KR20230100676A - 당근 추출물 또는 그 발효물을 이용한 항염증용 조성물 - Google Patents

당근 추출물 또는 그 발효물을 이용한 항염증용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포독성을 보이지 않으면서 LPS(lipopolysaccharide)로 자극된 마우스 대식세포주(RAW 264.7 cells)에서 농도 의존적으로 NO 생성을 억제하고 또 iNOS 발현을 억제하는 활성을 가진, 당근 추출물 또는 그 발효물을 이용한 항염증용 조성물을 개시한다.

Description

당근 추출물 또는 그 발효물을 이용한 항염증용 조성물{Composition for Anti-inflammation Using a Carrot Extact or a Carrot Fermentation Product}
본 발명은 당근(Daucus carota var. sativa) 추출물 또는 그 발효물을 이용한 항염증용 조성물에 관한 것이다.
염증은 물리적인 외상, 유해한 화학물질, 박테리아, 곰팡이, 바이러스에 의한 감염이나 생체 내 대사산물 중의 자극성 물질에 의하여 야기되는 병리적 상태에 대응하여 나타나는 국소적인 생체의 방어 반응이다. 염증은 손상된 조직과 이동하는 세포(migrating cells)로부터 생산되는 다양한 염증 매개 인자에 의하여 촉발된다. 염증 반응 시에는 염증 부위에 혈장이 축적되어 세균이 분비한 독성을 희석시키며, 혈류가 증가하고, 홍반, 통증, 부종, 발열 등의 증상이 수반되게 된다. 정상적인 경우에 생체는 염증 반응을 통하여 발병 요인을 중화시키거나 제거하고 상한 조직을 재생시켜서 정상적인 구조와 기능을 회복시키지만, 그렇지 못한 경우에는 만성 염증과 같은 질병 상태로 진행되기도 한다.
최근 분자생물학의 발달로 분자적 수준에서 염증 반응에 대한 많은 연구가 이루어져 있다.
염증 반응에는 다양한 생화학적 현상이 관여하지만, 특히 대식세포(Macrophage)는 화학적 자극 등에 의하여 산화질소(NO)와 IL-1β, TNF-α, IL-6 등의 염증성 사이토카인을 생성하여 염증반응에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Ito T., et al., Curr Drug Traget Inflamm Allergy, 2(3):257-265, 2003).
산화질소는 산화질소의 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)의 작용에 의하여 L-아르기닌(L-arginine)으로부터 합성되는데, NOS는 몇 가지 이소 형태가 존재한다. 뇌에 존재하는 bNOS(brain NOS), 신경계에 존재하는 nNOS(neuronal NOS), 혈관 내피계에 존재하는 eNOS(endothelial NOS) 등은 체내에서 항상 일정수준으로 발현되고 있으며, 이들에 의해 소량 생성되는 일산화질소(NO)는 혈압 조절 작용, 신경 전달 작용, 학습, 기억 등과 관련된 다양한 생리 반응을 수행함으로써 인체의 항상성 유지에 중요한 역할을 수행한다. 이에 반하여 세균 외막의 지질 단백인 LPS(lipopolysacchride) 등 여러 내·외부 면역적 자극에 의하여 대식세포 등에서 그 발현이 유도되는 iNOS(induced NOS)는 NO를 과다 생성하며, iNOS에 의해 과다 생성된 NO는 혈관투과성, 부종 등의 염증반응을 촉진시킬 뿐만 아니라 염증 매개체의 생합성을 촉진하여 급성과 만성 염증에 대한 반응으로 조직의 손상 및 유전자 변이 등을 일으킬 수 있다. 이러한 결과로 동맥경화를 비롯한 고혈압, 관절염, 암이나 당뇨 등 만성 염증성 질환(chronic inflammatory disease)이 발생하게 되고 임상에서는 이러한 질환이 임상에서 차지하는 비중이 매우 높다(J. Endotoxin. Res. 7: 431-438, 2001; Free Radical. Biol. Med. 33: 1026-1036, 2002; Kor. J. Herbology. 25: 89-98; 2010).
현재 항염증제로서 널리 사용되고 있는 비스테로이드성 소염제(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDS)는 위장관 장애, 간장애, 신장애 등의 심각한 부작용을 야기한다고 알려져 있다(Rainsford KD., Subcell biochem., 42:3-27, 2007; Guruprasad P. Aithal.,Rheumatology., 7:139-150, 2011; Praveen P. N. Rao et al.,Pharmaceuticals., 3:1530-1549, 2010). 따라서 항염 활성을 가지면서 부작용이 적은 천연의 물질로부터 효과가 지속적인 새로운 약물을 찾고자 하는 연구가 활발하게 이루어지고 있다.
