JP7148494B2 - アレル編集およびその応用 - Google Patents

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Description

本発明は、遺伝子編集（特にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集）に際した、ＤＮＡ二本鎖切断の相同組み換え修復の効率を監視し最適化する方法に関する。本発明はまた、ＨＤＲ多重化に基づいて、細胞試料中のＨＤＲを経た細胞を濃縮する方法にも関する。本発明はさらに、in vitroまたはin vivoにおいて編集された細胞を選択的に減らす方法に関する。
〔序論〕
ＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子操作は、細胞にゲノム変異を導入する、柔軟性に富んだ方法である。「プログラム可能」で、ヌクレアーゼと複合している、ユーザーの定めた短鎖ガイドＲＮＡを用いることで、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）切断を所望のゲノム上の位置で起こすことができる。しばしば用いられるヌクレアーゼとしては、Ｃａｓタンパク質、（とりわけＣａｓ９）が挙げられるが、それらの変異体でもよい。変異体としては、改変したＤＮＡ結合特異性を有する改変ヌクレアーゼ、または、明確な特徴（例えば、転写活性もしくは転写抑制、または酵素活性）を加えてヌクレオチドを直接編集する融合タンパク質が挙げられる。Ｃａｓヌクレアーゼを改変して、ゲノムＤＮＡに一本鎖の「ニック」を誘導することもできる。これらの誘導されたＤＮＡ切断に対する細胞の反応は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路と相同組み換え修復（ＨＤＲ）経路とから主に成る、ＤＮＡ修復機構の活性化である。ＮＨＥＪは通常、ランダムな挿入および欠失（indel）を引き起こし、それを用いて遺伝子を取り除くことができる。これは実験用途では有効だが、臨床用途では、本質的に確率論的なＮＨＥＪ修復経路は大きな危険性を有する。標的を定めた正確な遺伝子編集の方がより安全であり、したがってより望ましい。ＨＤＲ経路は、ＤＮＡ鋳型に基づいて（ｄｓ）ＤＮＡ切断を修復することで、正確な変異をもたらす機会を提供する。しかし、バイオテクノロジーの目的でのＨＤＲ経路の使用は、ＮＨＥＪの使用に比べずっと効率が低い。ＮＨＥＪとＨＤＲは、およそ９：１の比で生じる。ＨＤＲの効率が低いことを克服する際の障害は、一つの細胞におけるＮＨＥＪとＨＤＲのイベントを定量化する、簡単なシステムがないことである。遺伝子編集イベントを評価するアッセイの多くは、半定量的である。全細胞集団をシーケンシングしても、細胞ごとのイベントの頻度についての情報は提供されないし、ホモ接合性とヘテロ接合性との区別もできない。細胞株をクローニングして一つの細胞の情報を得ることはできるが、このアプローチは冗漫であり、初代細胞には使えない。あるいは、フローサイトメトリーベースのレポーターシステムを開発して、一つの細胞ベースでの遺伝子編集を定量化してきた。しかし、そのようなシステムは、評価した細胞または組織の遺伝子操作に依存し（大部分は、細胞または組織の使用に先立つ）、そのため、システムの用途が制限される。
本発明の課題は、導入遺伝子も細胞の事前の操作も必要とせずに、一細胞ベースで高速に遺伝子編集イベントを定量化する、簡単で費用効果の高いシステムを提供することである。本発明の他の課題は、細胞を恒久的にマーキングし追跡するよう機能し、マーキングされた細胞またはマーキングされなかった細胞を、in vitroまたはin vivoで選択的に減らすことができるシステムを提供することである。これらの課題は独立請求項の構成によって達成される。
〔説明〕
本発明の第一の態様によれば、第１相同組み換え修復（ＨＤＲ）イベントを判定する方法が提供される。該ＨＤＲイベントは、真核細胞内の第１ゲノム位置において生じる。該細胞は、第１表面タンパク質の第１アイソフォーム（アレル）を発現する。該第１アイソフォームは、該第１表面タンパク質の第２アイソフォーム（アレル）とは、アミノ酸マーカーに関して異なっている。該第１アイソフォームは、核酸配列Ａによってコードされるアミノ酸マーカーＡを含む。該第２アイソフォームは、核酸配列Ｂによってコードされるアミノ酸マーカーＢを含む。上記第１ゲノム位置は、核酸配列Ａを含む。上記方法は、
（ａ）上記第１ゲノム位置において、第１ＤＮＡ二本鎖切断を誘導する工程と、
（ｂ）上記核酸配列Ｂおよび相同性アームの第１のペア（上記第１ゲノム位置のＤＮＡ配列５’およびＤＮＡ配列３’に対して相同である）を含む、第１ＤＮＡ修復コンストラクトを提供する工程（とりわけ、上記第１ＤＮＡ修復コンストラクトを上記細胞にトランスフェクションする工程）と、
（ｃ）上記細胞上の上記第１表面タンパク質の上記第１アイソフォームおよび／または上記第２アイソフォームの発現を判定し、任意で、上記表面タンパク質の上記第１アイソフォームおよび／または上記第２アイソフォームの発現に基づいて、上記細胞を精製する工程と、
（ｄ）上記第１ＨＤＲイベントの発生を判定する工程であって、上記細胞上の上記第１表面タンパク質の上記第２アイソフォームの発現は、上記第１ＨＤＲイベントの発生に対応している、工程と、
を含む。
本明細書の文脈において、「細胞表面タンパク質の第１アイソフォームおよび／または第２アイソフォーム」という表現は、細胞表面タンパク質の第１アレルおよび第２アレルを指す。該アレルは、各アレル／アイソフォームに特異的に結合するリガンドによって区別できる。ある実施形態では、該アレルは機能的に同一である。
本明細書の文脈において、「ＤＮＡ修復コンストラクト」という表現は、ゲノムＤＮＡ内のＤＮＡ鎖損傷（とりわけ二本鎖切断（ＤＳＢ））をＨＤＲによって修復するための鋳型として用いられる、ＤＮＡコンストラクトを指す。ＤＮＡ修復コンストラクトは、相同性アームおよび所定の遺伝子組み換え配列を含む。該相同性アームは、ＤＳＢのゲノムＤＮＡ配列５’およびゲノムＤＮＡ配列３’に対して相同である。上記所定の遺伝子組み換え配列は、上記相同性アーム同士の間に位置している。ＨＤＲによるゲノムＤＮＡ修復に際して、上記所定の遺伝子組み換え配列はゲノムＤＮＡ内に挿入される。当業者ならば、上記ＤＮＡ修復コンストラクトは線状（一本鎖または二本鎖）でも環状（例えば、プラスミド、ミニサークルプラスミド）でもよいとわかる。
理想的には、上記第１ゲノム位置（ＤＳＢが生じる位置）は、核酸配列Ａに対応する。ガイドＲＮＡ設計上の要求によりこれが実現可能でない例では、第１ゲノム位置は、核酸配列Ａから５’方向または３’方向に最大２０ｂｐまでの範囲内にあってもよい。あるいは、ガイドＲＮＡ設計上の要求によりこれが実現可能でない例では、第１ゲノム位置は、核酸配列Ａから５’方向または３’方向に最大５０ｂｐまでの範囲内にあってもよい。距離が２０ｂｐを超えると、ＨＤＲ効率が大幅に低下する。
ある実施形態では、上記第１ＨＤＲイベントの発生は、少なくとも２つの異なる実験条件において判定される。そして、上記第２アイソフォームの発現の上記第１アイソフォームに対する比が、第２実験条件におけるものよりも第１実験条件におけるものの方が高い場合は、上記第１実験条件のＨＤＲ効率の方が高いことを示す。
このシステムは、遺伝子編集イベントを、導入遺伝子も事前の操作も必要とせずに、一つの細胞ベースで迅速に定量化することを可能にする。したがって、このシステムは初代細胞で用いることができる。これは、マーカーシステムをまず導入するための複数の操作が必要な場合には、その操作が必要となる細胞株または細胞クローンとは対照的である。
ある実施形態では、（ａ）工程および（ｂ）工程は、バニリンおよび／またはルカパリブを含む細胞培地で行われる。とりわけ、濃度５０μＭから５００μＭのバニリンおよび／または濃度０．５μＭから２．５μＭのルカパリブを含む細胞培地で行われる。さらにとりわけ、濃度約３００μＭのバニリンおよび／または濃度約１μＭのルカパリブを含む細胞培地で行われる。
本明細書の文脈において、バニリンは、４－ヒドロキシ－３－メトキシベンズアルデヒド（ＣＡＳ番号：１２１－３３－５）を指す。
本明細書の文脈において、ルカパリブは、８－フルオロ－２－｛４－［（メチルアミノ）メチル］フェニル｝－１，３，４，５－テトラヒドロ－６Ｈ－アゼピノ［５，４，３－ｃｄ］インドール－６－オン（ＣＡＳ番号：２８３１７３－５０－２）を指す。
ある実施形態において、上記第１表面タンパク質の上記第１アイソフォームおよび上記第２アイソフォームは、それぞれ第１リガンドおよび第２リガンドによって互いに区別できる。該第１リガンドおよび該第２リガンドは、上記アミノ酸マーカーＡおよび上記アミノ酸マーカーＢとそれぞれ特異的に結合する。
本明細書の文脈において、「特異的に結合するリガンド」という表現は、抗体または抗体様分子を指す。
本明細書の文脈において、「抗体」という用語は、細胞生物学および免疫学の分野で知られている意味で用いられる。この用語は、あらゆる抗体を指す。これには、免疫グロブリンＧ型（ＩｇＧ）、Ａ型（ＩｇＡ）、Ｄ型（ＩｇＤ）、Ｅ型（ＩｇＥ）、またはＭ型（ＩｇＭ）、それらの任意の抗原結合フラグメントまたは一本鎖、および、関連するまたは由来するコンストラクトを含むが、それらに限定されない。すべての抗体は、ジスルフィド結合によって相互に連結した少なくとも２つの重鎖（Ｈ鎖）と２つの軽鎖（Ｌ鎖）を含む、糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）から成る。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）から成る。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略称する）と軽鎖定常領域（ＣＬ）から成る。軽鎖定常領域は１つのドメイン（ＣＬ）から成る。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと、宿主組織または因子（免疫システムのさまざまな細胞（例えば、エフェクター細胞）や、古典的補体系の第１因子など）との結合を媒介できる。
本明細書の文脈において、「抗体様分子」という用語は、高い親和性（Ｋｄ≦１０－８ｍｏｌ／Ｌ）で他の分子または標的に特異的に結合できる分子を指す。抗体様分子は、抗体の特異的結合と同様に、標的に結合する。抗体様分子という用語には、リピートタンパク質が含まれる。リピートタンパク質とは、例えば、設計されたアンキリンリピートタンパク質（Molecular Partners, Zuerich）、アルマジロリピートタンパク質由来のポリペプチド、ロイシンリッチリピートタンパク質由来のポリペプチド、抗体由来の分子（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ））、テトラトリコペプチドリピートタンパク質由来のポリペプチドなどである。
抗体様分子という用語は、さらに、タンパク質Ａドメイン由来のポリペプチド、フィブロネクチンドメインＦＮ３由来のポリペプチド、コンセンサスフィブロネクチンドメイン由来のポリペプチド、リポカリン由来のポリペプチド、ジンクフィンガー由来のポリペプチド、Ｓｒｃ相同ドメイン２（ＳＨ２）由来のポリペプチド、Ｓｒｃ相同ドメイン３（ＳＨ３）由来のポリペプチド、ＰＤＺドメイン由来のポリペプチド、ガンマクリスタリン由来のポリペプチド、ユビキチン由来のポリペプチド、システインノットポリペプチド由来のポリペプチド、およびノッティン由来のポリペプチドを含む。
リガンドは、抗体、Ｆａｂ（フラグメント抗原結合）フラグメント、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または、表面タンパク質の特定のアイソフォームを認識できる任意の他のリガンドであってよい。理想的には、２つのリガンドが用いられる。一方のリガンドは第１アイソフォームを特異的に認識でき、他方のリガンドは第２アイソフォームを特異的に認識できる。言い換えれば、各リガンドは一方のアイソフォームに特異的に結合できるが、他方のアイソフォームには特異的に結合できない。本明細書の文脈では、「特異的に結合」という表現は、解離定数ＫＤ≦１０－７での結合を指す。言い換えれば、リガンド（抗体）は、アイソフォーム同士を区別でき、一方のアイソフォームには結合できるが、他方のアイソフォームには結合できない。
ある実施形態では、第１表面タンパク質は天然タンパク質である。この天然タンパク質は、さまざまな異形（すなわち、異なるアイソフォーム／アレルのバリアント）があってもよく、なくてもよい。本明細書の文脈では、「天然タンパク質」という表現は、細胞のゲノム中にあり、遺伝子操作によって挿入されたものではない核酸配列によってコードされるタンパク質を指す。言い換えれば、天然タンパク質は、遺伝子組み換えタンパク質ではないタンパク質である。特定の核酸配列の、１または数個のヌクレオチドのバリエーションによって、生物の集団にアレルのバリアントが生じ得る。ある実施形態では、人工のエピトープを天然タンパク質に導入した。そのような人工のエピトープは、短いヌクレオチド配列（とりわけ１から１０個のヌクレオチド）を遺伝子操作することによって導入することができる。人工のエピトープが天然タンパク質に導入される例では、タンパク質全体をコードする核酸配列は遺伝子操作によって挿入されず、人工のエピトープをコードする短い核酸配列のみが挿入された。
ある実施形態では、第１表面タンパク質は遺伝子組み換えタンパク質である。本明細書の文脈では、「遺伝子組み換えタンパク質」という表現は、細胞のゲノム中にあり、遺伝子操作によって挿入された核酸配列によってコードされるタンパク質を指す。
ある実施形態では、精製はフローサイトメトリーによって行われる。ある実施形態では、精製は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって行われる。
ある実施形態では、精製は、上記第１表面タンパク質の上記第１アイソフォームまたは第２アイソフォームを発現する細胞を、磁気ビーズで濃縮することを含む。この濃縮は、ＨＤＲを経た（そしてそれにより表面タンパク質の第２アイソフォームを発現する）細胞を単離することにより直接的に行ってもよい。あるいは、ＨＤＲを経なかった（そしてそれにより表面タンパク質の第１アイソフォームをまだ発現している）細胞を除去することにより間接的に行ってもよい。抗体を表面タンパク質に結合させることは、細胞内に望ましくない生物学的影響をもたらす可能性がある。したがって、編集済み細胞を「触らない」でおく間接的な濃縮が好ましい。
ある実施形態では、第１表面タンパク質はＴｈｙ１またはＣＤ４５である。
本明細書の文脈では、「Ｔｈｙ１」は、"mus musculusthymus cell antigen 1"（theta; alternative name:CD90; NCBI Gene ID 21838; NCBI protein ID NP_033408.1）を指す。
本明細書の文脈では、「ＣＤ４５」は、"mus musculusprotein tyrosine phosphatase（receptor type, C(Ptprc)"; NCBI Gene ID 19264; NCBI protein ID NP_001104786）を指す。
ある実施形態では、第１表面タンパク質はCD4である。ある実施形態では、第１表面タンパク質はCD2である。ある実施形態では、第１表面タンパク質はCD8である。ある実施形態では、第１表面タンパク質はCD19である。ある実施形態では、第１表面タンパク質はHLAである。
ある実施形態では、二本鎖切断は、上記第１ゲノム位置において、上記細胞に、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）およびガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ発現コンストラクトをトランスフェクションすることによって誘導される。該ガイドＲＮＡは上記第１ゲノム位置に対してアニールできる。
当業者ならば、「ガイドＲＮＡは所定のゲノム位置に対してアニールできる」という表現は、該ガイドＲＮＡの一部分（ユーザーが定めた「標的配列」）が、高度にストリンジェントな条件下で所定のゲノム位置に対してアニールできることを指すとわかる。ガイドＲＮＡは、所定のゲノム位置にアニールできない他の部分を含む。所定のゲノム位置に対して（部分的に）アニールすることにより、ガイドＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを所定のゲノム位置へ誘導する。それにより、所定のゲノム位置でＤＳＢをもたらす。
本明細書の文脈では、「ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ」は、本技術分野で知られている、ＣＲＩＳＰＲ様配列誘導ＤＮＡ二本鎖切断を促進するＣａｓ９エンドヌクレアーゼを指す。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの非限定的な例としては、Streptococcus pyogenesのＣａｓ９エンドヌクレアーゼ（ＳｐｙＣａｓ９）、FrancisellaのＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ（ＦｎＣｐｆ１）、AcidaminococcusのＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ（ＡｓＣｐｆ１）、Lachnospiraceae bacteriumのＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ（ＬｂＣｐｆ１）、ＳｐｙＣａｓ９、ＦｎＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１もしくはＬｂＣｐｆ１の任意のオルソログ、またはＳｐｙＣａｓ９、ＦｎＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１もしくはＬｂＣｐｆ１の任意の改変タンパク質バリアント、またはそれらのオルソログが挙げられる。当業者ならば、本発明は、新たに発見または改変されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓバリアントをも含むとわかる。
本明細書の文脈では、「オルソログ」という用語は、一つの祖先遺伝子から垂直に下って進化した遺伝子、およびそれに対応するポリペプチドを指す。言い換えれば、オルソログ遺伝子／ポリペプチドは、共通の祖先を有し、１つの種が２つの別々の種に分岐したとき分かれた。その結果生じた２つの種における一つの遺伝子のコピーを、オルソログと称する。２つの遺伝子がオルソログであることを確かめるために、当業者は、遺伝子またはポリペプチドのヌクレオチドまたはアミノ酸配列を整列させて比較することにより、遺伝子系統の系統発生解析を行うことができる。
本明細書の文脈では、「ガイドＲＮＡ」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを所定のゲノム位置へ誘導できる、合成ＲＮＡを指す（このゲノム位置は、該エンドヌクレアーゼがゲノムＤＮＡ内のリン酸ジエステル結合を切断する位置である）。当業者ならば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが用いられる場合、「ガイドＲＮＡ」という表現は、（i）Ｃａｓ９結合に必要な配列とユーザーの定めた「標的配列」の両方を含む、１つのガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を指してもよいし、（ii）２つのＲＮＡ分子の組み合わせであって、一方がＣａｓ９結合に必要な配列を含み（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、他方がユーザーの定めた「標的配列」を含む（ｃｒＲＮＡ）、２つのＲＮＡ分子の組み合わせを指してもよい、とわかる。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼが用いられる場合、「ガイドＲＮＡ」という表現は、（i）Ｃｐｆ１結合に必要な配列と、ユーザーの定めた「標的配列」の両方を含む一つのＲＮＡ分子を指すか、あるいは、（ii）一つのｃｒＲＮＡアレイとして転写された、いくつかのガイドＲＮＡを指す（Zetsche,Nat Biotech, 2016）。「標的配列」は、所定のゲノム位置にアニールすることができ、それによって改変すべきゲノム標的を定めるものである。「標的配列」は、通常、約２０個のヌクレオチドを含む。
Ｃａｓ９によるＤＮＡ切断は、標的ＤＮＡにおける短いプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在に左右され、標的にできる配列の選択が制限されている。例えば、Streptococcus pyogenes由来のＣａｓ９（ＳｐｙＣａｓ９）に対応するＰＡＭ配列は、5'-NGG-3'である。ある実施形態では、ＤＮＡ修復コンストラクトは、変異ＰＡＭ配列を含む。変異により、ＰＡＭ配列は機能を失うが、タンパク質の発現、安定性、または機能には影響しない。変異ＰＡＭ配列を含むＤＮＡ修復コンストラクトを用いることで、ＨＤＲ効率が向上する。
当業者ならば、ＣＲＩＳＰＲシステムの他にも、部位特異的ＤＮＡ編集の代替的な手段が存在することがわかる。すなわち、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、またはアルゴノートベースのシステム（Nat Biotechnol. 2016 Jul;34(7):768-73）、または塩基エディタ（Komor et al., Nature 533, 420-424, doi:10.1038/nature17946）の使用である。本発明は、部位特異的ＤＮＡ編集にそれらの代替手段を用いることも含む。
いくつかの実施形態では、第１ＤＮＡ修復コンストラクトは、上記方法の第１工程（ゲノムＤＮＡへの鎖切断の導入）において用いるＣＲＩＳＰＲシステムの基盤ではない。第１ＤＮＡ修復コンストラクトは、ＰＡＭ配列を含まないからである。そのため、挿入された配列は、第２エンドヌクレアーゼイベントによる挿入後は、それ以上切断され得ない。
