JP2005082497A - 植物由来ポリフェノール成分を有効成分として含むことを特徴とする免疫調節剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】
植物由来のプロアントシアニジン成分を有効成分として含有することを特徴とする免疫調節剤が提供される。
Description
いる成分群の一つとして植物由来のポリフェノール成分が挙げられる。ポリフェノールとは、複数のフェノール性水酸基を有する化合物群の総称であり、非常に広範な成分からなる化合物群である。代表的なものとしてフェノール酸類、クマリン類、フラボノイド類、タンニン類、等が知られている。ポリフェノール化合物の生合成には、質・量的な差異はあるが高等植物の大部分は何らかのポリフェノール化合物を生合成していると考えられている。植物性食品に含まれるポリフェノールは、主に色素成分や苦み成分を構成し、様々な生理活性を示すことが知られている。
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
Ohnishi-Kameyama et al.,Mass Spectrometry, 11, 31−36, 1997]。
こうして得られた粗リンゴポリフェノール画分には、プロアントシアニジン画分を約50%含有していることが確認され、後述する経口免疫に与える影響を評価するための試料とした。
(1)マウスへの試料投与と卵白アルブミンによる免疫
下記手法により実施例1で得たプロアントシアニジン画分について試験に用いた。雌性BALB/cマウス(7週令、日本チャールズリバーより購入)を室温23±2℃、湿度55±5%の条件にて飼育し、餌(CRF-1)、水は自由に摂取させた。購入後7日間馴化させた後、実験に用いた。また、1%プロアントシアニジン画分溶液は、プロアントシアニジン画分の粉末2
gを200mLの水に溶解して経口自由摂取させた。試料の交換および補充は、給水ビンが空にならないよう注意しながら3日ごとに行った。プロアントシアニジン画分投与群については、通常、第1次免疫の1週間前から1%プロアントシアニジン画分溶液を自由に経口摂取を開始し、脾臓採取の日まで投与を続けた。
脾臓細胞の採取は、第2次免疫応答後行った。すなわち、目より全採血を行い、頚椎脱臼により安楽死させたマウスを70%エタノールに浸して消毒した後、クリーンベンチ内で無菌的に行った。ピンセットで上皮を摘み上げ、左脇腹に1cm程切れ目を入れ(腹膜まで切らない、刃の真中辺りで切る)、指で皮を剥いだ。ハサミの先端で腹膜に穴を開け、脾臓を摘出する。RPMI
1640培地を満たしたシャーレ内でナイロンメッシュと2.5mLシリンジのプランジャーを用いて、脾臓をすりつぶすようにして破砕した。細胞懸濁液をナイロンメッシュで濾過した。次に、4℃、250×gで10分間遠心し、上清を除去した(この操作を繰り返した後、沈殿に10%FBS含有RPMI
1640培地を加え、5×106 cells/mLになるように調製した。細胞懸濁液を24well プレートに2mL/wellで播いた後、4.2 mg/mL OVAを50μlずつ添加し、37℃、5%CO2インキュベーターにて培養した。3日後と7日後に、ピペットを用いて付着細胞をきれいに取りながら、2mL容マイクロチューブに移し、4℃で、1600rpm、5分間遠心分離を行った後、上清を採取し、-80℃で保存した。
脾臓細胞の採取と同様に、ハサミで腹膜に穴を開け、腸管を傷つけないように正中線に沿って開腹した。腸間膜を切断しながら腸を切り出し、大腸と大腸をつなぐ腸間膜リンパ節をハサミの先で突き刺すように穴を開け、この間に腸管をくぐらせる。盲腸の手前で切断し、氷冷したHBSS (FBS(−))の入ったシャーレに入れた。胃側を5 mm程度切断後、盲腸側からシリンジを用いて、HBSS (FCS (−))で腸内を洗浄した。次に、腸管を反転させ、37℃、5%
FBS (+)−HBSSを入れた遠心チューブに4等分に切って絡まないように入れ、37℃、45分間で振とうした。接着性の細胞や細胞片を除去するため、グラスウールカラムに細胞浮遊液を通し、チューブに回収した。更に、予め温めておいた5%
FBS (+)−HBSSを加え腸管と混ぜ、腸管と共にカラムに入れ、軽く上下に揺すり採取した後、遠心分離(20 ℃、1800 rpm×20 min)した。この細胞懸濁液(3mL)に5.5mLの5%FBS
(+)-HBSSを入れ遠心後、上清を捨て、新たに約2mLの5%FBS (+)−HBSSを加え懸濁し、別のチューブに移した。残査に5%FBS (+)−HBSSを加え、穏やかに上下に傾けよく懸濁する。遠心分離(20℃、1800
