CH666906A5 - Procede pour l'obtention de polymeres d'anthocyanosides de raisins vitis vinifera l. - Google Patents

Procede pour l'obtention de polymeres d'anthocyanosides de raisins vitis vinifera l. Download PDF

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CH666906A5
CH666906A5 CH2968/85A CH296885A CH666906A5 CH 666906 A5 CH666906 A5 CH 666906A5 CH 2968/85 A CH2968/85 A CH 2968/85A CH 296885 A CH296885 A CH 296885A CH 666906 A5 CH666906 A5 CH 666906A5
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fermentation
polymers
anthocyanoside
vitis vinifera
grapes
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CH2968/85A
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Henri Pourrat
Aimee Pourrat
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Debiopharm Sa
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/12Disaccharides
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides

Description

DESCRIPTION
L'invention traite du domaine pharmaceutique. Elle a plus précisément pour objet un procédé pour l'obtention de polymères d'anthocyanosides de raisins (Vitis vinifera L.) pouvant être utilisés à diverses fins thérapeutiques. Lesdits polymères sont obtenus par fermentation en milieu aqueux acide d'anthocyanosides de raisins monomères, exempts d'aglycones, fermentation effectuée au moyen d'une souche acclimatée à'Aspergillus niger. Elle est définie aux revendications.
Certains mélanges de produits contenant des polymères d'anthocyanosides ont été proposés comme substances médicamenteuses, notamment à usage ophtalmique. De tels mélanges sont à ce jour obtenus à partir d'extraits végétaux soumis à des procédés de traitement et de purification relativement complexes. Isolés avec un rendement faible, ils sont de ce fait relativement coûteux.
Le procédé de la présente invention a l'avantage de permettre l'obtention de polymères d'anthocyanosides de raisins avec des rendements supérieurs à ceux connus jusqu'alors et avec un degré de pureté suffisant pour l'usage thérapeutique envisagé. Ledit procédé présente en outre l'avantage d'utiliser comme matière de départ les anthocyanosides de raisins monomères, présents sur le marché en quantités abondantes et facilement accessibles: ces anthocyanosides sont en effet utilisés à titre de colorants alimentaires.
Selon l'invention, on utilise les anthocyanosides de raisins monomères sous la forme de solution aqueuse, exempte d'aglycones. Une telle solution est obtenue par dissolution desdits monomères en milieu acide (pH compris de préférence entre 3,3 et 3,5), suivie de l'élimination de la phase solide non dissoute, par filtratura ou centri-fugation par exemple.
La fermentation proprement dite est effectuée à l'aide de microorganismes issus d'une souche acclimatée à'Aspergillus niger. L'acclimatation de ladite souche est effectuée selon les techniques usuelles, après sélection sur milieu gélose, culture subséquente dans un milieu approprié, dit de Karow, et finalement culture en présence d'une portion de la solution d'anthocyanosides monomères. Dans la pratique, la souche utilisée est cultivée pendant environ 8 jours dans le milieu de Karow, puis de 4 à 7 jours en présence de la solution de monomères, jusqu'à ce que le nombre de spores par unité volumétri-que ait atteint le niveau souhaité.
Une fois le stade de préculture de la souche achevé, les microorganismes sont introduits dans une cuve à fermentation, cette dernière étant complétée par la solution acide de monomères d'anthocyanosides de raisins. Durant la fermentation, on maintient une bonne agitation du mélange et introduit de l'air stérile au sein du milieu, à intervalles réguliers. Au cours de la réaction, la température du milieu réactionnel est maintenue à une valeur inférieure à 35° C environ à l'aide d'un refroidissement externe, de préférence à une valeur comprise entre 27 et 32° C.