ある実施形態では、ＨＤＲ促進試薬はＢ工程で用いられる。
本明細書の文脈では、「ＨＤＲ促進試薬」という表現は、（i）非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復経路を阻害し、それによって間接的にＨＤＲ経路を促進できる試薬、または、（ii）ＨＤＲ経路を直接的に促進できる試薬を指す。ＤＮＡ二本鎖切断に対する細胞の反応は、ＮＨＥＪ経路とＨＤＲ経路から主に成るＤＮＡ修復機構の活性化である。ＮＨＥＪは通常、ランダムな挿入および欠失（indel）を引き起こし、それを用いて遺伝子を削除できる。これは実験用途では有効だが、臨床用途では、本質的に確率論的なＮＨＥＪ修復経路は大きな危険性を有する。ＤＳＢがＮＨＥＪ経路を介して修復される発生確率は、ＤＳＢがＨＤＲ経路を介して修復される発生確率よりずっと高い（約９：１）。ＮＨＥＪ経路を阻害することで、細胞の反応がＨＤＲ経路へとシフトする。
ある実施形態では、相同性アームはそれぞれ約２０００塩基対（ｂｐ）を含む。
ある実施形態では、同じ細胞内の第２ゲノム位置において、第２ＨＤＲイベントが判定される。上記細胞は、第２表面タンパク質の第１アイソフォームを発現する。該第１アイソフォームは、該第２表面タンパク質の第２アイソフォームとは、アミノ酸マーカーに関して異なっている。該第１アイソフォームは、核酸配列Ｙによってコードされるアミノ酸マーカーＹを含む。該第２アイソフォームは、核酸配列Ｚによってコードされるアミノ酸マーカーＺを含む。上記第２ゲノム位置は上記核酸配列Ｙを含む。上記方法は、（ａ）工程から（ｄ）工程と並行して行われる、さらなる以下の工程
（ｅ）上記第２ゲノム位置において、第２ＤＮＡ二本鎖切断を誘導する工程と、
（ｆ）上記核酸配列Ｚおよび相同性アームの第２のペア（上記第２ゲノム位置のＤＮＡ配列５’およびＤＮＡ配列３’に対して相同である）を含む、第２ＤＮＡコンストラクトを提供する工程と、
（ｇ）上記細胞上の上記第２表面タンパク質の上記第１アイソフォームおよび／または上記第２アイソフォームの発現を判定し、任意で、上記第２表面タンパク質の上記第１アイソフォームおよび／または上記第２アイソフォームの発現に基づいて、上記細胞を選別する工程と、
（ｈ）上記第２ＨＤＲイベントの発生を判定する工程であって、上記細胞上の上記第２表面タンパク質の上記第２アイソフォームの発現は、上記第２ＨＤＲイベントの発生に対応している、工程と、
を含む。
本発明の第二の態様によれば、真核細胞内の所定のゲノム位置を、該所定のゲノム位置に遺伝子組み換え核酸配列を挿入することにより編集する方法が提供される。上記方法は、本発明の第一の態様に係る、第１ゲノム位置における第１ＨＤＲイベントの判定を含む。このとき、上記第１ゲノム位置は、代理のゲノム位置として働く。上記方法はさらに、（ａ）工程から（ｄ）工程と並行して行われる、以下の工程
（ｅ）上記所定のゲノム位置において、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導する工程と、
（ｆ）上記遺伝子組み換えＤＮＡ配列と、上記所定のゲノム位置のＤＮＡ配列５’およびＤＮＡ配列３’に対して相同である相同性アームのペアと、を含むＤＮＡ修復コンストラクトを提供する工程と、
（ｇ）上記第１ゲノム位置において上記第１ＨＤＲイベントが生じた上記細胞を単離し、それによって、上記遺伝子組み換え核酸配列を第２ゲノム位置（すなわち上記所定のゲノム位置）に挿入することに成功した細胞を濃縮する工程と、
を含む。
発明者らは、個々の細胞で多重ＨＤＲが可能であることを実証した。驚くべきことに、所定のゲノム位置におけるＨＤＲの発生確率は、他の（代理の）ゲノム位置でＨＤＲを経た細胞における方が、該代理のゲノム位置でＨＤＲを経なかった細胞よりも高い（図３）。予期せぬことに、発明者らは、上記代理のゲノム位置でヘテロ接合ＨＤＲを経た細胞を単離することにより、所定のゲノム位置においてヘテロ接合ＨＤＲを有する細胞を濃縮できることを示した。また、上記代理のゲノム位置でホモ接合ＨＤＲを経た細胞を単離することにより、所定のゲノム位置でのホモ接合ＨＤＲを有する細胞を濃縮できることも示した（図３）。
本発明の第二の態様のある実施形態によれば、上記真核細胞はＴ細胞であり、上記所定のゲノム位置はＦｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘ変異であり、上記ＤＮＡ鋳型は、上記Foxp3変異の野生型アレルを含む。とりわけ、上記ＤＮＡ鋳型は、配列番号０２２または配列番号０２３であるか、配列番号０２２または配列番号０２３を含む。
発明者らは、マウスＴ細胞におけるＦｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘ変異を、本発明に係る方法を用いて修正できることを示した（図４）。
本発明の第一の態様のある実施形態では、上記表面タンパク質の上記第１アイソフォームおよび／または上記第２アイソフォームの発現に基づいた細胞の精製によって、上記表面タンパク質の上記第１アイソフォームおよび／または上記第２アイソフォームを発現する細胞を選択的に枯渇させる。（図６）。
本発明の他の態様によれば、編集済み細胞および非編集細胞の組成物において、編集済み細胞を選択的に枯渇させるまたは濃縮する方法が提供される。上記非編集細胞は、表面タンパク質の第１アイソフォームを発現する。上記編集済み細胞は、本発明の第一の態様に係る方法によって編集されて、上記表面タンパク質の第２アイソフォームを発現する。該第２アイソフォームは、該第１アイソフォームとアミノ酸マーカーに関して異なっている。該第１アイソフォームは、核酸配列Ａによってコードされるアミノ酸マーカーＡを含む。該第２アイソフォームは、核酸配列Ｂによってコードされるアミノ酸マーカーＢを含む。上記編集済み細胞は、上記表面タンパク質の上記第１アイソフォームまたは上記第２アイソフォームの発現に基づいて、選択的に濃縮または枯渇させられる（図６および図２５～図２９）。
あるいは、本発明のこの態様は、非編集細胞および編集済み細胞の組成物において、細胞を選択的に枯渇させるまたは濃縮する方法と表すこともできる。上記方法は、
（ａ）細胞を提供する工程であって、該細胞は表面タンパク質の第１アイソフォームを発現し、該第１アイソフォームは上記表面タンパク質の第２アイソフォームとアミノ酸マーカーに関して異なっており、該第１アイソフォームは核酸配列Ａによってコードされるアミノ酸マーカーＡを含み、該第２アイソフォームは核酸配列Ｂによってコードされるアミノ酸マーカーＢを含む、工程と、
（ｂ）上記核酸配列Ａを含むゲノム位置でＤＮＡ二本鎖切断を誘導する工程と、
（ｃ）上記核酸配列Ｂと、上記ゲノム位置のＤＮＡ配列５’およびＤＮＡ配列３’に対して相同である相同性アームのペアと、を含むＤＮＡ修復コンストラクトを提供する工程（とりわけ、上記細胞を該ＤＮＡ修復コンストラクトでトランスフェクションさせる工程）と、
（ｄ）上記細胞を、上記表面タンパク質の上記第１アイソフォームまたは上記第２アイソフォームの発現に基づいて、選択的に濃縮するまたは枯渇させる工程と、
を含む。
本明細書の文脈では、「細胞を選択的に枯渇させる」という用語は、あるマーカー／アレルを発現している細胞の総数または濃度を、選択的に減らすことを指す。
非限定的な例として、選択的な枯渇は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、または、天然抗原受容体もしくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有する細胞、によって達成できる。
発明者らは、ＣＤ４５．２またはＣＤ４５．１に対する抗体を用いてin vivoにおける選択的な枯渇が可能だと実証した（図２５～図２９）。
当業者ならば、非編集細胞の枯渇は、編集済み細胞の濃縮に相当するとわかる。
発明者らは、細胞内において一アミノ酸の相違を導入することができ、これらは、２種類のアイソフォーム／アレル（天然および改変）に特異的に結合する２種類の異なるリガンドによって区別できることを実証する。特異的に設計した人工変異、または、稀だが自然に生じる変異（例えば、一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ））を、内因性の表面で発現する遺伝子の中に導入して、その抗原性を変える。当業者ならば、この変異は、本技術分野で知られている任意の方法（ＨＤＲおよび塩基エディタを含む）を用いて導入できるとわかる。続いて、この改変されたエピトープを用い、この人工エピトープを特異的かつ選択的に認識するリガンドによって、編集に成功した細胞を選択的に枯渇させる。あるいは、天然エピトープを認識する（したがって宿主細胞を枯渇させ得る）が、改変されたエピトープは認識しない（したがって移植細胞は残しておく）リガンドを用いて、編集済み細胞の枯渇を抑制する。
「編集済み／改変細胞」（細胞表面タンパク質の第１アイソフォームが第２アイソフォームに変えられた細胞）が、そのあと、移植（とりわけ養子移入）のために用いられる例では、２つの異なるアイソフォームを用いて、移植細胞と宿主細胞とを区別することができる。これにより、移植細胞の追跡が可能になる。移植細胞は、永久にマーキングされているからである。追跡は、標識化されたリガンドを用いて、in vivoでもex vivoでも行うことができる（例えば、細胞または組織に対するフローサイトメトリーまたは組織化学によって）。移植細胞または宿主細胞のどちらかに特異的なリガンドをin vivoで適用することにより、移植された改変細胞または宿主細胞のいずれか一方だけに結合する抗体を用いて、移植細胞または宿主細胞を選択的に枯渇させることができる。あるいは、選択的細胞枯渇は、移植細胞または宿主細胞のどちらかを認識する天然抗原受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有する細胞によって行うことができる。そのようなＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、特定のアイソフォームを認識するリガンドを産生するハイブリドーマ細胞に由来し得る。
改変細胞の選択的枯渇は、「安全スイッチ」を提供するものであり、安全面での重要な特徴となっている。安全スイッチおよび自殺遺伝子の基本的な概念は、［Jones et al., Front Pharmacol.; 5:254. doi: 10.3389］に記載されている。発明者らのアプローチはより単純で、より安全で、より用途が広いものである。原則として、養子移入された任意の細胞を遺伝子操作して、改変アレル／エピトープを持たせることができる。この改変アレル／エピトープは、in vitroまたはin vivoにおいて、選択スイッチ、追跡スイッチ、安全スイッチ、および／または選択的除去スイッチとしての結合場所となる。非限定的な例として、（i）改変アレルのみを有するが、その他の点では遺伝子操作されていない細胞、または、（ii）さらに遺伝子操作された特徴を有する細胞（例えば、ＣＡＲ細胞）が挙げられる。例えば、移植片対白血病効果のために用いられる異質遺伝子型移植細胞は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こし得る。移植前から改変アレルが組み込まれている場合、異質遺伝子型移植細胞を改変アレルによって排除され、ＧｖＨＤを軽減／治療することができる。同様に、移植された自系の腫瘍内浸潤リンパ球（ＴＩＬ）または病原体特異的リンパ球を遺伝子操作して改変アレルを持たせ、オフターゲット効果または強すぎるオンターゲット効果により望ましくない副作用が生じる場合に、それらを枯渇させることができる。ＣＡＲ細胞の場合、改変アレルは安全スイッチとして働き得る。さらに、移植された改変細胞は、悪性になったり、または任意の種類の望ましくないオンターゲット損傷もしくはオフターゲット損傷を引き起こしたりする場合、排除することができる。あるいは、疾患を引き起こす宿主細胞を選択的に枯渇させ、一方、自系の改変細胞は残すことができる。発明者らの方法とは対照的に、既存の技術は移植細胞の枯渇に制限されており、宿主細胞の枯渇は容易ではない。改変されたアイソフォームは、宿主細胞を枯渇させる際に、例えば遺伝子修復したまたはその他の点で遺伝子操作した自系の細胞を移植することを可能にする。本発明の方法により導入されるアイソフォーム切替えがなければ、健康な細胞が移植されるときには、宿主細胞の枯渇を中断する必要がある。この場合、新たに移植され修復された細胞が増殖するあいだ、宿主細胞も増殖し、もはや除去できなくなり、病原である宿主細胞が修復細胞に打ち勝つという危険性がある。したがって、本発明の方法によって改変細胞の枯渇を抑制することは、治療アプローチに大きく関連する。例として、抗ＣＤ１９－ＣＡＲ細胞によって認識されるＣＤ１９エピトープを自系の造血細胞中で変異させて、抗ＣＤ１９ｍＡｂまたは抗ＣＤ１９ＣＡＲ細胞が改変細胞に結合させたり破壊したりすることを抑制する一方で、ＣＤ１９の機能は保持するようにできる。これにより、今日有効な抗ＣＤ１９－ＣＡＲ細胞の主な問題を取り除くことができるであろう。抗ＣＤ１９－ＣＡＲは、ＣＤ１９を発現する造血性悪性腫瘍を除去する成功率が極めて高いが、同時に、ＣＤ１９を発現する健康な宿主細胞も除去することになる。これは低ガンマグロブリン血症につながり、したがって感染の危険性を増すことになる。変異ＣＤ１９は、健康な自系の造血幹細胞（ＨＳＣ）により宿主の免疫システムの再構築を可能にし、それにより、抗ＣＤ１９－ＣＡＲ細胞に抵抗力のあるＢ細胞を産生する。したがって、ＣＡＲ１９Ｔ細胞は持続的に再発を防止し、一方、編集された抵抗力のある細胞は感染からの自然な防御を提供する。したがって、患者はもはやＩＶＩＧ注入に左右されない。ＨＳＣ移植は、非遺伝毒性の事前調整を通じて（例えば抗体を通じて）、部分的キメラ現象として達成し得る可能性がある（Nat Biotech, 2016）。あるいは、天然のＣＤ４５エピトープ（例えば、ＣＤ４５．２）を認識する抗ＣＤ４５－ＣＡＲ細胞を用いて、悪性の（またはその他の点で病原性の）造血細胞を含む、すべての造血宿主細胞を除去することができる。健康な自系の造血幹細胞（ＨＳＣ）の移植や、遺伝子操作されたＣＤ４５エピトープ（例えば、ＣＤ４５．１）を有する他の造血細胞（ＣＤ４５．２からＣＤ４５．１へのスイッチ実験として示された）は、宿主に健康な造血システムを再構築し、該造血システムが抗ＣＤ４５－ＣＡＲ細胞によって除去されることはもうない。主な利点は、ＣＤ４５を発現する悪性腫瘍（Ｔ細胞悪性腫瘍および骨髄悪性腫瘍を含むが、これらに限定されない）のすべてを、腫瘍特異的抗原または細胞腫特異的抗原を必要とすることなく、標的にできることである。すなわち、本発明は、造血悪性腫瘍および他の非悪性造血疾患を治療する、広範囲に適用可能なシステムを提供する。さらに、異質遺伝子型細胞を必要とすることなく造血腫瘍を治療することができ、したがって、主な問題であるＧｖＨＤを排除できる。さらに、除去段階のあいだに再構築が始まり得るので、回復に要する時間が短くなる。重要なことは、移植細胞を枯渇に対して抵抗性にするのに用いられる変異は、のちに、必要ならば、それらの細胞をふたたび枯渇させるのにも用いることができることである。ＣＡＲ細胞依存のＨＳＣ枯渇は、穏やかな（すなわち非遺伝毒性の事前調整を行う）代替的な方法として用い得る可能性がある。１つの抗原または複数の抗原の組み合わせに向けられており、標的細胞がＨＳＣに特異的に限定されているＣＡＲ細胞を用いて、内在性ＨＳＣを枯渇させることができる。これは、例えば、抗ＣＤ４５または抗ＣＤ３４に合成生物学アプローチで（例えば、ＡＮＤゲートを用いて）第２抗原を追加し、特異的かつ排他的にＣＡＲ細胞をＨＳＣに向けるものであり得る。
本発明のこの態様は、細胞を交換するという普遍的な手法を表わす。細胞は造血細胞でもよいし、自系でも異形遺伝子型でもよい。交換する細胞がＨＳＣである場合、上に記載した方法を用いて、任意の造血悪性腫瘍または他の造血疾患を治療することができる。
既存の「安全スイッチ」アプローチと比べた、発明者らのアプローチの他の利点としては、以下の点が挙げられる。発明者らのアプローチは、内在性タンパク質を用いる。導入遺伝子またはタグを細胞内に導入する必要がない。２つのエピトープは機能的に同一であるが、リガンドへの特異的な結合によって区別し得る。上記アプローチは、どちらのリガンドが用いられるかに応じて、移植細胞の枯渇または宿主細胞の枯渇の両方を可能にする。設計された変異がゲノムに導入されるので、安全面での特徴が細胞内に不変に残る。これは、ウイルスによって導入した遺伝子組み換え安全スイッチに起こり得るように、サイレンシングされることがない。さらに、改変エピトープは、人工的な大きな安全スイッチ／自殺遺伝子コンストラクトより抗原性が低く、したがって、宿主細胞によって拒絶されにくい。さらに、改変アイソフォームの使用は位置を狙った変異に基づいており、したがって、他の安全スイッチ／自殺遺伝子よりも安全である可能性が高い。他の安全スイッチ／自殺遺伝子は、通常はウイルス送達によってゲノムにランダムに組み込まれ、したがって挿入突然変異誘発に至ることがある（Cornu, Nat Med, 2017）。
当業者ならば、細胞表面タンパク質を第１アイソフォームから第２アイソフォームへ変えるために、ＨＤＲの代替となる方法を用い得るとわかる。非限定的な例として、塩基エディタを用いてアイソフォーム切替えを実現できる。これは、非限定的な例として挙げる刊行物［Komor et al., Nature 533, 420-424, doi:10.1038/nature17946］に記載されている。このアプローチは、ｄｓＤＮＡ切断を必要とすることなく所望のアミノ酸を編集可能にすることにより、安全性をさらに高め得る。塩基エディタまたは関連する技術は、プラスミドまたはミニサークル（ｄｓＤＮＡ）、ｍＲＮＡ、またはＲＮＰとして送達できる。
細胞表面タンパク質の第１アイソフォームの第２アイソフォームへのスイッチングが、本発明の方法による病原性遺伝子（例えば、Ｆｏｘｐ３遺伝子）の修復と結び付いている例では、第１アイソフォームを発現する細胞を枯渇させることにより、in vivoで（すなわち、宿主への移植後に）、非修復細胞を枯渇させることができる。発明者らは、アイソフォーム切替えが生じた細胞では、遺伝子修復の成功率が高いことを実証した。第１遺伝子におけるアイソフォーム切替えを、第２遺伝子における遺伝子修復と結び付けることにより、安全面での特徴を改変細胞に含ませることができる。
アイソフォーム切替えは、宿主中の編集済みの移植細胞を追跡するのにも用いることができる。
本発明のこの態様の代替的態様によれば、非編集細胞および編集済み細胞の組成物において、細胞を選択的に枯渇させるまたは濃縮する方法が提供される。上記方法は、
（ａ）細胞を提供する工程であって、該細胞は表面タンパク質の第１アイソフォームを発現し、該第１アイソフォームは上記表面タンパク質の第２アイソフォームとアミノ酸マーカーに関して異なっており、該第１アイソフォームは核酸配列Ａによってコードされるアミノ酸マーカーＡを含み、該第２アイソフォームは核酸配列Ｂによってコードされるアミノ酸マーカーＢを含む、工程と、
（ｂ）上記細胞中で、部位特異的遺伝子操作によって、核酸配列Ａから核酸配列Ｂへの交換を誘導し、それによって、上記細胞中で、上記第１アイソフォームの発現を上記第２アイソフォームの発現へと変える工程と、
（ｃ）上記表面タンパク質の上記第１アイソフォームまたは上記第２アイソフォームの発現に基づき、上記細胞を選択的に濃縮する／枯渇させる工程と、
を含む。
この代替的態様のいくつかの実施形態において、遺伝子操作は、上記細胞に、塩基エディタ（［Komor et al., Nature 533, 420-424, doi:10.1038/nature17946］に記載）とガイドＲＮＡを提供することにより、実行される（とりわけ、上記細胞にこれらをトランスフェクションすることにより）。上記塩基エディタは、アミノ酸マーカーＡをコードする核酸配列Ａを、アミノ酸マーカーＢをコードする核酸配列Ｂに変えることができる。上記ガイドＲＮＡは、上記塩基エディタを、アミノ酸マーカーＡをコードする核酸配列Ａに誘導することができる。
本発明の他の態様によれば、以下の要素を含むキットが提供される：
（ａ）細胞表面タンパク質をコードする遺伝子のゲノム位置を標的とするガイドＲＮＡ。上記遺伝子には、核酸マーカー配列に関して異なる２つのアイソフォームが存在する。アイソフォーム１は、第１マーカー配列を含む。アイソフォーム２は、第２マーカー配列を含む。上記ゲノム位置は、ＰＡＭ配列と上記第１マーカー配列または上記第２マーカー配列とを含む。
（ｂ）ＤＮＡコンストラクトであって、（i）上記第１マーカー配列または上記第２マーカー配列、（ii）上記ＰＡＭ配列（とりわけ、変異して機能しない上記ＰＡＭ配列）、ならびに、（iii）上記細胞表面タンパク質をコードする上記遺伝子の上記ゲノム位置のゲノムＤＮＡ配列５’およびゲノムＤＮＡ配列３’に対して相同である相同性アームのペア、を含む、ＤＮＡコンストラクト。
（ｃ）任意で、アイソフォーム１およびアイソフォーム２の遺伝子産物にそれぞれ特異的に結合する、第１抗体および第２抗体。