rpm×20min)した後、上清を約1mL残して除去した。腸管上皮リンパ球は沈殿し、腸管上皮細胞は、液面もしくは液中を漂っているため、浮遊している細胞を沈殿させないよう吸引、除去した。ピペットで懸濁し、細胞懸濁液の状態にした。4.1mL
100%Percollを加え混合し、5%FBS (+)−HBSSで10mLにし、穏やかによく混合した(44%
Percoll)。2mLの70%Percollをチューブ最下部に静かに重層した。遠心分離(20℃、1800
rpm×20min)後、上静を約3mL残し、培地を吸引、除去した。界面に存在する細胞をピペットで0.5mL残して回収し、別のチューブに移した。HBSSで10mLにfill
upし穏やかに上下に傾け撹拌し、遠心分離(20℃、1800 rpm×10 min)をした。上清を1mL残し、内壁と水面の境をなでるようにしてゆっくり慎重に吸い取った。ピペッティングしながら懸濁した細胞懸濁液を10倍希釈したトリパンブルーで染色し、細胞数を数えた。
約3×106 cells/mLに細胞数を調節し、100μLずつチューブに分注した。次に、マウスのFcγIII/IIレセプターへの免疫グロブリンの非特異的な結合を阻害するためFACSバッファーで100倍希釈したFcブロックを50μLずつチューブに加えた。よく撹拌した後、4℃、5分間インキュベートした。さらに、FACS
バッファーをチューブに1mLずつ加え、よく撹拌した後、4℃、1500 rpmで5分間遠心分離をした。チューブを下に傾け垂れてくる液をパスツールピペット吸引、除去した。抗体を50μLずつ加え、よく撹拌した後、4℃、30分間インキュベートし、反応液をアスピレーターで吸引、除去した。FACSバッファーをチューブに1mLずつ加え、よく撹拌した後、4℃、1500 rpmで5分間遠心分離をした。反応液をアスピレーターで吸引、除去し、BD
Pharmingen Strain Buffer (FBS)を500μLずつチューブに加えた。よく撹拌した後、フローサイトメトリーで測定を行った。
IFN−γの測定は、市販のOptEIA
マウスIFN−γ setを用いて行った。すなわち、96 wellプレ−トに希釈したCapture Antibodyをウエルごとに100μL加え、4℃、オーバーナイトでインキュベートした。次いで、プレートウォッシャーで5回洗浄した。洗浄後、Assay
Diluentを 200μL加え、室温で1時間反応させた後、5回洗浄した。脾細胞の培養上清もしくは標準品を100μL加え、室温で2時間反応させた後、洗浄した。Working
Detectorを100μL加え、室温で1時間反応させ、10回洗浄した。酵素反応の基質を100μL加え、室温、暗所で30分間反応させた。反応停止液50μLを加え、反応を停止させた後、450
nmの吸光度をプレートリーダーで測定した。標準品で作成した検量線から検体のIFN-γ量を求めた。
setを用いて行った。すなわち、96 wellプレートに希釈したCapture Antibodyを100μL加え、4℃、オーバーナイトでインキュベートした。次いで、プレートウォッシャーで3回洗浄した。洗浄後、Assay
Diluentを200μL加え、室温で1時間反応させた後、3回洗浄した。さらに、脾細胞の培養上清もしくは標準品を100μL加え、室温で2時間反応させた後、5回洗浄した。Working
Detector を100μL加え、室温で1時間反応させ、7回洗浄した。酵素反応の基質として、Substrate Solution(100μL)を加え、室温、暗所で30分間反応させた。Stop
solution(50μL)を加え、反応を停止させた。プレートリーダーで450 nmの吸光度を測定した。標準品より作成した検量線を用いて検体のIL−4量を求めた。
setを用いて行った。すなわち、96 wellプレートに希釈したCapture Antibodyを100μL/wellで加え、4℃、オーバーナイトでインキュベートした。次いで、プレートウォッシャーで3回洗浄した。洗浄後、Assay Diluent(200μL)を加え、室温で1時間反応させた後、3回洗浄した。脾細胞の培養上清もしくは標準品を100μL加え、室温で2時間反応させた後、5回洗浄した。Working
Detector(100μL)を加え室温で1時間反応させ、7回洗浄した。酵素反応の基質として、Substrate Solution(100μL)を加え、室温、暗所で30分間反応させた。Stop
solution(50μL)を加え、反応を停止させた。プレートリーダーで450 nmの吸光度を測定した。標準品から作成した検量線より検体のIL−5量を求めた。
setを用いて行った。すなわち、96wellプレ−トに希釈したCapture Antibodyを100μL加え、4℃、オーバーナイトでインキュベートした。次いで、マイクロプレートウォッシャーで3回洗浄した後、プレートに残った液をよく取り除いた。Assay