본 발명에서는 당근 추출물 또는 그 발효물의 항염증 활성을 확인하였다.
본 발명의 목적은 당근 추출물 또는 그 발효물을 이용한 항염증용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.
본 발명은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 당근 추출물과 그것의, 김치로부터 분리·동정한 제주 토착 미생물인 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans)에 의한 발효물이 특별한 세포독성을 보이지 않으면서 LPS(lipopolysaccharide)로 자극된 마우스 대식세포주(RAW 264.7 cells)에서 농도 의존적으로 NO 생성을 억제하고 또 iNOS 발현을 억제함을 확인함으로써 완성된 것이다.
전술한 바를 고려할 때, 본 발명은 (i) 당근 추출물 또는 (ii) 당근이나 당근 추출물의 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans)에 의한 발효물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물로 파악할 수 있다.
본 명세서에서, "당근 추출물"이란 추출 대상인 당근의 지상부, 지하부, 잎, 줄기, 뿌리, 전초 또는 이들의 혼합물을 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜(메탄올, 에탄올, 부탄올 등), 메틸렌클로라이드, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 침출하여 얻어진 추출물, 이산화탄소, 펜탄 등 초임계 추출 용매를 사용하여 얻어진 추출물 또는 그 추출물을 분획하여 얻어진 분획물을 의미하며, 추출 방법은 활성물질의 극성, 추출 정도, 보존 정도를 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사, 초임계 추출 등 임의의 방법을 적용할 수 있다. 분획된 추출물의 경우 추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합·정치시켜 얻은 분획물, 상기 조추출물을 친수성이나 소수성 수지에 흡착시킨 후, 적정 용매 예컨대 소수성 용매, 친수성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이동상으로 하여 얻은 분획물을 포함하는 의미이다. 또한 상기 추출물의 의미에는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물이 포함된다. 바람직하게는 추출용매로서 물, 탄소수 1 내지 4의 알콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물을 의미한다.
본 명세서에서, "당근이나 당근 추출물의 발효물"이란 당근 건조 분말이나 상기 당근 추출물에 물을 가하거나 가하지 않고 바실러스 코아굴란스를 접종하고 배양하여 얻어진 배양물을 말한다. 이 배양물은 그대로 이용되거나, 감압농축 및/또는 동결건조시켜 액상 또는 분말상으로 이용되거나, 상기 추출물 제조와 동일하게 물, 에탄올 등을 사용하여 추출하거나, 그 추출물을 분획하거나, 그 추출물 또는 분획물을 농축하여 이용될 수 있다.
상기 발효물의 제조시 발효 미생물의 탄소원이 배지에 첨가될 수 있는데 그러한 탄소원은 당업계에 잘 알려져 있고, 따라서 당업계에 알려진 임의의 것을 사용할 수 있는데, 통상은 올리고당, 유당, 포도당, 과당, 설탕, 당밀, 덱스트로스, 이들의 혼합물 등이 사용될 것이다. 이러한 탄소원은 의도한 발효 시간, 발효 정도 등을 고려하여 임의의 범위로 첨가될 수 있다. 첨가될 경우 발효 대상인 솔잎 100 중량부 기준 0.1 중량부 내지 5 중량부의 범위로 첨가될 것이다.
또한 배지에는 질소원이나 미량원소가 0.1 내지 3%(w/v) 범위로 더 포함될 수 있는데, 질소원으로서는 암모니아, 암모늄염, 우레아, 아미노산, 대두박, 대두 단백질, 효모 추출물, 육즙 등을 들 수 있고, 미량원소로서는 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브덴, 칼륨, 망간, 아연, 구리, 철, 인, 황 등을 들 수 있다. 배양은 25℃ 내지 40℃, 바람직하게는 35 내지 37℃에서 12시간 내지 2일 정도 이루어질 수 있다.
또 발효 미생물 접종 후의 배양은 발효 원료인 당근의 함량, 탄소원의 첨가 여부나 첨가량, 물의 첨가 여부와 첨가량 등을 고려하여 15℃~45℃의 온도 조건 특히 30℃~40℃의 온도 조건에서 10시간 이상, 특히 1일 내지 15일 동안 이루어질 수 있다.
