ES2305981T3 - Un procedimiento para la purificacion de oligomeros de proantocianidina. - Google Patents
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Abstract
Un proceso para la purificación de oligómeros de proantocianidina diméricos a pentaméricos, que comprende pretratar con glicosidasa las materias primas que contienen los oligómeros de proantocianidina, sus productos de purificación brutos, o una disolución que contiene uno de éstos, y obtener los oligómeros de proantocianidina purificados.
Description
Un procedimiento para la purificación de
oligómeros de proantocianidina.
La presente invención se refiere a un proceso
para purificar de forma eficaz oligómeros de proantocianidina con
una gran pureza, que tienen una diversidad de actividades
biológicas, que incluyen actividad antineoplásica,
antiinflamatoria, antienvejecimiento, antioxidante, antialérgica,
antibacteriana y de crecimiento capilar, y que se pueden aplicar de
manera provechosa a alimentos, cosméticos, fármacos o similares.
En general, proantocianidina, que se conoce como
una sustancia de bioprofilaxis de las plantas superiores, es un
nombre genérico para polímeros en forma de dímero o de orden
superior que polimerizan mediante formatos de unión tales como
4\beta\rightarrow6, 4\beta\rightarrow8,
4\beta\rightarrow8\cdot2\betao\rightarrow7, con
flavan-7-ol como unidad
constitutiva. También se denominan taninos condensados ("E.
Steinegger R. Hänsel, Pharmacognosy [1^{er} vol.], Approach to
Chemistry and Pharmacology" (traducido por Shuji Itokawa et
al., Hirokawa Publishing Co.), 204-208 (1977);
Porter L.J., Flavans and proanthocyanidins, In: Harborne J. B.
(ed.), "The Flavonoids, Advances in Research Science 1986",
Chapman & Hall, 23-55 (1994)). Se denominan en
general proantocianidinas porque producen antocianidina y viran a
rojo mediante tratamiento ácido. Se sabe que las proantocianidinas
muestran una diversidad de actividades biológicas. Las actividades
que se han informado incluyen actividad antineoplásica,
antiinflamatoria, antienvejecimiento, antioxidante, antialérgica,
antibacteriana y de crecimiento capilar (Bart Schwitters/Jack
Masquelier, "21^{st} century Biophylaxis Substance OPC",
traducido por Akira Sasaki, Fragrance Journal,
50-135 (1997); Tomoya Takahashi, et al.,
Journal of Investigative Dermatology, 112,
310-316 (1999)). No se han clarificado todas las
relaciones entre estructura y actividad que hay entre estas
actividades biológicas y el grado de polimerización de las
proantocianidinas. Por ejemplo, con respecto a la actividad de
crecimiento capilar, se ha informado que los oligómeros de
proantocianidina diméricos a pentaméricos (especialmente el dímero
y el trímero) de proantocianidinas tienen la actividad más elevada
(documento WO96/00561).
Con respecto a la separación y purificación de
proantocianidinas a partir de vegetales, se han hecho intentos para
separar y purificar proantocianidinas a partir de diversos
vegetales, que incluyen semillas de uvas, cortezas de pino, hojas
de ginkgo, cacahuetes y granos de cacao. Los ejemplos de extracción
industrial a partir de estas materias primas incluyen la extracción
a partir de semillas de uva (Solicitud Japonesa sin examinar
publicada nº 3-200781, documentos WO97/39632,
US5484594), corteza de pino (documentos US4698360, WO97/44407) o
similares. En el método según la Solicitud Japonesa sin examinar
publicada nº 3-200781, se realiza un pretratamiento
poniendo en contacto semillas de uva blanca con agua a menos de
70ºC, seguido de extracción con agua caliente. El extracto
resultante se aplica a una columna de Sephadex
LH-20^{TM}, y después se eluye con etanol del
70%, por lo que se obtiene un polvo que contiene proantocianidinas
con una pureza de aproximadamente el 90%. En el método según el
documento US4698360, se somete a una tonelada de corteza de pino
marítimo a extracción con agua caliente a presión, y después se
repite la elución con acetato de etilo y la precipitación mediante
la adición de cloroformo, de forma que se obtiene un polvo que
contiene proantocianidinas. Sin embargo, ninguno de los productos
purificados resultantes de los métodos anteriores contiene un 90% o
más de oligómeros de proantocianidina diméricos a pentaméricos
solamente. Todos estos productos purificados contienen también
monómeros, polímeros hexaméricos o de orden superior, u otros
ácidos orgánicos.
Como proceso para purificar proantocianidinas
que usa el método de distribución líquido-líquido en
contracorriente, por ejemplo, se describe un método que usa agua y
acetato de etilo en Andrew G.H. Lea, J. Sci. Fd. Agric., 29,
471-477 (1978), en la Solicitud Japonesa sin
examinar publicada nº 61-16982 y similares.
Como proceso para purificar proantocianidinas
que usa la extracción sólido-líquido, por ejemplo,
se describe un método que usa acetato de etilo en la Solicitud
Japonesa sin examinar publicada nº 8-176137 y en el
documento EP0707005. Por ejemplo, se extraen 100 kg de uvas
prensadas con un disolvente mixto de agua (1650 L), cloruro sódico
(300 kg) y acetona (550 L). A continuación, se elimina la acetona
mediante destilación para obtener el residuo. El residuo se somete
después a extracción sólido-líquido usando acetato
de etilo, y después se le añade dicloroetano (45 L), por lo que se
obtiene de 1,5 kg a 2,5 kg de un precipitado de proantocianidina
(documento EP0707005).
Además, los métodos conocidos para purificar
proantocianidinas que usan cromatografía incluyen un método que usa
la columna anterior de Sephadex LH-20^{TM} (un
método para la extracción a partir de semillas de uva, Solicitud
Japonesa sin examinar publicada nº 3-200781), y un
método que usa resina de adsorción basada en poliestireno (un
método para la extracción a partir de judías rojas, Solicitud
Japonesa sin examinar publicada nº 7-62014). Por
ejemplo, se añade la resina de adsorción basada en poliestireno
"Sepabeads SP-850^{TM}" (MITSUBISHI
CHEMICAL CORPORATION) a agua obtenida sumergiendo judías rojas secas
en ella, y la mezcla se agita, por lo que se permite que las
proantocianidinas se adsorban. Después, se seca la resina a menos de
70ºC y posteriormente se eluye con etanol del 80% (v/v) a 70ºC, de
forma que se puede obtener un polvo que contiene proantocianidinas
brutas con una pureza de aproximadamente el 60%.
