KR20040067605A

KR20040067605A - 과실추출물로부터 프로안토시아니딘 올리고머의 분리방법

Info

Publication number: KR20040067605A
Application number: KR1020030004811A
Authority: KR
Inventors: 홍태희
Original assignee: (학)청운학원 (대전보건대학); 홍태희
Priority date: 2003-01-24
Filing date: 2003-01-24
Publication date: 2004-07-30

Abstract

본 발명은 과실추출물로부터 프로안토시아니딘 올리고머(OPCs)의 분리방법에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 과실을 분쇄시키는 단계; 상기 분쇄된 과실을 물과 에탄올의 혼합용매에 첨가한 다음, 75∼85℃에서 환류추출 또는 상온에서 초음파로 추출하여 농축시킨 과실추출물을 얻은 단계; 및 상기 과실추출물을 물과 에탄올의 혼합용매에 현탁시켜 알킬 벤젠계 폴리머로 구성된 대공흡부수지에 얹은 다음, 에탄올 함량이 20%, 60% 및 95%의 농도 구배를 갖는 물과 에탄올의 혼합용매로 순차적으로 프로안토시아니딘계 화합물을 용리시키는 단계;를 포함하는 과실추출물로부터 프로안토시아니딘 올리고머의 분리방법에 관한 것이다.

본 발명은 대공흡부수지를 이용하여 과실추출물 중의 프로안토시아니딘 올리고머를 값싸고 신속하게 분리한다는 데에 경제성이 있다.

Description

과실추출물로부터 프로안토시아니딘 올리고머의 분리방법{Method for separating an oligomeric proanthocyanidins from an extract of fruit}

본 발명은 과실추출물로부터 프로안토시아니딘 올리고머(oligomeric proanthocyanidins; OPCs)의 분리방법에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 알킬 벤젠계 폴리머로 구성된 대공흡부수지(macro-porous polymer resin)를 이용하여 과실추출물, 특히 포도주 공장에서 부산물로 얻어지는 포도종자로부터 프로안토시아니딘 올리고머 분획물을 신속하고 경제적으로 분리하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로 포도는 과육만을 섭취하는 경우가 많아 포도를 가공 처리하는 식품업체나 가정에서는 표피와 종실을 폐기 처리하므로 인하여 환경문제를 야기시키고 폐기 처리비용이 소요되고 있는 실정이다.

그러나 포도의 종실에는 천연 플라보노이드류의 일종인 프로안토시아니딘 (Proanthocyanidin)이라고 하는 축합형 탄닌이 다량 함유되어 있으며, 이는 항산화성과 같은 생리활성이 높은 것으로 알려지고 있다.

이러한 사실은 포도주를 많이 애용하는 프랑스인 중에서 심장병으로 사망하는 사람의 비율이 다른 유럽 국가에 비해 상대적으로 낮다는 통계가 잘 뒷받침 해주고 있으며, 이는 포도주에 함유된 프로안토시아니딘과 같은 플라보노이드 성분에 의한 것으로 알려지고 있다.

포도종자의 주요 생리활성물질인 프로안토시아니딘 올리고머는 노화방지, 항산화, 항암, 항염증, 항균, 면역-증강 및 항알레르기 효과가 있으며 독성은 없다고 알려져 있다(Yamakoshi 등, 2002; Bagchi 등, 2000; Saito 등, 1998).

포도종자에는 (+)-카테친(catechins), (-)-에피카테친(epicatechin), (-)-에피카테친(epicatechin)-3-O-갈레이트(gallate)와 같은 모노머(monomer) 형태의 페놀성분과 다이머(dimer), 트리머(trimer) 및 테트라머(tetramer) 형태의 프로안토시아니딘계 화합물(proanthocyanidins)이 함유되어 있다(Fuleki 등, 1997; Santos-Buelga 등, 1995).

포도종자를 실온에서 물-아세톤(3:2, v/v) 혼합용매로 추출한 후 추출액의 감압농축물을 초산에틸로 분배하였을 때 얻어지는 페놀성분함유 추출물의 수율은 약 0.8%이다(Delaunay 등, 2002).