Diluent 200μL加え、室温で1時間反応させた後、3回洗浄した。脾細胞の培養上清もしくは標準品100μLを加え、室温で2時間反応させた後、5回洗浄した。Working
Detector(100μl)を加え室温で1時間反応させ、7回洗浄した。酵素反応の基質として、Substrate Solution(100μL)を加え、室温、暗所で30分間反応させた。Stop
solution(50μL)を加え、反応を停止させた。プレートリーダーで450 nmの吸光度を測定した。標準品で作成した検量線から検体中のIL−2量を求めた。
setを用いて行った。すなわち、96wellプレートに希釈したCapture Antibodyを100μL加え、4℃、オーバーナイトでインキュベートした。次いで、マイクロプレートウォッシャーで3回洗浄した。洗浄後、96wellプレートに残った液をよく取り除き、Assay
Diluent(200μL)を加え、室温で1時間反応させた後、3回洗浄した。脾細胞の培養上清もしくは標準品(100μL)を加え、室温で2時間反応させた後、5回洗浄した。Working
Detector(100μL)を加え、室温で1時間反応させ、10回洗浄した。基質溶液(100μL)を加え、室温、暗所で30分間反応させた。Stop solution(50μL)を加え、反応を停止させた。可視プレートリーダーで450nmの吸光度を測定した。標準品で作成した検量線から検体中のIL−10量を求めた。
上記手法によりリンゴ由来プロアントシアニジン画分の摂取免疫感作マウスにおける経口自由摂取の免疫系に与える影響をみるため、免疫感作したマウスから摘出した脾細胞をOVAと共に3日間及び7日間培養し、培地に産生される各種サイトカインをELISAで定量し、サイトカイン産生に与える影響を検討した。サイトカインとは、リンパ球(T細胞、B細胞)などから何らかの刺激に応じて細胞外に出すタンパク質で、細胞同士が相互作用を発揮する際の情報交換を行う微量物質である。免疫応答に重要な役割を有するヘルパーT細胞(Th)には、2種類のタイプが存在し、いずれもナイーブCD4+T細胞(Th0細胞)という同じ前駆細胞から分化する。生体の免疫の恒常性が、このTh1、Th2細胞によって形成される免疫調節のバランス(Th1/Th2バランス)によって保たれていると考えられており、そのバランスはそれぞれが分泌するサイトカインにより制御されている。I型アレルギー疾患では、Th1/Th2バランスがIL−4を産生するTh2細胞側へ偏ると考えられている。従って、サイトカイン産生量を調べることは、免疫系に与える影響を評価する指標となる。
図2にTh1型のサイトカインであるIFN−γ産生量を示した。培養3日目では、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群で3212pg/mL、対照群1241pg/mLであり、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群は対照群に比べIFN−γ産生が有意に促進された。一方、培養7日目では、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群4995pg/mL、対照群5412pg/mLであり、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群は対照群に比べIFN−γ産生に有意な差は見られなかった。
次に、図3にTh2型のサイトカインであるIL−5産生量を示した。培養3日目では、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群114pg/mL、対照群118pg/mLであり、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群は対照群に比べIL−5産生に有意な差は見られなかった。一方、培養7日目では、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群1578pg/mL、対照群1955pg/mLであり、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群は対照群に比べIL−5産生が有意に抑制された。
図4にTh2型のサイトカインであるIL-10産生量を示した。培養3日目では、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群319pg/mL、対照群326pg/mLであり、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群は対照群に比べIL−10産生に有意な差は見られなかったが、培養7日目では、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群774pg/mL、対照群948pg/mLであり、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群は対照群に比べIL−10産生が有意に抑制された。