上記キットは、アイソフォーム１をアイソフォーム２に、またはアイソフォーム２をアイソフォーム１に形質転換させることができる。「上記第１マーカー配列または上記第２マーカー配列を含むＤＮＡコンストラクト」という表現は、上記第１マーカー配列または上記第２マーカー配列のどちらかを含んでいるコンストラクトを指す。このとき、上記キットのユーザーは、どちらのマーカー配列が含まれているかを知っている。上記キットが両方のコンストラクトを含む場合、これらのコンストラクトは物理的に離れており（例えば、別々のチューブに入っており）、それに従ってラベル付けされている。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記キットはＨＤＲ促進試薬（とりわけバニリンおよび／またはルカパリブ）を含む。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記相同性アームはそれぞれ少なくとも８５塩基対（ｂｐ）を含む。とりわけ、それぞれ少なくとも４５０ｂｐを含む。さらにとりわけ、それぞれ約２０００ｂｐを含む。本発明のこの態様のある実施形態では、上記相同性アームはそれぞれ少なくとも２０００ｂｐを含む。発明者らは、上記相同性アームの長さが長くなると、ＨＤＲ効率が上昇することを示した（図４Ｄ）。長い鋳型を用いる場合は、ＨＤＲ促進試薬の量は減らしてよい。これは、臨床用途においてＨＤＲ促進試薬が引き起こし得る副作用を最小限にするために望ましい。ある例では、長い相同性アームは、ＨＤＲ促進化合物よりも効率的であり、より望ましい。他の例では、短い鋳型（例えばｓｓＤＮＡ鋳型）をＨＤＲ促進分子と組み合わせて用いるのが、より望ましい。発明者らはまた、誘導されたＤＮＡ切断と変異部位との距離が５０ｂｐを超える例（例えば、配列の制限により、ｓｇＲＮＡを変異部位の５０ｂｐ内に設計することができない例）においては、相同性アームの長さを長くするとＨＤＲが可能になることを示した（図４Ｈ）。これは、重要かつ驚くべき知見である。他の文献は、誘導されたＤＮＡ切断と変異部位との距離が５０ｂｐを超える場合、ＨＤＲを達成できないと記載しているからである（Paquet et al, Nature. 2016 May 5;533(7601):125-9）。長い鋳型は、サイレント変異が不可能な場合にＰＡＭ配列を変異させる必要をなくすることもできる。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記細胞表面タンパク質はヒト細胞の表面タンパク質である。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記細胞表面タンパク質は、マウスＴｈｙ１またはマウスＣＤ４５である。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記細胞表面タンパク質はマウスＴｈｙ１であり、上記ガイドＲＮＡは配列番号００１であり、上記ＤＮＡコンストラクトは、配列番号０１３(no mut)、配列番号０１４(mut)、配列番号０１５(4x mut)、配列番号０２４(2kb)、配列番号０２５(4kb)、配列番号０２６(1kb)、および配列番号０２７(160bp)から選択される。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記細胞表面タンパク質はマウスＴｈｙ１であり、上記ガイドＲＮＡは配列番号００８であり、上記ＤＮＡコンストラクトは、配列番号０１７(120bp)および配列番号０１８(180bp)から選択される。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記細胞表面タンパク質はマウスＣＤ４５であり、上記ガイドＲＮＡは配列番号００３であり、上記ＤＮＡコンストラクトは、配列番号００９、配列番号０１９(1kb)、配列番号０２０(2kb)、および配列番号０２１(4kb)から選択される。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記キットは、安定したＣａｓ９発現のために遺伝子操作された、マウスＴ細胞株をさらに含む。発明者らは、そのようなＣａｓ９発現が安定したＴ細胞株（EL-4 ATCC TIB-39）を確立した（図８）。安定したＣａｓ９発現を有する細胞を用いることの利点は、トランスフェクションさせるべきＤＮＡの量が減り、それにより細胞の生存率が上がり、ＨＤＲ効率を高められることである。こうした細胞では、ガイドＲＮＡとＤＮＡ修復コンストラクトだけをトランスフェクションすればよい。
他の態様によれば、造血細胞において所定のゲノム位置を編集する方法が提供される。該方法は以下の工程を含む：
（ａ）造血細胞を提供する工程。
（ｂ）該造血細胞を、該造血細胞を活性化できる因子の存在下、第１培養工程において培養する工程。
（ｃ）該造血細胞を、下記（i）および（ii）でトランスフェクションさせる工程。
（i）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、第１マーカー遺伝子およびガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ発現コンストラクトであって、該ガイドＲＮＡは上記所定のゲノム位置にアニールできる、ＤＮＡ発現コンストラクト
（ii）ＤＮＡ修復コンストラクトであって、（ゲノムＤＮＡに挿入する）所定の遺伝子組み換えＤＮＡ配列と、上記所定のゲノム位置のゲノムＤＮＡ配列５’およびゲノムＤＮＡ配列３’に対して相同である相同性アームと、を含むＤＮＡ修復コンストラクト
（ｄ）該造血細胞を、該造血細胞を活性化できる因子の存在下、第１培養工程において培養する工程。
（ｅ）上記第１マーカー遺伝子を発現する造血細胞を、単離工程において単離する工程。
（ｆ）該単離された造血細胞を、第３培養工程において培養する工程であって、該第３培養工程は該造血細胞を相同組み換え修復（ＨＤＲ）促進試薬で処理することを含む工程。
本明細書の文脈において、「ＤＮＡ発現コンストラクト」という表現は、（i）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと、マーカー遺伝子と、ガイドＲＮＡとを含む一つのＤＮＡコンストラクト、または、（ii）上記の各要素を含む複数のＤＮＡコンストラクト、を指す。３つの要素すべてを１つのコンストラクト上に含む利点は、マーカー遺伝子に対して陽性である細胞はすべて、他の要素に対しても陽性であることである。当業者ならば、ガイドＲＮＡは、in vitro転写ガイドＲＮＡの形態で提供されてもよく、エンドヌクレアーゼは、ｍＲＮＡまたはタンパク質として提供されてよいとわかる。エンドヌクレアーゼとガイドＲＮＡは組み合わせられて、リボヌクレオタンパク質粒子（ＲＮＰ）の形態で提供されてもよい。ＤＮＡ発現コンストラクトがマーカー遺伝子（とりわけ蛍光タンパク質をコードする遺伝子）を含む場合、該ＤＮＡ発現コンストラクトを取り込んだ細胞を特定するのに用いることができる。
初代細胞における遺伝子編集には、ＲＮＰの使用が必須であると報告されている（Schumannet al., 2015, PNAS）。また、一般に、血液および免疫システムの細胞では、エレクトロポレーションでむきだしのＤＮＡを移植すると、内在する細胞防御機構の活性化により大量の細胞死に至り得ることが報告されている（Cornu, Nat Med, 2017）。驚くべきことに、発明者らは、Ｃａｓ９、ガイドＲＮＡ、およびＧＦＰを含むＤＮＡ発現コンストラクトを用いて、初代Ｔ細胞においてエレクトロポレーションおよび遺伝子編集（ＨＤＲを含む）を達成することができた。
ＤＮＡ二本鎖切断に対する細胞の反応は、ＮＨＥＪ経路とＨＤＲ経路から主に成るＤＮＡ修復機構の活性化である。ＮＨＥＪは通常、ランダムな挿入および欠失（indel）を引き起こし、それを用いて遺伝子を削除することができる。これは実験用途では有効だが、臨床用途では、本質的に確率論的なＮＨＥＪ修復経路は大きな危険性を有する。ＮＨＥＪ経路を阻害することで、細胞の反応がＨＤＲ経路へとシフトする。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記ＤＮＡ修復コンストラクトの上記相同性アームは、それぞれ、約２０００塩基対（ｂｐ）を含む。ある実施形態では、相同性アームは、それぞれ、少なくとも２０００ｂｐを含む。発明者らは、上記相同性アームの長さが長くなるとＨＤＲ効率が上昇することを示した（図４Ｄ）。長い鋳型を用いる場合は、ＨＤＲ促進試薬の量は減らしてよい。これは、臨床用途においてＨＤＲ促進試薬が引き起こし得る副作用を最小限にするために望ましい。ある例では、長い相同性アームは、ＨＤＲ促進化合物よりも効率的であり、より望ましい。他の例では、短い鋳型、例えばｓｓＤＮＡ鋳型をＨＤＲ促進分子と組み合わせて用いるのがより望ましい。発明者らはまた、相同性アームの長さを長くすると、誘導されたＤＮＡ切断と変異部位との距離が５０ｂｐを超える例（例えば、配列の制限により、ｓｇＲＮＡを変異部位の５０ｂｐ内に設計することができない例）において、ＨＤＲが可能になることを示した（図４Ｈ）。これは、重要かつ驚くべき知見である。他の文献は、誘導されたＤＮＡ切断と変異部位との距離が５０ｂｐを超える場合、ＨＤＲを達成できないと記載しているからである（Paquet et al, Nature. 2016 May 5;533(7601):125-9）。長い鋳型は、サイレント変異が不可能な場合にＰＡＭ配列を変異させる必要をなくすることもできる。
Ｃａｓ９によるＤＮＡ切断は、標的ＤＮＡにおける短いプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在に左右され、標的にできる配列の選択が制限されている。例えば、Streptococcus pyogenes由来のＣａｓ９（ＳｐｙＣａｓ９）に対応するＰＡＭ配列は、5'-NGG-3'である。ある実施形態では、ＤＮＡ修復コンストラクトは、変異ＰＡＭ配列を含む。変異により、ＰＡＭ配列は機能を失うが、タンパク質の発現、安定性、または機能には影響しない。変異ＰＡＭ配列を含むＤＮＡ修復コンストラクトを用いることで、ＨＤＲ効率が向上する（図３Ｄ）。
ＤＮＡ修復コンストラクトが提供されない例では、ＤＮＡ二本鎖切断は主にＮＨＥＪ経路を介して修復される。
ＨＤＲ促進試薬を用いて、細胞の反応をＨＤＲ経路の方へシフトさせることができる。
一般的に用いられるＨＤＲ促進試薬は、ＳＣＲ７（リガーゼＩＶ阻害剤）（Singhet al., 2014, Genetics）およびＲＳ－１（Song et al., 2016, NatCommunications）である。ＨＤＲ効率を高め得るさらなる試薬が求められているが、応えられていない。低分子を用いてＮＨＥＪを阻害し、それによってＨＤＲを高める一般的な手法が考えられてきた。しかし、本明細書で提示されたような、個々の分子および最適条件の選択は、本技術分野において一度も考えられたり示唆されたりしたことはない。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記ＨＤＲ促進試薬は、バニリンおよびルカパリブから成る群から選択される。バニリンおよびその誘導体は、従来、ＮＨＥＪ経路を阻害することが示唆されてきた（Durant and Karan, 2003, Nucleic Acids Research, Vol. 31, No. 195501-5512）。発明者らは、バニリンおよび他のＨＤＲ促進試薬がＨＤＲ効率に与える影響を体系的に実験した（図１Ｃ、図２Ｆ）。そして驚くべきことに、バニリンが実際にＨＤＲ効率を高めるのに対し、その誘導体は高めないことを発見した。バニリンの、他のＨＤＲ促進試薬に対する利点は、バニリンが水溶性であることである。他のＨＤＲ促進成分は、水溶性媒体に溶媒化するのにＤＭＳＯを必要とする。
本明細書の文脈において、バニリンは、４－ヒドロキシ－３－メトキシベンズアルデヒド（ＣＡＳ番号１２１－３３－５）を指す。
本明細書の文脈において、ルカパリブは、８－フルオロ－２－｛４－［（メチルアミノ）メチル］フェニル｝－１，３，４，５－テトラヒドロ－６Ｈ－アゼピノ［５，４，３－ｃｄ］インドール－６－オン（ＣＡＳ番号２８３１７３－５０－２）を指す。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記ＨＤＲ促進試薬は、バニリンおよび／またはルカパリブである。ある実施形態では、上記ＨＤＲ促進試薬は、濃度５０μＭから５００μＭのバニリンおよび／または濃度０．５μＭから２．５μＭのルカパリブである。ある実施形態では、上記ＨＤＲ促進試薬は、濃度約３００μＭのバニリンおよび／または濃度約１μＭのルカパリブである。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記造血細胞は、造血幹細胞（血球芽球）、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、調節Ｔ細胞（Ｔ ｒｅｇ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、自然リンパ球（ＩＬＣ）、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂリンパ球、粘膜関連インバリアントＴ細胞（ＭＡＩＴ）、およびガンマデルタＴ細胞（γδＴ）を含む群から選択される。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記第１培養工程および上記第２培養工程は、上記造血細胞を活性化モノクローナル抗体抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８と接触させることを含む。上記各抗体は水溶性でもよいし、固定されていてもよい（特に、培養皿、ビーズ、または人工抗原提示細胞（ＡＰＣ）に）。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記請求項のいずれか一つに記載の方法は、上記トランスフェクションを、エレクトロポレーション、リポソームおよび／またはエクソソームを用いたトランスフェクション、弾道移送、ナノワイヤを用いたトランスフェクション、Cell Squeeze技術、浸透圧衝撃、ウイルス送達、またはソノポレーションによって達成することができる。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記単離工程は、細胞をフローサイトメトリーまたは磁気ビーズ単離によって単離することを含む。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記ＨＤＲ促進試薬を用いた処理は、２２時間から２６時間行われ、とりわけ２４時間行われる。上記処理後、細胞を洗浄して上記ＨＤＲ促進試薬を取り除く。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記ＤＮＡ発現コンストラクトはミニサークルプラスミドである。本明細書の文脈では、「ミニサークルプラスミド」という用語は、原核生物ベクター部品の全体から分離された、小さな環状のプラスミド誘導体を指す。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記第１培養工程および上記第２培養工程は、１８時間から３６時間行われ、とりわけ２２時間から２６時間行われ、さらにとりわけ２４時間行われる。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記第３培養工程は５日から１０日間行われ、とりわけ６日から８日間行われ、さらにとりわけ７日間行われる。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記第１マーカー遺伝子は、蛍光タンパク質（とりわけ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））をコードする。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記第１マーカー遺伝子は上記細胞表面で発現するタンパク質をコードする。このとき、上記細胞表面で発現する該タンパク質は、該タンパク質に特異的に結合するリガンドを用いて検出可能である。
上記ＤＮＡ修復コンストラクトは第２マーカー遺伝子をコードする発現カセットに結合しており、上記第１マーカー遺伝子および上記第２マーカー遺伝子を発現する造血細胞は、上記単離工程において単離される、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。上記第２マーカー遺伝子は、蛍光タンパク質または上記細胞表面で発現するタンパク質をコードしてよい。上記細胞表面で発現したタンパク質は、上記タンパク質に特異的に結合するリガンドを用いて検出できる。上記第１マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質は、上記第２マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質とは異なる。当業者ならば、「第２マーカー遺伝子をコードする発現カセットに結合したＤＮＡ修復コンストラクト」の提供は、上記ＤＮＡ修復コンストラクトと、上記第２マーカー遺伝子をコードする発現カセットの両方を含むＤＮＡプラスミドを提供することにより実現され得ることがわかる。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記造血細胞はＴ細胞である。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記単離工程は、上記Ｔ細胞を芽球段階(blasting stage)において単離することを含む。発明者らは、芽球段階にある細胞の方が、芽球段階にない細胞よりも、ＨＤＲ効率が高いことを示した（図２Ｅおよび図３Ｅ）。したがって、芽球段階で細胞を単離することで、ＨＤＲ効率を高めることができる。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記Ｔ細胞はナイーブマウスＴ細胞（とりわけナイーブマウスＣＤ４＋Ｔ細胞）である。当業者ならば、この実施形態は、本発明に係る方法が行われる前にナイーブであるＴ細胞について述べているとわかる。該方法を行った後は、該Ｔ細胞はもはやナイーブとは見なし得ない。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記Ｔ細胞はナイーブヒトＴ細胞である。当業者ならば、この実施形態は、本発明に係る方法が行われる前にナイーブであるＴ細胞について述べているとわかる。該方法を行った後は、該Ｔ細胞はもはやナイーブとは見なし得ない。
本発明の他の態様によれば、上記請求項のいずれか一項に記載の方法を用いて所定のゲノム位置を編集した造血細胞が、疾患の治療方法または予防方法に用いるために提供される。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記造血細胞はＴ細胞である。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記疾患は多腺性内分泌不全症、腸疾患を伴う伴性劣性免疫調節異常（ＩＰＥＸ；OMIM http://www.omim.org/entry/304790）またはＩＰＥＸ様症候群であり、上記ゲノム位置は、Foxp3遺伝子、CD25遺伝子、Stat5b遺伝子、Stat1遺伝子、およびItch遺伝子から選択される遺伝子に含まれる変異である（Verbsky and Chatila, Curr Opin Pediatr. 2013 Dec;25(6):708-14）。上記遺伝子に含まれる変異により、遺伝子産物の発現または通常の機能が妨げられる。本発明の方法に従ってこれらのゲノム位置を編集することで、該変異が除去され、それにより遺伝子発現およびタンパク質発現が回復される。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記ゲノム位置はＦｏｘｐ３遺伝子に含まれる変異であり、上記疾患は多腺性内分泌不全症、腸疾患を伴う伴性劣性免疫調節異常である。本発明のこの態様のある実施形態では、上記ゲノム位置はＦｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘ変異である。Ｆｏｘｐ３遺伝子に含まれる変異により、遺伝子産物の発現または通常の機能が妨げられる。本発明の方法に従ってこれらのゲノム位置を編集することで、該変異が除去され、それにより、Ｆｏｘｐ３遺伝子およびＦｏｘｐ３タンパク質の発現が回復する。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記造血細胞はマウスＴ細胞であり、上記ゲノム位置はＦｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘ変異である。この変異は、臨床上関連のあるヒトＦｏｘｐ３変異を再現する（Ramsdell et al., Nature reviews. Immunology 14, 343-349 (2014); Linet al., The Journal of allergy and clinical immunology 116, 1106-1115 (2005)）。
本明細書の文脈では、「Ｆｏｘｐ３遺伝子」という用語はヒトforkheadbox P3（NCBI GENE ID: 50943）またはマウスforkhead box P3（NCBI GENE ID:20371）に関する。
発明者らは、マウスＴ細胞におけるFoxp3K276X変異を、本発明に係る方法を用いて修正できることを示した（図４）。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記ゲノム位置はＣＴＬＡ－４遺伝子に含まれる変異であり、上記疾患はＣＴＬＡ－４変異と関連するヒト免疫調節異常症候群である（Schubert et al., Science Translational Medicine 5, 215ra174-215ra174(2013); Kuehn et al., Science (New York, N.Y.) 345, 1623-1627 (2014)）。
本発明のこの態様のある実施形態では、疾患の治療または予防は、本発明に係る方法によって編集された細胞の養子移入（とりわけ、本発明に係る方法によってゲノム欠陥が修正された細胞の養子移入）によって行われる。
養子細胞治療は、長い間、血小板輸血、赤血球輸血、および造血幹細胞移植で成功裡に用いられてきた。より最近では、養子リンパ球送達が、さまざまな疾患の場面において臨床的な有効性を示し、それによって、感染症、炎症性疾患および自己免疫性疾患、臓器移植および癌の治療としての応用が、前途有望に広がっている。細胞ベースの治療が、次の医療の「柱」となると提案されてきた。本発明に係る方法によって達成される狙いを付けた改変によれば、移植細胞産物をカスタマイズして、遺伝子欠陥を修復したり、移植細胞の能力を増強させたり、あるいは細胞にさらなる所望の特徴（例えば、誘導分子または安全スイッチ）を備えさせたりすることができるようになる。本発明は、造血細胞において正確な遺伝子編集を行う、効率的で、信頼性が高く、安価な方法を提供する。