포도종자의 지용성 물질을 석유에테르로 추출하여 제거한 후 아세톤-물-초산 (90:9.5:0.5, v/v) 혼합용매 또는 메탄올-물-초산(90:9.5:0.5, v/v) 혼합용매로 추출하였을 때 얻어지는 추출물의 수율은 5.6∼6.1%이며, 이 추출물에 함유되어 있는 프로시아니딘계 화합물의 조성은 모노머 40.4∼48.0%, 다이머 16.5∼26.3%, 트리머 10.8∼15.1%, 테트라머 5.5∼8.1%의 순으로 모노머가 가장 많이 함유되어 있고 다이머와 트리머가 비교적 많이 함유되어 있는 경향이다(Jayaprakasha 등, 2002).

1H636 GSPE(포도종자 프로안토시아니딘 추출물)는 적포도 종자로부터 추출한 표준화된 물-에탄올 추출물로서 "ActiVin"이라는 상품명으로 시판되고 있다(Bagchi 등, 2000; Kovac 등, 1995).

프로안토시아니딘 올리고머의 분리에는 세파덱스(Sephadex) LH-20이나 셀룰로스 분말 또는 셀라이트(Celite) 등이 연구목적으로 이용되고 있으나, 비용이 많이 드는 단점이 있어 산업적으로는 거의 활용되지 않고 있다(Yamakoshi 등, 2002; Peng 등, 2001).

한편, 포도이외에도 다른 식물에서의 프로안토시아니딘의 분리 정제에 관해서는 종래부터 소나무껍질, 은행나무잎, 땅콩, 카카오콩 등의 각종 식물체에서의 분리가 시도되었다.

포도 종자를 포함하는 다양한 식물로부터 프로안토시아니딘을 공업적으로 추출한 선행특허들을 살펴보면, 포도종자(일본 특개평 3-200781, 국제공개특허 W0 97/39632, 미국특허 제5,484,594호) 또는 소나무껍질(미국특허 제4,698,360호, 국제공개특허 W0 97/44407호)에서의 추출 등을 들 수 있다.

일본 특개평 3-200781에서는, 백포도 종자와 70℃미만의 물을 접촉시켜 전처리를 행한 후 열수 추출을 행하고, 얻어진 추출액을 세파덱스 LH-20 컬럼에 주입한 뒤, 70% 에탄올로 용출하여 순도 약 90%의 프로안토시아니딘 함유 분말을 얻는다.

미국특허 제4,698,360호에서는 해안 소나무껍질 1t를 가압 상태에서 온수 추출한 다음, 아세트산 에틸에 의한 용출 및 클로로포름 첨가에 의한 침전을 반복하여 프로안토시아니딘 함유 분말을 얻는다. 그러나, 상기의 각 방법으로 정제한 정제물 중에 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머만을 90%이상 함유하는 것은 없고, 모든 정제물은 단량체나, 6량체이상의 중합체 또는 다른 유기산을 함유한 것이다.

향류 액액 분배법(countercurrent liquid-liquid distribution method)을 이용한 프로안토시아니딘의 정제방법으로는, 예를 들면 물과 아세트산 에틸을 사용하는 방법이 Andrew G.H. Lea 저, J. Sci. Fd. Agric., 471-477(1978), 일본 특개소 61-16982 등에 기재되어 있다.

또한, 고액 추출법을 이용한 프로안토시아니딘의 정제방법으로, 아세트산 에틸을 사용하는 방법이 일본 특개평 8-176l37 및 유럽공개특허 제0707005호에 기재되어 있다. 예를 들면, 파쇄한 포도종자 100㎏을 물(1,650ℓ), 염화나트륨(300㎏), 아세톤(550ℓ)의 혼합 용액으로 추출하고, 증류에 의해 아세톤을 제거하여 얻은 잔류물을 아세트산에틸을 사용한 고액 추출을 행한 다음, 디클로로에탄(45ℓ)을 첨가함으로써 프로안토시아니딘의 침전물 1.5㎏∼2.5㎏을 얻었다.