또 본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
또 본 명세서에서, "항염증"은 아래에서 정의되는 염증 반응을 수반하는 염증성 질환에서 염증 반응의 억제에 의한 그러한 질환의 개선(증상의 경감), 치료, 그러한 질환의 발병 억제 또는 지연을 포함하는 의미이다.
또 본 명세서에서, "염증 반응을 수반하는 염증성 질환"이란 외부의 물리·화학적 자극 또는 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염 또는 자가면역에 대한 국부적 또는 전신적 생체 방어 반응으로 특정되는 염증 반응이 일으키는 병리적 증상으로서 정의될 있다. 이러한 염증 반응은 각종 염증 매개 인자와 면역세포와 관련된 효소(예컨대 iNOS, COX-2 등) 활성화, 염증 매개 물질의 분비(예컨대, NO, TNF-α, IL-6 등의 분비), 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등의 일련의 복합적인 생리적 반응을 수반하며, 홍반, 통증, 부종, 발열, 신체의 특정 기능의 저하 또는 상실 등의 증상에 의해 외적으로 나타난다. 상기 염증성 질환은 급성, 만성, 궤양성, 알레르기성 또는 괴사성을 띨 수 있으므로, 어떠한 질환이 상기와 같은 염증성 질환의 정의에 포함되는 한 그것이 급성이든지, 만성이든지, 궤양성이든지, 알레르기성이든지 또는 괴사성이든지를 불문한다. 구체적으로 상기 염증성 질환에는 천식, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유종, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두통, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염(예컨대, C형 감염), 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 관절염, 류머티스성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염(아토피성 피부염 포함), 습진, 다발성 경화증 등이 포함될 것이다.
본 발명의 항염증용 조성물은 그 유효성분을 구체적 용도, 제형 등에 따라 치료를 의도하는 염증성 질환의 개선 활성을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게 의료 전문가 등의 제언에 의한 투여 기간 동안 본 발명의 조성물이 투여될 때, 염증성 질환의 개선, 치료, 또는 그러한 병리적 증상의 발병 억제/지연 등 의도한 의료적·약리학적 효과를 나타낼 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 유효성분 이외에, 항염증 효과의 상승·보강을 위하여 또는 항알러지 활성, 피부 보호 활성(자외선에 의한 피부 손상 억제, 피부 보습 등) 등 유용 활성의 부가를 통한 복용이나 섭취의 편리성을 증진시키기 위하여, 당업계에서 이미 안전성이 검증되고 해당 활성을 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
이러한 화합물 또는 추출물에는 각국 약전(한국에서는 「대한민국약전」), 각국 건강기능식품공전(한국에서는 식약처 고시인 「건강기능식품 기준 및 규격」임) 등의 공정서에 실려 있는 화합물 또는 추출물, 의약품의 제조·판매를 규율하는 각국의 법률(한국에서는 「약사법」임)에 따라 품목 허가를 받은 화합물 또는 추출물, 건강기능식품의 제조·판매를 규율하는 각국 법률(한국에서는 「건강기능식품에관한법률」임)에 따라 개별적으로 기능성을 인정받은 화합물 또는 추출물이 포함된다. 예컨대 한국 건강기능식품공전상의 '관절염 개선' 기능성을 가진 MSM(dimethylsulfonylmethane), '관절염 개선' 기능성과 '피부 보습' 기능성을 가진 N-아세틸글루코사민 등과, 한국 「건강기능식품에관한법률」에 따라 '과민 면역반응 완화'로 개별적으로 기능성을 인정받은 Enterococcus faecalis 가열 처리 건조 분말, 구아바 잎 추출물 등의 복합물, 다래 추출물, 소엽 추출물, 피카오프레토 분말 등의 복합물, PLAG(1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-acetyl-rac-glycerol) 등과, '과민피부상태 개선'으로 개별적으로 기능성을 인정받은 L. sakei Probio 65, 감마리놀렌산 함유 유지, 과채 유래 유산균인 L.plantarum CJLP133, 프로바이오틱스 ATP 등이 이러한 화합물 또는 추출물에 해당할 것이다.
이러한 화합물 또는 천연 추출물은 본 발명의 항염증용 조성물에 그 유효성분과 함께 하나 이상 포함될 수 있다.