Sin embargo, todos estos procesos sirven para
purificar mezclas de proantocianidinas independientemente del grado
de polimerización. Es decir, estos procesos no sirven para obtener
de forma eficaz y selectiva oligómeros de proantocianidina
diméricos a pentaméricos. Sus porcentajes de recuperación de
oligómeros de proantocianidina diméricos a pentaméricos son
bajos.
Con respecto a la separación de
proantocianidinas por grado de polimerización, se conoce un método
que usa cromatografía líquida de gel de sílice en fase normal (A
method for extraction from cocoa beans: J. Rigaud et al., J.
Chromatogr. A, 654, 255-260 (1993), A method
for extraction from grape seeds: Corine Prieur et al.,
Phytochemistry, 36, 781-784 (1994)). El
primer método comprende cargar una disolución de muestra que
contiene proantocianidinas, que se ha obtenido mediante extracción
con metanol a partir de granos de cacao, en una columna de gel de
sílice, seguido de elución en gradiente usando un disolvente mixto
de diclorometano : metanol : ácido fórmico : agua
((41\rightarrow5):(7\rightarrow43):1:1) como fase móvil. El
segundo método comprende cargar una disolución de muestra que
contiene proantocianidinas, que se ha obtenido mediante extracción
con metanol a partir de semillas de uva, en una columna de gel de
sílice, seguido de elución en gradiente usando un disolvente mixto
de diclorometano : metanol : agua : ácido trifluoroacético
((82\rightarrow10):(18\rightarrow86):2:0,05) como fase
móvil.
Ricardo Da Silva J. M. et al.,
Phytochemistry, vol. 30, nº 4, 1991, páginas
1259-1264, estudió el fraccionamiento del extracto
de semillas de uva, que produjo diversos dímeros y trímeros de
procianidina naturales. Las estructuras de estos compuestos se
dilucidaron mediante hidrólisis enzimática, hidrólisis ácida
completa, degradación parcial catalizada por ácidos con
floroglucinol y fenilmetanotiol, FABMS y
^{1}H-RMN.
El documento
EP-A-0727493 se dirige a un proceso
para mejorar las propiedades de las proantocianidinas que comprende
poner en contacto la disolución que contiene proantocianidina con
tanasa, y un proceso para incrementar el rendimiento de
proantocianidinas que comprende poner en contacto la disolución que
contiene proantocianidina con tanasa en la extracción de las
proantocianidinas.
Sin embargo, estos métodos ocasionan problemas,
tales como que la recuperación y la reutilización de los disolventes
es difícil, debido al uso de un disolvente que contiene cloro y a
la complejidad de la composición del disolvente. Además, es
necesaria la elución en gradiente para aplicar gradientes de
concentración a una fase móvil. Por lo tanto, estos métodos no son
apropiados para los métodos industriales de separación orientados a
purificación en masa, teniendo en cuenta estas consideraciones
económicas y de seguridad.
El objeto de la presente invención es
proporcionar un proceso para purificar de forma eficaz oligómeros de
proantocianidina diméricos a pentaméricos con gran pureza, a partir
de materias primas que contienen proantocianidinas o de sus
productos de purificación brutos.
Una combinación de técnicas convencionales no es
lo suficientemente buena para eliminar las sustancias distintas de
los componentes de interés, que son los oligómeros de
proantocianidina diméricos a pentaméricos, por ejemplo monómeros
que constituyen proantocianidinas, tales como flavonoides, catequina
o epicatequina, polímeros de proantocianidina hexaméricos o de
orden superior, u otros contaminantes. Es decir, es difícil obtener
de forma eficaz con gran pureza oligómeros de proantocianidina
diméricos a pentaméricos, que son los componentes de interés de
esta invención. Además, la mayoría de los métodos conocidos no son
apropiados para los procesos industriales, teniendo en cuenta la
complejidad de la composición disolvente utilizada, las
consideraciones económicas, la seguridad o similares.
Como resultado de estudios rigurosos para
resolver estos problemas, se ha completado un proceso para purificar
de forma eficaz oligómeros de proantocianidina diméricos a
pentaméricos con una gran pureza.
En un primer aspecto se describe un proceso para
purificar oligómeros de proantocianidina diméricos a pentaméricos,
que comprende extraer los oligómeros de proantocianidina mediante un
método de extracción sólido-líquido que usa
acetato de metilo como fase líquida de las materias primas que
contienen los oligómeros de proantocianidina o de sus productos de
purificación brutos.
Como la fase líquida anterior, se puede usar
acetato de metilo como disolvente simple o como disolvente mixto,
que es una combinación de acetato de metilo y un disolvente orgánico
miscible con acetato de metilo, que se prepara añadiendo tal
disolvente orgánico a acetato de metilo.
La invención proporciona un proceso para
purificar oligómeros de proantocianidina diméricos a pentaméricos,
que comprende pretratar con glicosidasa las materias primas que
contienen los oligómeros de proantocianidina, sus productos de
purificación brutos, o una disolución que contiene uno de éstos, y
obtener los oligómeros de proantocianidina purificados.
En un tercer aspecto se describe un proceso para
purificar oligómeros de proantocianidina diméricos a pentaméricos
con un grado de polimerización uniforme, en el que los oligómeros de
proantocianidina se separan y se purifican por grado de
polimerización a partir de materias primas que contienen los
oligómeros de proantocianidina o de sus productos de purificación
brutos, mediante cromatografía líquida de gel de sílice en fase
normal que usa como fase móvil un disolvente simple o un disolvente
mixto de dos o más disolventes seleccionados del grupo que consiste
en un disolvente de éster, un disolvente de cetona, un disolvente de
hidrocarburo, un disolvente de éter y un disolvente de alcohol.
Preferiblemente, se usa como la fase móvil anterior un disolvente
mixto de dos o más disolventes.
Además, la presente invención puede proporcionar
oligómeros de proantocianidina diméricos a pentaméricos purificados
con una pureza del 90% (p/p) o más, proantocianidinas diméricas con
una pureza del 90% (p/p) o más, y proantocianidinas triméricas con
una pureza del 90% (p/p) o más, que son obtenibles mediante los
procesos de purificación anteriores.
Las proantocianidinas son taninos condensados
presentes en diversos vegetales, y poseen una estructura básica en
la que flavan-7-ol se condensa o
polimeriza secuencialmente mediante uniones 4\beta\rightarrow6,
4\beta\rightarrow8,
4\beta\rightarrow8\cdot2\betao\rightarrow7, o similares.