또한, 크로마토그래피를 이용한 프로안토시아니딘의 정제방법으로는 상술한 세파덱스 LH-20 컬럼을 사용한 방법(포도종자에서의 추출법, 일본 특개평 3-200781)이나 폴리스티렌계 흡착 수지를 사용한 방법(빨간콩(red beans)에서의 추출법, 일본 특공평 7-62014) 등이 알려져 있다.

예를 들면, 건조된 빨간콩으로부터 얻은 침지수에 폴리스티렌계 흡착수지「세파비즈 SP-850」(MITSUBISHI CHEMICAL CORPORATION)을 첨가하고 교반하여 프로안토시아니딘을 흡착시킨 뒤, 70℃이하에서 수지를 건조시키고, 70℃의 80%(v/v) 에탄올로 용출함으로써, 순도 약 60%의 조(粗) 프로안토시아니딘 함유 분말을 얻었다.

그러나, 이들 방법은 모두 중합도수에 관계없는 프로안토시아니딘 혼합물의 정제방법이고, 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머를 선택적으로 효율 좋게 얻기 위한 수법은 아니며, 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머의 회수율이 낮다.

프로안토시아니딘의 중합도수별 분리에 관해서는, 정상(normal phase) 실리카 겔 액체 크로마토그래피를 사용한 방법[카카오콩에서의 추출법: J. Rigaud et al., J. Chromatogr. A, 255-260(1993), 포도종자로부터의 추출법: Corine Prieuret al., Phytochemistry. 781-784(1994)]이 알려져 있다.

전자의 경우, 카카오콩을 메탄올로 추출하여 얻어진 프로안토시아니딘 함유 시료액을 실리카 겔 충전 컬럼에 주입하고, 이동상으로 디클로로메탄:메탄올:포름산:물[(41→5):(7→43):1:1]의 혼합 용매를 사용하여 기울기 용출(gradient elution)을 행한다.

후자의 경우, 포도종자를 메탄올로 추출하여 얻어진 프로안토시아니딘 함유 시료액을 실리카 겔 충전 컬럼에 주입하고, 이동상으로 디클로로메탄:메탄올:물:트리플루오로 아세트산[(82→10):(18→86):2:0.05]의 혼합 용매를 사용하여 기울기 용출을 행한다.

이밖에 한국 공개특허 제2002-06707호에서는 2∼5량체의 프로안토시아니딘올리고머의 정제방법을 개시하고 있고, 한국 등록특허 제0298512호에서는 천연 항산화물질이 함유된 포도종실 추출물의 제조방법을 개시하고 있으며, 한국 공개특허 제99-035867호에서는 한외여과 방식, 역삼투압 방식 및 상기 2가지 방식의 조합방식으로 프로안토시아니딘의 추출 및 단리방법을 개시하고 있다.

그러나, 이들 방법에는 사용 용매에 염소계의 용매가 포함되어 있고, 또한 용매 조성이 복잡하기 때문에 용매의 회수 재사용이 어렵고, 또한 이동상에 농도 구배를 적용하는 기울기 용출법이 필수로 되는 등의 문제가 있으므로, 이들 방법은 안전성이나 경제성의 면에서 대량 정제를 목적으로 하는 공업적 분리 방법으로는 적합하지 않다.