Le pH du milieu réactionnel est contrôlé et ajusté en permanence, de façon à ne pas dépasser 3,7 environ.
L'ajustement du pH peut être effectué par l'addition d'acide minéral ou organique compatible avec le milieu de fermentation, tel 5 HCl, H2S04 ou acide acétique par exemple.
Une fois la fermentation terminée, le mélange résultant peut être filtré ou centrifugé; la solution limpide obtenue est alors concentrée et finalement évaporée à sec, le plus généralement à une température voisine de ou inférieure à 50° C environ. Le produit sec ainsi obtenu io consiste pour l'essentiel en polymères d'anthocyanosides désirés; il est obtenu avec un degré de pureté suffisant pour son application thérapeutique.
Les polymères obtenus au moyen du procédé selon la présente invention peuvent être alors incorporés aux solvants ou excipients 15 appropriés, servant ainsi de base à la préparation de médicaments divers.
L'invention sera illustrée à l'aide de l'exemple ci-dessous, sans être pour autant limitée (températures en degrés centigrades).
Exemple :
Les anthocyanosides de raisins bruts {Vitis vinifera L.) utilisés comme produits de départ sont des produits du commerce (source: Société coopérative agricole de distillation du Languedoc-Roussil-lon, avenue Pierre-de-Coubertin, Béziers, France). 25 a) Préparation de la solution d'anthocyanosides monomères
11,25 kg d'anthocyanosides monomères bruts ont été introduits dans 901 d'eau et le pH du mélange a été amené de 3,3 à 3,5 par addition d'acide chlorhydrique. Après agitation et centrifugation du mélange acidifié, on a éliminé 3,15 kg de produits insolubles (aglyco-30 nés, etc. : env. 28%). La solution limpide résultante a été utilisée telle quelle pour la fermentation.
b) Acclimatation de la souche
Une souche à'Aspergillus niger a été premièrement sélectionnée sur milieu gélosé, puis cultivée pendant 8 jours dans 21 env. d'un 35 milieu de Karow ayant la composition suivante:
— Saccharose 150 g
— Urée 1 g
— MgSO* 0,5 g
— KH2P04 0,08 g 40 — KCl 0,15 g
— MnS04 0,02 g
— ZnS04 0,01 g Eau q.s.p. 1 litre
4s A la fin de la période précitée, une solution aqueuse à 10% d'anthocyanosides monomères (lettre a) a été ajoutée au milieu de culture, à raison de !/io du volume total de ladite culture. Le développement de la souche a été poursuivi à une température de l'ordre de 27 à 32° C, jusqu'à obtention de 3-109 à 3-1010 spores au sein du so milieu. Cette phase a duré près de 5 jours. La culture mentionnée ci-dessus a été effectuée en milieu préalablement stérilisé.
c) Fermentation proprement dite
La culture résultant de l'étape ci-dessus a été broyée avec un ho-mogénéisateur (type ULTRA-TURAX) et introduite dans la cuve 55 de fermentation préalablement nettoyée. Après introduction de la totalité de la solution d'anthocyanosides monomères (étape a), on a maintenu l'agitation du mélange au moyen d'une turbine, à env. 150-300 tr/min, durant toute la période de fermentation: le volume introduit représente 80-90% de la capacité de la cuve.
60 Après 24, respectivement 48 h de fermentation, on a fait passer un courant d'air stérile au travers du milieu de réaction, à raison de 1 m3/h, durant 5 à 10 min chaque fois. Durant la fermentation, la température du milieu de réaction a été maintenue entre 27 et 32° à l'aide d'un système de refroidissement externe et le pH stabilisé à 65 une valeur inférieure ou égale à 3,7 par additions répétées d'HCl. La fermentation a été considérée comme achevée après 72 h environ.
Le mélange résultant a été ensuite soutiré de la cuve, filtré sur filtre-presse et la solution limpide obtenue concentrée sous pression
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réduite, à env. 50° C. La masse sirupeuse ainsi obtenue a été finale- • ment séchée dans une étuve à vide, à une température au plus égale à 50°, pour donner les polymères d'anthocyanosides désirés. Il a été observé que la pureté du produit ainsi obtenu était acceptable quant aux usages thérapeutiques envisagés. 5
