JP6023398B2 - アズキ由来抗アレルギー剤の製造方法 - Google Patents
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Description
IL−4等のシグナルによりB細胞から分泌されるIgE(免疫グロブリンE)は、マスト細胞や好塩基球細胞の表面の受容体FcεRIに結合する。IgEに各種のアレルゲン(抗原)が結合すると、マスト細胞や好塩基球細胞からヒスタミン、セロトニン、ロイコトリエン等のケミカルメディエーターが分泌される。前記の各種ケミカルメディエーターにより、血管拡張によるむくみや鼻炎、気管支収縮による喘息、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎等の症状を引き起こす。食物アレルギー、アナフィラキシーショックの症状もI型アレルギーに含まれる。
自己の細胞が抗原として認識されることにより、この細胞に対するIgG、IgM等の抗体が産生される。自己の細胞同士で抗原抗体反応の攻撃が起きてしまう反応である。症状として、自己免疫性溶液性貧血、橋本病、バセドウ病等がある。
可溶性抗原とIgGとの反応により免疫複合体が形成される。この免疫複合体による組織傷害に起因した反応である。症状として、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス等がある。
Th1細胞、Th2細胞の活性化によりIL−1、IFN−γ、IL−5等のサイトカインが産性され、マクロファージ、好中球、NK細胞により異物が処理される際の反応がある。症状として、アトピー性皮膚炎、ツベルクリン反応等がある。特に、I型アレルギーが進行した後のアトピー性皮膚炎の場合、炎症を悪化させやすい。
原料となるアズキに北海道十勝産の小豆を用いた。開放型の蒸煮釜にアズキを投入し、水から加熱して45分間煮沸した。煮上がって軟らかくなったアズキとその煮汁と分けた。煮汁を室温付近(約20℃)になるまで冷ました後、16500×g(9000rpm)、10分間の遠心分離をした。遠心分離より得た上清1kgに芳香族系合成吸着剤(三菱化学株式会社製 逆相吸着剤「DIAION HP−20」)300gを加えて4℃で12時間攪拌した。合成吸着剤とそれ以外の液に分けた後、合成吸着剤を蒸留水により洗浄し、さらに40%エタノール水溶液(v/v)により数回溶出を行った。
4種類の異なるアズキ煮汁由来の抽出物を調製した発明者は、細胞内における抗アレルギー性能の発現の有無、細胞内の作用部位を明らかにすることにより、アズキ煮汁由来の抽出物の薬効性を確認した。以下、検証実験を順に述べる。
溶出条件の異なる4種類のアズキ煮汁由来の抽出物について、脱顆粒反応抑制作用を抗アレルギー性能の指標として測定した。併せて、既存の抗アレルギー作用を発揮する薬剤等との比較も試みた。脱顆粒反応抑制作用は、図2に開示の好塩基球細胞等の細胞内シグナル伝達モデルの模式図における脱顆粒(degranulation)に伴い、ケミカルメディエーター(chemical mediator)となるβ−ヘキソサミニダーゼ(β−hexosaminidase)の分泌抑制効果を指標として用いた。
I型アレルギーにおける脱顆粒反応には、カルシウムイオン(Ca2+)の流入による細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が関与すると考えられている。図2の模式図に示すように、活性酸素種(H2O2等)よりカルシウムイオンチャンネルが開き、細胞外から細胞内はカルシウムイオンが流入する経路と、IP3を介してのシグナル伝達から小胞体ERよりカルシウムイオンが放出される経路が現在知られている。そこで、発明者は、脱顆粒反応抑制効果が最も高いアズキの煮汁に由来する抽出物である「EtEx.40」に着目して、カルシウムイオンの流入に及ぼす影響を検証した。
生体内では、スーパーオキシドアニオンラジカル、ヒドロキシラジカル、過酸化水素、一重項酸素等の活性酸素種である「ROS」が常時産生されている。白血球、特に好中球によるROSの産生量は顕著である。ROSは殺菌、異物除去等の免疫応答の誘導等のシグナル伝達物質となることが知られている。また、ROSは前述の細胞内カルシウムイオン濃度の増加を誘導し、これに関連して脱顆粒反応を起こすと考えられている。例えば、図2の模式図に示すH2O2等のROSによるカルシウムイオンチャンネルの開放、カルシウムイオンの流入の経路が挙げられる。前掲「2.細胞内カルシウムイオン濃度の変動」における結果から判明した細胞内カルシウムイオンの増加抑制活性を踏まえ、ROSの濃度の測定を検討した。そこで、活性酸素種を特異的に検出するDCF蛍光指示薬を用いて抗原刺激後の細胞内のROS濃度の測定を試みた。