이에 본 발명에서는 상술한 문제점을 해결하기 위해 광범위한 연구를 수행한 결과, 값싼 알킬 벤젠계 폴리머로 구성된 대공흡부수지를 이용하여 물-에탄올 혼합용매로 포도종자 추출물로부터 프로안토시아니딘 올리고머를 신속하게 분리할 수 있었고, 본 발명은 이에 기초하여 완성되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 경제적으로 신속하게 과실추출물로부터 프로안토시아니딘 올리고머를 분리하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 과실추출물로부터 프로안토시아니딘 올리고머의 분리방법은 과실을 분쇄시키는 단계; 상기 분쇄된 과실을 물과 에탄올의 혼합용매에 첨가한 다음, 75∼85℃에서 환류추출 또는 상온에서 초음파로 추출하여 농축시킨 과실추출물을 얻은 단계; 및 상기 과실추출물을 물과 에탄올의 혼합용매에 현탁시켜 알킬 벤젠계 폴리머로 구성된 대공흡부수지에 얹은 다음, 에탄올 함량이 20%, 60% 및 95%의 농도 구배를 갖는 물과 에탄올의 혼합용매로 순차적으로 프로안토시아니딘계 화합물을 용리시키는 단계;를 포함한다.

이하 본 발명을 좀 더 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 과실추출물에 함유되어 있는 프로안토시아니딘 올리고머를 이온교환 크로마토그래피용 수지(resin)와 겔 크로마토그래피용 흡착제의 성질을 함께 가지고 있는 대공흡부수지를 이용하여 용리시킨다.

본 발명에 있어서, 상기 프로안토시아니딘 올리고머는 포도종자, 포도 껍질, 감잎 또는 감 껍질 등의 과실, 바람직하게는 포도종자로부터 얻는다. 따라서, 먼저 상기 과실을 잘게 분쇄한 다음, 물과 에탄올의 혼합용매를 가하여 추출한다.

추출은 75∼85℃로 가온하면서 환류추출하거나 상온에서 초음파로 추출할 수 있다. 상기 2가지 방법의 추출 수율은 거의 비슷하나 실온에서 추출하는 초음파 추출방법이 경제적인 면에서 바람직하다.

본 발명에 사용되는 대공흡부수지는 알킬 벤젠계의 폴리머로서 천연추출물로부터 약리활성이 있는 배당체의 분리에 산업적으로 이용되고 있다. 상기 대공흡부수지는 이온교환 크로마토그래피용 수지(resin)와 겔 크로마토그래피용 흡착제의 성질을 함께 가지고 있다.

이러한 대공흡부수지는 시판되는 제품을 구입하여 사용할 수 있는데, 예를들어, 대공흡부수지 AB-8(중국 남개대학화공창(中國南開大學化工廠) 제조) 또는 대공흡부수지인 D101(중국 천진대학화공창(中國天津大學化工廠) 제품) 등이 있다.

본 발명에 사용된 대공흡부수지를 이용하여 배당체와 OPCs의 분리시키는 차이를 살펴보면 다음과 같다.

식물에 존재하는 배당체는 사포닌 배당체, 페놀 배당체, 알칼로이드 배당체 등이 있는데, 이들 배당체의 화학식에는 1개이상의 당이 붙어있어 높은 극성을 띠게 된다.

예를 들면, 인삼의 주요 사포닌성분인 진세노사이드-Rg1의 화학식은 담마란 (da㎜arane)계 골격의 6번과 20번 탄소 위치에 각각 1개씩의 포도당(-glucose)이 붙어 있으며, 진세노사이드-Rb1의 화학식은 담마란계 골격의 3번과 20번 탄소 위치에 각각 1개씩의 포도당-포도당(-glucose-glucose)이 붙어 있다.

한편, 천연물질에 가장 광범위하게 사용되고 있는 흡착제는 실리카겔(silica gel)인데, 실리카겔 칼럼 상에서 천연물질을 분리하는 경우 용리액(eluent)은 극성이 낮은 용매부터 시작하여 점차 극성이 높은 용매의 순으로 사용하며, 천연물질은 역시 비극성→반극성→극성→수용성의 순으로 용출된다.

그러나 천연물에 따라서는 진세노사이드와 같이 극성이 높은 배당체가 함유되어 있는 경우도 많은데, 이러한 배당체를 분리할 때 실리카겔을 흡착제로 사용하면 용리액의 극성도를 아무리 높여도 배당체와 수용성 물질이 효과적으로 분리하기 어려운 경우가 있다.