本発明の他の態様によれば、ルカパリブがＨＤＲ促進試薬として提供される。本発明のこの態様のある実施形態では、ルカパリブは濃度０．５μＭから２．５μＭ（とりわけ濃度約１μＭ）で適用される。本発明のこの態様のある実施形態では、ルカパリブはバニリンとともに（とりわけ５０μＭから５００μＭのバニリンとともに）適用される。
本発明の他の態様によれば、高解像度エピトープマッピングの方法が提供される。該方法は以下の工程を含む：
（ａ）リガンドに結合できる遺伝子産物を発現する細胞を、提供する工程。上記遺伝子産物に含まれる１つまたは複数のマーカーは、上記リガンドへの結合を判定し、それに加えてエピトープを含む。上記１つまたは複数のマーカーは線状の配列でもよく、非線状の配列でもよい。上記遺伝子産物は、上記細胞のゲノムＤＮＡに含まれるヌクレオチド配列によってコードされる。上記エピトープは、上記ヌクレオチド配列に含まれる１つまたは複数のオリジナルエピトープコード配列によってコードされる。
（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）と、上記オリジナルエピトープコード配列を標的とするガイドＲＮＡとをコードするＤＮＡ発現コンストラクトで上記細胞をトランスフェクションすることにより、上記コード配列中の二本鎖切断を誘導する工程。
（ｃ）上記細胞内にＤＮＡ修復コンストラクトを提供する工程。該ＤＮＡ修復コンストラクトは、（i）上記オリジナルエピトープコード配列とは異なる、遺伝子組み換えエピトープコード配列と、（ii）上記オリジナルエピトープコード配列のゲノムＤＮＡ配列５’およびゲノムＤＮＡ配列３’に対して相同である相同性アームのペアと、を含む。
上記の工程を実行することにより、上記細胞において、相同組み換え修復（ＨＤＲ）イベントが誘導される。これにより、上記細胞において、上記遺伝子産物の変異が発現する。
（ｄ）続いて、上記変異が上記リガンドに結合できるかどうかを評価する。
上記（１つまたは複数の）マーカーは、アミノ酸（上記遺伝子産物がポリペプチドの場合）でもよく、核酸でもよい。上記（１つまたは複数の）マーカーは、上記マーカーアミノ酸またはマーカー核酸に付着する、（i）炭水化物、（ii）脂質、または、（iii）タンパク質と、糖、脂質および他の分子との組み合わせ（翻訳後修飾または非古典的抗原に見られる）、を含んでよい。
本明細書の文脈において、「エピトープマッピング」という用語は、遺伝子産物上にあるリガンドの結合部位（エピトープ）を、実験的に特定し特徴づけるプロセスを指す。該プロセスは、いくつかの異なるエピトープバリアントを含む遺伝子産物の、いくつかのバリアントを体系的に生成することを含む。該プロセスはまた、上記リガンドの上記遺伝子産物への結合を、体系的に試験することを含む。本発明に係る方法は、一つのアミノ酸を変異させることにより、エピトープを正確に特徴づけることを可能にする。該方法はまた、一つのアミノ酸を除去または変異させることにより、既知のエピトープまたはエピトープの可能性があるものを除去することを可能にする。このようにして、あるアミノ酸がリガンドの結合にとって、必要および／または十分であるかを分析することができる。
特定のリガンドについて正確なエピトープを知ることは、さまざまな理由で重要である。（ａ）既存のリガンド（例えば、治療用の抗体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の最適化。（ｂ）知的財産（例えば、治療用の抗体）の保護。（ｃ）自由に操作できるか否かの判定。理想的には、エピトープをマッピングするタンパク質には、内因性の翻訳後修飾が全て含まれているべきである。このことは、細胞ベースのアッセイである、本発明の方法により可能である。エピトープマッピング用の既存のアッセイには、よく知られた限界がある。用いられる細胞は、（i）所定の標的細胞ではない可能性が高く、（ii）エピトープの候補は、ペプチドまたは導入遺伝子として発現するかもしれず、（iii）したがって、それらにおいて最も一般的なコピー数および発現レベルは、生理学的なものではなく、（iv）翻訳後修飾が異なるかもしれない。本発明は、所定の細胞において（例えば、標的の腫瘍細胞において）生理学的に発現し、すべての翻訳後修飾を含む抗原を、エピトープマッピングする方法を提供する。
本明細書の文脈では、「リガンド」という表現は、遺伝子産物に特異的に結合（解離定数≦１０－７）できる任意の分子を指す。本発明の文脈では、「遺伝子産物」は本発明の方法によって編集され、この遺伝子産物への分子（リガンド）の結合がテストされる。該分子（リガンド）は、タンパク質、ＲＮＡ、さらにはＤＮＡからも選択できる。したがって、本発明に係る方法は、タンパク質とタンパク質の相互作用、タンパク質とＲＮＡの相互作用、およびタンパク質とＤＮＡの相互作用のマッピングを可能にする。
当業者ならば、「オリジナルエピトープコード配列を標的とするガイドＲＮＡ」という表現が、（i）該エピトープコード配列を直接ＤＳＢせしめるガイドＲＮＡ、（ii）該エピトープコード配列から５’方向または３’方向に最大２０ｂｐの範囲において、ＤＳＢせしめるガイドＲＮＡ、または（iii）該エピトープコード配列から５’方向または３’方向に最大５０ｂｐまでもの範囲において、ＤＳＢせしめるガイドＲＮＡ、を指すとわかる。
ガイドＲＮＡの設計上の要求により、エピトープコード配列を直接標的とするガイドＲＮＡを設計することが不可能である例では、該エピトープコード配列から５’方向または３’方向に最大２０ｂｐ（最大５０ｂｐ）の範囲を標的とするガイドＲＮＡを用いてもよい。２０ｂｐより大きな距離だと、ＨＤＲ効率は大きく低下する。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記ＤＮＡ修復コンストラクトの上記相同性アームは、それぞれ、約２０００塩基対（ｂｐ）を含む。ある実施形態では、相同性アームは、それぞれ、少なくとも２０００ｂｐを含む。発明者らは、上記相同性アームの長さが長くなるとＨＤＲ効率が上昇することを示した（図４Ｄ）。長い鋳型を用いる場合は、ＨＤＲ促進試薬の量は減らしてよい。これは、臨床用途においてＨＤＲ促進試薬が引き起こし得る副作用を最小限にするために望ましい。ある例では、長い相同性アームは、ＨＤＲ促進化合物よりも効率的であり、より望ましい。他の例では、短い鋳型、例えばｓｓＤＮＡ鋳型をＨＤＲ促進分子と組み合わせて用いるのがより望ましい。発明者らはまた、相同性アームの長さを長くすると、誘導されたＤＮＡ切断と変異部位との距離が５０ｂｐを超える例（例えば、配列の制限により、ｓｇＲＮＡを変異部位の５０ｂｐ内に設計することができない例）において、ＨＤＲが可能になることを示した（図４Ｈ）。これは、重要かつ驚くべき知見である。他の文献は、誘導されたＤＮＡ切断と変異部位との距離が５０ｂｐを超える場合、ＨＤＲを達成できないと記載しているからである（Paquet et al, Nature. 2016 May 5;533(7601):125-9）。長い鋳型は、サイレント変異が不可能な場合にＰＡＭ配列を変異させる必要をなくすることもできる。
重要なことに、本発明に係る方法は、所定の遺伝子産物を内因的に発現する細胞におけるエピトープマッピングを、過剰発現の必要なしに可能にする。これにより、すべての翻訳後修飾を含む全長タンパク質において、エピトープの特徴づけが可能になる。
本明細書の文脈では、「抗原」という用語は、リガンドによって特異的に認識され結合される分子を指す。抗原は、タンパク質、翻訳後修飾されたタンパク質、脂質、またはタンパク質の文脈において登場する糖であり得る。抗体または抗体由来のリガンド（例えば、Ｆａｂフラグメントまたはキメラ抗原受容体）によって認識されるエピトープの文脈では、抗原決定基は、リガンドによって特異的に認識される任意の構造でよい。
ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、（該エンドヌクレアーゼをコードする）ＤＮＡまたはｍＲＮＡとして提供してもよいし、タンパク質として提供してもよい。ガイドＲＮＡは、（該ガイドＲＮＡをコードする）ＤＮＡとして提供してもよいし、in vitroでの合成ＲＮＡとして提供してもよい。エンドヌクレアーゼとガイドＲＮＡは、組み合わせてリボヌクレオタンパク質粒子（ＲＮＰ）の形態でも提供し得る。
ＤＮＡ二本鎖切断に対する細胞の反応は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路とＨＤＲ経路から主に成る、ＤＮＡ修復機構の活性化である。ＨＤＲによるゲノムＤＮＡ修復の際には、遺伝子組み換えエピトープコード配列はコピーされ、ゲノムＤＮＡに挿入される。当業者ならば、ＤＮＡ修復コンストラクトは線状（一本鎖または二本鎖）でもよく、環状（例えば、プラスミド、ミニサークルプラスミド）でもよいとわかる。
本発明のこの態様のある実施形態では、ＤＮＡ修復コンストラクトは提供されず、ＤＮＡ修復はＮＨＥＪ経路を介して達成される。いくつかの例では、この方法は遺伝子産物の発現を停止させず、変異型遺伝子産物の発現に至る。こうした例では、変異型がリガンドに結合できるかどうかを評価し得る。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記細胞は真核細胞である。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記遺伝子産物はポリペプチドである。上記遺伝子産物がポリペプチドである例において、リガンドは（非限定的な例として）、免疫細胞に対する水溶性または膜結合性の抗原受容体、抗原受容体の天然または人工誘導体、Ｂ細胞抗原受容体（免疫グロブリン）、またはＴ細胞受容体でよい。リガンドはまた、任意の種類の抗原受容体（天然でも人工でも）を含む細胞でもよい。
本発明のこの態様のある実施形態では、所定のエピトープを有する細胞は、生理的に生じる細胞（言い換えれば、健康な細胞）である。ある実施形態では、所定のエピトープを有する細胞は、疾患を有していてもよい（例えば、腫瘍細胞）。あるいは、抗原を有する細胞は、デザイナー抗原またはそれらの任意の組み合わせを有する、人工細胞でもよい。遺伝子産物は天然に生じる抗原でもよく、改変された抗原（腫瘍抗原を含む）でもよく、あるいは、人工的に改変または合成された抗原でもよい。これらの例において可能な用途は、改変された腫瘍抗原に対するリガンドの正確な結合部位の高解像度マッピングである。
個人化された腫瘍治療において、患者の腫瘍細胞を用いて腫瘍抗原を特徴づけ、入手可能な治療抗体に最もよく結合するエピトープを特定することができる。患者由来の腫瘍を単離し、それから固定してエピトープマッピングに用いる。今度はこの情報を用いてリガンドそのものを最適化する。最適化は、誘導突然変異生成によって、または、本明細書に開示のものに類似の手順を用いたリガンドの抗原結合領域の突然変異生成によって、行う。エピトープを変化させるよりむしろ、リガンドそのものを改変して、抗原とリガンドとの親和性を高めることができる。同じ手順を用いて、その抗原を改変することにより腫瘍治療を逃れた腫瘍細胞の、エピトープを特徴づけることができる。その後、この情報を用いて、治療耐性のある腫瘍細胞を認識できるリガンドを作製することができる。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記遺伝子産物はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。本明細書の文脈では、「キメラ抗原受容体」という用語は、Ｔ細胞受容体のドメインおよびＢ細胞受容体のドメインを有する、遺伝子操作された受容体を指す。ＣＡＲは、タンパク質、脂質、および糖を含む広範囲の抗原を認識する。遺伝子産物がＣＡＲである例では、上記リガンドはそれぞれの抗原である。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記遺伝子産物は抗体（Ｂ細胞受容体、免疫グロブリン）である。このようにすれば、特定の抗原に結合するのに必要なＢ細胞受容体の正確な領域を決定できる。この情報を用いて、該受容体の結合特性を改変できる（例えば、抗体の結合親和性を増すことができる）。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記遺伝子産物はＴ細胞受容体である。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記リガンドはポリペプチドである。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記リガンドは抗原受容体である。特定の抗原受容体（抗体）に対する変異型遺伝子産物の結合を評価するために、遺伝子産物の２つ以上のエピトープを認識するポリクローナル抗体を、ポジティヴ・コントロールとして用いることができる。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記リガンドはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である。そのような場合、Ｔ細胞全体、またはＴ細胞受容体を有する他の細胞を用いて、ＴＣＲ／抗原相互作用を探ることができる。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記リガンドはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記相同性アームはそれぞれ、少なくとも８５塩基対（ｂｐ）を含む。ある実施形態では、上記相同性アームはそれぞれ、少なくとも４５０ｂｐを含む。ある実施形態では、上記相同性アームはそれぞれ、約２０００ｂｐを含む。ある実施形態では、上記相同性アームはそれぞれ、少なくとも２０００ｂｐを含む。発明者らは、上記相同性アームの長さが長くなると、ＨＤＲ効率が上昇することを示した（図４Ｄ）。長い鋳型を用いる場合は、ＨＤＲ促進試薬の量は減らしてよい。これは、臨床用途においてＨＤＲ促進試薬が引き起こし得る副作用を最小限にするために望ましい。ある例では、長い相同性アームは、ＨＤＲ促進化合物よりも効率的であり、より望ましい。他の例では、短い鋳型（例えばｓｓＤＮＡ鋳型）をＨＤＲ促進分子と組み合わせて用いるのが、より望ましい。発明者らはまた、誘導されたＤＮＡ切断と変異部位との距離が５０ｂｐを超える例（例えば、配列の制限により、ｓｇＲＮＡを変異部位の５０ｂｐ内に設計することができない例）においては、相同性アームの長さを長くするとＨＤＲが可能になることを示した（図４Ｈ）。これは、重要かつ驚くべき知見である。他の文献は、誘導されたＤＮＡ切断と変異部位との距離が５０ｂｐを超える場合、ＨＤＲを達成できないと記載しているからである（Paquet et al, Nature. 2016 May 5;533(7601):125-9）。長い鋳型は、サイレント変異が不可能な場合にＰＡＭ配列を変異させる必要をなくすることもできる。
本発明のこの態様のある実施形態では、第１スクリーニング工程において、短い相同性アーム（少なくとも８５ｂｐ）とＨＤＲ促進試薬を用いて本発明に係る方法を行う。第２検証工程では、長い相同性アーム（約２０００ｂｐ以上）を用いて、かつＨＤＲ促進試薬は用いずに、本発明に係る方法を行う。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記細胞は、（ｃ）工程後、ＨＤＲ促進試薬を含む細胞培地内にて、２２時間から２６時間（とりわけ約２４時間）保たれる。
in vivoにおけるＨＤＲ媒介エピトープマッピングのための様々なパラメータの最適化を含む、最適化法を適用することができる（図３）。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記ＨＤＲ促進試薬は、バニリン、ルカパリブ、ベラパリブ(velaparib)、ルミネスピブ、Ｌ７５５０７、ＳＣＲ７－Ｘ、およびＲＳ－１を含む群から選択される。
本発明のこの態様のある実施形態では、上記ＨＤＲ促進試薬は、バニリンおよび／またはルカパリブである。ある実施形態では、上記ＨＤＲ促進試薬は、濃度５０μＭから５００μＭのバニリンおよび／または濃度０．５μＭから２．５μＭのルカパリブである。ある実施形態では、上記ＨＤＲ促進試薬は、濃度約３００μＭのバニリンおよび／または濃度約１μＭのルカパリブである。
一つに分けられるような各特徴に対応する各代替例を、本明細書では「実施形態」として提示している。そのような代替例を自由に組み合わせて、本明細書に記載の発明の個々の実施形態を作ることができると理解されたい。
本発明を、以下の実施例および図面によりさらに例示する。該実施例および図面から、さらなる実施形態および利点を引き出すことができる。これらの実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
図１は、初代Ｔ細胞における効率的なプラスミドベースの遺伝子切除を示す。Ａ）ＥＬ－４細胞におけるプラスミドベースの遺伝子編集のプロトコル。遺伝子Ｘを標的とするｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９と、ＧＦＰとをコードするプラスミドを、エレクトロポレーションする（工程１）。２４時間後、トランスフェクションに成功した細胞を、ＧＦＰ発現に基づくフローサイトメトリーで精製する（工程２）。その後、in vitroでの遺伝子編集のため、細胞を９日間増殖させる（工程３）。Ｂ）初代ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるプラスミドベースの遺伝子編集のプロトコル。エレクトロポレーションの前に、細胞を抗ＣＤ３ｍＡｂおよび抗ＣＤ２８ｍＡｂで活性化する。２４時間後、遺伝子Ｘを標的とするｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９と、ＧＦＰとをコードするプラスミドをエレクトロポレーションする（工程１）。２４時間後、トランスフェクションに成功した細胞を、ＧＦＰ発現に基づいて精製する（工程２）。図示するように、in vitroで９日間増殖させる（工程３）。 Ｃ）ＣＤ９０．２を標的とするｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ９０．２、配列番号００１）をコードするプラスミド、または空のベクターpx458（コントロール）で、ａと同様にトランスフェクションさせたＥＬ－４細胞のフローサイトメトリー。フローサイトメトリーのヒストグラム（左パネル）および複数の実験の定量化（ｎ＝３）。エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表わす（右パネル）。Ｄ）ＣＤ９０．２を標的とするｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ９０．２、配列番号００１）をコードするプラスミド、または空のベクター（コントロール）で、ｂと同様にトランスフェクションさせた初代Ｔ細胞。フローサイトメトリーのヒストグラム（左パネル）および２回の実験の定量化。エラーバーはＳＤを表わす（右パネル）。Ｅ）ｃと同じ条件だが、ＣＤ４５．２を標的とするｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ４５．２、配列番号００３）または空のベクター（コントロール）を用いる。３回の実験から代表的データを示す。エラーバーはＳＤを表わす。Ｆ）ｄと同じ条件だが、ＣＤ４５．２を標的とするｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ４５．２、配列番号００３）または空のベクター（コントロール）を用いる。３回の実験から代表的データを示す。エラーバーはＳＤを表わす。Ｇ）ａと同様に、ただし、ＣＤ９０．２とＣＤ４５．２を同時に標的とする２つのｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ９０．２およびｓｇＲＮＡ４５．２、配列番号００１および配列番号００３）をコードする２つのプラスミドでトランスフェクションさせたＥＬ－４細胞。空のpx458ベクターでトランスフェクションさせた細胞（左パネル）またはＣＤ９０．２およびＣＤ４５．２を標的とするｓｇＲＮＡ（配列番号００１および配列番号００３）をコードするプラスミドでトランスフェクションさせた細胞（右パネル）のフローサイトメトリー。２回の実験から代表的データを示す。エラーバーはＳＤを表わす。Ｈ）ＣＤ９０．２を標的とするｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ９０．２、配列番号００１）または空のベクター（コントロール）で、ｂと同様にトランスフェクションさせた初代ＣＤ４＋Ｔ細胞。ＧＦＰ＋細胞を精製した（工程２）直後、２×１０５個の精製した細胞を、ＲＡＧ ＫＯレシピエントに静脈注射した。１０日後、脾臓およびリンパ節から細胞を収穫した。リンパ節および脾臓中の生存ＣＤ４＋Ｔ細胞における、ＣＤ９０．２のフローサイトメトリーヒストグラム（左パネル）および複数のレシピエントの定量化（右パネル）。２回の実験で、合計６体のレシピエント（右パネル）。 図２は、初代Ｔ細胞における点変異の標的導入を示す。Ａ）Balb/cマウスに由来し、ビーズ濃縮したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、２４時間活性化させた。その後、（ｉ）空のpx458プラスミド（コントロール）、（ｉｉ）ＣＤ９０．１を標的とするｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ ＣＤ９０．１、配列番号００８）をコードするプラスミド単独、または、（ｉｉｉ）ｓｇＲＮＡ ＣＤ９０．１と、サイズが異なる３種類のＳＳＤＮＡ ＣＤ９０．２鋳型（９０ｂｐ：配列番号０１６、１２０ｂｐ：配列番号０１７、および１８０ｂｐ：配列番号０１８）と、でエレクトロポレーションした（工程１、補図１ａ）。エレクトロポレーションから２４時間後、ＧＦＰ＋細胞を精製し、続いて、精製された細胞をin vitroで培養した。９日後、細胞を収穫し、ＣＤ９０．