これに比べて、得られたアントシアニジンオリゴマーを対象にＥＳＩ ｍａｓｓをかけてピークを観察した結果、図３に示すように、分子量６００付近で高いピークが観察されたとともに、９００と１２００付近でもピークが観察された。これは、アントシアニンモノマーが発酵の結果としてダイマー（ｄｉｍｅｒ）、トリマー（ｔｒｉｍｅｒ）、テトラマー（ｔｅｔｒａｍｅｒ）などのアントシアニジンオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）に変換されたことを意味するもので、合成されたことが確認された。
アントシアニンモノマーとオリゴマーとの効能を比較するために、図４に示すように、モノマーとオリゴマーの濃度を異ならせて、ヒドロキシルラジカルを消去する効能を実験した。実験の結果、オリゴマーの抑制濃度（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、ＩＣ５０）がモノマーに比べて半分程度にしかならないため、低濃度でもラジカル消去効能があることが確認された。
アントシアニンモノマーとオリゴマーとの効能を比較するために、図４に示すように、モノマーとオリゴマーの濃度を異ならせて、ヒドロキシルラジカルを消去する効能を実験した。実験の結果、オリゴマーの抑制濃度（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、ＩＣ５０）がモノマーに比べて半分程度にしかならないため、低濃度でもラジカル消去効能があることが確認された。
実施例２．アスペルギルス属菌培養液から得られた補酵素のオリゴマー合成能力の確認
図５にまとめたように、黒カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、アスペルギルス・ニガー）菌株培養液から補酵素を得るために、黒カビ菌株を培地溶液２Ｌで２５℃の条件下に５日間培養して培養液を得、培地をろ紙（ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ）で濾過して菌株を除去し、アセトンを投入して４℃で８〜１２時間沈殿させた。３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、培養沈殿物を得、培養沈殿物の中から３次蒸留水に溶解する酵素を分離し、凍結乾燥させて補酵素を準備した。
次に、図６にまとめたように、アントシアニンモノマーと蒸留水を１：１０の質量比で混合してアントシアニンモノマー溶液を用意した。そして、アントシアニンモノマー溶液と補酵素とを５００：１の質量比で混合して２５℃の温度で５日間発酵させた。
発酵させた後、これをろ紙（ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ）で濾過してアントシアニン以外の物質を濾過することにより、アントシアニジンオリゴマーを分離し、凍結乾燥させてアントシアニジンオリゴマーを得た。アントシアニジンオリゴマーを精製するためには、チューブラー（ｔｕｂｕｌａｒ）、キャピラリー（ｃａｐｉｌｌａｒｙ）、コイル状スパイラル（ｃｏｉｌｅｄ ｓｐｉｒａｌ）、平面膜（ｐｌａｎｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を用いて濾過することが好ましい。
図５にまとめたように、黒カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、アスペルギルス・ニガー）菌株培養液から補酵素を得るために、黒カビ菌株を培地溶液２Ｌで２５℃の条件下に５日間培養して培養液を得、培地をろ紙（ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ）で濾過して菌株を除去し、アセトンを投入して４℃で８〜１２時間沈殿させた。３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、培養沈殿物を得、培養沈殿物の中から３次蒸留水に溶解する酵素を分離し、凍結乾燥させて補酵素を準備した。
次に、図６にまとめたように、アントシアニンモノマーと蒸留水を１：１０の質量比で混合してアントシアニンモノマー溶液を用意した。そして、アントシアニンモノマー溶液と補酵素とを５００：１の質量比で混合して２５℃の温度で５日間発酵させた。
発酵させた後、これをろ紙（ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ）で濾過してアントシアニン以外の物質を濾過することにより、アントシアニジンオリゴマーを分離し、凍結乾燥させてアントシアニジンオリゴマーを得た。アントシアニジンオリゴマーを精製するためには、チューブラー（ｔｕｂｕｌａｒ）、キャピラリー（ｃａｐｉｌｌａｒｙ）、コイル状スパイラル（ｃｏｉｌｅｄ ｓｐｉｒａｌ）、平面膜（ｐｌａｎｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を用いて濾過することが好ましい。
アントシアニンモノマーを対照群とし、ＥＳＩ ｍａｓｓをかけてピークを観察した。図７がその結果である。これに比べて、得られたアントシアニジンオリゴマーを対象にＥＳＩ ｍａｓｓをかけてピークを観察した結果、図８に示すように、図７に比べて分子量６００、９００および１２００付近でピークが高くなることが観察された。これは、アントシアニンモノマーが発酵の結果としてダイマー（ｄｉｍｅｒ）、トリマー（ｔｒｉｍｅｒ）、テトラマー（ｔｅｔｒａｍｅｒ）などのアントシアニジンオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）に変換されたことを意味するもので、合成されたことが確認された。