이때 실리카겔 칼럼 대신 알킬 벤젠계 계열의 대공흡부수지 칼럼을 사용하고물과 주정으로 용출시키면 수용성 물질은 물 용출 분획으로 분리되고, 배당체는 물보다 극성이 낮은 함수 주정 분획으로 효과적으로 분리되므로 산업적으로 대공흡부수지가 배당체의 분리에 이용되고 있는 것이다.

반면에, OPCs는 배당체보다 극성이 낮은 물질이다. 실리카겔 칼럼 상에서 배당체는 보통 부탄올이나 함수 부탄올을 용리액으로 사용할 때 분리되지만, OPCs는 부탄올보다 극성이 낮은 초산에틸(ethyl acetate)을 용리액으로 사용할 때 분리되는 물질이다. 그러나 실리카겔 칼럼을 이용한 OPCs 분리방법은 인체에 해로운 초산에틸을 용리액으로 사용해야 하므로 산업적으로 이용하기는 어렵다.

대공흡부수지를 OPCs 분리에 이용하면 OPCs는 배당체 분리에 적합한 용리액보다 극성이 낮은 용리액(함수 주정의 경우 주정함량이 높은 용리액)을 사용할 때 더 용이하게 분리된다. 따라서, 대공흡부수지는 산업적으로 배당체의 분리에 이용되고 있으나 배당체보다 극성이 낮은 OPCs의 분리에 산업적으로 이용된 예가 없는 것이다.

본 발명에 따르면, 과실추출물에 함유되어 있는 OPCs는 대공흡부수지 칼럼 상의 대공(大孔; macropore)에 흡착되었다가 흡착력의 차이에 따라 순차적으로 방출되어 분리된다.

본 발명에 따르면, 상기 과실추출물에 약 70% 주정(에탄올의 함량이 70%인 물과 에탄올의 혼합용매)을 가하여 75∼85℃에서 환류추출 또는 상온에서 초음파로 추출하였을 때 얻어지는 추출물의 수율은 약 8%(고형분 42.7°Bx)이었으며, 과실추출물을 물과 에탄올의 혼합용매에 현탁시킨 다음, 대공흡부수지 칼럼에 얹고 20%주정(에탄올의 함량이 20%인 물과 에탄올의 혼합용매)(A분획), 60% 주정(에탄올의 함량이 60%인 물과 에탄올의 혼합용매)(B분획) 및 95% 주정(에탄올의 함량이 95%인 물과 에탄올의 혼합용매)(C분획)의 순으로 용리하였을 때 A분획, B분획 및 C분획의 수율은 각각 52∼64%, 35∼45% 및 1∼2%이었다.

전술한 바와 같이, 대공흡부수지 칼럼으로 과실추출물 성분들을 분리할 때 과실추출물 성분들은 대공흡부수지의 대공에 흡착되었다가 흡착력의 차이에 따라 순차적으로 방출되어 분리되는데, 과실추출물성분들의 흡착력은 용리액(eluent)과의 친화력(affinity)과도 밀접한 관계가 있다. 다시 말하면, 과실추출물성분 중 어떤 성분이 대공에 대한 흡착력보다 용리액과의 친화력이 더 크면 그 성분은 대공으로부터 방출되는 것이다.

용리액과의 친화력은 일반적으로 과실추출물 성분과 용리액의 극성도와 밀접한 관계가 있는데, 용리액의 극성이 높으면 상대적으로 극성이 높은 과실추출물 성분이 대공으로부터 방출되고, 용리액의 극성이 낮으면 상대적으로 극성이 낮은 과실추출물 성분이 대공으로부터 방출된다.

본 발명에 따르면, 대공흡부수지 칼럼 상에서 OPCs를 분리할 때 물과 에탄올의 혼합용매의 농도 구배를 달리하여 추출하는데, 이는 용리액의 극성을 다르게 함으로써 과실추출물 중의 수용성물질, 극성이 높은 물질, 극성이 상대적으로 낮은 물질을 용이하게 분리할 수 있기 때문이다.