En esta memoria descriptiva, los dímeros a pentámeros de
proantocianidinas y los hexámeros o polímeros de orden superior de
proantocianidinas se definen como oligómeros de proantocianidina y
polímeros de proantocianidina, respectivamente. Además, un monómero
de flavan-7-ol se define como un
monómero que constituye proantocianidinas. Los ejemplos de
oligómeros de proantocianidina incluyen proantocianidinas, tales
como procianidina, prodelfinidina y propelargonidina, y todos sus
estereoisómeros. Se muestra un monómero que constituye
proantocianidinas en la siguiente fórmula (I):
\vskip1.000000\baselineskip
(en la que R^{1}, R^{2},
R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} son iguales o diferentes, y
representan hidrógeno, un grupo hidroxilo o un grupo
galoilo).
Los ejemplos de las materias primas o de sus
productos de purificación brutos usados en esta invención incluyen
cualquiera que contenga oligómeros de proantocianidina, y los
ejemplos particularmente preferibles de éstos incluyen materias
primas vegetales, tales como frutos, pericarpios, semillas y
cortezas de vegetales, sus extractos, y sus productos de
purificación brutos. Por ejemplo, son preferibles aquellos ricos en
contenido de oligómeros de proantocianidina, que incluyen zumos de
frutos, o extractos de pericarpios o semillas, de uvas, caquis,
manzanas, arándanos, arándanos agrios, o similares; o extractos de
la epidermis de cacahuetes, castañas o similares, cáscaras de
salvado de cebada o alforfón, hojas de caqui, pino marítimo,
palmera, o similares.
Además, se pueden usar también como materias
primas los productos brutos o sus productos de purificación brutos
obtenidos mediante métodos no enzimáticos o enzimáticos. Los
ejemplos de un proceso sintético para sintetizar oligómeros de
proantocianidina incluyen el proceso de fabricación de un dímero de
epicatequina o catequina descrito en Journal of Chemical Society
Perkin Transaction I, 1535-1543 (1983), y el proceso
de fabricación de un trímero de epicatequina o catequina descrito
en Phytochemistry, 25, 1209-1215 (1986). Los
productos brutos o sus productos de purificación brutos obtenidos
de una manera similar a estos procesos también se pueden usar como
materias primas para el proceso de esta invención.
Es preferible un disolvente orgánico volátil
como disolvente orgánico miscible con el acetato de metilo usado
para el primer aspecto descrito aquí. Los ejemplos de tales
disolventes orgánicos incluyen disolventes de alcohol, tales como
metanol, etanol, propanol y butanol; disolventes de éster, tales
como formiato de metilo, formiato de etilo y acetato de etilo;
disolventes de cetona, tales como acetona; disolventes de nitrilo,
tales como acetonitrilo; disolventes de éter, tales como
tetrahidrofurano y 1,2-dimetoxietano; disolventes de
hidrocarburo, tales como hexano; y disolventes de ácido
carboxílico, tales como ácido acético. Cuando se usa un disolvente
orgánico miscible con acetato de metilo, el disolvente total de
extracción contiene preferiblemente acetato de metilo en un 50%
(volumen) o más, más preferiblemente en un 70% (volumen) o más, y
aún más preferiblemente en un 90% (volumen) o más.
La enzima para hidrólisis usada en la presente
invención es glicosidasa.
Los ejemplos de glicosidasa incluyen una única
sustancia o una mezcla de dos o más sustancias seleccionadas del
grupo que consiste en amilasa, celulasa, glucanasa, xilanasa,
glucosidasa, dextranasa, quitinasa, galacturonasa, lisozima,
galactosidasa, manosidasa, fructofuranosidasa, trehalasa,
glucosaminidasa, pululanasa, ceramidasa, fucosidasa y agarasa.
En la presente invención, los ejemplos de la
disolución que contiene materias primas que contienen oligómeros de
proantocianidina diméricos a pentaméricos o sus productos de
purificación brutos incluyen en general una disolución acuosa, o
una disolución acuosa que contiene un 10% o menos de un disolvente
orgánico, tal como un alcohol, éster o cetona.
En el tercer aspecto descrito aquí, los ejemplos
del disolvente de éster usado como fase móvil incluyen formiato de
metilo, formiato de etilo, formiato de propilo, formiato de
isopropilo, formiato de butilo, formiato de isobutilo, acetato de
metilo, acetato de etilo, acetato de propilo, acetato de isopropilo,
acetato de butilo, acetato de isobutilo, propionato de metilo,
propionato de etilo, propionato de propilo, propionato de
isopropilo, propionato de butilo, propionato de isobutilo, butirato
de metilo, butirato de etilo, butirato de propilo, butirato de
isopropilo, butirato de butilo y butirato de isobutilo. Los ejemplos
del disolvente de cetona incluyen acetona, metiletilcetona,
metilpropilcetona, metilisopropilcetona, metilbutilcetona,
metilisobutilcetona, metiltert-butilcetona,
dietilcetona, diisopropilcetona, metilvinilcetona, ciclobutanona,
ciclopentanona y ciclohexanona. Los ejemplos del disolvente de
hidrocarburo incluyen pentano, hexano, heptano, octano, nonano,
decano, nonadecano, ciclohexano, xileno y tolueno. Los ejemplos del
disolvente de éter incluyen tetrahidrofurano y
1,2-dimetoxietano. Los ejemplos del disolvente de
alcohol incluyen metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol,
sec-butanol, tert-butanol y
similares.
La extracción y la purificación bruta de las
materias primas vegetales se puede realizar, por ejemplo, mediante
procesos conocidos como se describe más adelante.
Las materias primas vegetales, que incluyen
frutos, pericarpios, semillas, pieles, cáscaras, hojas y cortezas
vegetales, se usan como materiales para la extracción después de un
proceso de secado, tal como en general el secado al aire. Las
materias primas vegetales intactas se pueden usar también como
materiales para la extracción.
La extracción bruta de proantocianidinas a
partir de los materiales anteriores para la extracción se puede
realizar con referencia a procesos conocidos (Chem. Pharm. Bull.,
38, 3218 (1990), Chem. Pharm. Bull., 40,
889-898 (1992)). Por ejemplo, las materias primas
vegetales prensadas o trituradas se someten a extracción usando un
disolvente. Como disolvente para la extracción, se puede usar un
disolvente simple o un disolvente mixto de dos o más disolventes
seleccionados de un disolvente hidrófilo y un disolvente lipófilo.