36.68%であり、有意な差は見られなかった。同様に、脾臓由来B細胞の細胞表面抗原であるCD90.2-CD45R/B220+
B細胞は、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群55.99%、対照群55.16%であり、有意な差は見られなかった。一方、T細胞(CD3−ε+)のサブセットであるヘルパーT細胞と細胞障害性T細胞の組成比を測定するため、antiCD4とantiCD8を用いて細胞表面抗原を染色した。リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群と対照群におけるCD4(CD4+CD3-ε+T細胞)とCD8(CD8+CD3−ε+ T細胞)の組成比を求めた。ヘルパーT細胞の細胞表面抗原であるCD4+CD3−ε+ T細胞は、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群26.51%、対照群26.95%であり、有意な差は見られなかった。また、細胞障害性T細胞の細胞表面抗原であるCD8+CD3−ε+ T細胞は、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群26.51%、対照群26.95%であり、有意な差は見られなかった。
以上の結果から、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群と対照群における脾臓由来T細胞とB細胞およびヘルパーT細胞と細胞障害性T細胞の組成比に変化は見られなかった。つまりプロアントシアニジン画分によるリンパ球の分化誘導への影響は少ないと思われる。
腸管上皮内リンパ球は腸管免疫系の免疫担当細胞として重要な役割を果たしている。そこで、腸管上皮内リンパ球に発現しているT細胞レセプター(TCR)のサブセットであるTCRαβとTCRγδの組成比を測定するため、anti TCRαβとanti TCRγδを用いて細胞表面抗原を染色した(図5)。その結果、TCRのサブセットの細胞表面抗原であるTCRαβ+組成は、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群は60.19%、対照群59.14%であり、有意な差は見られなかった。一方、TCRのサブセットの細胞表面抗原であるTCRγδ組成は、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群16.64%で、対照群9.29%であり、プロアントシアニジン画分投与群は、対照群と比べ有意に発現量が減少していた。しかしながら、細胞障害性T細胞のサブセットであるCD8ααとCD8αβの組成比を測定するため、antiCD8αとantiCD8βを用いて細胞表面抗原を染色した。その結果、CD8α+CD8β−T細胞は、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群36.64%、対照群25.71%であり、有意な差は見られなかった。また、細胞障害性T細胞のサブセットの細胞表面抗原であるCD8α+CD8β+T細胞においても、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群27.53%、対照群21.1%であり、有意な差は見られなかった。TCRγδ細胞は経口免疫寛容の誘導と関連性が報告されていることから、リンゴ由来プロアントシアニジン画分摂取によるTCRγδ細胞増加により、経口免疫寛容を誘導し、何れかの経路で全身免疫系に影響を与えると考えられた。
Claims (6)
- 植物由来ポリフェノール成分を有効成分として含むことを特徴とする免疫調節剤。
- 植物がリンゴ、ナシ、モモ、ブドウ、大麦、グァバ、ホップ、小豆、松樹皮であることを特徴とする請求項1に記載の免疫調節剤。
- ポリフェノール成分がプロアントシアニジン類であることを特徴とする請求項1または2に記載の免疫調節剤。
- プロアントシアニジン類がプロシアニジン類であることを特徴とする請求項1または2に記載の免疫調節剤。
- 医薬品であることを特徴とする請求項1−4のいずれか1項に記載の免疫調節剤。
- 機能性食品であることを特徴とする請求項1−4のいずれか1項に記載の免疫調節剤。
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