물은 용리액 중에서 극성이 가장 높은 물질이며 물과 에탄올 혼합용매에서 에탄올의 농도가 증가할수록 극성은 낮아진다. 대공흡부수지 칼럼 상에서 100% 물을 용리액으로 사용하면 유리당, 수용성 단백질, 수용성 탄수화물 등을 수용성 물질들을 선택적으로 분리할 수 있다.

그러나 수용성 물질이 적게 함유되어 있는 과실추출물(예: 포도종자추출물) 중의 OPCs를 산업적으로 분리하고자 하는 경우에는 용리액으로 100% 물을 사용하는 과정이 불필요하며, 직접 물과 에탄올의 혼합용매를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 물과 에탄올의 혼합용매의 농도 구배를 달리하여 추출하는 또 다른 이유는 OPCs의 함량이 가장 높은 분획을 선별할 수 있을 뿐만 아니라, OPCs 함량이 각기 다른 분획을 제조할 수 있기 때문이다.

과실추출물에는 OPCs 이외에 유리당, 수용성 단백질, 수용성 탄수화물 등의 수용성 물질과 OPCs보다 극성이 높은 물질, OPCs보다 극성이 낮은 물질이 함께 함유되어 있기 마련이다.

수용성 물질은 100% 물을 용리액으로 사용할 때 분리된다. 100% 물보다 극성이 낮은 용리액을 사용하는 경우에도 수용성 물질은 분리되나 에탄올 농도 구배에 따라 수용성 물질 이외에 극성물질, 반극성 물질 및 비극성 물질도 함께 분리될 수 있다.

OPCs보다 극성이 높은 물질은 100% 물을 용리액으로 사용할 때는 분리되지 않으나 에탄올 농도가 적정수준인 물과 에탄올의 혼합용매에서 분리된다. 이때 에탄올 농도를 적정수준보다 더 크게 높이면 OPCs 및 OPCs보다 극성이 낮은 물질이 함께 분리될 수 있다.

OPCs는 100% 물을 용리액으로 사용할 때는 분리되지 않으나, 에탄올 농도가적정수준인 물과 에탄올의 혼합용매에서 분리된다. 이때 에탄올 농도가 적정수준보다 낮으면 OPCs의 분리 수율(yield)이 낮아지고 에탄올 농도가 적정수준보다 높으면 OPCs보다 극성이 낮은 물질도 함께 분리될 수 있다.

한편, 카테친을 기준으로 하는 Jayaprakasha 등(2000)의 방법에 준하여 프로안토시아니딘 올리고머를 분석하였을 때 과실추출물 중의 함량은 9.0㎎/g(0.90%; 건조무게 기준)이었고, A분획, B분획 및 C분획 중의 함량은 과실추출물 무게를 기준으로 하였을 때 각각 약 3.7㎎/g(0.37%), 약 3.8㎎/g(0.38%) 및 약 1.5㎎/g (0.15%)이었다.

본 발명의 바람직한 일 실시예로서 포도종자추출물로부터 프로안토시아니딘 올리고머를 분리하는 방법을 일례로 설명하면 다음과 같다.

(1) 포도종자추출물(고형분 42.7°Bx) 3g을 20% 주정에 현탁시켜 대공흡부수지 AB-8(중국 남개대학화공창(中國南開大學化工廠) 제조) 칼럼(22㎜ x 21㎝)의 상부에 얹는다.

·포도종자추출물 3g은 고형분 무게로 환산하였을 때 1.28g에 해당된다.

·AB-8을 충전시킨 유리 칼럼은 95% 주정 500㎖로 세척하고 나서 다시 물 1,000㎖로 세척한 후 사용한다.

(2) 포도종자추출물을 얹은 AB-8 칼럼의 상부에 20% 주정 200㎖를 가하고 칼럼의 하부로부터 흘러나오는 액을 포집한다(A분획).

·20% 주정은 200∼1,000㎖를 사용하여도 무방하다.