Tales disolventes incluyen agua, disolventes de alcohol tales como
metanol, etanol e isopropanol, disolventes de cetona tales como
acetona y metil-etilcetona, y disolventes de éster
tales como acetato de metilo y acetato de etilo. La temperatura
para la extracción oscila generalmente de 0 a 100ºC, preferiblemente
de 5 a 50ºC. Un material, tal como semillas que contienen aceite,
se puede someter como tal a extracción sin prensar. La extracción
se puede repetir de dos a tres veces, si es necesario. El residuo
insoluble se elimina mediante filtración o centrifugación de la
disolución de extracto bruto obtenida mediante la etapa anterior,
por lo que se obtiene una disolución de extracto bruto. Las
materias primas vegetales, tales como zumo, savia o similares, se
pueden usar directamente como materiales para la extracción, o se
puede preparar una disolución de extracto bruto concentrada de
taninos condensados con referencia a Agric. Biol. Chem., 45,
1885-1887 (1981).
La extracción y la purificación bruta a partir
de productos brutos obtenidos mediante un método químico, tal como
métodos no enzimáticos o enzimáticos, se puede realizar también de
una manera similar a las descritas anteriormente.
A continuación se dará una descripción detallada
del proceso de purificación de esta invención con ejemplos.
En el primer aspecto descrito aquí, se purifican
oligómeros de proantocianidina diméricos a pentaméricos sometiendo
a las materias primas que contienen los oligómeros de
proantocianidina o a sus productos de purificación brutos a
extracción sólido-líquido, que usa un disolvente
simple de acetato de metilo o un disolvente mixto de acetato de
metilo y un disolvente orgánico miscible con acetato de metilo como
fase líquida. Cuando las materias primas o sus productos de
purificación brutos son líquidos, se realiza preferiblemente la
solidificación previa mediante secado por pulverización o mediante
liofilización. En general, la proporción de mezcla (p/v) de un
sólido y acetato de metilo, o de un sólido y un disolvente mixto de
acetato de metilo y un disolvente orgánico miscible con acetato de
metilo, es aproximadamente de 1:1 a 1:1000. Se realiza la extracción
a temperatura ambiente o calentando con agitación durante un
periodo corto de tiempo. Preferiblemente, la proporción de mezcla
(p/v) de un sólido y acetato de metilo, o de un sólido y un
disolvente mixto de acetato de metilo y un disolvente orgánico
miscible con acetato de metilo es de 1:5 a 1:100. Se prefiere la
extracción a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora, y
la extracción repetida subsiguiente (varias veces) del residuo en
las mismas condiciones. Se prefiere un tamaño de partícula de polvo
más fino para una extracción sólido-líquido eficaz.
Cuando la extracción se realiza usando un disolvente mixto, es
preferible que el disolvente mixto tenga una polaridad análoga a la
del acetato de metilo mezclando los disolventes. La extracción
sólido-líquido que usa estos disolventes elimina la
elución de polímeros de proantocianidina y otros contaminantes, y
permite la purificación eficaz de oligómeros de proantocianidina
diméricos a pentaméricos. En el primer aspecto descrito aquí, los
oligómeros de proantocianidina diméricos a pentaméricos se pueden
recuperar mediante liofilización o secado por pulverización,
después de concentrar el extracto de acetato de metilo resultante y
disolver otra vez el residuo concentrado en agua o en un disolvente
acuoso, tal como un tampón.
En la presente invención, se purifican
oligómeros de proantocianidina diméricos a pentaméricos pretratando
con glicosidasa las materias primas que contienen los oligómeros de
proantocianidina, sus productos de purificación brutos o una
disolución que contiene uno de éstos, y se obtienen los oligómeros
de proantocianidina purificados. Las materias primas o sus
productos de purificación brutos contienen generalmente muchos
contaminantes distintos de los oligómeros de proantocianidina.
Particularmente cuando las materias primas o sus productos de
purificación brutos proceden de vegetales, hay presentes en una
elevada proporción glicósidos de polifenol, ésteres o similares,
además de oligómeros de proantocianidina. El pretratamiento de tales
glicósidos o ésteres, que son contaminantes, con la glicosidasa
anterior para obtener agliconas permite la eliminación eficaz de los
contaminantes en la próxima etapa de purificación, y permite
mejoras en la pureza de los oligómeros de proantocianidina. Por
ejemplo, mediante tratamiento con
\beta-glicosidasa, la rutina, que es un glucósido
flavonoide abundante en la planta Fagopyrum esculentum de la
familia Polygonaceae, da como resultado quercetina, que es
una aglicona. Cuando se tratan ácido clorogénico y ácido
p-cumaroilquínico, que son hidroxicinamatos y los
frutos u hojas de las dicotiledóneas los contienen en abundancia,
con hidroxicinamato hidrolasa, sus enlaces depsídicos, que son
enlaces éster intramoleculares, se hidrolizan, lo que da como
resultado ácido cafeico y ácido quínico, y ácido
p-cumárico y ácido quínico, respectivamente. Las
condiciones de reacción para el tratamiento con la enzima de
hidrólisis difieren dependiendo del tipo de enzimas o similares. En
general, las condiciones son pH 3 a 8, 25 a 55ºC, y 1 a 24 horas.
Los componentes de aglicona anteriores, carbohidratos libres o
ácidos carboxílicos resultantes del tratamiento con la glicosidasa,
se pueden eliminar fácilmente mediante técnicas convencionales,
tales como refrigeración, extracción líquido-líquido
o sólido-líquido, o adsorción en columna, o una
combinación de estos métodos y cromatografía en fase normal. Estas
etapas permiten la eliminación eficaz de contaminantes de las
materias primas que contienen oligómeros de proantocianidina
diméricos a pentaméricos o de sus productos de purificación brutos,
y permiten la mejora de la pureza de los componentes de interés, es
decir, de los oligómeros de proantocianidina diméricos a
pentaméricos.
En el tercer aspecto descrito aquí, se pueden
obtener oligómeros de proantocianidina diméricos a pentaméricos con
un grado de polimerización uniforme mediante separación y
purificación por grado de polimerización, a partir de materias
primas que contienen los oligómeros de proantocianidina o de sus
productos de purificación brutos mediante cromatografía líquida de
gel de sílice en fase normal que usa como fase móvil un disolvente
simple o un disolvente mixto de dos o más disolventes, seleccionados
del grupo que consiste en un disolvente de éster, un disolvente de
cetona, un disolvente de hidrocarburo, un disolvente de éter y un
disolvente de alcohol. Para la cromatografía líquida de gel de
sílice en fase normal anterior, se puede aplicar un método que usa
cromatografía en columna abierta o el que usa cromatografía líquida
de alta eficacia. El disolvente o el agua se eliminan de la
disolución que contiene oligómeros de proantocianidina diméricos a
pentaméricos, y después el residuo se disuelve en una fase móvil o
en un disolvente orgánico soluble en una fase móvil. Cuando las
materias primas o sus productos de purificación brutos son sólidos,
se disuelven directamente en la fase móvil o en un disolvente
orgánico soluble en la fase móvil. Si es necesario, se filtran a
través de un filtro de membrana o similar, y después se cargan en
la columna. En la elución de un componente de interés, se prefiere
la elución isocrática, que no aplica gradiente de concentración en
la fase móvil, teniendo en cuenta la simplificación de la
operación. Los ejemplos de fase móvil preferible en la elución
isocrática incluyen disolventes mixtos, tales como
hexano/metanol/acetato de etilo, hexano/acetona,
hexano/metanol/tetrahidrofurano/ácido acético,
hexano/metanol/tetrahidrofurano/ácido fórmico,
hexano/metanol/acetato de metilo/ácido acético,
hexano/metanol/acetato de metilo y hexano/acetato de
metilo/acetona.