１およびＣＤ９０．２についてフローサイトメトリーを行った。１回の実験から代表的データを示す。Ｂ）C57Bl6/Nマウスに由来する、ビーズ濃縮したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、（ａ）と同様に活性化させエレクトロポーションした。ただし、ＣＤ９０．２を標的とするｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ ＣＤ９０．２、配列番号００１）をコードするプラスミドと、１８０ｂｐのＣＤ９０．１ｓｓＤＮＡ鋳型（配列番号０１３）とを用いた。続く２４時間、細胞をin vitroで培養し、ＧＦＰ発現させた。ＧＦＰ＋細胞の精製直後、２４時間のあいだ、ＤＭＳＯ（左パネル）またはＮＨＥＪ阻害剤ＳＣＲ７－Ｘ（XcessBioから購入。［Greco et al., DNA Repair (Amst). 2016 Jul;43:18-23］を参照せよ）（右パネル）を添加した。９日後、細胞を収穫し、ＣＤ９０．２およびＣＤ９０．１についてフローサイトメトリーを行った。１回の実験から代表的データを示す。Ｃ）ＥＬ－４細胞を、ＣＤ９０．２を標的とするｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ ＣＤ９０．２、配列番号００１）をコードするプラスミドと、１８０ｂｐのＣＤ９０．１ｓｓＤＮＡ鋳型（配列番号０１３）とでエレクトロポレーションした。続く２４時間、細胞をin vitroで培養し、ＧＦＰ発現させた。ＧＦＰ＋細胞の精製直後、２４時間のあいだ、ＮＨＥＪ阻害剤であるＳＣＲ７－Ｘ、バニリン、またはルカパリブを添加した。９日間、in vitroで増殖させ、それから細胞を収穫し、未処理サンプル（左パネル）および処理済みサンプル（右パネル）におけるＣＤ９０．２およびＣＤ９０．１の発現についてフローサイトメトリーを行った。３回の実験から代表的データを示す。Ｄ）ＥＬ－４細胞を、ＣＤ９０．２を標的とするｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ ＣＤ９０．２、配列番号００１）をコードするプラスミドと、さまざまな長さのＣＤ９０．１ｄｓＤＮＡ鋳型（１６０ｂｐ：配列番号０２７、１ｋｂ：配列番号０２６、２ｋｂ：配列番号０２４、４ｋｂ：配列番号０２５）を含む環状プラスミドと、でエレクトロポレーションした。続く２４時間、細胞をin vitroで培養し、ＧＦＰ発現させた。ＧＦＰ＋細胞の精製直後、２４時間のあいだ、バニリン（ＮＨＥＪ阻害剤）を添加した。９日間、in vitroで増殖させたあと、細胞を収穫し、ＣＤ９０．２およびＣＤ９０．１についてフローサイトメトリーを行った。代表的なフローサイトメトリープロット（左パネル）およびＨＤＲ（ヘテロ接合およびホモ接合）を経た細胞の平均頻度についての複数の実験の定量化（右パネル）を示す（ｎ＝３実験から代表的データを示す。エラーバーはＳＤを表わす）。 Ｅ）C57BI6/Nマウスに由来するビーズした濃縮ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化させ、（ｉ）空のpx458プラスミド、または、（ｉｉ）ＣＤ９０．２を標的とするｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ ＣＤ９０．２、配列番号００１）をコードするプラスミドと、１ｋｂのＣＤ９０．１ｄｓＤＮＡ鋳型（配列番号０２６）とを含むプラスミド、でエレクトロポレーションした。続く２４時間、細胞をin vitroで培養し、ＧＦＰ発現させた。ＧＦＰ＋細胞の精製直後、２４時間のあいだ、バニリン（ＮＨＥＪ阻害剤）を添加した。９日間、in vitroで増殖させたあと、細胞を収穫し、ＣＤ９０．２およびＣＤ９０．１についてフローサイトメトリーを行った。フローサイトメトリープロットは、全生存細胞に対するゲーティング（左パネル）および芽球に対するゲーティング（右パネル）を示す。２回の実験から代表的データを示す。Ｆ）ＨＤＲ頻度の相対的な向上（倍率の変化）にバニリンが与える効果の、ｄｓＤＮＡ鋳型の長さの関数としての定量化。Ｄと同様の実験。鋳型ごとの、バニリンなしの場合に対する、バニリン処理された細胞のＨＤＲ頻度の上昇率。（ｎ＝３実験から代表的データを示す。エラーバーはＳＤを表わす）。Ｇ）ＮＨＥＪ阻害剤なしの長い鋳型の方が、ＮＨＥＪ阻害剤と組み合わせた短い鋳型よりも、ＨＤＲ頻度が高い。短い鋳型（１６０ｂｐ、１ｋｂ）にＮＨＥＪ阻害剤（バニリン）を加えて得たＨＤＲ頻度と、長い鋳型（２ｋｂ，４ｋｂ）でＮＨＥＪ阻害剤なしで得たＨＤＲ頻度の定量化。Ｄと同様の実験（ｎ＝３実験から代表的データを示す。エラーバーはＳＤを表わす）。Ｈ）切断位置から変異位置までの距離がＨＤＲ効率に与える影響。意図した変異をカバーする、ＣＤ９０．２を標的とするｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ ＣＤ９０．２、配列番号００１）（上部パネル）、または、５０ｂｐ離れた位置をカバーするｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ ＣＤ９０．２－Ａ、配列番号００２）（下部パネル）を用いて、ＣＤ９０．２細胞をＣＤ９０．１細胞へと編集した。Ｄと同様の実験設定。切断位置から変異位置までの距離が５０ｂｐあると、短い鋳型（１６０ｂｐ、１ｋｂ）を用いたＨＤＲはうまくいかない。長い鋳型（２ｋｂ、４ｋｂ）ならば、この障害を乗り越える（ｎ＝３実験から代表的データを示す。エラーバーはＳＤを表わす）。 図３は、代理の細胞表面マーカーのアイソフォーム切替をモニタリングするによる、ＨＤＲ編集済み細胞の濃縮を示す。Ａ）mus musculus（C57BL6）のゲノムの、ＣＤ４５．１およびＣＤ４５．２遺伝子アイソフォームの整列。ＣＤ４５．１およびＣＤ４５．２の細胞外ドメインは、３つの異なる領域（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３と表示）において、ヌクレオチド６個分異なる（赤で表示）。ＣＤ４５．２の領域Ｒ１は配列番号０３２であり、ＣＤ４５．１の領域Ｒ１は配列番号０３３であり、ＣＤ４５．２の領域Ｒ２は配列番号０３４であり、ＣＤ４５．１の領域Ｒ２は配列番号０３５であり、ＣＤ４５．２の領域Ｒ３は配列番号０３６であり、ＣＤ４５．１の領域Ｒ３は配列番号０３７である。ｓｇＲＮＡ結合部位は緑線で、ＰＡＭ配列は黒線で示す。Ｂ）天然ＣＤ４５．１エピトープの、遺伝子編集ベースの高解像度マッピング。図５Ａと同様の実験設定。所定のＳＮＰにできるだけ近いＣＤ４５．２遺伝子を標的とする３つの異なるｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ ＣＤ４５．２＿Ｒ１、ｓｇＲＮＡ ＣＤ４５．２＿Ｒ２、およびｓｇＲＮＡ ＣＤ４５．２＿Ｒ３）を用いて、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞中の３つの候補領域を切断した。そして、３つの異なる１８０ｂｐのｓｓＤＮＡ ＣＤ４５．１鋳型（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３）で修復した。ＧＦＰ＋細胞の精製直後、バニリン（ＮＨＥＪ阻害剤）を２４時間、添加した。９日後、細胞を収穫し、ＣＤ４５．２およびＣＤ４５．１についてフローサイトメトリーを行った。実験は、１回はＥＬ－４細胞を用いて、一回は初代ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いて行った。Ｃ）Ｂで得られた結果を、長い（１ｋｂ ＣＤ４５．１ ｄｓＤＮＡ）鋳型を用いて検証。Lys277Glu変異は、ＣＤ４５．２反応性をＣＤ４５．１反応性に切替えるために、必要かつ十分である。データを、代表的なフローサイトメトリープロット（左パネル）および複数の実験の定量化（右パネル）として示す。（ｎ＝３実験から代表的データを示す。エラーバーはＳＤを表わす）。 Ｄ）代理の細胞表面マーカーのアイソフォーム切替を用いた、ＨＤＲ編集済み細胞の濃縮。２つのｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ ＣＤ９０．２およびｓｇＲＮＡ ＣＤ４５．２ Ｒ１）をコードするプラスミドと、２ｋｂのｄｓＤＮＡ鋳型（ＣＤ９０．１およびＣＤ４５．１）とでＥＬ－４細胞をエレクトロポレーションして、多重ＨＤＲを発生させた。続く２４時間、細胞をin vitroで培養して、ＧＦＰ発現させた。ＧＦＰ＋細胞の精製直後、バニリン（ＮＨＥＪ阻害剤）を２４時間添加した。細胞を９日間、in vitroで増殖させ、それから収穫し、フローサイトメトリーでＣＤ９０．２、ＣＤ９０．１、ＣＤ４５．２、およびＣＤ４５．１の発現について調べた。上部パネル：ＣＤ９０．１－（緑）およびＣＤ９０．１＋（赤）に対するプレゲーティング。すなわち、アイソフォームが切替えられた細胞は、第２遺伝子座（Ptprc）におけるＨＤＲイベントが同じ細胞内でリンクしていることを実証する。ＣＤ４５アイソフォームが切替えられた細胞（下部パネル）は、ＣＤ９０アイソフォームも切替えられた細胞において、より高頻度で認められる。２回の実験から代表的データを示す（１回は長い鋳型を、１回は１８０ｂｐのｓｓＤＮＡ鋳型を用いた）。Ｅ）ＨＤＲ編集済み細胞の接合状態の選択。ｄと同様の実験データ。上部パネル：ヘテロ接合ＣＤ９０．１＋／ＣＤ９０．２＋細胞に対してプレゲーティング（赤実線）することで、ヘテロ接合ＣＤ４５．１＋／ＣＤ４５．２＋細胞（左下部パネル）が濃縮される。ホモ接合ＣＤ９０．１＋／ＣＤ９０．１＋細胞に対してプレゲーティング（上部パネル、赤点線）することで、ホモ接合ＣＤ４５．１＋／ＣＤ４５．１＋細胞（下部パネル）が濃縮される。 図４は、scurfy細胞、および、ヒトＦｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘ変異を有する細胞の遺伝子修正を示す。同図はまた、アイソフォームを切替えた代理表面マーカーに対してゲーティングする際の、遺伝子修復細胞の相対的頻度の上昇を示す。Ａ）（ｉ）野生型ｆｏｘｐ３（C57BL/6）のゲノムＤＮＡ配列（配列番号０３８）と、（ｉｉ）未成熟なストップコドンを導入する標的変異Ｆｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘ（配列番号０３９）を有する、Ｆｏｘｐ３遺伝子座のゲノムＤＮＡ配列と、（ｉｉｉ）フレームシフトが生じる自然発生的な２ｂｐの挿入（配列番号０４０）を有する、scurfyマウス（B6.Cg-Foxp3sf/J）のＦｏｘｐ３遺伝子座のゲノムＤＮＡ配列、の整列。ｓｇＲＮＡ結合部位は緑線で、ＰＡＭ配列は黒線で示す。Ｂ）Ｆｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘ C57BL/6マウスに由来する全てのＣＤ４＋Ｔ細胞の、遺伝子編集プロトコル。in vitroで活性化させ、Ｆｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘ変異を標的とするｓｇＲＮＡをコードするプラスミドと、１ｋｂの野生型（ｗｔ）Ｆｏｘｐ３修復鋳型を含む環状プラスミドと、でエレクトロポレーションする（工程１）。トランスフェクションに成功した細胞を、ＧＦＰ発現に基づいて単離する（工程２）。遺伝子編集のために、（ｉ）ｒｈＩＬ－２およびＴＧＦ－βのみの存在下で、または、（ｉｉ）それに加えてレチノイン酸（ＲＡ）およびサイトカイン中和抗体（抗ＩＬ－４および抗ＩＦＮγ）の存在下で、細胞を７日間、in vitroで増殖させる（工程３）。 Ｃ）Ｂと同様の実験設定で、コントロールマウス（ＷＴ）由来またはＦｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘマウスに由来する全てのＣＤ４＋Ｔ細胞を用いる。ＣＤ２５およびＦｏｘｐ３発現のフローサイトメトリー（生存しているＣＤ４＋Ｔ細胞にゲーティング）。空のpx458プラスミドでエレクトロポレーションした野生型細胞は、CD4+Foxp3+CD25+Ｔ細胞に分化する（左パネル）。ｓｇＲＮＡ Ｆｏｘｐ３Ｋ２７６ＸのみでエレクトロポレーションしたＦｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘ細胞は、Ｆｏｘｐ３に分化しない（中央パネル）。ｓｇＲＮＡ Ｆｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘおよび１ｋｂのＦｏｘｐ３ ｄｓＤＮＡ修復鋳型でエレクトロポレーションしたＦｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘ細胞は、Ｆｏｘｐ３タンパク質発現を回復する（右パネル）。上の行：ＴＧＦ－βのみによるＦｏｘｐ３誘導。下の行：ＲＡと組み合わせたＴＧＦ－βによるＦｏｘｐ３誘導。ＴＧＦ－βのみと比較すると、ＴＧＦ－βとＲＡとの組み合わせでは、完全なＦｏｘｐ３遺伝子座を有する細胞（すなわち、野生型細胞および修復細胞）におけるＦｏｘｐ３発現細胞の頻度がより高くなる。Ｆｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘ細胞を用いた２回の実験およびＦｏｘｐ３ｓｆ／Ｊ細胞を用いた１回の実験から、代表的データを示す。Ｄ）ＣＤ４５の多重アイソフォーム切替えを代理マーカーとして用いた、遺伝子修復済みＦｏｘｐ３発現細胞の濃縮。ｂと同様の実験設定。ただし、２つのｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ Ｆｏｘｐ３Ｋ２７６ＸおよびｓｇＲＮＡ ＣＤ４５．２＿Ｒ１）をコードするプラスミドと、２つの１ｋｂのｄｓＤＮＡ鋳型（野生型Ｆｏｘｐ３およびＣＤ４５．１）と、で同時にエレクトロポレーションした。７日後、ＣＤ４５．２、ＣＤ４５．１、ＣＤ２５、およびＦｏｘｐ３のフローサイトメトリーを行った（生存ＣＤ４＋細胞にゲートした）。上部パネル：ＣＤ４５．１－細胞に対するプレゲーティング（緑の線）およびＣＤ４５．１＋細胞に対するプレゲーティング（赤の線）。下部パネル：アイソフォームを切替えたＣＤ４５．１＋細胞中における、ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の濃縮。Ｆｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘ細胞を用いた２回の実験およびＦｏｘｐ３ｓｆ／Ｊ細胞を用いた１回の実験から代表的データを示す。 図５は、図２に関連する補足データを示す。Ａ）ＣＤ４Ｔ細胞におけるプラスミドベースのＨＤＲのプロトコル。ビーズ濃縮したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、in vitroで２４時間活性化させた。その後、遺伝子Ｘを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｃａｓ９およびＧＦＰコードするプラスミドで、エレクトロポレーションする。さらに、（ｉ）ｓｓＤＮＡ ＨＤＲ鋳型、または、（ｉｉ）ｐＵＣ５７ベクター（ここでは鋳型Ｙとして示す）でクローニングしたＨＤＲ鋳型を含む、環状ｄｓＤＮＡプラスミド、のいずれかとコトランスフェクションさせる（工程１）。２４時間後、トランスフェクションが成功した細胞を、ＧＦＰ発現に基づくフローサイトメトリーで精製する（工程２）。細胞選別の直後、ＮＨＥＪ阻害剤で２４時間、インキュベートする。選別後、４日間で再活性化させた後、遺伝子編集のために、６日～９日間、in vitroで細胞を増殖させる（工程３）。ＥＬ－４細胞を同じようにトランスフェクションする。ただし、ＥＬ－４細胞は、エレクトロポレーション前、または選別から４日後にＴＣＲ活性化を必要とせず、エレクトロポレーションパラメータは異なる（「材料および方法」を参照）。Ｂ）ゲノムＣＤ９０．１およびＣＤ９０．２のｎｔおよびａａ配列。ＣＤ９０．１のｎｔ：配列番号０４１、ＣＤ９０．２のｎｔ: 配列番号０４２。Ｒ１０８Ｑを発生させる、ＣＧＡ（ＣＤ９０．１）ＣＡＡ（ＣＤ９０．２）ＳＮＰを、赤でハイライト表示する。Ｃ）実験リードアウトのグラフ表示：Ｑ１：未編集の細胞、または、タンパク質発現が停止しない変異（例えば、インフレーム変異）を有する細胞。Ｑ２：ＮＨＥＪ後の細胞。Ｑ３：編集済みＣＤ９０．２/ＣＤ９０．１ヘテロ接合細胞。Ｑ４：編集済みホモ接合ＣＤ９０．１細胞、または、１つのＫＯアレルと、１つのＨＤＲ編集済みアレルとを有する細胞。Ｄ）サイズが異なる３種類のｓｓＤＮＡ ＣＤ９０．２鋳型（９０ｂｐ：配列番号０１６、１２０ｂｐ：配列番号０１７、１８０ｂｐ：配列番号０１８）を、ｓｇＲＮＡ９０．１の切断部位を中心として示した概略図。 Ｅ）アイソフォーム切替え用の鋳型における、異なる変異の影響。変異のない、１８０ｂｐのｓｓＤＮＡ ＣＤ９０．１鋳型（no mt、配列番号０１３）。変異ＰＡＭ（mt PAM (1nt)、配列番号０１４）。または、変異ＰＡＭ（２ｎｔ）に加えて３つのさらなる変異（mt PAM (2nt)+ 3 other nt、配列番号０１４）。ＥＬ－４細胞を、ａと同様に、ＣＤ９０．２を標的とするｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ ＣＤ９０．２、配列番号００１）をコードするプラスミドと、異なる１８０ｂｐのｓｓＤＮＡＣＤ９０．１鋳型と、でトランスフェクションさせた。９日後、フローサイトメトリーを行った。Ｆ）図２Ｄと同じ実験であるが、データを異なるゲーティング手法で分析した。芽球にゲーティングした代表的なフローサイトメトリープロット、および、複数の実験を横断したＨＤＲ効率の定量化（ｎ＝３；エラーバーはＳＤを表わす）を示す。ヘテロ接合細胞とホモ接合細胞の頻度は、すべてのリンパ球にゲーティングした場合に比べ、芽球における場合の方が高い。Ｇ）切断位置から変異位置までの距離が、ＨＤＲ効率に与える影響を判定するための実験設計。ＣＤ９０．２を標的とする２つの異なるｓｇＲＮＡが、所定の変異に対して結合する部位：ｓｇＲＮＡ ＣＤ９０．２（配列番号００１）は変異部位に結合するのに対し、ｓｇＲＮＡ ＣＤ９０．２－Ａ（配列番号００２）は変異部位から５０ｎｔ離れた部位に結合する。上部のバーは、異なる長さの修復鋳型を表わす。 図６は、図３に関連する補足データを示す。ＣＤ４５．２からＣＤ４５．１への正確なアイソフォーム切替えを、サンガーシーケンシングで検証した。図５Ａに示したように、ＣＤ４５．２を標的とするｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ ＣＤ４５．２）をコードするプラスミドおよびＣＤ４５．１の環状ｄｓＤＮＡ２ｋｂプラスミド鋳型で、ＥＬ－４細胞をエレクトロポレーションした。細胞をin vitroで９日間培養し、それから収穫して、ＣＤ４５．２およびＣＤ４５．１発現に基づいてフローサイトメトリーで選別した。これにより、４つの定義された集団、ＣＤ４５．２＋/ＣＤ４５．１－（Ｑ１）、ＣＤ４５．２－/ＣＤ４５．１－（Ｑ２）、ＣＤ４５．２＋/ＣＤ４５．１＋（Ｑ３）、およびＣＤ４５．２－/ＣＤ４５．１＋（Ｑ４）に分離した。Ｑ１：配列番号０４７および配列番号０４８（上から３行目）。Ｑ２：配列番号０４９（１行目、２行目、３行目、６行目、１０行目、１１行目）および配列番号０４７（４行目、５行目、７行目、８行目、９行目）。Ｑ３：配列番号０５０、配列番号０５１、配列番号０５２、配列番号０５３、配列番号０５４、配列番号０５４、配列番号０５５、配列番号０５６、配列番号０５７、配列番号０５８、配列番号５４、配列番号０５９。Ｑ４：配列番号０４９（１行目、２行目、４行目、５行目、７行目、８行目、９行目、１１行目、１２行目、１４～２２行目）、配列番号０６０（３行目）、配列番号０４７（６行目、１０行目）、配列番号０６１（１３行目）。ＤＮＡを抽出し、サンガーシーケンシングのためにＰＣＲアンプリコンをクローニングした。四分割された配列群のそれぞれにおいて、ゲノム配列の右側に変異を記載してシーケンシング結果を示す。四分割された配列群のそれぞれの下部右側の数字は、ｗｔ配列の頻度、または、ＮＨＥＪ対ＨＤＲ修復を示す。矢印の上の丸数字１は、ＣＤ４５．１鋳型に導入されたＡに対するＰＡＭ変異９３０Ｇを表す。矢印の上の丸数字２は、所定の変異（Lys277Glu）を表す。Ｑ３およびＱ４集団の鋳型の両側にはindelは見つからなかった（データは不図示）。 図６Ａ－Ｑ１に同じ。 図６Ａ－Ｑ１に同じ。 図６Ａ－Ｑ１に同じ。 選別・精製後のデータを図６Ｂに示す。左パネル：４つの個別の細胞集団を定める４つの四分象限のラベルの凡例である。右パネル:４つの精製した集団の電子オーバーレイを示す。以下に定めた４つの集団が精製された。ＣＤ４５．２＋／ＣＤ４５．１－（Ｑ１；赤）、ＣＤ４５．２－／ＣＤ４５．１－（Ｑ２；緑）、ＣＤ４５．２＋／ＣＤ４５．１＋（Ｑ３；青）、およびＣＤ４５．２－／ＣＤ４５．１+（Ｑ４、オレンジ）。このことは、アイソフォーム／アレルの切替えにより、オリジナルのアレルおよび編集済みアレルの発現に基づいて、複数の遣伝子型／複数の表現型の混合集団の中から、純度の高い個別の集団を単雕できることを実証する。 図７は、（Ａ）Ｔｈｙ１．２についてホモ接合、（Ｂ）Ｔｈｙ１．２およびＴｈｙ１．１についてヘテロ接合、または（Ｃ）Ｔｈｙ１．１についてホモ接合である同系交配類似遺伝子型マウスにおいて、２種類のモノクローナル抗体が、アイソフォームＴｈｙ１．１（クローンＯＸ－７）とアイソフオームｈｙ１．２（クローン５３．２－１）とを区別できることを示す。同図はまた、２つのアイソフオームの接合性を、一細胞レベルで判定できることを示す。アイソフオームＴｈｙ１．１とアイソフォームＴｈｙ１．２とのゲノムの相違は、一つのヌクレオチドの相違である（配列番号０４１および配列番号０４２におけるヌクレオチド１４）。 図８は、安定してＣａｓ９を発現するマウス細胞株の世代を示す。Ａ）これらの細胞におけるゲノムＣａｓ９ＤＮＡの存在をＰＣＲで確認し、Ｃａｓ９遺伝子座（順プライマー:AACAGCCGCGAGAGAATGAA、配列番号０３０、逆プライマー:TCGGCCTTGGTCAGATTGTC、配列番号０３１）を増幅させた。この遺伝子座を、Ｃａｓ９遺伝子組み換えマウス（Ｃａｓ９Ｔｇマウス）におけるＣａｓ９配列または野生型マウス（ＷＴマウス）と比較した。