·칼럼의 하부로부터 액이 잘 흘러나오지 않는 경우에는 감압 또는 가압을 하여도 무방하다.

(3) AB-8 칼럼의 상부에 60% 주정 200㎖를 가하고 칼럼의 하부로부터 흘러나오는 액을 포집한다(B분획).

·60% 주정은 200∼1,000㎖를 사용하여도 무방하다.

(4) AB-8 칼럼의 상부에 95% 주정 200㎖를 가하고 칼럼의 하부로부터 흘러나오는 액을 포집한다(C분획).

·95% 주정은 200∼1,000㎖를 사용하여도 무방하다.

·칼럼의 하부로부터 액이 잘 흘러나오지 않는 경우에는 감압을 하거나 가압을 하여도 무방하다.

이렇게 포도종자추출물로부터 분리한 분획물은 순수한 물질이 아니라 프로안토시아니딘의 다이머(dimer), 트리머(trimer), 테트라머(tetramer) 등의 혼합물을 포함한다. 또한, 이들 혼합물 이외에 카테친, 에피카테친 등의 모노머(monomer)가 함유되어 있을 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하지만, 하기 실시예에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

파쇄한 포도종자 1,000g에 3배 량의 70% 주정을 가하고 실온에서 초음파로 30분씩 2회 추출한 후, 추출액을 40∼45℃에서 감압 농축하여 고형분이 42.7°Bx인 알콜가용성 포도종자추출물 80g을 얻었다. 카테친을 기준으로 할 때 이 포도종자추출물 중의 프로안토시아니딘 올리고머 함량은 9㎎/g이었다.

실시예 2

포도종자추출물(고형분 42.7°Bx) 3g을 20% 주정에 현탁시켜 대공흡부수지 AB-8(중국 남개대학화공창(中國南開大學化工廠) 제조) 칼럼(22㎜×21㎝)의 상부에 얹은 후 칼럼의 상부에 20% 주정(A분획), 60% 주정(B분획), 95% 주정(C분획)을 200㎖씩 차례로 가하여 칼럼의 하부로부터 흘러나오는 액을 각각 포집하였다.

A분획, B분획 및 C분획의 수율은 고형분 기준으로 각각 63.6%, 35.1% 및 1.3%이었으며, 카테친을 기준으로 할 때 각 분획 중의 프로안토시아니딘 올리고머 함량은 과실추출물 무게를 기준으로 하였을 때 각각 3.7㎎/g, 3.8㎎/g 및 1.5㎎/g이었다.

상기 실시예 2에서 포도종자추출물을 대공흡부수지 칼럼 상에서 분리하였을 때 A분획, B분획, C분획의 고형분 수율은 각각 63.6%, 35.1%, 1.3%로서, A분획이 가장 높았으나 각 분획의 OPCs 수율은 41.1%, 42.2%, 16.7%로서 B분획이 가장 높았고 각 분획 중의 OPCs 함량(카테친 기준)은 각각 0.58%, 1.08%, 11.29%로서 C분획이 가장 높았다.

이와 같이, 물과 에탄올의 혼합용매의 농도 구배를 달리하여 OPCs의 함량이가장 높은 분획을 선별할 수 있을 뿐만 아니라, OPCs 함량이 각기 다른 분획을 제조할 수 있었다.

즉, A분획은 고형분 수율이 비교적 높으나 OPCs 함량은 0.58%로 낮고, B분획은 A분획보다 고형분 수율이 낮은 반면에 OPCs 함량은 높으며, C분획은 OPCs 함량이 11.29%로 매우 높으나 고형분 수율은 매우 낮았다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

분획명	고형분	OPCs
분획명	사용량¹⁾/수득량(㎎)	수율(%)	사용량²⁾/수득량(㎎)	수율(%)	분획중 함량³⁾(%)
포도종자추출물사용량	1,281	-	11.52	-
A분획 (20% 주정)	815	63.6	4.75	41.1	0.58
B분획 (60% 주정)	449	35.1	4.86	42.2	1.08
C분획 (95% 주정)	17	1.3	1.92	16.7	11.29

1) 고형분 사용량: 3,000㎎ x 0.427 = 1,281㎎

- 포도종자추출물 중의 고형분 함량은 42.7%이었음.