細胞内へのカルシウムイオンの流入を調節するカルシウムチャンネルは細胞膜に存在する。このカルシウムチャンネルは細胞内のROS(前記参照)により調節される。マスト細胞における抗原刺激後の細胞内ROS産生にNADPHオキシダーゼ(以降、NOXと称する。)が関与することが報告されている。NOXの活性化を図2の模式図を用いて簡単に説明する。はじめに、Racは細胞質に存在するサブユニットp40phox、p47phox、p67phoxと結合して四量体を形成する。次に、この四量体が細胞膜サブユニットgp91phox、p22phox側へ移行することによりROSは産生される。そこで、膜画分及び細胞質画分を調べることにより、NOXの活性をサブユニットの移行の結果として把握することができる。
細胞内ROS濃度は、添加した試料自体の抗酸化活性により低下することも推測される。そこで、試料自体の抗酸化活性を明らかにする必要がある。ラジカル発生剤として汎用される2,2−Diphenyl−1−picrylhydrazyl(以降、DPPHと称する。)におけるラジカル補足能により、in vitroで各試料のラジカル消去能を測定した。DPPHはラジカル状態で517nmの極大吸収を有する。抗酸化物質により還元されることにより、517nmの吸光度は低下する。吸光度の低下を測定することにより、試料(化合物)の抗酸化活性を測定できる。
図2の模式図から理解されるように、脱顆粒反応の上流では各種タンパク質のリン酸化が生じ、サイトカイン遺伝子の発現、アラキドン酸カスケード等の要因となっていることが明らかになりつつある。そこで、アズキ由来抽出物のEtEx.40が実際にリン酸化の抑制に作用するか否かを調べた。
これまで述べたin vitroの系において、発明者は、本発明のアズキ由来抽出物(EtEx.40)はアレルギー反応の抑制に有効であることを確信した。そこで、発明者は、次に述べるin vivoの系においても効果を検証することとした。PCA反応(Passive Cutaneous Anaphylaxis Reaction)はI型アレルギー症状のひとつである血管透過性の亢進を測定する試験法である。エバンスブルー生理食塩水、IgE−DNP、及びDNP−BSA抗原をマウスの尾静脈から投与し、DNP抗原刺激によりアレルギー反応を誘導した。1時間後、麻酔により致死させ、皮膚を剥離した。
本発明のアズキ煮汁に由来の抽出物は抗アレルギー剤として有効に作用すると考えられる。このため、当該アズキ由来抽出物(抗アレルギー剤)を個々の食品に配合して、実際に調理、製造した。以下に、食品・飲料の名称、そのレシピ(組成):左欄、及び配合割合(重量パーセント表記):右欄を開示する。
寒天 0.40
水 45.35
砂糖 27.00
小倉生あん 27.00
食塩 0.10
アズキ由来抽出物 0.15
(合計) 100.00
寒天 0.65
水 24.00
砂糖 24.00
小倉生あん 48.00
水あめ 3.20
アズキ由来抽出物 0.15
(合計) 100.00
アズキ 31.00
砂糖 35.80
食塩 0.05
水 33.00
アズキ由来抽出物 0.15
(合計) 100.00
薄力粉 20.20
上白糖 17.00
全卵 17.50
はちみつ 2.50
重曹 0.20
水 12.45
アズキ由来抽出物 0.15
小倉あん 30.00
(合計) 100.00
こしあん 31.00
粉ゼラチン 1.40
生クリーム 14.20
卵白 10.50
砂糖 4.30
水 38.45
アズキ由来抽出物 0.15
(合計) 100.00
卵黄 11.00
グラニュー糖 17.80
牛乳 53.20
生クリーム 17.80
バニラ香料 0.05
アズキ由来抽出物 0.15
(合計) 100.00
水あめ 45.00
砂糖 54.75
アズキ由来抽出物 0.15
(合計) 100.00
水あめ 34.50
砂糖 19.70
小麦粉 4.85
無糖練乳 34.60
食塩 0.20