Ｂ）Ｔｈｙ１．２およびＣＤ４５．２に対するｓｇＲＮＡを、該ｓｇＲＮＡに続くＴ７プロモーターをコードするｄｓＤＮＡ鋳型からin vitro転写で作製し、Ｃａｓ９発現細胞株にトランスフェクションした。すべてのテストされた細胞株において、in vitro転写ｓｇＲＮＡのエレクトロポレーションは、Ｔｈｙ１およびＣＤ４５（Ｑ２）のホモ接合で多重化した遣伝子を高効率で除去するのに十分である。６つの異なるＣａｓ９発現ＥＬ－４細胞株のＦＡＣＳプロットを示す。 図９は、末梢血またはヒト臍帯血に由来する初代ヒトＴ細胞の、トランスフェクションを示す。実験条件は、マウス細胞に用いたものに対応する。詳しいプロトコルについては、「方法」の節を参照されたい。手短に述べると、ＰＢＭＣまたはナイーブＴ細胞をヒト血液から単雕し、in vitroで抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を用いて活性化させる。それから、ガイドＲＮＡと、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（または他のヌクレアーゼ）と、ＧＦＰのような選択マーカー（エレクトロポレーションの成功を示すために用いられる）とを発現するプラスミドで、エレクトロポレーションする。ＧＦＰは、ＧＭＰを産生することが立証されている代替マーカーと取換えてもよい（例えば、ｔＮＧＦＲ（短縮型神経成長困子受容体））。具体的な条件は、「材料および方法」の節に記載する。 図１０は、Ｃａｓ９リボヌクレオタンパク質粒子（ＲＮＰ）を用いた、ＥＬ－４細胞の遣伝子編集を示す。ＥＬ－４細胞に、ｃｒＲＮＡｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体および＋／－ＨＤＲ２ｋｂ鋳型をトランスフェクションした。エレクトロポレーション条件（「方法」の節に記載）以外は、プラスミドベースのアプローチと同じ手法である。 図１１は、Ｃａｓ９リボヌクレオタンパク質粒子（ＲＮＰ）を用いた、初代マウスＴ細胞の遺伝子編集を示す。初代マウスＴ細胞に、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体および＋／－ＨＤＲ２ｋｂ鋳型をトランスフェクションした。プラスミドベースのアプローチと同じ手法である。 図１２は、プラスミドベースのアプローチとＲＮＰベースのアプローチを用いた、Ｆｏｘｐ３遣伝子の修復を示す。Ａ：Ｆｏｘｐ３ ＫＯマウス由来のＣＤ４Ｔ細胞を、（ｉ）ｓｇＲＮＡプラスミド単独、または（ｉｉ）ｓｇＲＮＡプラスミドおよびＦｏｘｐ３野生型ＨＤＲ鋳型、でトランスフェクションさせた。トランスフェクション（プラスミドトランスフェクション）から２４時間後、ＧＦＰ＋細胞とＧＦＰ－細胞を選別し、細胞選別の直後、Ｆｏｘｐ３分化カクテルの存在下にて実験の終了まで増殖させた。Ｂ：Ｆｏｘｐ３ ＫＯマウス由来のＣＤ４Ｔ細胞を、（ｉ）ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体単独、または（ｉｉ）＋/－ＨＤＲ鋳型（１８０ｂｐのｓｓＤＮＡまたは２ｋｂのプラスミド）を伴って、トランスフェクションさせた。ＲＮＰトランスフェクション細胞の全プールを、Ｆｏｘｐ３分化カクテルの存在下、実験の終了まで増殖させた。 図１３は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）によるトランスフェクションの際に生じた、編集済み細胞を示す。Ａ：養子Ｔ細胞移植およびＬＣＭＶ感染後、末梢リンパ節（ＬＮ）、腸間膜ＬＮ（ｍｅｓＬＮ）、および膵臓（ＳＰ）において、編集済み／ＣＤ４５．１＋細胞（ｓｇＲＮＡ ＩＣＯＳ、ｓｇＲＮＡ ＢＣｌ６またはコントロール（空のプラスミド））が回復しうることを実証する。Ｂ：ＩＣＯＳの標的化を実証する（コントロール、およびＢＣｌ６（他のＴＦＨマーカー）に対するｓｇＲＮＡに関して、種々の器官でＩＣＯＳ ＭＦＩが減少する）。Ｃ：濾胞性ヘルパーＴ細胞の分化（ＣＸＣＲ５およびＰＤ１によって定められる）が損なわれているＩＣＯＳが低い（欠失した）集団と、ＩＣＯＳ集団（高ＩＣＯＳ）集団とを示す。 図１４は、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞クローンにおける、エレクトロポレーション条件の最適化を示す。ヒト抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンを、同族ペプチドで活性化した。その後、Neonエレクトロポレーターを用いてエレクトロポレーションを行い、図示したように、異なるバッファ（バッファＴおよびバッファＲ、どちらもNeonキットによって提供されるThermo Fisher/Invitrogen製）、および、異なるエレクトロポレーション条件（電圧、幅、パルス）を比較した。トランスフェクションに用いたプラスミドはp-EGFP-N1であった（設計された「小さな（ＧＦＰ）プラスミド」）。プラスミドpEGFP-N1は４．７ｋｂであり、Takara/C1ontech製である。生存リンパ球の分析は、生存リンパ球にゲーティングしたＦＳＣ／ＳＳＣおよびＧＦＰ発現に基づく。参考として示したのは［Schuman et al PNAS 2015, doi: 10.1073/pnas］で公開されたプロトコルである。大部分の条件では、細胞の大多数が死亡した。どの条件においても、生存細胞のトランスフェクション効率（ＧＦＰ発現によって読み取る）は低かった。このプラスミドの選択：我々は、このプラスミドを成功裡に用いて、マウスＴ細胞のエレクトロポレーション条件を最適化した。 図１５は、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞クローンのエレクトロポレーション条件の最適化を示す。大きなＣａｓ９－ＧＦＰ発現プラスミドpx458を用いた（Addgene pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) No 48138）以外は、図１４と同じ条件である。小さなプラスミドの場合と同様、大部分のエレクトロポレーション条件では、細胞の大多数が死亡した。大きなプラスミドでは、最良の条件（Schumann et al.）ですらＧＦＰ発現をもたらさなかった。 図１６は、健康な成人ドナーの末梢血に由来するヒトナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の精製における、品質コントロール（純度チェック）を示す。細胞の単離は、「材料および方法」に記載した通りである。ナイーブＴ細胞の濃縮前後に純度チェックを行った。濃縮前は、３３．５％の細胞がＣＤ４５ＲＯ－ＣＤ４５ＲＡ＋ナイーブＴ細胞であった。濃縮後は、９４．７％の細胞がＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ナイーブＴ細胞であった。 図１７は、初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞のエレクトロポレーション条件の最適化を示す。初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の単離および活性化は、「材料および方法」に記載した通りである。トランスフェクション効率（ＧＦＰ＋の割合）を、Ｔ細胞活性化がない場合、刺激が低い場合、刺激が中程度である揚合、または刺激が高い場合で比較した。活性化条件は「材料および方法」に記載した通りである。小さなプラスミドp-EGFP-N1（上部パネル）を、大きなプラスミドpx458（下部パネル）と比較した。エレクトロポレーションの設定は、［Schuman et al., PNAS 2015, doi: 10.1073/pnas］に記載した通りである。 図１８は、初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞のエレクトロポレーション条件の最適化を示す。品質コントロール。活性化状態をモニタリングし、メモリー（ＣＤ４５ＲＯ＋）Ｔ細胞とナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋）Ｔ細胞との相対分布を比較した。活性化条件は「材料および方法」に記載した通りである。 図１９は、初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞のエレクトロポレーション条件の最適化を示す。初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の単離および活性化は、「材料および方法」に記載した通りである。大きなpx458プラスミドを用いた。トランスフェクション効率（ＧＦＰ＋の割合）を、Ｔ細胞活性化がない場合、刺激が低い場合、刺激が中程度である場合、または刺激が高い場合で比較した（全ＰＢＭＣ、上部パネル）。ナイーブＴ細胞を濃縮し、続いて中程度のまたは高い活性化を行った場合と比較した（下部パネル）。プログラムX-001を用いるAmaxa Transfection System（Lonza）によって、エレクトロポレーションを行った。これらの条件では、トランスフェクション効率は低いかゼロである。 図２０は、初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞のエレクトロポレーション条件の最適化を示す。初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の単離および活性化は、「材料および方法」に記載した通りである。大きなpx458プラスミドを用いた。プラスミドのトランスフェクション後、生存率（生存細胞をゲーティング）を、Ｔ細胞活性化がない場合、刺激が低い場合、刺激が中程度である場合、または刺激が高い揚合で比較した（全ＰＢＭＣ、上部パネル）。ナイーブＴ細胞を濃縮し、続いて中程度のまたは高い活性化を行った場合と比較した（下部パネル）。プログラムT-020を用いるAmaxa Transfection System（Lonza）によって、エレクトロポレーションを行った。これらの条件を用いると、生存率は高い。 図２１は、初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞のエレクトロポレーション条件の最適化を示す。初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の単離および活性化は、「材料および方法」に記載した通りである。大きなpx458プラスミドを用いた。プラスミドのトランスフェクション後、トランスフェクション効率（ＧＦＰ＋の割合）を、Ｔ細胞活性化がない場合、刺激が低い場合、刺激が中程度である揚合、または刺激が高い揚合で比較した（全ＰＢＭＣ、上部バネル）。ナイーブＴ細胞を濃縮し、中程度のまたは高い活性化を行った場合と比較した（下部パネル）。プログラムT-020を用いるAmaxa Transfection System（Lonza）によって、エレクトロポレーションを行った。これらの条件を用いると、トランスフェクション効率は高い（８～２０％）。活性化前にナイーブＴ細胞を濃縮すると、全ＰＢＭＣと比較してＧＦＰ＋細胞の割合が高くなる。 図２２は、ヒト臍帯血リンパ球（とりわけＴ細胞）の、フローサイトメトリーによる特徴づけを示す。大半は、ナイーブＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－）である。 図２３は、プラスミドトランスフェクション後の細胞生存率とＣａｓ９ ＲＮＰトランスフェクション後の細胞生存率との比較を示す。出発物質：ヒト臍帯血（ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を事前に濃縮していない）。「材料および方法」の節に記載されたように、培地活性化力(medium activation strength)を用いて細胞を活性化した。プラスミドpx458およびAmaxa program T-020によるエレクトロポレーション後の生存率（左パネル）を、NeonエレクトロポレーターによるＣａｓ９ ＲＮＰエレクトロポレーション（「材料および方法」の節および［Schuman et al., PNAS 2015, doi: 10.1073/pnas］に記載）後の生存率（右パネル）と比較した。これらのエレクトロポレーション条件では、同等の生存率が得られる。 図２４は、プラスミドトランスフェクションによるトランスフェクション効率と、Ｃａｓ９ ＲＮＰトランスフェクションによるトランスフェクション効率との比較を示す。出発物質：ヒト臍帯血（ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を事前に濃縮していない）。「材料および方法」の節に記載されたように、培地活性化力(medium activation strength)を用いて細胞を活性化した。プラスミドpx458およびAmaxa program T-020によるエレクトロポレーション後のトランスフェクション効率（左パネル）を、Neonエレクトロポレーターによる標識化ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ－Ａｔｔｏ ５５０／Ｃａｓ９ ＲＮＰエレクトロポレーション（「材料および方法」の節および［Schuman et al., PNAS 2015, doi: 10.1073/pnas］に記載）後のトランスフェクション効率（右パネル）と比較した。 図２５は、in vivo（末梢血）における、ＣＤ４５．２＋細胞の選択的枯渇を示す。リンパ球を枯渇させたＲＡＧ ＫＯマウスを、「材料および方法」の節に記載したように、１：１の比で混合したホモ接合ＣＤ４５．１＋/ＣＤ４５．１＋同族マウス系統由来のＴ細胞およびホモ接合ＣＤ４５．２＋/ＣＤ４５．２＋同族マウス系統由来のＴ細胞で再構築した。未処理の宿主（「未処理」）における枯渇と、ＣＤ４枯渇ｍＡｂ（クローンＧＫ１．５）（「ａ－ＣＤ４ ＡＢ」）または抗ＣＤ４５．２ｍＡｂ（クローン１０４）を注入した宿主における枯渇と、を比較した。「材料および方法」の節に記載したように、抗ＣＤ４５．２ｍＡｂは、（ｉ）ビオチン化されているが毒物に結合していない抗ＣＤ４５．２ｍＡｂ（「ａ－ＣＤ４５．２ ＡＢ」と称する）か、（ｉｉ）ビオチン化されておりストレプトアビジン－ＳＡＰ毒物と共役させた抗ＣＤ４５．２ｍＡｂ（「ａ－ＣＤ４５．２－ＺＡＰ」と称する）であった。枯渇から一週間後、末梢血を分析した。上部パネル：左：ゲーティング手法：リンパ球／ＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞。棒グラフ（上部右パネル）:ＣＤ４５．２＋／ＣＤ４５．１＋細胞の比の定量化。下部パネル：代表的なＦＡＣＳプロット。処埋なし：ＣＤ４５．２＋細胞およびＣＤ４５．１＋細胞が、１：１割合で残った。抗ＣＤ４ｍＡｂによる非選択的枯渇：ＣＤ４５．１細胞およびＣＤ４５．２細胞は、ともに、区別なく排除される。抗ＣＤ４５．２ｍＡｂによる枯渇：ＣＤ４５．２＋細胞の選択的枯渇により、ＣＤ４５．１＋細胞が相対的に増加する。毒物を抗ＣＤ４５．ＺｍＡｂに結合することはより効率的だが、結合していないｍＡｂでもＣＤ４５．２＋細胞を枯渇させる。このことは、in vivoにおいて、非常に密接に関達したアレルを用いた細胞の選択的枯渇が可能であることを実証する。 図２６は、in vivo（リンパ器官）における、ＣＤ４５．２＋細胞の選択的枯渇を示す。図２５におけるものと同じ設定であるが、リンパ節および脾臓の分析である。細胞枯渇の分析のためのゲーティング手法。リンパ球ゲート、生体染色、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞。抗ＣＤ４ｍＡｂにより枯渇処理した宿主マウスは、リンパ球ゲートに見られるリンパ球が大幅に減少し、ＣＤ３ＣＤ４染色でも同様に減少する。 図２７は、in vivo（リンパ器官）におけるＣＤ４５．２＋細胞の選択的枯渇を示す。図ｘｙにおけるものと同じ設定であるが、リンパ節および脾臓の分析である。「材料および方法」の節に記載したように、リンパ節（ＬＮ）、腸間膜リンパ節（ｍｅｓＬＮ）、および脾臓（ＳＰ）におけるＣＤ４５．１＋Ｔ細胞およびＣＤ４５．２＋Ｔ細胞の存在を分析した。末梢血について観察したように、分析した３つの未処理の器官すべてにおいて、ＣＤ４５．１＋／ＣＤ４５．２＋細胞が１：１の比率で見られた。抗ＣＤ４ｍＡｂでの非選択的枯渇は、すべての器官において、ＣＤ４５．１＋Ｔ細胞およびＣＤ４５．２＋Ｔ細胞を枯渇させる。対照的に、抗ＣＤ４５．ＺｍＡｂ（毒物ありまたは毒物なし）の投与は、ＣＤ４５．２＋細胞を選択的に枯渇させ、ＣＤ４５．１＋細胞を相対的に濃縮する。相対数を示す代表的なフローサイトメトリープロットを示す。毒物をＣＤ４５．２ｍＡｂに結合することで、枯渇がより効率的になる。このことは、in vivoにおいて、非常に密接に関達したアレルを用いた細胞の選択的枯渇が可能であることを実証する。 図２８は、in vivoにおけるＣＤ４５．２＋細胞の選択的枯渇を示す。リンパ器官におけるＴ細胞の絶対数の定量化。図２５におけるものと同じ設定だが、リンパ節（ＬＮ）および腸間膜リンパ節（ｍｅｓＬＮ）を分析した。 図２９は、in vivoにおけるＣＤ４５．２＋細胞の選択的枯渇を示す。リンパ器官におけるＴ細胞の絶対数の定量化。図２５におけるものと同じ設定だが、脾臓（ＳＰ）を分析した。 図３０は、in vivoにおけるＣＤ４５．２＋細胞の選択的枯渇を示す。リンパ器官におけるＴ細胞の相対数の定量化。図２５におけるものと同じ設定だが、リンパ節（ＬＮ）および腸間膜リンパ節（ｍｅｓＬＮ）を分析した。 図３１は、in vivoにおけるＣＤ４５．２＋細胞の選択的枯渇を示す。リンパ器官におけるＴ細胞の相対数の定量化。図２５におけるものと同じ設定だが、脾臓（ＳＰ）を分析した。
〔初代Ｔ細胞における効率的なプラスミドベースの遺伝子除去〕
これまでに、化学的に修飾されたガイドＲＮＡ（Hendel et al.,Nat Biotech 33, 985-989, 2015）、または、ヒトＴ細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ゲノム編集用のＣａｓ９／ｓｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体（Schumann, PNAS 112 10437-10442, 2015）の使用に成功したことが報告されている。ＤＮＡベースのアプローチは、行われたとしても、上手く行かなかったと報告されていた。しかし、効率的なプロトコルが利用可能ならば、数多くのプラスミドが利用できるようになる（Addgene.org/crispr）。一方、組み換えタンパク質として利用可能なゲノム編集ヌクレアーゼは、ごくわずかしかない。そこで、本発明者らは、初代Ｔ細胞におけるプラスミドベースのゲノム編集アプローチを開発することを目指した。有効なＴ細胞へのエレクトロポレーションプロトコル（Steiner et al., Immunity 35, 169-181, 2011）に基づき、本発明者らは、ＧＦＰ発現プラスミドを用いる、ＥＬ－４細胞およびマウスの初代ＣＤ４＋Ｔ細胞用の実験条件を最適化した（図１Ａおよび図１Ｂ）。本発明者らは、細胞表面タンパク質をコードする遺伝子に関して、一つの細胞における遺伝子編集の効率をフローサイトメトリーによって定量化した。ＥＬ－４細胞およびマウスの初代ＣＤ４＋Ｔ細胞の両方において、ＣＤ９０．２およびＰｔｐｒｃの除去効率は極めて高かった。ＣＤ９０．２およびＰｔｐｒｃの遺伝子産物であるＣＤ４５が、コントロール条件に比べて、大多数の細胞において失われていた（図１Ｃから図１Ｆ）。上記した多重遺伝子編集用のプロトコルを用いることで、細胞のうちほとんど半分が、ＣＤ９０．２およびＣＤ４５．２の発現を同時に失った。このことは、両遺伝子のホモ接合的切除を示す（図１Ｇ）。続いて、本発明者らは、上記の編集はin vivoでも起こりうるだろうかと考えた。このため、本発明者らは、エレクトロポレーションした細胞を、ＧＦＰ選別の直後、リンパ欠失ＲＡＧ ＫＯマウスに養子移植（ＡＴ）した。ＡＴの１０日後、本発明者らは、リンパ節（ＬＮ）および脾臓（ＳＰ）において回復したＴ細胞におけるＣＤ９０．２の欠失は、in vitroにおける遺伝子編集と同等であることを観察した（図１Ｈ）。回復した細胞は生存しており、実質的に増殖していた。このように、このプラスミドベースのアプローチにより、in vitroでもin vivoでも、Ｔ細胞における効率的な遺伝子除去が可能である。
〔初代Ｔ細胞における点変異の標的導入〕