2) OPCs 사용량: 1,281㎎ x 0.90% = 11.52㎎

- 포도종자추출물 중의 OPCs 함량은 고형분 건조무게 기준으로 0.90%이었음.

3) 각 분획 중 OPCs 함량(%) = (각 분획의 OPCs 수득량 / 고형분 수득량) x 100

실시예 3

포도종자추출물(고형분 42.7°Bx) 30g을 20% 주정에 현탁시켜 AB-8 칼럼(45㎜×51㎝)의 상부에 얹은 후 칼럼의 상부에 20% 주정(A분획), 60% 주정(B분획), 95% 주정(C분획)을 차례로 3.5ℓ, 2ℓ및 2ℓ가하여 칼럼의 하부로부터 흘러나오는 액을 각각 포집하였다. A분획, B분획 및 C분획의 수율은 고형분 기준으로 각각 52.4%, 45.3% 및 2.3%이었다.

실시예 4

포도종자추출물(고형분 42.7°Bx) 30g을 20% 주정에 현탁시켜 AB-8 칼럼(45㎜×51㎝)의 상부에 얹은 후 칼럼의 상부에 20% 주정(A분획), 60% 주정(B분획) 및 95% 주정(C분획)을 차례로 3.5ℓ, 2ℓ및 2ℓ가하여 칼럼의 하부로부터 흘러나오는 액을 각각 포집하였다. A분획, B분획 및 C분획의 수율은 고형분 기준으로 각각 54.5%, 43.2% 및 2.3%이었다.

실시예 5

포도종자추출물(고형분 42.7°Bx) 30g을 20% 주정에 현탁시켜 AB-8 칼럼(45㎜×51㎝)의 상부에 얹은 후 칼럼의 상부에 20% 주정(A분획), 60% 주정(B분획), 95% 주정(C분획)을 차례로 3.5ℓ, 2ℓ및 2ℓ가하여 칼럼의 하부로부터 흘러나오는 액을 각각 포집하였다. A분획, B분획 및 C분획의 수율은 고형분 기준으로 각각 62.5%, 35.2% 및 2.3%이었다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 대공흡부수지를 이용하여 과실추출물 중의 프로안토시아니딘 올리고머를 값싸고 신속하게 분리한다는 데에 경제성이 있다. 과실추출물 중의 프로안토시아니딘 올리고머 분리에는 연구분야에서 세파덱스 LH-20, 셀룰로스, 셀라이트 등이 이용되고 있으나, 이들 흡착제는 가격이 비싸고 재사용이 불가능하다는 단점이 있다.

이에 비하여 대공흡부수지 AB-8은 세파덱스 LH-20이나 셀룰로스 또는 셀라이트에 비하여 저렴하고 간단한 조작만으로 재사용이 가능하여 산업적으로 활용될 수 있는 이점이 있다.

Claims

과실을 분쇄시키는 단계;

상기 분쇄된 과실을 물과 에탄올의 혼합용매에 첨가한 다음, 75∼85℃에서 환류추출 또는 상온에서 초음파로 추출하여 농축시킨 과실추출물을 얻은 단계; 및

상기 과실추출물을 물과 에탄올의 혼합용매에 현탁시켜 알킬 벤젠계 폴리머로 구성된 대공흡부수지에 얹은 다음, 에탄올 함량이 20%, 60% 및 95%의 농도 구배를 갖는 물과 에탄올의 혼합용매로 순차적으로 프로안토시아니딘계 화합물을 용리시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 과실추출물로부터 프로안토시아니딘 올리고머의 분리방법.
제1항에 있어서, 상기 과실이 포도종자, 포도껍질, 감잎 또는 감 껍질인 것을 특징으로 하는 분리방법.