ショートニング 5.90
アズキ由来抽出物 0.25
(合計) 100.00
牛乳 58.90
卵 24.00
砂糖 17.00
アズキ由来抽出物 0.10
(合計) 100.00
コーヒー(液体) 82.90
砂糖 8.30
粉ゼラチン 1.40
コーヒーリキュール 0.30
水 7.00
アズキ由来抽出物 0.10
(合計) 100.00
グラニュー糖 39.00
水 51.85
ゼラチン 6.80
クエン酸 0.50
フルーツ香料 1.60
アズキ由来抽出物 0.25
(合計) 100.00
牛乳 47.40
生クリーム 19.00
卵黄 12.60
砂糖 19.00
ゼラチン 1.90
アズキ由来抽出物 0.10
(合計) 100.00
水あめ 46.30
砂糖 50.90
ゼラチン 2.70
アズキ由来抽出物 0.10
(合計) 100.00
全卵 34.30
卵黄 3.80
砂糖 34.30
はちみつ 4.80
米飴 1.90
薄力粉 18.00
水 2.80
アズキ由来抽出物 0.10
(合計) 100.00
卵 19.70
砂糖 13.40
牛乳 23.40
ベーキングパウダー 1.80
薄力粉 36.00
バター 5.40
食塩 0.15
バニラ香料 0.05
アズキ由来抽出物 0.10
(合計) 100.00
マーガリン 12.20
ショートニング 12.20
砂糖 18.40
全卵 8.20
薄力粉 44.80
強力粉 4.10
アズキ由来抽出物 0.10
(合計) 100.00
フルーツ果汁 50.00
果糖ブドウ糖液糖 10.00
クエン酸 0.30
フルーツ香料 0.20
水 39.25
アズキ由来抽出物 0.25
(合計) 100.00
果糖ブドウ糖液糖 11.00
クエン酸 0.20
クエン酸ナトリウム 0.05
フルーツ香料 0.20
炭酸水 88.45
アズキ由来抽出物 0.10
(合計) 100.00
セルロース 30.00
ステアリン酸カルシウム 2.50
二酸化ケイ素 1.50
アズキ粉末 59.40
デンプン 6.50
アズキ由来抽出物 0.10
(合計) 100.00
Claims (1)
- アズキ由来抗アレルギー剤の製造方法であって、
アズキを熱湯で煮沸し生じた煮汁から上清を分離し、前記上清を、スチレン−ジビニルベンゼン系樹脂からなる細孔を備えた粒径0.25mm以上のビーズであって逆相吸着剤(DIAION HP−20(登録商標))とする芳香族系合成吸着剤に吸着させた後、前記吸着後の芳香族系合成吸着剤に10%〜40%エタノール水溶液を添加し、抽出物を溶出してなるアズキ煮汁抽出物であり、
前記アズキ煮汁抽出物が抗原刺激後における脱顆粒反応のシグナル伝達系の上流のタンパク質に作用する
ことを特徴とするアズキ由来抗アレルギー剤の製造方法。
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JP2010042100A JP6023398B2 (ja) | 2010-02-26 | 2010-02-26 | アズキ由来抗アレルギー剤の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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JP2010042100A JP6023398B2 (ja) | 2010-02-26 | 2010-02-26 | アズキ由来抗アレルギー剤の製造方法 |
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Publication Number | Publication Date |
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JP2011178680A JP2011178680A (ja) | 2011-09-15 |
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JP2010042100A Active JP6023398B2 (ja) | 2010-02-26 | 2010-02-26 | アズキ由来抗アレルギー剤の製造方法 |
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