JP2006096693A - 抗アレルギー剤 - Google Patents

Abstract

【課題】
抗ヒスタミン作用ではなく、すなわち活性酸素消去という原理に基づいた、即時型アレルギーによる炎症を、直接塗布あるいは噴霧することにより副作用を極力低減して改善する治療薬を提供すること。
【解決手段】
抗酸化剤を含有することを特徴とする抗アレルギー剤。
【選択図】 なし

Description

本発明は、抗アレルギー剤に関するものである。

スギやダニに対するアレルギーの即時型アレルギーは、近年花粉症やアトピー性皮膚炎等の大きな問題となっている。即時型アレルギーはT細胞、B細胞、肥満細胞、好塩基球等の免疫系エフェクター細胞が抗原と抗原に対するIgE抗体により活性化され、ヒスタミン等のケミカルメディエーターを放出することにより発症すると考えられている。このため、抗アレルギー薬はステロイド剤や抗ヒスタミン剤などが治療に施されるが、副作用が強くアレルギー患者の状態を健全に保つことはできていない。例えばスギ花粉症等のアレルギーにより発症する鼻炎の治療薬として現在用いられているもののほとんどが抗ヒスタミン剤である。抗アレルギー薬は眠気を引き起こす等の副作用を有し、副作用のない食品、医薬品、医薬部外品等の抗アレルギー剤が望まれている。

一方、白血球から放出される活性酸素は、アレルギーの中で炎症に大きく関与することが知られているが、最近ではヒト白血球にダニ抗原を作用させると活性酸素が発生し、シグナル伝達のメディエーターとなることも報告されている（非特許文献１）。

また、ラットの好塩基球株化細胞に抗原としてジニトロフェニル（DNP-BSA）を加えた場合、アレルギー反応として生じるヒスタミン放出量が活性酸素消去剤であるジフェニレンヨードニウムによって抑えられること、およびその抗原抗体反応系に、ルミノールとペルオキシダーゼを反応させることで活性酸素発生、およびSOD（活性酸素消去酵素）でその抑制を確認、さらに、アレルギー患者の白血球画分にアレルゲンを作用させることによるルミノール発光の経時的増加が確かめられている（特許文献１）。従ってヒスタミンの放出と活性酸素発生が関連しているとし、活性酸素消去剤でヒスタミン放出抑制が可能であると報告されている。

しかしながら、特許文献１では、活性酸素を各々直接測定しているわけではなく、また抗酸化剤がアレルギー症状の改善に貢献するという直接的な証拠がない。また、この反応系ではルミノール発光にペルオキシダーゼを使用するため、ポリフェノールの様に酵素阻害活性を有する物質、あるいは自家蛍光を有する物質のアッセイには利用できない。

即時型アレルギーの診断には、血清中のヒスタミン量を測定する方法、および、免疫系エフェクター細胞の活性化が細胞表面に存在するIgEレセプターに抗原特異的IgE抗体が結合することにより起こることから、被験者の血清中の抗原特異的IgE抗体を検出する方法等が用いられているが、抗原特異的IgE抗体価が低くてもアレルギー症状が重い場合もあれば、抗体価が高くてもアレルギー症状を発症しない場合もあることが知られている。またその治療または症状緩和のためには、一般的に抗ヒスタミン剤やステロイド剤が用いられているが、これらの医薬品には眠気や倦怠感を伴ったり、肝機能の低下やリバウンド等の副作用を引き起こしたりするため、安全なアレルギーの改善薬とは言えない。
特開２００１−２１５２２４号公報 生化学、鈴木、６９、ｐ１８７-１９１、１９９７

本発明が解決しようとする課題は、抗ヒスタミン作用ではなく、すなわち活性酸素消去という原理に基づいた、即時型アレルギーによる炎症を、直接塗布あるいは噴霧することにより副作用を極力低減して改善する治療薬を提供することである。

特には、抗酸化剤を含有する点鼻薬を提供することである。

本発明者らは、上記の問題を解決するため、アレルギー症状の作用機序を明確にし、それに基づいた安全な抗アレルギー剤を提供する。すなわち、アレルギー患者の末梢血からT細胞、B細胞、好塩基球、好酸球などの免疫エフェクター細胞が揃っている白血球画分に、該アレルギーのアレルゲン抗原を作用させることによりヒスタミンが放出されることを確認した。続いて同様の白血球画分系においてin vitroで活性酸素消去活性の高い物質を存在させておいても、そのヒスタミン放出量および放出率が抑制されないことを確認した。さらにラット好塩基球細胞株を用いてヒスタミン放出抑制を確認した物質を、ヒト白血球画分とアレルゲンによるヒスタミン放出系に作用させても抑制されないことを確認した。これらのことから、ラット好塩基球細胞株の培養細胞系とDNP-BSA抗原でヒスタミン抑制活性を示しても、ヒト白血球とアレルゲン抗原では同様の活性が得られないことが判明し、細胞株での抗アレルギーアッセイ系が有効でないことを見出した。