La pureté du produit de fermentation a été confirmée au moyen d'une analyse par Chromatographie sur couche mince, comme indiqué ci-dessous.
On prépare une solution à 2,5% du produit terminé de la manière suivante: io
Dissoudre le produit dans le minimum d'eau à pH 3,3 à 3,7 et ajouter du méthanol et de l'eau de manière à avoir une solution mé-thanol-eau à 50% (v/v).
Déposer 40 à 50 ni de la solution suivante selon un trait de 20 mm centré dans un angle à 3 cm du bord. 15
On utilise des plaques couches minces de 20 x 20 cm cellulose, Macherey & Nagel MN 300, épaisseur 0,75 mm.
Laisser migrer pendant 2 heures environ (3 à 4 cm du bord supérieur de la plaque) en utilisant comme solvant de migration: alcool amylique-acide formique-HCl N/10 (8-4-1,5). 20
Sécher par un courant d'air à température ambiante pendant 1 heure environ.
Effectuer la 2e migration en utilisant un mélange: acide acétique cristallisable-eau (50/50) (v/v). Avant d'effectuer la 2° migration, on humidifie la couche de cellulose en plaçant au fond de la cuve des 25 capsules remplies d'eau à 80° environ de manière à humidifier la cellulose.
On arrête le développement à 2 à 3 cm du bord supérieur de la plaque, ce qui demande environ 1 heure 30 min. On sèche par un courant d'air à température ambiante. 30
On observe une tache principale irrégulière de Rf très élevé, vers le front du solvant, et 2 ou 3 petites taches de Rf inférieur.
La tache principale correspond aux polymères d'anthocyanosides (rouges), les petites taches à des monomères restants. Au front du solvant, on note la présence d'une tache de Rf pratiquement nul correspondant à un peu de polymères plus condensés.
d) Analyse par Chromatographie liquide sous pression (HPLC) Un échantillon du produit résultant de la fermentation décrite ci-dessus a été soumis à analyse, dans les conditions suivantes:
— échantillon en solution à 1% dans le méthanol
— colonne LICHROSORB RP 18
— éluants: A) acide formique à 5% dans H20
B) alcool méthylique
— débit: 2,5 ml/min
Durant les 8 premières minutes d'élution, on a utilisé un mélange d'éluants A/B 50:50 (volume); au-delà de 8 min d'élution, on a utilisé un mélange A/B 20:80 (volume).
Le chromatogramme résultant indique la présence de 3 pics (polymères) définis comme suit:
Temps de rétention % du total
1) 0,95 min |
env. 99% env. 1%
2) 1,38-1,42 min
3) 5,60 min e) Analyse chimique partielle
Un échantillon du produit résultant de la fermentation, soumis à une hydrolyse acide dans les conditions usuelles, indique que la génine dominante est la malvidine.
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Claims (5)

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1. Procédé pour l'obtention de polymères d'anthocyanosides de raisins Vitis vinifera L., caractérisé en ce qu'on soumet des anthocya-nosides de raisins monomères, exempts d'aglycones, à une fermentation en milieu aqueux acide effectuée à l'aide de microorganismes issus d'une souche acclimatée $ Aspergillus niger.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la fermentation est effectuée à un pH inférieur ou égal à 3,7.
2
REVENDICATIONS
o
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la fermentation est effectuée à une température inférieure ou égale à 35° C environ, de préférence comprise entre 27 et 32° C.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la fermentation est effectuée en milieu aérobie.
5. Médicament contenant à titre d'ingrédient pharmacologique-ment actif des polymères d'anthocyanosides de raisins Vitis vinifera L. obtenus au moyen du procédé selon l'une des revendications 1 à 4.
CH2968/85A 1985-07-09 1985-07-09 Procede pour l'obtention de polymeres d'anthocyanosides de raisins vitis vinifera l. CH666906A5 (fr)

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