El proceso de purificación del tercer aspecto
descrito aquí permite la eliminación eficaz de contaminantes, es
decir, monómeros que constituyen proantocianidinas, tales como
(+)-catequina, (+)-galocatequina,
(-)-epicatequina y
(-)-epigalocatequina, y polímeros de
proantocianidina hexaméricos o de orden superior; y permite la
separación y purificación por grado de polimerización de los
componentes de interés, es decir, oligómeros de proantocianidina
diméricos a pentaméricos.
El proceso de la presente invención se puede
combinar con otros procesos conocidos. Cuando los procesos de
purificación se combinan, las etapas a usar y su orden se pueden
seleccionar libremente.
Mediante estos procesos, se pueden obtener de
forma eficaz oligómeros de proantocianidina diméricos a
pentaméricos, proantocianidinas diméricas, y proantocianidinas
triméricas con gran pureza (pureza del 90% (p/p) o más).
Los oligómeros de proantocianidina diméricos a
pentaméricos, proantocianidinas diméricas y proantocianidinas
triméricas purificadas mediante el proceso de purificación de esta
invención se pueden usar como materias primas para fabricar
alimentos, cosméticos, fármacos o similares.
La Fig. 1 muestra el resultado de la
cromatografía líquida en fase inversa. Los símbolos en la Fig. 1
indican lo siguiente.
- 1.
- PB1
- 2.
- (+)-catequina
- 3.
- PB2
- 4.
- ácido clorogénico
- 5.
- ácido cafeico
- 6.
- PC1
- 7.
- (-)-epicatequina
- 8.
- éster de ácido p-cumárico
- 9.
- ácido p-cumárico
- 10.
- floricina
- 11.
- floretina
La Fig. 2 (Referencia) muestra el resultado de
la cromatografía líquida en fase normal.
La Fig. 3 (Referencia) muestra el resultado de
la cromatografía líquida en fase normal.
La Fig. 4 (Referencia) muestra el resultado de
la cromatografía líquida en fase inversa. Los símbolos de la Fig. 4
indican lo siguiente.
- 1.
- PB1
- 2.
- (+)-catequina
- 3.
- PB2
- 4.
- PC1
- 5.
- (-)-epicatequina
- [5], [6]
- Fracciones de monómeros que corresponden a los n^{os} de fracción de la Fig. 3.
- [7] - [11]
- Fracciones de dímeros que corresponden a los n^{os} de fracción de la Fig. 3.
- [12] - [20]
- Fracciones de trímeros que corresponden a los n^{os} de fracción de la Fig. 3.
La Fig. 5 (Referencia) muestra el resultado de
la cromatografía líquida en fase normal.
La Fig. 6 (Referencia) muestra el resultado de
la cromatografía líquida en fase inversa. Los símbolos de la Fig. 6
indican lo siguiente.
- 1.
- PB1
- 2.
- (+)-catequina
- 3.
- PB2
- 4.
- PC1
- 5.
- (-)-epicatequina
- [2] - [4]
- Fracciones de monómeros que corresponden a los n^{os} de fracción de la Fig. 5.
- [5] - [9]
- Fracciones de dímeros que corresponden a los n^{os} de fracción de la Fig. 5.
- [10] - [15]
- Fracciones de trímeros que corresponden a los n^{os} de fracción de la Fig. 5.
La Fig. 7 muestra el resultado de analizar la
distribución de los grados de polimerización de los oligómeros de
proantocianidina.
A continuación, la presente invención se
describirá adicionalmente con Ejemplos, pero no se limita por
ninguno de estos Ejemplos o similares.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
(Referencia)
Se añadieron 300 ml de acetato de metilo a 30 g
de la fracción de proantocianidina obtenida en el Ejemplo de
Referencia 1, y después se realizó extracción
sólido-líquido a temperatura ambiente durante 1
hora. La extracción se realizó dos veces en total, los dos
extractos resultantes de la extracción se mezclaron y después se
sometieron a filtración. Después, el residuo de la extracción se
lavó con una pequeña cantidad de acetato de metilo. Los extractos
de acetato de metilo y el lavado se combinaron y se concentraron a
presión reducida. Se añadió una pequeña cantidad de agua destilada,
y se realizó otra vez concentración a presión reducida, y el
componente extraído se disolvió en una disolución acuosa. La
disolución acuosa resultante se liofilizó para dar 17,5 g de un
extracto de acetato de metilo en forma de polvo. Además, el residuo
de la extracción se secó para dar 12,5 g de un residuo sin extraer
de la extracción de acetato de metilo en forma de polvo. El
contenido de los componentes de proantocianidina diméricos y
triméricos contenidos en ambos productos en polvo se determinó
mediante cromatografía líquida en fase inversa como se describe en
el Ejemplo de Referencia 2. Los componentes de proantocianidina
diméricos determinados fueron procianidina B1
(epicatequina-(4\beta\rightarrow8)-catequina;
en adelante abreviado como PB1) y procianidina B2
(epicatequina-(4\beta\rightarrow8)-epicatequina;
en adelante abreviado como PB2). El componente de trímero
determinado fue procianidina C1
(epicatequina-(4\beta\rightarrow8)-epicatequina-(4\beta\rightarrow8)-epicatequina;
en adelante abreviado como PC1). La Tabla 1 muestra los resultados
de la extracción con acetato de metilo, así como los rendimientos
(%) de contenido sólido.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la Tabla 1, se consiguió de
forma eficaz la extracción selectiva y la mejora de la pureza de
los componentes de oligómeros de proantocianidina representados por
PB1, PB2 y PC1 mediante extracción sólido-líquido
con acetato de metilo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
(Referencia)
Se mezclaron acetato de metilo y diversos
disolventes en una proporción de volúmenes de 9 : 1 (en el caso de
acetato de metilo : hexano, la proporción es 95 : 5), y así se
prepararon disolventes para la extracción
sólido-líquido. El disolvente orgánico miscible con
acetato de metilo usado en estos diversos disolventes fue metanol,
etanol, propanol, butanol, formiato de etilo, acetato de etilo,
acetona, acetonitrilo, tetrahidrofurano, hexano o ácido acético. Se
añadieron 10 ml del disolvente de extracción a 1 g de cada fracción
de proantocianidina obtenida en el ejemplo de referencia 1, y la
mezcla se sometió a extracción sólido-líquido a
temperatura ambiente durante 1 hora (extracción única). Tras la
eliminación de los componentes sólidos del extracto mediante
centrifugación, se diluyó una cierta cantidad del extracto 100
veces con agua destilada (0,01\rightarrow1 ml). Después se
determinó el contenido de PB1, PB2 y PC1 mediante la cromatografía
líquida en fase inversa descrita en el Ejemplo de Referencia 2. De
forma simultánea, se tomó una muestra de 1 ml de cada uno de los
extractos para eliminar los disolventes, y después se liofilizó,
por lo que se determinó la cantidad de extracto sólido. La Tabla 2
muestra las eficacias de extracción y los rendimientos (%) del
contenido sólido para PB1, PB2 y PC1 en el extracto procedente de
la extracción sólido-líquido con cada disolvente de
extracción. Además, como ejemplo comparativo, se realizó extracción
sólido-líquido solamente con acetato de etilo de una
manera similar a la descrita anteriormente (excepto que se usaron
20 ml de acetato de etilo para 2 g de la fracción de
proantocianidina). La Tabla 2 también muestra los resultados del
experimento comparativo.