アントシアニジンオリゴマーを作る補酵素を分離し、その特性と培養条件を確認するために、図９のようなＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果写真を得ることができた。培養期間を４〜８日に多様にして抽出される補酵素の量をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって比較した結果、６〜８日の条件では時間が経っても補酵素の量がほぼ同様に抽出された。したがって、アントシアニジンオリゴマーの合成のための補酵素を用意するために、黒カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、アスペルギルス・ニガー）を５日間培養することが最適であることを確認することができる。
また、図１０に四角形で表示したように、９つの薄片を得て、それぞれトリプシンタンパク質分解酵素を用いて分解した後、Ｑ−ＳＴＡＲ Ｐｕｌｓａｒ ＥＳＩ−ｈｙｂｒｉｄ Ｑ−ＴＯＦ機器でＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。その結果、数十個のタンパク質を確認し、これらのＭＳ／ＭＳスペクトルピークをＡｎａｌｙｓｔ ＱＳ（ｖ１．１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析してタンパク質を同定した。同定したタンパク質は、下記表のとおりである。黒カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、アスペルギルス・ニガー）の場合、現在産業的に有用なモデル菌類として脚光を浴びているので、これらの菌類は様々な食品添加物や医薬品、産業用酵素の生産に非常に適した加水分解タンパク質（ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を分泌することが知られている。下記表１乃至表２において、同定されたタンパク質のうち、一部のアントシアニジンオリゴマー代謝と関係があるものと予想されるタンパク質を選択して、斜体文字で表記した。
アントシアニジンオリゴマーを作る補酵素を分離し、その特性と培養条件を確認するために、図９のようなＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果写真を得ることができた。培養期間を４〜８日に多様にして抽出される補酵素の量をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって比較した結果、６〜８日の条件では時間が経っても補酵素の量がほぼ同様に抽出された。したがって、アントシアニジンオリゴマーの合成のための補酵素を用意するために、黒カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、アスペルギルス・ニガー）を５日間培養することが最適であることを確認することができる。
また、図１０に四角形で表示したように、９つの薄片を得て、それぞれトリプシンタンパク質分解酵素を用いて分解した後、Ｑ−ＳＴＡＲ Ｐｕｌｓａｒ ＥＳＩ−ｈｙｂｒｉｄ Ｑ−ＴＯＦ機器でＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。その結果、数十個のタンパク質を確認し、これらのＭＳ／ＭＳスペクトルピークをＡｎａｌｙｓｔ ＱＳ（ｖ１．１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析してタンパク質を同定した。同定したタンパク質は、下記表のとおりである。黒カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、アスペルギルス・ニガー）の場合、現在産業的に有用なモデル菌類として脚光を浴びているので、これらの菌類は様々な食品添加物や医薬品、産業用酵素の生産に非常に適した加水分解タンパク質（ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を分泌することが知られている。下記表１乃至表２において、同定されたタンパク質のうち、一部のアントシアニジンオリゴマー代謝と関係があるものと予想されるタンパク質を選択して、斜体文字で表記した。
実施例３．アスペルギルス属菌の培養液から得られた補酵素のうちのグルコシダーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）及びビスコザイムＬ（Ｖｉｓｃｏｚｙｍｅ Ｌ）のオリゴマー合成能力の確認
図１１でまとめたように、アントシアニンモノマーと蒸留水とを１：１０の質量比で混合してアントシアニンモノマー溶液を用意した。アントシアニンモノマー溶液と、黒カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、アスペルギルス・ニガー）菌株補酵素から分離した酵素であるグルコシダーゼ（ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）とビスコザイムＬ（ｖｉｓｃｏｚｙｍｅ Ｌ）をそれぞれ１０００：１と５００：１の質量比で混合（図１１に１００：１で示されているものは、溶液ではなく、アントシアニンモノマー自体と酵素との質量比である。グルコシダーゼがより良い酵素効率を持つから、類似する効率を示すために、ビスコザイムＬ（Ｖｉｓｃｏｚｙｍｅ Ｌ）を２倍多い量で混合する。）して、２５℃の温度で５日間発酵させた。
ビスコザイムＬ（Ｖｉｓｃｏｚｙｍｅ Ｌ）は、グルコシダーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）を含む酵素であり、市販の酵素である。
発酵させた後、これをろ紙（ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ）で濾過してアントシアニン以外の物質を濾過することにより、アントシアニジンオリゴマーを分離し、凍結乾燥させてアントシアニジンオリゴマーを得た。アントシアニジンオリゴマーを精製するためには、チューブラー（ｔｕｂｕｌａｒ）、キャピラリー（ｃａｐｉｌｌａｒｙ）、コイル状スパイラル（ｃｏｉｌｅｄ ｓｐｉｒａｌ）、平面膜（ｐｌａｎｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を用いて濾過することが好ましい。