본 발명의 항염증용 조성물은 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로서 파악할 수 있다. 이 경우 본 발명의 용도는 염증 반응 억제로 이해될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예컨대 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구르트 등의 가공 유류, 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 건강기능식품 제제류 등으로 제조될 수 있다.
또 본 발명의 식품 조성물은 법률상·기능상의 구분에 있어서 제조·유통 시점의 시행 법규에 부합하는 한 임의의 제품 구분을 띨 수 있다. 예컨대 한국 「건강기능식품에관한법률」에 따른 건강기능식품이거나, 한국 「식품위생법」의 식품공전(식약처 고시 「식품의 기준 및 규격」)상 각 식품유형에 따른 과자류, 두류, 다류, 음료류, 특수용도식품 등일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 식품첨가물이 포함될 수 있다. 식품첨가물은 일반적으로 식품을 제조, 가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가되어 혼합되거나 침윤되는 물질로서 이해될 수 있는데, 식품과 함께 매일 그리고 장기간 섭취되므로 그 안전성이 보장되어야 한다. 식품의 제조·유통을 규율하는 각국 법률(한국에서는 「식품위생법」임)에 따른 식품첨가물공전에는 안전성이 보장된 식품첨가물이 성분 면에서 또는 기능 면에서 한정적으로 규정되어 있다. 한국 식품첨가물공전(식약처 고시 「식품첨가물 기준 및 규격」)에서는 식품첨가물이 성분 면에서 화학적 합성품, 천연 첨가물 및 혼합 제제류로 구분되어 규정되어 있는데, 이러한 식품첨가물은 기능 면에 있어서는 감미제, 풍미제, 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등으로 구분된다.
감미제는 식품에 적당한 단맛을 부여하기 위하여 사용되는 것으로, 천연의 것이거나 합성된 것 모두 본 발명의 조성물에 사용할 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.
풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.
보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등이 사용될 수 있고, 또 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있으며, 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등이 사용될 수 있다. 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.
점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 전술한 바의 식품첨가물 이외에, 기능성과 영양성을 보충, 보강할 목적으로 당업계에 공지되고 식품첨가물로서 안정성이 보장된 생리활성 물질이나 미네랄류를 포함할 수 있다.
그러한 생리활성 물질로서는 녹차 등에 포함된 카테킨류, 비타민 B1, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B12 등의 비타민류, 토코페롤, 디벤조일티아민 등을 들 수 있으며, 미네랄류로서는 구연산 칼슘 등의 칼슘 제제, 스테아린산마그네슘 등의 마그네슘 제제, 구연산철 등의 철 제제, 염화 크롬, 요오드칼륨, 셀레늄, 게르마늄, 바나듐, 아연 등을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 전술한 바의 식품첨가물이 제품 유형에 따라 그 첨가 목적을 달성할 수 있는 적량으로 포함될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에 포함될 수 있는 기타의 식품첨가물과 관련하여서는 각국 식품공전이나 식품첨가물 공전을 참조할 수 있다.
본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 투여 경로는 국소 경로, 경구 경로, 정맥 내 경로, 근육 내 경로, 및 점막 조직을 통한 직접 흡수를 포함하는 임의의 적절한 경로일 수 있으며, 두 가지 이상의 경로를 조합하여 사용할 수도 있다. 두 가지 이상 경로의 조합의 예는 투여 경로에 따른 두 가지 이상의 제형의 약물이 조합된 경우로서 예컨대 1차로 어느 한 약물은 정맥 내 경로로 투여하고 2차로 다른 약물은 국소 경로로 투여하는 경우이다.
약학적으로 허용되는 담체는 투여 경로나 제형에 따라 당업계에 주지되어 있으며, 구체적으로는 「대한민국약전」을 포함한 각국의 약전을 참조할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유, 에탄올, 그리세롤 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라적절한 결합제, 윤활제, 붕해제, 착색제, 희석제 등을 포함시킬 수 있다. 적절한 결합제로서는 전분, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페리스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 소듐 카복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 글루코스, 옥수수 감미제, 소듐 알지네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등을 들 수 있고, 윤활제로서는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 초산나트륨, 염화나트륨, 실리카, 탈쿰, 스테아르산, 그것의 마그네슘염과 칼슘염, 폴리데틸렌글리콜 등을 들 수 있으며, 붕해제로서는 전분, 메틸 셀룰로스, 아가(agar), 벤토나이트, 잔탄 검, 전분, 알긴산 또는 그것의 소듐 염 등을 들 수 있다. 또 희석제로서는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 소비톨, 셀룰로스, 글라이신 등을 들 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 수성 등장 용액 또는 현탁액을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화할 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화할 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 담체로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등을 사용할 수 있다.