しかしながら本発明者らは、該ヒト白血球画分からさらに精製した好中球９５％以上からなる顆粒球に、直接該アレルギーに対するアレルゲン抗原を作用させることにより、顆粒球から発生する個々の活性酸素種であるスーパーオキシドラジカルおよびヒドロキシラジカルをそれぞれ測定し、症状固有のアレルゲンに対して顆粒球から活性酸素がはっせいすることを確認した。さらに同様の顆粒球系において、前記の白血球画分からヒスタミン放出を抑制することができなかった活性酸素消去活性の高い物質（抗酸化剤）を存在させると、スーパーオキシドラジカルおよびヒドロキシラジカルの発生が抑制されることを確認した。

すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１） 抗酸化剤を含有することを特徴とする抗アレルギー剤。
（２） 前記抗酸化剤が活性酸素消去活性を有する化合物である（１）に記載された抗アレルギー剤。
（３） 前記抗酸化剤が植物由来ポリフェノールである（１）または（２）に記載された抗アレルギー剤。
（４） 前記抗酸化剤がプロアントシアニジンである（３）に記載の抗アレルギー剤。
（５） 通年性鼻炎および／または花粉症を改善する効果を有する（１）ないし（４）のいずれか１項に記載の抗アレルギー剤。
（６） 投与形態が点鼻薬である（１）ないし（５）のいずれか１項に記載の抗アレルギー剤。
（７） 抗酸化剤がアレルギー患者の顆粒球とアレルゲンにより発生するスーパーオキシドラジカルとヒドロキシラジカルを選択的に消去する能力を有する化合物であることを特徴とする（１）ないし（６）のいずれか１項に記載の抗アレルギー剤。

本発明の抗アレルギー剤は、従来の抗ヒスタミン剤のような副作用が少なく、アレルギー症状の改善に有効である。

上記、知見に基づいてなされた請求項１に係る発明は、抗酸化剤を含有することを特徴とする抗アレルギー剤に関するものである。

抗酸化剤には、１）自動酸化の連鎖反応を抑制するラジカル阻害剤、２）鉄、銅等の金属の酸化促進作用を不活性にする金属不活化剤、３）過酸化物を非ラジカル分解して不活性化する過酸化物分解剤、４）自ら酸化防止作用はもたないが、ラジカル阻害剤と共同してその作用を増強させる相乗剤等がある。生体内において、活性酸素・フリーラジカルの主たるターゲットとなるのは不飽和脂肪酸やＤＮＡ分子である。特に、不飽和脂肪酸が酸化されると、連鎖的な脂質過酸化反応によって、毒性の強い過酸化脂質が生成される。抗酸化剤は、この連鎖反応が開始する前に、活性酸素・フリーラジカルと結びつき水素の引き抜きを防御する物質、あるいは脂質の酸化反応を停止させる物質、さらには発生した過酸化物を無毒なものに変える。

本発明における抗酸化剤は、上記知見より、活性酸素消去活性を有する化合物であることが好ましい。活性酸素消去活性を有する化合物としては、例えばポリフェノール、植物由来ポリフェノール、プロアントシアニジン、ビタミンＥ、Ｃ、Ａ（カロテン）、β-カロテン、リコペン、ユビキノン、グルタチオン、カテキン等を挙げることができる。

ポリフェノールとは、1分子内に複数のフェノール性水酸基を持つ化合物の総称であり、植物由来ポリフェノールとは、植物を起源とするポリフェノール即ち、フラボノイド類、タンニン酸類もしくはフェノールカルボン酸類などの化合物を指す。これにはカテキン、イソフラボンあるいはプロアントシアニジンなどが含まれる。植物由来ポリフェノールの例としては、リンゴポリフェノール(主成分；プロアントシアニジン)、大豆ポリフェノール（主成分；イソフラボン）、緑茶ポリフェノール（主成分；カテキン）などがあり、主成分は由来となる植物によって異なる。

ポリフェノール製剤の製法は、当該植物の表皮、種子あるいは搾汁残渣などを水またはアルコール抽出する方法、あるいはこれら抽出物や果汁を吸着カラムなどで精製する方法が一般的である。