Ejemplo
3
(Referencia)
Se mezclaron acetato de metilo y acetato de
etilo en una proporción en volumen como se muestra en la Tabla 3, y
después se realizó extracción sólido-líquido. Se
añadieron 10 ml de cada uno de los disolventes de extracción en la
proporción en volumen respectiva a 1 g de la fracción de
proantocianidina obtenida en el Ejemplo de Referencia 1, seguido de
extracción sólido-líquido a 30ºC durante 1,5 horas.
Esta etapa se repitió tres veces. Estos extractos se combinaron, se
concentraron a presión reducida y se liofilizaron, por lo que se
obtuvieron productos en polvo (extracto). Se determinaron los
contenidos de PB1, PB2 y PC1 en los productos en polvo mediante la
cromatografía líquida en fase inversa descrita en el ejemplo de
referencia 2. La Tabla 3 muestra los resultados de la extracción
con un disolvente en la proporción de volúmenes respectivos, e
incluye los rendimientos (%) de contenido sólido, las cantidades
del extracto y los rendimientos de cada uno de PB1, PB2 y PC1, y
las cantidades del extracto, rendimientos (%) y pureza del total de
PB1, PB2 y PC1.
Como se muestra en la Tabla 3, la extracción
selectiva y la mejora de los rendimientos de los componentes de
oligómeros de proantocianidina representados por PB1, PB2 y PC1 se
consiguieron de forma eficaz mediante extracción
sólido-líquido con un disolvente de extracción que
contenía acetato de metilo.
Ejemplo
4
El extracto de polifenol obtenido en el Ejemplo
de Referencia 1 se trató con una preparación enzimática disponible
comercialmente para procesado de alimentos. Las preparaciones
enzimáticas usadas aquí fueron una preparación de lipasa (no es
parte de la invención) derivada del género Aspergillus
(Lipase Sankyo^{TM}, SANKYO CO., LTD.) y una preparación de
hidrolasa (no es parte de la invención) (hidroxicinamato hidrolasa
(Seishin Co., Ltd.)). Previamente se han ajustado 100 ml del
extracto de polifenol al valor de pH 5 con 5 moles/l de NaOH, y se
han diluido 10 veces con agua destilada, por lo que se obtiene una
disolución de muestra. Se añadió 1 g de la anterior preparación de
lipasa y de la anterior preparación de hidrolasa a 1 L de la
disolución de muestra (concentración final: 0,1%), y se dejó
desarrollar la reacción enzimática a 45ºC durante 16 horas. Se
muestran los resultados del análisis de la cromatografía líquida en
fase inversa descrita en el Ejemplo de Referencia 2 realizada sobre
la disolución de muestra antes y después de la reacción en la Fig.
1-a y 1-b, respectivamente. Como se
muestra en la figura, la mayoría de los contaminantes principales,
ácido clorogénico y floricina, desaparecieron, y en su lugar se
incrementaron ácido cafeico, ácido p-cumárico y
floretina libres, debido a la reacción enzimática anterior. A
continuación, se concentró la disolución tras la reacción y después
se sometió a secado por pulverización, por lo que se obtuvieron 20 g
de polvo. Después, se le añadieron 200 ml de acetato de metilo, y
se realizó extracción sólido-líquido. Se muestra un
cromatograma del extracto de acetato de metilo en la Fig.
1-c. Los polímeros de proantocianidina, que
aparecieron como una elevación de la línea base de la Fig.
1-a y 1-b, se eliminaron mediante
extracción sólido-líquido. Además, se añadió una
pequeña cantidad de agua destilada a este extracto, y después se
eliminó acetato de metilo mediante concentración a presión
reducida, por lo que los componentes extraídos se disolvieron en
agua. Se añadió acetato de etilo/n-hexano (8/2) (en
una cantidad equivalente a la disolución acuosa) a la disolución
acuosa obtenida (50 ml) para realizar extracción
líquido-líquido. Se muestran los cromatogramas de la
capa de disolvente orgánico (capa superior) y de la capa acuosa
(capa inferior) resultantes en las Fig. 1-d y Fig.
1-e, respectivamente. Así, parte de los monómeros
que constituyen proantocianidinas (catequina, epicatequina) y la
mayoría de los productos principales del tratamiento enzimático
previo, ácido cafeico, ácido p-cumárico y floretina
libres, se extrajeron hacia la capa de disolvente orgánico (Fig.
1-d). La mayoría de los oligómeros de
proantocianidina diméricos a pentaméricos representados por PB1,
PB2 y PC1 permanecieron en la capa acuosa tras la extracción
líquido-líquido (Fig. 1-e). La capa
acuosa obtenida finalmente se concentró y se liofilizó, por lo que
se obtuvieron 5,7 g de polvo. Como resultado de una serie de
etapas, la pureza de PB1 + PB2 + PC1 en contenido sólido total
mejoró alrededor de 4 veces, de 11,5% a 40,3%. Como se describió
anteriormente, la pureza de los componentes de interés, oligómeros
de proantocianidina diméricos a pentaméricos, se puede mejorar de
forma eficaz mediante tratamiento de lisis enzimática de los
extractos procedentes de las materias primas, seguido de una
combinación de múltiples procesos de purificación.