약제학적 조성물의 구체적인 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001mg/kg ~ 10g/kg 범위, 바람직하게는 0.001mg/kg ~ 1g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
본 발명의 조성물은 또 다른 구체적인 양태에 있어서, 화장료 조성물로 파악할 수 있다. 본 발명의 항염증용 조성물이 화장품 조성물로 파악될 경우 그 용도는 염증성 피부 트러블 억제, 염증성 피부 자극 완화 등의 용도로 이해될 수 있다.
본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 파악될 경우에도 그 화장료 조성물은 그 용도상, 법률상 임의의 제품 구분을 띨 수 있으며, 구체적으로 피부 트러블 개선, 아토피 피부염 개선 등의 용도를 가진 기능성 화장품, 비기능성 일반 화장품 등일 수 있다. 제품 형태에 있어서도 임의의 제품 형태를 띨 수 있는데, 구체적으로 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 등의 제품 형태를 띨 수 있다. 구체적인 제품 형태에 있어서는 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형 등일 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 그 유효성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 예컨대, 안정화제, 용해화제, 계면활성제, 비타민, 색소 및 항료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되는데, 구체적으로 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 항염증 활성을 나타내는 유효성분을 포함하는 것을 제외하고는 당업계에 통상적으로 행하여지는 화장료 조성물의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 당근 추출물 또는 그 발효물을 이용한 항염증용 조성물을 제공할 수 있다. 이러한 본 발명의 조성물은 식품, 약품 등으로 제품화될 수 있다.
도 1은 본 발명의 자체 분리한 바실러스 코아굴란스 KK7 균주의 16S rRNA 서열이다.
도 2는 당근 추출물과 그 발효물이 세포독성과 NO 생성에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 3은 당근 추출물과 그 발효물이 iNOS 발현에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예> 당근 추출물 또는 발효물의 항염증 활성
1. 시료 준비
1.1 발효 미생물의 준비
발효 미생물인 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans) 균주는 자체 분리·동정하여 사용하였다.
구체적으로 제주도 서귀포시 남원읍에서 제조한 김치를 잘게 분쇄하고 그 분쇄한 시료 10g을 멸균된 0.85% 멸균 생리식염수 용액 90 ml에 첨가하여 분쇄하고 vortexing 하여 현탁 용액을 제조한 후, 10-1부터 10-6까지 희석하여 접종을 위한 현탁액을 제조하였다. MRS (Difco, Detroit, MI, USA) 고체 배지를 제조한 후 상기 10-6 희석 현탁액 200μL를 도말한 후 30℃에서 48시간 이상 배양하였다. 배양 후 colony의 색깔, 모양 등 형태학적 특징에 따라 단일 colony로 순수 분리하고 사용 전 까지 glycerol stock을 만들어 -80℃에서 보관하면서 실험에 사용하였다. 순수 분리된 미생물의 분자생물학적 동정을 위하여 MRS 고체 배지에 배양한 미생물에 대하여 솔젠트사(Solgent Co., Korea)에 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석을 의뢰하였다. 분석된 서열번호 1(도 1)의 16S rRNA 유전자 서열을 가지고, 미국국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)의 Blast 프로그램(Basic Local Alignment Search Tool)을 사용하여 기존 보고된 균주와 서열 상동성 비교하여 기존 보고된 Bacillus coagulans ATCC 7050 균주와 99.44%의 상동성을 보여 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans)로 동정하였고, 해당 균주를 바실러스 코아굴란스 KK7 균주(Bacillus coagulans KK7 stain)로 명명하여 생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 기탁하고 기탁번호 KCTC19023P를 부여받았다.
1.2 당근 추출물과 발효물의 준비
1.2.1 당근 추출물의 준비
당근(뿌리) 건조 분말 100g에 증류수 1,000mL를 첨가하고 2시간 침지 후 고온가압추출기를 이용하여 121℃에서 15분 동안 추출하였다. 추출물을 여과하고, 그 여과액을 감압농축하고 동결건조하여 분말상으로 당근 추출물(CL)을 준비하고 이후 실험에 사용하였다.