プロアントシアニジンを主体とするリンゴポリフェノールは、緑茶ポリフェノールなど他の植物由来ポリフェノールに比べて生体内での抗酸化作用を始め、様々な生理活性において優れる。このため、本発明ではプロアントシアニジンを抗酸化素材として用いることが好ましい。

リンゴ果汁からプロアントシアニジンを調製するには、例えば以下の方法により調整すればよい。

リンゴ果汁にはポリフェノール成分として、プロアントシアニジン類、フェノールカルボン酸類およびその他フラボノイド類などが含まれる。

果汁を吸着カラムAに通液、ポリフェノール成分をカラム内樹脂に吸着させる。冷水にてカラムを洗浄後、アルコール水溶液を通液しポリフェノール画分を得る。

このポリフェノール画分を吸着カラムBに通液し、洗浄後アルコールを通液しプロシアニジンを得る。
後者は、吸着、洗浄およびアルコール通液の条件をプロシアニジン回収に最適化してある。

本発明の抗アレルギー剤は、通年性鼻炎および／または花粉症の改善に有効である。

通年性鼻炎とは、発作性反復性のくしゃみ、水性鼻漏、鼻閉の三主徴が通年的に現れる、鼻粘膜のＩ型アレルギー性疾患を意味する。

花粉症とは、花粉が原因として起こる季節性鼻炎を意味する。

本発明における抗アレルギー剤を適用するには、リンゴポリフェノールの場合はリンゴポリフェノール濃度０．０１％〜５％、使用回数１〜１０回／日の範囲で適宜適用すればよい。

本発明の抗アレルギー剤の剤形は、例えば点鼻薬が好ましい。点鼻薬としては、例えばリンゴポリフェノール（アップルフェノン；アサヒビール(株)製）10g、ポリエチレングリコール400（マクロゴール；丸石製薬(株)製）100ml及び蒸留水900mlを混合し、0.22ミクロンフィルターにて濾過を行ったのち点鼻薬容器GL20NS（椿本興業(株)製）に封入し点鼻薬を調製すればよいが、この処方に限定されることはない。

有効成分を直接鼻炎患部に噴霧することができ、飲用摂取に比べ高濃度の有効成分を迅速に患部へ届けることができる。また容器形体は小型スプレー式であり、薬剤に直接触れる事無く簡単に扱うことができ、携行性にも優れているため、点鼻薬が好ましい。

上記した知見より、本発明の抗アレルギー剤を構成する抗酸化剤は、アレルギー患者の顆粒球と該アレルゲンにより発生するスーパーオキシドラジカルとヒドロキシラジカルを選択的に消去する能力を有する化合物であることが好ましい。

スーパーオキシドラジカルとは、酸素分子が１電子還元されたもの。大気中にある酸素の酸化あるいは還元によって生成する活性酸素種のフリーラジカルで、酸素分子に１電子が付加されたものを意味する。

ヒドロキシラジカルとは、過酸化水素に紫外線を照射したり、過酸化水素と２価の鉄イオンとの反応（フェントン反応）により生成する。活性酸素の中で最も反応性の高いラジカルで反応特異性が低い。
実施例
次に、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

スギ花粉症患者１２名と健常者１２名の抹消血をヘパリン含有採血管に採取した。７ｍｌは遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）を行い、その血漿をスギ特異的IgE抗体量やサイトカイン量の測定に供した。スギ特異的IgE抗体量や各種サイトカイン量の測定は、三菱化学ビーシーエル株式会社（東京都）に委託した。その結果、血清中のスギ特異的IgE抗体の量が高い程、花粉症の症状が重い傾向があったが有意差は見出されなかった（図１）。

同じスギ花粉症患者と健常者の抹消血（３３ｍｌ）に、１／５量相当の６％デキストラン含有生理食塩水を加え、撹拌後室温で１時間静置し、上層の白血球画分を回収した。白血球画分は遠心分離とタイロード液による縣濁を２回繰り返して洗浄し、該白血球縣濁液６ｍｌを３７℃１０分間インキュベーション後、１μｌ／ｍｌのスギ抗原タンパク質（生化学工業社製）を６０μｌ加え、軽く撹拌し、３７℃５０分間インキュベーションした。遠心分離後、上清をヒスタミン測定に供し、沈殿はタイロード液で縣濁後、超音波で破砕し、遠心分離後の上清のヒスタミン量を測定した。ヒスタミン測定にはELISAを用い、４３０ｎｍの吸光度を測定することにより、ヒスタミン濃度を定量した。その結果、本法により重度の花粉症者と健常者の間に優位な差が見出されることが明らかになった（図１）。