図１１でまとめたように、アントシアニンモノマーと蒸留水とを１：１０の質量比で混合してアントシアニンモノマー溶液を用意した。アントシアニンモノマー溶液と、黒カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、アスペルギルス・ニガー）菌株補酵素から分離した酵素であるグルコシダーゼ（ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）とビスコザイムＬ（ｖｉｓｃｏｚｙｍｅ Ｌ）をそれぞれ１０００：１と５００：１の質量比で混合（図１１に１００：１で示されているものは、溶液ではなく、アントシアニンモノマー自体と酵素との質量比である。グルコシダーゼがより良い酵素効率を持つから、類似する効率を示すために、ビスコザイムＬ（Ｖｉｓｃｏｚｙｍｅ Ｌ）を２倍多い量で混合する。）して、２５℃の温度で５日間発酵させた。
ビスコザイムＬ（Ｖｉｓｃｏｚｙｍｅ Ｌ）は、グルコシダーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）を含む酵素であり、市販の酵素である。
発酵させた後、これをろ紙（ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ）で濾過してアントシアニン以外の物質を濾過することにより、アントシアニジンオリゴマーを分離し、凍結乾燥させてアントシアニジンオリゴマーを得た。アントシアニジンオリゴマーを精製するためには、チューブラー（ｔｕｂｕｌａｒ）、キャピラリー（ｃａｐｉｌｌａｒｙ）、コイル状スパイラル（ｃｏｉｌｅｄ ｓｐｉｒａｌ）、平面膜（ｐｌａｎｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を用いて濾過することが好ましい。
アントシアニンモノマーを対照群とし、ＥＳＩ ｍａｓｓをかけてピークを観察した。図１２がその結果である。これに比べて、黒カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、アスペルギルス・ニガー）菌株補酵素から分離した酵素であるグルコシダーゼ（ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）とビスコザイムＬ（ｖｉｓｃｏｚｙｍｅ Ｌ）を用いて得られたアントシアニジンオリゴマーを対象にＥＳＩ ｍａｓｓをかけてピークを観察した結果、図１３及び図１４に示すように、図１２に比べて分子量６００、９００および１２００付近でピークが高くなることが観察された。これは、アントシアニンモノマーが発酵の結果としてダイマー（ｄｉｍｅｒ）、トリマー（ｔｒｉｍｅｒ）、テトラマー（ｔｅｔｒａｍｅｒ）などのアントシアニジンオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）に変換されたことを意味するもので、合成されたことが確認された。さらに、酵素としてグルコシダーゼ（ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）を用いた図１３の場合は、オリゴマーの割合がビスコザイムＬ（ｖｉｓｃｏｚｙｍｅ Ｌ）を用いた図１４の場合よりも高いことを確認した。
各酵素で得たアントシアニジンオリゴマーの効能を比較するために、図１５に示すように、グルコシダーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）で得られたオリゴマーとビスコザイムＬ（Ｖｉｓｃｏｚｙｍｅ Ｌ）で得られたオリゴマーとの濃度を異ならせて、ヒドロキシルラジカルを消去する効能を実験した。実験結果、グルコシダーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）で得られたオリゴマーの抑制濃度（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、ＩＣ５０）である０．２１７ｍｇ／ｍＬが、ビスコザイムＬ（Ｖｉｓｃｏａｙｍｅ Ｌ）で得られたオリゴマーの抑制濃度である０．２７８ｍｇ／ｍＬに比べて遥かに低い値なので、低濃度でもラジカル消去効能があることが確認された。
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業分野における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好適な実施様態に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されるものではないことは明白であろう。よって、本発明の実質的な範囲は、添付された請求の範囲及びそれらの等価物によって定められると理解されるべきである。
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業分野における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好適な実施様態に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されるものではないことは明白であろう。よって、本発明の実質的な範囲は、添付された請求の範囲及びそれらの等価物によって定められると理解されるべきである。
Claims (3)
- （１）アントシアニンモノマーに、ビスコザイムＬ（Ｖｉｓｃｏｚｙｍｅ（登録商標） Ｌ）を添加して反応させる段階を含む、アントシアニジンオリゴマー製造方法。
- 前記（１）段階の反応が、
アントシアニンモノマーと蒸留水とを１：８乃至１：１５の質量比で混合してアントシアニンモノマー溶液を用意した後、前記アントシアニンモノマー溶液と前記ビスコザイムＬとを基質対酵素比４０：１〜６０：１の質量比で混合して行われることを特徴とする、
請求項１に記載のアントシアニジンオリゴマー製造方法。 - 前記（１）段階の反応が１５〜３０℃の温度で５〜１０日間行われることを特徴とする、請求項１に記載のアントシアニジンオリゴマー製造方法。
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