1.2.1 당근 발효물의 준비
상기 추출물의 여과액에 1 × 107 cfu/mL 이상으로 배양한 상기 분리, 동정한 바실러스 코아쿨란스 KK7 배양액을 5%(v/v) 비율로 접종하고 37℃서 5일간 5% CO2배양기에서 배양하였다. 배양물을 여과하고 감압농축하고 동결건조하여 분말상으로 발효물(FCL)을 준비하고 이후 실험에 사용하였다.
2. 항염증 활성 평가
2.1 세포 배양
실험에 사용된 대식세포(murine macrophage cell line) RAW 264.7 세포는 ATCC (American Type Culture Collection, VA, USA)에서 분양 받아 10% FBS (fetal bovine serum)와 penicillin-streptomycin 100 units/100 ㎍/㎖이 함유된 DMEM 배지(GIBCO, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2배양기에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대배양을 실시하였다.
2.2 세포독성 평가(LDH assay)
RAW 264.7 세포(1.5 × 105 cells/㎖)를 DMEM 배지에 발효 전, 후의 당근 잎 추출물 시료와 LPS(lipopolysaccaride) 1 ㎍/㎖를 동시에 처리하여 24시간 배양 한 후 배지를 3,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. LDH (lactate dehydrogenase) assay는 non-radioactive cytotoxicity assay kit (Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 측정했으며, 96 well plate에 원심 분리하여 얻은 배양 배지 50 ㎕와 reconstituted substrate mix를 50 ㎕를 넣고, 실온에서 30분 동안 반응시킨 후 stop solution 50 ㎕를 넣은 후 microplate reader를 사용하여 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군(LDH control, 1:5000)의 흡광도 값과 비교하여 세포독성을 평가하였다.
결과를 도 2에 나타내었다. 도 2를 참조하여 보면 당근 추출물과 그 발효물 모두 200 ㎍/㎖까지 특별한 세포독성을 보이지 않음을 알 수 있다. 2A4M(2-amino-4-methylpyridine)은 양성대조군으로 사용되었으며, 20 uM에서 세포독성을 나타내지 않았다.
2.3 산화질소 생성 활성
RAW 264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.5 × 105 cells/㎖로 조절하여 96 well plate에 접종하고 50% ethanol에 녹인 발효 전, 후 당근 잎 추출물 시료와 염증 반응 유도 인자인 LPS를 1 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 생성된 NO의 양은 griess 시약(1% (w/v) sulfanilamide, 0.1% (w/v) naphylethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid)을 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO2- 형태로 측정하였다. 세포 배양 상등액 100 ㎕와 griess 시약 100㎕를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 microplate reader (Bio-TEK Instruments Inc., Vermont, WI, USA)를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO의 양은 NaNO2 (sodium nitrite)를 standard로 비교하였다.
결과를 도 2에 나타내었다. 당근 추출물과 그 발효물 모두 농도 의존적으로 NO 생성 억제 활성을 나타내었으며, 당근 발효물의 활성이 당근 추출물에 비해 우수한 것으로 나타났다.
2.4 웨스턴 블럿에 의한 iNOS 발현량 평가
24시간 동안 배양한 RAW 264.7 cell을 cold PBS로 wash하고 lysis buffer로 세포를 용해하였다. 원심분리기(15000 rpm, 30 min)를 이용하여 상층액을 얻은 다음 단백질 농도를 측정하고, SDS-PAGE로 분리한 후 gel을 0.2 ㎛ nitrocellulose membrane으로 옮겨 Primary antibody 및 secondary antibody에 배양하였다. ECL 기질(iNtRON biotechnology, SungNam, Korea)과 반응시킨 다음 Vilber Western blot imaging system을 이용해 확인하였다.
결과를 도 3에 나타내었다. 당근 추출물과 그 발효물 모두 농도 의존적으로 iNOS 발현 억제 활성을 나타내었으며, 당근 발효물의 활성이 당근 추출물에 비해 우수하였다.

Claims (6)

  1. (i) 당근 추출물 또는 (ii) 당근이나 당근 추출물의 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans)에 의한 발효물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 바실러스 코아굴란스는 그 16S rRNA 유전자가 서열번호 1의 염기서열을 가지는 바실러스 코아굴란스 KK7 균주(기탁번호: KCTC19023P)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 당근 물 추출물이고,
    상기 발효물은 상기 당근 물 추출물의 바실러스 코아굴란스에 의한 발효물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 식품 조성물인 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 약제학적 조성물인 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 화장품 조성물인 조성물.


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