また、安全性の高い抗酸化剤として、プロアントシアニジン類５０％以上含有するリンゴ由来のポリフェノール（アサヒビール社製：登録商標「アップルフェノン」）を白血球画分に加え、同様にスギ抗原タンパク質で刺激し、放出されたヒスタミンを測定したところ、抗酸化剤の影響は全く見られなかった（図２）。

顆粒球（好中球）画分は、抹消血からのデキストラン沈降した白血球画分５ｍｌを、６ｍｌフィコール液（アマシャム社、Ficoll-Paque PLUS）入り遠心管に重層し、１５００ｒｐｍ、４５分間、４℃で遠心分離し、上清を除去した。沈殿に０.２％のNaCl溶液を５ｍｌ加え、４５秒間スポイトを用いて沈殿を縣濁し、顆粒球に混入した赤血球を溶血させた。続いて１.６％NaCl溶液を加え、撹拌して浸透圧を生理食塩水状態へ戻した。もう一度この溶血操作を繰り返し、顆粒球（好中球）画分を得た。

得られた顆粒球画分（１０００,０００細胞／ｍｌ）１００μｌに、スギ抗原タンパク質を０.２μｇ/ｍｌとなるように加え、発生するスーパーオキシドラジカルおよびヒドロキシルラジカルを、電子スピン共鳴装置（ＥＳＲ：日本電子社製）により測定した。その結果、本法により軽度の花粉症者と健常者との間においても優位な差が認められることが明らかとなった（図１、３）。

そこで、抗酸化剤として活性酸素消去活性の高いリンゴポリフェノールを、１０μｇ/ｍｌとなるように加え、同様にスギ抗原タンパク質により発生するスーパーオキシドラジカルおよびヒドロキシルラジカルを測定したところ、白血球画分からのヒスタミン放出の結果と異なり、抗酸化剤はスーパーオキシドラジカルおよびヒドロキシルラジカルの両方とも抑制した（図４）。

活性酸素消去能を有するリンゴポリフェノールを含む点鼻薬を表１の組成で調製し、花粉症患者による点鼻薬使用試験を行った。花粉飛散時期（３月）に、花粉症の症状が現れた患者７名に、一週間、点鼻薬を随時使用させ、使用前後での花粉症による鼻炎症状の程度をアンケートにより調査した。その結果、７名中６名に顕著な鼻炎改善効果が認められた（図５）。効果のなかった１名は慢性的な鼻炎を発症しており、ステロイド系薬剤を服用するものであった。従って、本発明すなわち活性酸素消去能による鼻炎改善薬は、花粉症等のアレルギー鼻炎の初期症状に効果を発揮するものである。

本発明の抗アレルギー剤は、従来の抗ヒスタミン剤の様な副作用がほとんどなく、抗アレルギー効果を示すので、通年性鼻炎および／または花粉症の症状を改善するのに極めて有用である。

図１は、血漿中スギIgE抗体、白血球をスギ抗原刺激した場合のヒスタミン放出率および顆粒球を抗原刺激した場合の活性酸素発生量と花粉症症状との関係を示すグラフ。 図２は、白血球をスギ抗原刺激した場合のヒスタミン放出に及ぼすアップルフェノン（ＡＰ）の影響を示すグラフ。 図３は、花粉症者および健常者の顆粒球にスギ抗原刺激した場合の活性酸素発生量を示すグラフ。 図４は、顆粒球にスギ抗原刺激することにより発生する活性酸素に対する抗酸化剤の効果を示すグラフ。 図５は、抗酸化剤配合点鼻薬を使用した花粉症者のアンケート結果を示すグラフ。

Claims (7)

1. 抗酸化剤を含有することを特徴とする抗アレルギー剤。
2. 前記抗酸化剤が活性酸素消去活性を有する化合物である請求項１に記載された抗アレルギー剤。
3. 前記抗酸化剤が植物由来ポリフェノールである請求項１または２に記載された抗アレルギー剤。
4. 前記抗酸化剤がプロアントシアニジンである請求項３に記載の抗アレルギー剤。
5. 通年性鼻炎および／または花粉症を改善する効果を有する請求項１ないし４のいずれか１項に記載の抗アレルギー剤。
6. 投与形態が点鼻薬である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の抗アレルギー剤。
7. 抗酸化剤がアレルギー患者の顆粒球とアレルゲンにより発生するスーパーオキシドラジカルとヒドロキシラジカルを選択的に消去する能力を有する化合物であることを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項に記載の抗アレルギー剤。