Ejemplo
5
(Referencia)
Se añadieron 100 ml de acetato de metilo a 10 g
de la fracción de proantocianidina obtenida en el Ejemplo de
Referencia 1 para realizar extracción
sólido-líquido. El extracto se concentró a presión
reducida hasta un volumen constante de 20 ml de líquido
concentrado. Después se realizó la cromatografía líquida de fase
normal que usa gel de sílice como relleno para separar los
componentes. Las condiciones para la cromatografía son las
siguientes:
Columna: Inertsil SIL^{TM} (4,6 mm de D.I. x
150 mm, GL Science)
Fase móvil para separación isocrática:
hexano/metanol/acetato de etilo (70/30/10)
Dosis de carga de la muestra: 0,01 ml
Caudal: 1,8 ml/min.
Detección: UV 280 nm
\vskip1.000000\baselineskip
El cromatograma obtenido se muestra en la Fig.
2. En estas condiciones, los componentes de oligómeros de
proantocianidina se separaron por grado de polimerización de dímero
a orden superior, y después eluyeron de la columna. Es decir, se
confirmó que la separación selectiva de componentes de oligómeros
con un grado de polimerización uniforme, dímeros, trímeros y
similares, dependiendo del propósito, se consiguió mediante
cromatografía líquida en fase normal que usa gel de sílice como
relleno.
Además, usando las mismas muestras líquidas
concentradas, se realizó un fraccionamiento mediante cromatografía
líquida en fase normal a escala preparativa. Las condiciones para el
fraccionamiento son las siguientes:
Relleno de gel de sílice: gel de sílice
multiporoso esférico (75 \mum, 120 A)
Tamaño de columna: 6 mm de D.I. x 500 mm x 2
columnas
Fase móvil para separación isocrática:
hexano/metanol/acetato de etilo (70/30/10)
Dosis de carga de la muestra: 0,5 ml
Caudal: 3 ml/min
Fraccionamiento: 15 ml/5 min./1 fracción
Detección: UV 280 nm
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la Fig. 3, los oligómeros de
proantocianidina de las muestras se separaron también por grado de
polimerización incluso a escala preparativa.
Posteriormente, se tomaron muestras de las
fracciones eluidas que correspondían a monómeros, dímeros y trímeros
en el cromatograma. Después, se examinó la constitución de los
componentes de oligómeros en cada fracción eluida usando la
cromatografía líquida en fase inversa descrita en el Ejemplo de
Referencia 2. Como se muestra en la Fig. 4-[5] y en la Fig. 4-[6],
las fracciones de monómero estaban compuestas principalmente de
catequina y epicatequina, como se muestra en la Fig. 4-[7] a [11],
las fracciones de dímeros estaban compuestas principalmente de PB1
y PB2, y como se muestra en la Fig. 4-[12] a [20], las fracciones de
trímero estaban compuestas principalmente de PC1. Las fracciones
separadas estaban cada una compuestas de componentes de oligómeros
con un grado de polimerización uniforme.
La pureza de los productos de proantocianidina
diméricos y triméricos purificados obtenidos anteriormente fue del
93% y 92% (p/p), respectivamente.
\newpage
Ejemplo
6
(Referencia)
Usando la muestra líquida concentrada obtenida
en el Ejemplo 5, se realizó un fraccionamiento mediante
cromatografía líquida en fase normal. Las condiciones para el
fraccionamiento fueron las siguientes:
Relleno de gel de sílice: gel de sílice
multiporoso esférico (75 \mum, 120 A)
Tamaño de columna: 6 mm de D.I. x 500 mm x 2
columnas
Fase móvil para separación isocrática:
hexano/acetona (40/60)
Dosis de carga de la muestra: 0,05 ml
Caudal: 3 ml/min.
Fraccionamiento: 15 ml/5 min./1 fracción
Detección: UV 280 nm
\vskip1.000000\baselineskip
La Fig. 5 muestra el cromatograma obtenido.
Además, se tomaron muestras de las fracciones eluidas
correspondientes a monómeros, dímeros y trímeros del cromatograma.
Después, se examinó la constitución de los componentes de
oligómeros en cada fracción eluida usando la cromatografía líquida
en fase inversa descrita en el Ejemplo de Referencia 2. Como se
muestra en la Fig. 6-[2] a [4], las fracciones de monómeros estaban
compuestas principalmente de catequina y epicatequina, como se
muestra en la Fig. 6-[5] a [9], las fracciones de dímeros estaban
compuestas principalmente de PB1 y PB2, y como se muestra en la
Fig. 6-[10] a [15], las fracciones de trímero estaban compuestas
principalmente de PC1. De forma similar al Ejemplo 5, las fracciones
separadas estaban cada una compuestas de componentes de oligómeros
con un grado de polimerización uniforme.
La pureza de los productos de proantocianidina
diméricos y triméricos purificados obtenidos anteriormente fue del
95% y 93% (p/p), respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Referencia
1
Se preparó un extracto de polifenol y una
fracción de proantocianidina a partir de manzanas según el método
descrito en Rapid Communication of Mass Spectrometry, 11,
31-36 (1997). Se usaron manzanas inmaduras (3 kg)
de la variedad "Fuji" como materia prima. Los frutos se
prensaron a la vez que se les añadían 3 g de metabisulfito
potásico, y se exprimieron para obtener el zumo. El zumo se
centrifugó y se filtró para su clarificación, por lo que se
obtuvieron 1,8 L de zumo claro. A continuación, el zumo se añadió a
una columna rellena con Sepabeads SP-850^{TM}
(Nippon Rensui) (25 mm de D.I. x 285 mm), y se dejó que los
componentes de polifenol del zumo se adsorbieran en ella. Después
de eliminar los carbohidratos y ácidos orgánicos presentes en el
zumo lavando con 300 ml de agua destilada, los componentes de
polifenol se eluyeron con 200 ml de una disolución de etanol acuoso
del 80%. Además, el eluido recogido se concentró hasta 65 ml a
presión reducida, de forma que se obtuvo el extracto de polifenol.
El extracto de polifenol (25 ml) se añadió después a una columna
rellena con TSK-GEL Toyopearl
HW-40EC^{TM} (TOSOH) (25 mm de D.I. x 285 mm), y
la columna se lavó con 200 ml de agua destilada, de forma que se
eliminó la mayoría de los contaminantes, ácidos carboxílicos
fenólicos. Después, se añadieron 250 ml de una disolución de etanol
acuoso del 40% a la columna, de forma que se eluyeron otros
polifenoles de bajo peso molecular. Posteriormente, se añadieron 100
ml de una disolución de acetona acuosa del 60% a la columna, por lo
que se eluyó y se recuperó la mayoría de las proantocianidinas.
Aquí, parte de los oligómeros de proantocianidina diméricos a
pentaméricos se mezclaron en el eluido con una disolución de etanol
acuoso del 40%. Así, el eluido se sometió a eliminación de etanol
mediante concentración a presión reducida, el concentrado se añadió
después a una columna Sep-pak C18ENV^{TM}
(Waters), por lo que se repurificaron y se recuperaron solamente
los componentes de proantocianidina de la mezcla. La disolución
recuperada y el eluido procedente de la elución con una disolución
de acetona acuosa del 60% se mezclaron, se concentraron a presión
reducida y se liofilizaron, por lo que se obtuvo una fracción de
proantocianidina (zumo claro 1,8 L \rightarrow 8 g). Un análisis
de espectrometría de masas reveló que esta fracción consistía en
proantocianidinas monoméricas a 15-méricas. Según
la demanda, esta etapa se realizó a una escala mayor, de forma que
se preparó un extracto de polifenol o una fracción de
proantocianidina en la cantidad necesaria en cada Ejemplo.
\newpage
Ejemplo de Referencia
2
La composición de componentes de polifenol en
las diversas muestras descritas en los Ejemplos se analizó mediante
cromatografía líquida en fase inversa en las siguientes condiciones,
según la demanda.
Columna: Inertsil ODS-3^{TM}
(4,6 x 15 mm, GL Science)
Eluyente: A) 0,1 moles/l de tampón fosfato (pH
2)/metanol (8/2) B) 0,1 moles/l de tampón fosfato (pH 2)/metanol
(5/5)
Condiciones de elución en gradiente: 0
\rightarrow 10 min. (100% A), 10 min. \rightarrow 50 min. (100%
A \rightarrow 100% B), 50
min. \rightarrow 65 min. (100% B)
min. \rightarrow 65 min. (100% B)
Dosis de carga por muestra: 10 \mul
Caudal: 1 ml/min.
Detección: 280 nm
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Referencia
3
Se analizó la distribución por grado de
polimerización de los oligómeros de proantocianidina en los
productos en polvo obtenidos en el Ejemplo 1 a partir del extracto
o del residuo sin extraer de la extracción con acetato de metilo
mediante cromatografía de penetrabilidad en gel. Las condiciones
para el análisis son las siguientes:
Columna: TSK-GEL Toyopearl
HW-40F^{TM} (2,5 x 95 cm, TOSOH)
Eluyente: acetona/urea 8 mol/l (6/4)
Caudal: 1,0 ml/min.
Fraccionamiento: 3 ml/3 min./1 fracción (se
descartaron los 80 ml iniciales)
Detección: Colorimetría mediante la adición de
un reactivo de fenol (detectado a VIS 760 nm)
\vskip1.000000\baselineskip
Además, una mezcla de catequinas patrón (2 mg de
epicatequina, PB2 y PC1), una mezcla de proantocianidina
(10 mg), un producto en polvo extraído con acetato de metilo de la mezcla de proantocianidina (5,83 mg), y un producto en polvo sin extraer con acetato de metilo de la misma mezcla (4,17 mg) se disolvieron separadamente en 0,5 ml de un eluyente, y se sometieron a análisis. La Fig. 7 muestra los resultados.
(10 mg), un producto en polvo extraído con acetato de metilo de la mezcla de proantocianidina (5,83 mg), y un producto en polvo sin extraer con acetato de metilo de la misma mezcla (4,17 mg) se disolvieron separadamente en 0,5 ml de un eluyente, y se sometieron a análisis. La Fig. 7 muestra los resultados.
Como se muestra en la Fig. 7, en las condiciones
anteriores de análisis, los oligómeros de proantocianidina de una
muestra eluyeron en orden de mayor a menor grado de polimerización,
basándose en el efecto de tamiz molecular del relleno.
Particularmente los componentes de trímero, dímero y monómero
aparecieron como picos individuales en el cromatograma. Como se
muestra en la Fig. 7, el producto en polvo extraído con acetato de
metilo consistió principalmente en componentes de oligómeros de
proantocianidina monoméricos, diméricos y triméricos. Por otra
parte, el producto en polvo sin extraer con acetato de metilo
consistió principalmente en componentes poliméricos de
proantocianidina con pesos moleculares elevados.
Según esta invención, se purificaron de forma
eficaz oligómeros de proantocianidina diméricos a pentaméricos, y
proantocianidinas diméricas y triméricas con un grado de
polimerización uniforme con gran pureza, a partir de materias
primas que contienen proantocianidinas o de sus productos de
purificación brutos. Los oligómeros de proantocianidina obtenidos
mediante la presente invención poseen una diversidad de actividades
biológicas, que incluyen actividad antineoplásica,
antiinflamatoria, antienvejecimiento, antioxidante, antialérgica,
antibacteriana, y de crecimiento capilar y similares, de forma que
son útiles en aplicaciones que incluyen alimentos, cosméticos y
fármacos.
Claims (5)
1. Un proceso para la purificación de oligómeros
de proantocianidina diméricos a pentaméricos, que comprende
pretratar con glicosidasa las materias primas que contienen los
oligómeros de proantocianidina, sus productos de purificación
brutos, o una disolución que contiene uno de éstos, y obtener los
oligómeros de proantocianidina purificados.
2. El proceso de purificación de la
reivindicación 1, en el que las materias primas que contienen
oligómeros de proantocianidina diméricos a pentaméricos o sus
productos de purificación brutos proceden de un vegetal.
3. El proceso de purificación de la
reivindicación 1, en el que la disolución que contiene las materias
primas que contienen oligómeros de proantocianidina diméricos a
pentaméricos o sus productos de purificación brutos es una
disolución acuosa que contiene un 10% o menos de disolvente
orgánico.
4. El proceso de purificación de la
reivindicación 3, en el que el disolvente orgánico es un disolvente
orgánico de alcohol, éster o cetona.
5. El proceso de purificación de la
reivindicación 1, en el que la glicosidasa es una única sustancia o
una mezcla de dos o más sustancias seleccionadas del grupo que
consiste en amilasa, celulasa, glucanasa, xilanasa, glucosidasa,
dextranasa, quitinasa, galacturonasa, lisozima, galactosidasa,
manosidasa, fructofuranosidasa, trehalasa, glucosaminidasa,
pululanasa, ceramidasa, fucosidasa y agarasa.
Applications Claiming Priority (3)
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| JP11638099 | 1999-04-23 | ||
| JP11-116380 | 1999-04-23 | ||
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Publications (1)
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