遺伝子編集によって引き起こされたＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）は、大部分は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復され、ランダムなindelとなる。一方、ＨＤＲによるＤＳＢ修復は制御されたゲノム編集を可能にし、したがって、臨床用途に望ましいが、生じる数がずっと少ない（Wang et al., Annual review of biochemistry 85, 227-264, 2016）。しかし、ＨＤＲイベントを容易に定量化する適切なアッセイがないため、細胞一般における（とりわけ初代細胞における）ＨＤＲの効率を向上させることができない。初代ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＨＤＲの効率を迅速に評価できるようにするため、本発明者らは、新たなアッセイを設計した（図５Ａ）。マウスＣＤ９０の２つのアイソフォーム（ＣＤ９０．１およびＣＤ９０．２）は、一つのヌクレオチド（ｎｔ）で異なっており、これは一つのアミノ酸（ａａ）の相違（ＣＤ９０．１：アルギニン（Ａｒｇ）；ＣＤ９０．２グルタミン（Ｇｌｎ））となる（図５Ｂ）。これらは、２種類のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）で区別しうる（Williams et al., Science (New York, N.Y.) 216, 696-703, 1982）。本発明者らは、１つのアイソフォームからもう１つのアイソフォームへとＤＮＡ編集が成功したことは、２種類のアイソフォーム特異的ｍＡｂを用いて定量化できるのではないかという仮説を立てた。アイソフォーム切替えアッセイ（ＩＳＡ）を確立するために、本発明者らは、Balb/cマウス（ＣＤ９０．１／ＣＤ９０．１）由来のＴ細胞を、３つの異なるサイズのＨＤＲ鋳型を提供することにより変換して、ＣＤ９０．２アイソフォームを発現させられるかを実験した（図５Ｃ）。ＣＤ９０．１を標的とするｓｇＲＮＡのみが遺伝子欠失をもたらし、これはトランスフェクションに成功した細胞の約２０％であった（図２Ａ）。ＣＤ９０．２をコードする一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）鋳型を設けることで、ＣＤ９０．１／ＣＤ９０．２についてヘテロ接合である少数の細胞と、ＣＤ９０．２についてホモ接合である少数の細胞が検出された（図２Ａ）。本発明者らは、最長のｓｓＤＮＡ（１８０ｂｐ、すなわち、変異の５’末端および３’末端に隣接する９０ｂｐ）を用いたアイソフォーム切替えのみを検出し、それより短い鋳型を用いたアイソフォーム切替えは検出しなかった（図２Ａおよび図５Ｃ）。したがって、内在性遺伝子のアイソフォーム切替えを用いて、一つの細胞においてＮＨＥＪ同様にＨＤＲを定量化できる。ＨＤＲの効率が比較的低いため、本発明者らは、上記システムをさらに最適化することにした。そこで、ＣＤ９０．２アイソフォームをＣＤ９０．１アイソフォームに戻すことにより、上記アッセイがより一般的に働くか実験した。C57BL/6Nマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ９０．２／ＣＤ９０．２）を用いて、本発明者らは、フローサイトメトリーによる点変異の導入のモニタリングの実行可能性を確認した（図２Ｂ）。しかし、ヘテロ接合的またはホモ接合的に編集されたＴ細胞の頻度は、低いままであった。そこで本発明者らは、上記細胞を、ＮＨＥＪを阻害するＤＮＡリガーゼＩＶ阻害剤ＳＣＲ７に対して一時的に曝露させた。以前に報告されたように、ＳＣＲ７－Ｘの存在により、ＨＤＲの効率が１０倍を超えて増加した（図２Ｂ）。次に、ＨＤＲ鋳型を変異させることにより、変異ＰＡＭ配列を有するＨＤＲ鋳型はＨＤＲの効率を約２倍に増加させるのに対し、一方、追加の変異をしてもＨＤＲの効率をさらに増加させはしないことが実証された（図５Ｄ）。したがって、本発明者らは、そのあとの実験の大半において、ＰＡＭ変異配列を用いた。ＮＨＥＪをＳＣＲ７－Ｘで阻害するとＨＤＲが実質的に高まる（図２Ｂ）ので、本発明者らは、ＮＨＥＪ経路を阻害するいくつかの小分子、または、ＨＤＲを直接増加させるいくつかの小分子を比較して、Ｔ細胞に対して最良のＨＤＲ促進戦略を発見した。ＳＣＲ７－Ｘの他に、ＤＮＡ ＰＫ阻害剤であるバニリンおよびＰＡＲＰ１阻害剤であるルカパリブは、ＨＤＲの頻度を最も増加させた（図２Ｃ）。他の化合物（ベリパリブ、Ｌ７５５０７（Ref Yu et al./Qi, Cell Stem Cell 2015）、ルミネスピブ、ＲＳ－１（Ref Song, Nat Comm, 2016）、およびバニリン誘導体Ａ１４４１５、Ａ１３５９、Ｌ１７４５２（Ref Durant, Karran, Nucl Acid Research 2003））はＨＤＲの増加がそれより少なかったり、あるいは毒性があったりした。バニリンがＨＤＲを最も増加させ、その上、唯一の水溶性化合物であったので、本発明者らは以降の実験ではバニリンに焦点を当てた。
本発明者らが評価した次のパラメータは、修復鋳型の長さであった。昨今の遺伝子編集の報告はしばしば、比較的短いｓｓＤＮＡ鋳型（通常、２００ｂｐ未満）を用いていた。しかし本発明者らによる結果（図２Ａ）は、より長い鋳型の方がＨＤＲの効率をより高くできるかもしれないことを示唆した。さらに、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）における遺伝子ターゲティングの相同性アームは、通常、ずっと長い（数ｋｂ）。実際、環状ｄｓＤＮＡ（プラスミド）ＣＤ９０．１ ＨＤＲ鋳型の相同性アームの増加は、ＨＤＲの効率と正に相関していた（図２Ｄ）。相同性が１ｋｂと２ｋｂの間であるときに、最大の増加が見られた（図２Ｄ）。さらに、本発明者らは、大きな芽球においてＨＤＲの効率が最大であることに気が付いた。該芽球中では、４ｋｂの相同性のときに、３０％超がＨＤＲを起こしていた（図５Ｆ）。重要なことに、上記の最適化された条件によれば、マウスの初代ＣＤ４＋Ｔ細胞でも同様のＨＤＲ頻度を示した。芽球段階の初代Ｔ細胞の最大で４分の１が、ＣＤ９０．１をホモ接合的に発現させていた（図２Ｅ）。注目すべきは、バニリンのＨＤＲ促進効果は、鋳型が短い場合（１６０ｂｐ、１ｋｂ）の方が、鋳型が長い場合（２ｋｂ、４ｄｂ）より高かったことである（図２Ｆ）。このため、本発明者らは、ＮＨＥＪ阻害剤を伴わない長い鋳型は、ＮＨＥＪ阻害剤と併用した短い鋳型と似たようなＨＤＲ頻度を示すのではないかと考えた。直接の比較によって、バニリンを使用しない２ｋｂおよび４ｋｂの鋳型は、バニリンの存在下での１６０ｂｐおよび１ｋｂの鋳型よりも、ずっと高いＨＤＲ頻度が得られることが示された（図２Ｇ）。したがって、臨床用途では、長いｄｓＤＮＡは、望ましくない副作用を持ち得るＮＨＥＪ阻害剤に代わる、有効な代替策と成り得る。
最後に、本発明者らは、変異に対する切断部位がＨＤＲの効率にどのような効果をもたらすのかを調べた（図２Ｈ）。このため、本発明者らは、変異部位に直接結合するｓｇＲＮＡ ＣＤ９０．２を、変異から５０ｂｐ離れて結合する第２のｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ ＣＤ９０．２－Ａ）と比較した（図５Ｇ）。どちらのｓｇＲＮＡも、細胞の大多数において、ＣＤ９０．２の欠失を伴うＤＳＢを効率的に誘導した（図２Ｈ）。従来の研究（Paquet et al., Nature 533, 125-129, 2016）と一致して、短い（１６０ｂｐおよび１ｋｂ）鋳型を用いた場合には、離れたｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ ＣＤ９０．２－Ａ）を用いると、ＨＤＲ修復は完全にだめになった（図２Ｇ）。一方、長い鋳型（２ｋｂ、４ｋｂ）はＨＤＲを部分的に回復させた。このように、ＩＳＡは、ＨＤＲの効率を定量化するための、簡単で、迅速で、費用効果のよいシステムである。長いｄｓＤＮＡ鋳型は、ＨＤＲの効率を増加させ、ＮＨＥＪ阻害剤に対する要求を減らし、切断位置から変異位置までの制限を克服するために考慮するに値する。
〔代理細胞表面マーカーのアイソフォーム切替えのモニタリングによる、ＨＤＲ編集済み細胞の濃縮〕
ＣＤ９０ ＩＳＡを用いて発見された最適化条件がより一般的に適用可能かテストするために、本発明者らは、多数のＣＤ４５スプライスフォームが発現する遺伝子であるＰｔｐｒｃに目を向けた。２つのアイソフォームＣＤ４５．１およびＣＤ４５．２は、２種類のｍＡｂで区別することができる。しかし、ＣＤ９０．１およびＣＤ９０．２と対照的に、ｍＡｂ抗ＣＤ４５．１（クローンＡ２０）およびｍＡｂ抗ＣＤ４５．２（クローン１０４）によって認識される正確なエピトープは知られていない。ＣＤ４５．１およびＣＤ４５．２の細胞外ドメインは６ｎｔ異なるが、どのエピトープがアレルの違いとして認識されるかは知られていない。１つのｎｔ置換はサイレントだが、他の５つはａａ配列を変化させる（図３Ａ）。そこで本発明者らは、上記５つのｎｔ置換候補を、初代Ｔ細胞中で直接、個別にまたは組み合わせて編集することで、上記２つの既知のｍＡｂによって認識されるエピトープを細かくマッピングすることができると仮説を立てた。本発明者らは、上記５つのｎｔ候補を、ＣＤ４５．１配列の一部をコードする３つのｓｓＤＮＡ鋳型（配列番号０３３、配列番号０３５、配列番号０３７）によってカバーされる３つのゲノム領域に分類した。そして、ＳＮＰにできるだけ近く結合している３つのｓｇＲＮＡ（配列番号００３、配列番号００４、配列番号００５）を設計した（図３Ａ）。Ｔ細胞ＨＤＲプロトコルを用いて、本発明者らは、３つのｓｇＲＮＡすべてが効率的な切断に至ることを発見した（図３Ｂ）。いくつかの細胞において、領域Ｒ１内で一つのｎｔを交換することで、ｍＡｂ ＣＤ４５．１を結合させることができ、ｍＡｂ ＣＤ４５．２の結合を阻害することができた。それと対照的に、Ｒ２およびＲ３を編集しても、抗ＣＤ４５．１の結合は生じなかった（図３Ｂ）。より長い修復鋳型を用いると、ＨＤＲ効率は増大し、この結果が追認された（図３Ｃ）。４つの精製集団すべてのサンガーシーケンシングにより、正確な編集が確認された（図６）。このように、Lys277Glu置換は、ＣＤ４５．１エピトープとｍＡｂ ＣＤ４５．１クローンＡ２０との反応性を説明するのに、必要かつ十分である。これらの結果は、初代細胞における（すなわち内在性抗原の天然の姿における）エピトープマッピングの実現可能性を実証する。
次に、本発明者らは、ＣＤ９０ ＩＳＡおよびＣＤ４５ ＩＳＡを結合して、一つの細胞における多重ＨＤＲを定量できるかどうかを考えた。このため、本発明者らは、ＣＤ９０．２およびＣＤ４５．２を標的とするｓｇＲＮＡをコードするプラスミドを、ＣＤ９０．１およびＣＤ４５．１の修復鋳型とともにエレクトロポレーションした。これらの条件下での切断効率は、プラスミドの数がより少ない場合に比べて多少低かったが、ＣＤ９０およびＣＤ４５の個々のアレルに対するＨＤＲは非常に効率的であった。それから、本発明者らは、同じ細胞中の２つのＨＤＲイベントが互いに独立しているのか、それとも結びついているのかを調べようとした。本発明者らは、ＣＤ９０．１－のままであった細胞に比べて、ＣＤ９０．２からＣＤ９０．１へ切替わった細胞においては、ＣＤ４５．２からＣＤ４５．１へ切替わっている細胞が、２倍存在することを見出した（図３Ｄ）。重要なのは、ＣＤ９０．２＋／ＣＤ９０．１＋ヘテロ接合型細胞の三分の一は、ＣＤ４５．２＋／ＣＤ４５．１＋についてもヘテロ接合型であったことである（図３Ｅ）。同様に、ホモ接合型ＣＤ４５．１＋細胞のもっとも高い相対頻度は、ＣＤ９０．１＋についてホモ接合型である細胞の中に見出された（図３Ｅ）。このように、１つの遺伝子座におけるアイソフォーム切替えは、他の遺伝子座におけるアイソフォーム切替えと結びついている。予期せぬことに、この結びつきは、ＨＤＲの接合子の構造に対して定量的である。すなわち、一アレル性ＨＤＲを経た細胞は、第２の遺伝子座においても一アレル性ＨＤＲを経る可能性が高く、二アレル性ＨＤＲを経た細胞は、第２の遺伝子座を修復するのに二アレル性ＨＤＲを経る可能性が高い。したがって、本発明者らは、代理マーカーのＨＤＲ遺伝子編集イベントを評価することによって、マーカーの利用ができない所定の第２遺伝子座でのＨＤＲ遺伝子編集の接合子の構造を、濃縮および／または選択できるのではないかと提案する。
〔Scurfy細胞の遺伝子修正〕
最後に、本発明者らは、新たに開発されたＴ細胞編集プロトコルを適用して、一遺伝子疾患を修正しようと試みた。ヒトの多腺性内分泌不全症、腸疾患を伴う伴性劣性免疫調節異常（ＩＰＥＸ）症候群を引き起こす原型的な変異は、Ｔ調節細胞（Ｔｒｅｇ）の機能および免疫調節の維持に重要な転写因子をコードする、Ｆｏｘｐ３遺伝子の変異である（Josefowicz, et al., Annual review of immunology 30, 531-564, 2012）。マウスのＦｏｘｐ３の変異は、scurfyと名付けられた、非常によく似た症候群に至る（Ramsdell et al.,Nature reviews. Immunology 14, 343-349, 2014）。Ｆｏｘｐ３のエキソン８に２ｂｐを挿入することで、scurfy表現型に至るフレームシフトが生じる。発症したマウスは、免疫寛容の完全な機能停止により、免疫システムの活動の制御不能、組織浸潤、および多臓器の免疫媒介性破壊に至り、それによって引き起こされた多臓器不全により、出生後数週間以内に死亡する。遺伝的にマーキングされたＦｏｘｐ３遺伝子座を有するＦｏｘｐ３欠失マウスは、「Ｔｒｅｇになろうとする」細胞を含む。このことは、scurfyマウスの中に、Ｆｏｘｐ３遺伝子座を積極的に転写してＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇになるよう定められている細胞は存在しはするが、Ｆｏｘｐ３がないために、そうした細胞はＴｒｅｇであると識別され得ず、抑制機能を失っていることを示す。このため、発明者らは、scurfyＴ細胞の遺伝子修正により、Ｆｏｘｐ３タンパク質の発現が回復されるはずだと仮説を立てた。
仮説を検証するため、本発明者らは、scurfyマウスに由来するＴ細胞と、周知のヒトＩＰＥＸ疾患を引き起こすＦｏｘｐ３変異を再現するＦｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘ変異（「Ｆｏｘｐ３ ＫＯ」）（Ramsdell, Nature reviews. Immunology 14, 343-349, 2014）を有する遺伝子標的マウスに由来するＴ細胞を用いた。したがって、この変異を修復することは、臨床的に関連がある。どちらの変異も、Ｆｏｘｐ３タンパク質の発現を停止させる。本発明者らは、ＨＤＲベースの遺伝子修復アプローチを、罹患マウス由来のＴ細胞に適応させた。そして、Ｆｏｘｐ３誘導シグナルＴＧＦ単独、またはレチノイン酸（ＲＡ）とＴＧＦの組合せを提供することによって、遺伝子を修正したＦｏｘｐ３ノックアウト細胞のin vitroでのＴｒｅｇの分化能を調べた（Chen et al., TheJournal of Experimental Medicine 198, 1875-1886, 2003）（図４Ｂ）。ＴＧＦ単独による遺伝子修復および刺激の後では、野生型Ｔ細胞の１０％がＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋になった。一方、ｓｇＲＮＡＦｏｘｐ３Ｋ２７６ＸのみをトランスフェクションしたＦｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘ ＣＤ４＋Ｔ細胞では、Ｆｏｘｐ３＋細胞は検出されなかった。それと対照的に、Ｆｏｘｐ３野生型修復鋳型は、細胞のうち３．５％においてＦｏｘｐ３の発現を回復させた（図４Ｃ、上側パネル）。エレクトロポレーションされたＴ細胞をＴＧＦおよびＲＡに曝露させると、野生型Ｔ細胞では８０．２％がＦｏｘｐ３を発現させた。しかし、ＨＤＲ修復鋳型のないＦｏｘｐ３Ｋ２７６ＸＣＤ４＋Ｔ細胞ではＦｏｘｐ３の発現は検出できず、野生型Ｆｏｘｐ３ＨＤＲ鋳型で修復されたＦｏｘｐ３Ｋ２７６ＸＣＤ４＋Ｔ細胞では２２．１％のＦｏｘｐ３＋Ｔ細胞が検出された（図４ｃ、下部パネル）。Scurfy細胞を用いても、類似の結果が得られた（データは図示せず）。最後に、本発明者らは、多重ＨＤＲを用いて、正確に修復された細胞を濃縮しようとした（図３Ｄに図示した通り）。本発明者らはＣＤ４５を代理の細胞表面マーカーとして用いて、アイソフォーム切替えをモニタリングした。実際、ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞は、ＣＤ４５．１－細胞よりもＣＤ４５．１＋細胞において実質的に濃縮されていた（図４Ｄ）。要するに、本発明者らは、初代Ｔ細胞でＦｏｘｐ３を修復する条件を確立し、遺伝子修正細胞の濃縮に多重ＨＤＲを適用し得ることを実証した。
〔方法〕
［マウス初代ＣＤ４＋Ｔ細胞における遺伝子編集］
C57BL6NまたはBalb/cマウスの脾臓（ＳＰ）およびリンパ節（ＬＮ）から、EasySepTM Mouse Naive CD4+ T Cell Isolation Kit（STEMCELL Technologies Inc）を用いて、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を精製した（純度：９６％超）。ＲＰＭＩ（Sigma）に、１０％熱不活性化ＦＣＳ（Atlanta biologicals）、２ｍＭGlutamax（Gibco）、５０μＭ －メルカプトエタノール（Gibco）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Sigma）、および非必須アミノ酸（Gibco）を添加して、完全ＲＰＭＩ培地（ＣＭ ＲＰＭＩ）を作製した。Ｔ細胞活性化のため、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の抗ＣＤ３（ハイブリドーマクローン２Ｃ１１、１μｇ／ｍＬ）および抗ＣＤ２８（ハイブリドーマクローンＰＶ－１、０．５μｇ／ｍＬ、ともにBioXcell）でコーティングした２４ウェルプレート（Corning）中に、２×１０６個のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を播種した。培養条件は、５０ＩＵ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン－２（ｒｈＩＬ－２）（RD systems）と、プレート結合モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の抗ＣＤ３（ハイブリドーマクローン２Ｃ１１、１μｇ／ｍＬ）、および抗ＣＤ２８（ハイブリドーマクローンＰＶ－１、０．５μｇ／ｍＬ）（BioXcell）との存在下にて、２４時間、３７℃、５％ＣＯ２とした。２４時間後、Ｔ細胞を収穫し、ＰＢＳで洗浄した。活性化させた２×１０６個のＴ細胞を、Invitrogen Neon（登録商標）Transfection Systemを用いて、以下の条件にてエレクトロポレーションした。電圧（１５５０Ｖ）、幅（１０ｍＳ）、パルス（３）（Invitrogen）、１００μＬチップ、バッファＲ（すべてのエレクトロポレーションでバッファＲを用いた）。６．５μｇの空のプラスミドpx458（Addgene plasmid number 48138）、または、図の説明文および補表１に記載したプラスミド（Addgene plasmid numbers 82670-82677）で、細胞をトランスフェクションさせた。ＨＤＲのため、細胞を、１２μｇ（または１２００ｎｇ、６００ｎｇ、２５０ｎｇ）のＨＤＲ鋳型（プラスミドの場合：補表３、Addgene 82661-82669）または１０μＬの１０μＭストックｓｓＤＮＡ鋳型（ＩＤＴ）でコトランスフェクションさせた。エレクトロポレーション後、２４ウェルプレート中に細胞を播種した。培養条件は、６５０μＬのＣＭ ＲＰＭＩに５０ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を加え、最初の活性化に用いた濃度の半分のプレート結合ｍＡｂｓ（すなわち抗ＣＤ３（０．５μｇ／ｍＬ）および抗ＣＤ２８（０．２５μｇ／ｍＬ））の存在下とした。細胞を、６．５μｇの空のプラスミドpx458（Addgene plasmid number 48138）またはｄｓＤＮＡ修復鋳型を含むプラスミドで、トランスフェクションさせた。ＨＤＲのため、細胞を、１２μｇ（または１２００ｎｇ、６００ｎｇ、２５０ｎｇ）のＨＤＲ鋳型（プラスミドの場合）または１０μＬの１０μＭストックｓｓＤＮＡ鋳型（ＩＤＴ）でコトランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後に、FACSAria Cell Sorterを用いて、ＧＦＰ＋細胞およびＧＦＰ－細胞を９８％超の純度まで選別した（BD Biosciences）。選別の直後、９６ウェルの平底プレート中に細胞を播種した。培養条件は、抗体の活性化はなく、２５０μＬのＣＭ ＲＰＭＩに５０ＵのｒｈＩＬ－２／ｍＬを添加した。それに引き続く２４時間、ＨＤＲ実験のために、ＮＨＥＪ阻害剤またはＨＤＲ促進剤の存在下にて選別した細胞を培養し、ＨＤＲを増やした（図の説明文に記載の通り）。ＧＦＰによる選別後４日目に、プレート結合抗ＣＤ３（０．５μｇ／ｍＬ）および抗ＣＤ２８（０．２５μｇ／ｍＬ）を用いて細胞を再活性化させ、その後９日間、実験の終了まで培地中で増殖させた。
［ＥＬ－４細胞における遺伝子編集］
ＥＬ－４細胞をATCC（ATCCTIB-39TM）から購入し、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（Atlantabiologicals）、２ｍＭ Glutamax（Gibco）、および５０μＭ β-メルカプトエタノール（Gibco）を添加したＲＰＭＩ（Sigma）中で増殖させた。ＦＡＣＳ分析により、ＥＬ－４細胞によるホモ接合のＣＤ９０．２およびＣＤ４５．２発現は、初代Ｔ細胞のそれと同等であることが確かめられた。２×１０６個のＥＬ－４細胞を、以下の条件にて、Invitrogen Neon（登録商標）Transfection Systemを用いてエレクトロポレーションした。電圧（１０８０Ｖ）、幅（５０ｍｓ）、パルス数（１）、１００μＬチップ（Invitrogen）。エレクトロポレーション後、６５０μＬＣＭ ＲＰＭＩを入れた２４ウェルプレート中に細胞を播種した。プラスミドの量およびＨＤＲ鋳型の濃度は、上述した初代Ｔ細胞のものと同じであった。トランスフェクションから２４時間後に、FACSAria Cell Sorterを用いて、ＧＦＰ＋細胞およびＧＦＰ－細胞を９８％超の純度まで選別した（BD Biosciences）。選別の直後、９６ウェルの平底プレート中に細胞を播種した。それに引き続く２４時間、ＨＤＲ実験のために、ＮＨＥＪ阻害剤またはＨＤＲ促進剤の存在下にて選別した細胞を培養し、ＨＤＲを増やした。それに続く９日間、細胞を培地中で増殖させた。
［Ｆｏｘｐ３修復プロトコル］
Ｆｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘ C57BL/6マウス由来のＴ細胞の大部分は表現型としては高く活性化されているが、エレクトロポレーションのためにＴ細胞をin vitroで再活性化する必要があった。in vitroにおける再活性化がない場合は、エレクトロポレーション後、ＧＦＰ発現Ｔ細胞が得られなかった（データは図示せず）。健康なマウス由来の初代Ｔ細胞をエレクトロポレーションするのに用いたプロトコルを、ＴＣＲ刺激を減らすことによって調整し、細胞の生存率とトランスフェクション率とのバランスを取った。さらに、全てのＣＤ４＋Ｔ細胞を出発集団として用いた。これは、ナイーブＴ細胞が少ないためである（データは図示せず）。すべてのＣＤ４＋Ｔ細胞を、プールしたＳＰおよびＬＮ由来のＦｏｘｐ３Ｋ２７６Ｘ（C57BL/6）またはＢ６．Ｃｇ－Ｆｏｘｐ３ｓｆ／Ｊ（C57BL/6;データは図示せず）から、EasySepTM CD4+ T Cell Isolation Kit（STEMCELL Technologies Inc）を用いて精製した（純度９６％超）。Ｔ細胞の活性化のために、２×１０６個のＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３（クローン２Ｃ１１；０．５μｇ／ｍＬ）および抗ＣＤ２８（クローンＰＶ－１；０．２５μｇ／ｍＬ）（BioXcell）でコートした２４ウェルプレート中に播種した。培養条件は、２４時間、３７℃、５％ＣＯ２にて、５０ＩＵ／ｍＬ ｒｈＩＬ－２（RD systems）を添加した。２４時間後、Ｔ細胞を収穫し、ＰＢＳで洗浄した。２×１０６個の活性化Ｔ細胞を、以下の条件にて、Invitrogen Neon（登録商標）Transfection Systemを用いてエレクトロポレーションした。電圧：１５５０Ｖ、幅：１０ｍｓ、パルス数：３（Invitrogen）。６．５μｇのプラスミド（p240_LTJ_sgRNAFoxp3K276Xおよびp236_LTJ_sgRNAFoxp3sf/J; Addgene numbers 82675, 82676）および１２μｇのｄｓＤＮＡ野生型Ｆｏｘｐ３修復鋳型（Addgene 82664）で、細胞をトランスフェクションさせた。エレクトロポレーション後、２４ウェルプレート中に細胞を播種した。培養条件は、６５０μＬのＣＭ ＲＰＭＩに５０ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を加え、最初の活性化に用いた濃度の半分のプレート結合ｍＡｂｓ（すなわち抗ＣＤ３（０．２５μｇ／ｍＬ）および抗ＣＤ２８（０．１２μｇ／ｍＬ））の存在下とした。トランスフェクションから２４時間後に、FACSAria Cell Sorterを用いて、ＧＦＰ＋細胞およびＧＦＰ－細胞を９８％超の純度まで選別した（BD Biosciences）。選別の直後、精製した細胞を、プレート結合抗ＣＤ３（０．５μｇ／ｍＬ）および抗ＣＤ２８（０．２５μｇ／ｍＬ）で再活性化させた。そして実験の終了まで、ｒｈＩＬ－２（２５０ＩＵ／ｍＬ）、ＴＧＦ（５ｎｇ／ｍＬ、RD Systems）、抗ＩＦＮγ（１０ｍｇ／ｍＬ、BioXcell）、抗ＩＬ－４（１０ｍｇ／ｍＬ、BioXcell）、およびレチノイン酸（１０ｍＭ、Sigma）の存在下にて増殖させた（図の説明文に記載の通り）。
［マウス］
C57BL/6N(Charles River stock No: 027)は、Charles River laboratoryから購入した。Balb/c(Jackson laboratory Stock No: 000651)マウスは、WernerKrenger (Basel University Hospital)からご恵贈いただいた。Foxp3K276XC57BL/6(Jackson laboratory Stock No: 019933)マウスは、EdPalmer (Basel University Hospital)からご恵贈いただいた。B6.Cg-Foxp3sf/Jマウスは、Jackson laboratory から購入した（Stock No: 004088）。B6.129S7-Rag1tm1Mom/J (Jackson laboratory Stock No: 002216)は、Swiss Immunological Mouse Repository (SwImMR)から得た。動物に対する操作は全て、スイス連邦法およびスイス州法に従って行われた。The Animal Research Commission of the Canton of Basel-Stadt,Switzerlandが、動物研究のプロトコルを承認した。
［フローサイトメトリーおよび抗体］
細胞を染色した後、BD Fortessa（BD Biosciences）で捕捉し、FlowJo software（Tree Star）を用いて分析した。以下の蛍光色素共役ｍＡｂｓを用いて、表面の表現型に応じて染色した：抗ＣＤ９０．２（クローン５３－２．１）、抗ＣＤ９０．１（クローンＯＸ７）、抗ＣＤ４５．２（クローン１０４）、抗ＣＤ４５．１（クローンＡ２０、以上すべてeBioscience）、抗ＣＤ４（クローンＲＭ４－５）、抗ＣＤ２５（クローンＰＣ６１、いずれもBiolegend）。製造者のプロトコルに従って細胞内染色を行い、これによってＦｏｘｐ３（クローンＦＪＫ－１６ｓ）（eBioscience）の発現を判定した。表面抗体の染色の前に、細胞をZombie UVdye（Biolegend）を用いて染色し、生死を判別した。
［ｓｇＲＮＡの設計］
本稿において用いたすべてのｓｇＲＮＡ、プライマー、およびＨＤＲ鋳型のＤＮＡ配列を、５’から３’の方向で捕捉情報に示す。ｓｇＲＮＡは、CRISPRtool（http://crispr.mit.edu）およびsgRNA Scorer 1.0sg（https://crispr.med.harvard.edu）を用いて設計した。ｓｇＲＮＡ配列を、それぞれのスコアとともに補表１に示す。ＣＤ４５エピトープマッピングの場合、候補領域につき２つのｓｇＲＮＡを設計した。所定のＳＮＰに最も近いｓｇＲＮＡで得られた結果を主図に示す。しかし、テストした６つのｓｇＲＮＡはすべて効率的に切断し、どちらのｓｇＲＮＡでも領域Ｒ１のエピトープを切り替えた（データは不図示）。切断位置から変異位置までの距離の違いは、影響を与えなかった。
［ｓｇＲＮＡのpx458プラスミドへのクローニング］
pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)は、Feng Zhangからご恵贈いただいた（Addgene plasmid # 48138）。px458へのクローニングは、［Schumann et al., PNAS 11210437-10442 (2015)］を改変した。px458プラスミドを、BbsIで、１．５時間、３７℃で消化した。続いて、２０分間、６５℃で熱不活性化した。製造者（Macherey-Nagel）の推奨に従ってNucleospin gel and PCRclean-up purification kitを用い、消化したプラスミドをゲル精製した。各ｓｇＲＮＡの順オリゴヌクレオチドおよび逆オリゴヌクレオチド（オリゴ）を、Ｈ２Ｏで１００μＭに稀釈した。オリゴをリン酸化およびアニールするために、２μＬの各オリゴをＴ４ライゲーションバッファおよびＴ４ ＰＮＫと混合し、最終的に２０μＬの量とした。そして、３０分間、３７℃でインキュベートし（リン酸化）、続いて５分間、９５℃でインキュベートし、その後、温度を２０℃まで１℃／分の速度で下降させた（アニーリング）。アニール・リン酸化したオリゴを、Ｈ２Ｏで１：２００に稀釈した。各ｓｇＲＮＡのライゲーション反応は、消化・精製したpx458プラスミド１００ｎｇと、リン酸化・アニールしたオリゴ稀釈液２μＬ、Ｔ４ライゲーションバッファ、およびＴ４リガーゼとを、最終量が２０μＬとなるように混合して行った。ライゲーションは１時間、２２℃で行った。細菌の形質転換は、５μＬのライゲーション反応液を、５０μＬの氷冷した化学的にコンピテントなＪＭ１０９細菌と混合して行った。混合物を３０分間氷上でインキュベートし、続いて、４２℃で３０秒間熱ショックを加え、続いて２分間氷上でインキュベートした。それから、２００μＬのＳＯＣ培地（Sigma）を添加し、１時間、３７℃で細菌を増殖させた。すべての形質転換反応を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢプレート上に播種した。上記プレートを、一晩、３７℃でインキュベートした。ＰＣＲコロニースクリーニングの後シーケンシングして、ｓｇＲＮＡが正しく挿入されたかどうかについてコロニーを調べた。プラスミドはAddgene.org（Addgene plasmid numbers 82670-82677）から入手可能である。
［Addgeneプラスミドpx458へのクローニングのためのＰＣＲコロニーのスクリーニング］
各プレートから２つのコロニー由来の細菌をピペットチップで採取し、ＰＣＲチューブ中で、Ｈ２Ｏ、REDTaq（登録商標）ReadyMixTM PCRReaction Mix（Sigma）、および特定のプライマー（順プライマーGAGGGCCTATTTCCCATGATTCC、配列番号０２８；逆プライマーTCTTCTCGAAGACCCGGTG、配列番号０２９）と混合した。アニーリング温度６４．９℃、３５サイクルで、ＰＣＲを行った。陽性のコロニー（ｓｇＲＮＡが挿入）はＰＣＲアンプリコンを示さないが、陰性のコロニーは２６４ｂｐのアンプリコンを示す。
［プラスミドのシーケンシング］
各ＬＢプレートから２つのコロニーをピペットチップで採取し、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加した５ｍＬのＬＢ培地に播種した。培養物は一晩、３７℃で増殖させた。製造者の推奨に従い、GenElute Plasmid Miniprep kit（Sigma）で培養物由来のプラスミドＤＮＡを単離した。ｓｇＲＮＡの正しい挿入を、Ｕ６－順プライマー（ACTATCATATGCTTACCGTAAC、配列番号００４３）を用いてプラスミドＤＮＡをシーケンシングして確かめた。
［ＨＤＲ修復鋳型］
ＤＮＡ修復鋳型を、ｓｇＲＮＡの結合部位に隣接する相同ゲノムＤＮＡ配列として設計した。断りのない限り、可能な限りｓｇＲＮＡの中心に修復鋳型を配置し、それにより対称的な相同性アームとした。断りのない限り、サイレント変異（すなわち、アミノ酸配列を変えない変異）をＰＡＭ配列内に導入した。短いｓｓＤＮＡ鋳型は、ＩＤＴから購入した。凍結乾燥したｓｓＤＮＡオリゴを、ｄｄＨ２Ｏ中で１０μＭに戻した。具体的な配列については、補表２を参照。ＣＤ９０．１、ＣＤ４５．１、およびＦｏｘｐ３用のｄｓＤＮＡ鋳型（１６０ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂおよび／または４ｋｂ）を、Genscriptから、pUC57にクローニングした合成ＤＮＡとして購入した（具体的な配列については、補表３を参照）。実験に用いる前に、Maxi preps（Sigma）で各プラスミドを下処理した。すべてのＨＤＲ実験において、環状ＨＤＲ鋳型プラスミドを用いた。その方が、線状プラスミドを用いるより良い結果が得られたためである（データは不図示）。ＨＤＲ鋳型を含むプラスミドは、Addgene.org（Addgene plasmid numbers82661-82669）から入手可能である。
［小分子］
ＨＤＲを向上させるため、以下のＮＨＥＪ阻害剤を用いた。バニリン（Durant,Nucl Acid Res, 2003）：Ｈ２Ｏで戻し、最終濃度３００μＭ（Sigmacat#V1104）。ＳＣＲ７－Ｘ：ＤＭＳＯ中、最終濃度１μＭ（Xcess Biosciencescat#M60082）。ＳＣＲ７－ＸはXcess Biosciencesから購入したので、この化合物を、最近提案されている通り「ＳＣＲ７－Ｘ」と称することにする（Greco et al., DNA Repair 2016）。ルカパリブ／ＡＧ－０１４６９９／ＰＦ－０１３６７３３８：ＤＭＳＯ中、最終濃度１μＭ（Selleckchem cat#S1098）。ベリパリブ／ＡＢＴ－８８８：ＤＭＳＯ中、最終濃度５μＭ（Selleckchem cat#S1004）。ＲＳ－１（Song et al., NatComm 2016）：ＤＭＳＯ中、最終濃度７．５μＭ（MerckMillipore cat# 553510）。ＲＳ－１：ＤＭＳＯ中、最終濃度７．５μＭ（Sigma cat#R9782）；ルミネスピブ／ＡＵＹ－９２２／ＮＶＰ－ＡＵＹ９２２、ＤＭＳＯ中、最終濃度１μＭ（Selleckchem cat#S1069）。Ｌ－７５５，５０７：ＤＭＳＯ中、最終濃度５μＭ（Tocris cat#2197）。バニリン誘導体（Durant, Nucl AcidRes, 2003）：６－ニトロベラトルアルデヒド：ＤＭＳＯ中、最終濃度３μＭ（Maybridgecat#11427047）。４，５－ジメトキシ－３－ヨードベンズアルデヒド：ＤＭＳＯ中、最終濃度３μＭ（Maybridgecat#11328426）。６－ブロモベラトルアルデヒド：ＤＭＳＯ中、最終濃度３μＭ（Maybridgecat#11480124）。
［ゲノムＤＮＡのシーケンシング］
別々に選別された細胞集団（例えば、ＣＤ４５．２＋／ＣＤ４５．１－、ＣＤ４５．２＋／ＣＤ４５．１＋、ＣＤ４５．２－／ＣＤ４５．１＋、およびＣＤ４５．２－／ＣＤ４５．１－）由来のゲノムＤＮＡを、当該細胞を抽出バッファ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）、５ｍＭ Ｎａ－ＥＤＴＡ、０．２％ ＳＤＳ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、および１００μｇ／ｍＬ プロテイナーゼＫ；すべてSigma）で、１時間、５６℃でインキュベートして抽出した。プロテイナーゼＫを、９５℃で１５分間、熱不活性化した。その後、サンプルを同体積のイソプロパノールと混合し、ＤＮＡの沈降を促進するために何回か転倒させた。２分間の遠心分離の後、上澄みを取り除き、ペレットを７０％エタノールで洗浄した。遠心分離によりＤＮＡをペレット状にし、空気乾燥させ、milliQ水に再懸濁し、NanoDrop device（Witec）で濃度を測定した。BamHI（順：TAAGCAGGATCCATTCCTTAGGACCACCACCTG、配列番号０４４）およびSalI（逆：TGCTTAGTCGACACACCGCGATATAAGATTTCTGC、配列番号０４５）突出部を含むＰＣＲプライマーを購入（Microsynth）して、ＨＤＲ実験用の２ｋｂの領域を増幅した。この領域では、ｓｇＲＮＡの位置はＰＣＲ産物の中心にある。種々のゲノムＤＮＡサンプル（２～６ｎｇ）のＰＣＲには、Phusion polymerase（Thermo Scientific）を用いた。２ｋｂのフラグメントに対して用いられた最適なアニーリング温度は、６８．１℃であった。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルにロードし、製造者（Macherey-Nagel）の推奨に従ってNucleospin gel and PCRclean-up purification kitを用いて、バンドを精製した。精製したＰＣＲ産物（１６０ｎｇ）を、BamHIバッファを用いて、１．５時間、３７℃で、BamHIおよびSalIで消化した。消化したＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルにロードし、製造者の推奨に従ってNucleospin gel and PCR clean-up purification kitを用いて、バンドを精製した。消化・精製した２ｋｂのＰＣＲアンプリコン９０ｎｇを、１時間、２２℃で、５０ｎｇまたは１００ｎｇのpGEM3Zプラスミドにライゲーションした。当該pGEM3Zプラスミドは、それぞれBamHI/SalIで消化し精製しておいたものである（Promega）。１０μＬのライゲーション反応物を５０μＬの氷冷した化学的にコンピテントなＪＭ１０９細菌（Promegaから購入、またはRbClプロトコルhttp://openwetware.org/wiki/RbCl_competent_cellによって作製）と混合して、形質転換させた。混合物を３０分間氷上でインキュベートし、続いて４２℃で３０秒間熱ショックを加え、続いて２分間氷上でインキュベートした。それから、２００μＬのＳＯＣ培地（Sigma）を添加し、１時間、３７℃で細菌を増殖させた。すべての形質転換反応物を、５０μｇ／ｍＬ アンピシリン、０．１ｍＭ ＩＰＴＧ（Promega）、および３５μｇ／ｍＬ ｘ－Ｇａｌ（Promega）を含むＬＢプレート上に播種した。上記プレートを、一晩、３７℃でインキュベートした。各プレートから、ピペットチップを用いて１２個のコロニーを採取し、５０μｇ／ｍＬ アンピシリンを添加したＬＢ培地（５ｍＬ）に播種した。培養物を一晩、３７℃で増殖させた。培養物由来のプラスミドＤＮＡを、製造者の推奨に従いGenElute Plasmid Miniprep kit（Sigma）によって単離した。上記２ｋｂのフラグメントに対して、Ｔ７、ＳＰ６、およびインターナルプライマー（GAGAAAGCAACCTCCGGTGT、配列番号００４６）を用いたシーケンシングにＤＮＡを供した。Lasergene（DNASTAR Inc.）を用いて配列を分析した。
［ヒトＴ細胞の単離および抗体］
ヒト初代Ｔ細胞を、健康なドナーの軟膜（Blutspendezentrum,Basel）から、LymphoprepTM（Stemcell Technologies）密度勾配を用いて単離した。製造者のプロトコルに従ってEasysep Human naive CD4+ T-cell enrichment kit（Stemcell Technologies）を用いて、ナイーブなＣＤ４＋Ｔ細胞を事前に濃縮した。あるいは、ナイーブＴ細胞の単離工程を経ずに、臍帯血をＰＢＭＣの源として用いた（ナイーブなＴ細胞が高頻度で現れることを考慮して）。純度を測るため、ナイーブなＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮前のサンプルおよび濃縮後のサンプルを、以下の抗体で染色した。αＣＤ４－ＦＩＴＣ（ＯＫＴ－４）、αＣＤ２５－ＡＰＣ（ＢＣ９６）、αＣＤ４５ＲＡ－ＢＶ７１１（ＨＩ１００）、αＣＤ４５ＲＯ－ＢＶ４５０（ＵＣＨＬ１）、αＣＤ６２Ｌ－ＢＶ６０５（ＤＲＥＧ－５６）、αＣＤ３－ＰｅｒＣＰ（ＨＩＴ３ａ）、およびZombie-UV生体染色（いずれもBiolegendで購入したもの）。
要約すると、５０ｍＬの軟膜１つに対して、フィルタを有する５０ｍＬ Falconチューブを２本用意し、各チューブに１６ｍＬのLympoprepを入れ、３００ｇで１分間遠心分離する。５０ｍＬフィルタチューブの両方に等量の血液を分注し、ＰＢＳをつぎ足して５０ｍＬにする。２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する（加速時間：４、減速時間：１）。血清のうちいくらかを取り除いて捨てる。白色の軟膜を、新しい５０ｍＬ Falconチューブに注意深く注入する。殺菌したＰＢＳを濃縮したＰＢＭＣ分画に添加して約５０ｍＬにし、３００ｇで５分間遠心分離する。上澄みを捨てて、ペレットを１０ｍＬのＰＢＳで再懸濁し、つぎ足して５０ｍＬにし、３００ｇで５分間遠心分離する。必要ならば、精製工程の前に、赤血球溶解バッファで赤血球を溶解させる。
［ヒトＴ細胞のトランスフェクションのプロトコル］
血液または臍帯血由来のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞または全ＰＢＭＣを、トランスフェクションに用いた。Ｔ細胞を活性化させるために、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ａ－ＣＤ３（ハイブリドーマクローンＯＫＴ３、５μｇ／ｍＬ（高）、２．５μｇ／ｍＬ（中）、１μｇ／ｍＬ（低））およびａ－ＣＤ２８（ハイブリドーマクローンＣＤ２８、２．５μｇ／ｍＬ（高）、１μｇ／ｍＬ（中）、０．５μｇ／ｍＬ（低）、いずれもBiolegend）でコートした２４ウェルプレート（Corning）中に、２×１０６個の細胞を播種した。培養条件は、５０ＩＵ／ｍＬ 組み換えヒトインターロイキン－２（ｒｈＩＬ－２）（RD systems）の存在下にて、２４時間、３７℃、５％のＣＯ２とした。２４時間後、Ｔ細胞を収穫し、ＰＢＳで洗浄した。２×１０６個の活性化Ｔ細胞を、Amaxa Transfection System, T-020 program（プラスミド用）で、あるいはNeon（登録商標）Transfection System（ThermoFisher）を以下の条件で用いて、エレクトロポレーションした：電圧（１６００Ｖ）、幅（１０ｍｓ）、パルス（３）、１００μＬチップ、バッファＲ（ＲＮＰ用）。６．５μｇの空のプラスミドpx458（Addgene plasmid number: 48138）、またはcrRNA:tracerRNA-Atto 550（IDT）およびＣａｓ９（Berkeley）複合体で、細胞をトランスフェクションさせた。エレクトロポレーション後、２４ウェルプレート中に細胞を播種した。培養条件は、６５０μＬの完全培地に５０ＩＵ／ｍＬ ｒｈＩＬ－２を加え、最初の活性化に用いた濃度の半分のプレート結合ｍＡｂｓ（すなわち抗ＣＤ３（２．５μｇ／ｍＬ、１．２５μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ）および抗ＣＤ２８（１．２５μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬ））の存在下とした。ＧＦＰ＋細胞またはＡｔｔｏ５５０＋細胞の発現は、２４時間後、Fortessa analyzer（BD Biosciences）を用いて評価した。
［Ｃａｓ９ ＲＮＰアセンブリ］
Ａｌｔ－Ｒ ＣＲＩＳＰＲ ｃｒＲＮＡおよびＡｔｔｏ５５０標識化ｔｒａｃｒＲＮＡ（どちらもIDT）ならびにＣａｓ９ヌクレアーゼ（Berkeley）を含むＣａｓ９リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）を、Neon（登録商標）Transfection System（ThermoFisher）を用いて、マウス／ヒト初代Ｔ細胞またはＥＬ４細胞に送達した。送達は、IDTの提供するプロトコル（https://eu.idtdna.com/pages/docs/default-source/CRISPR/idt_protocol_nep-of-jurkat-rnp-rt_crs-10061-prv2-1.pdf?sfvrsn=20）をアレンジしたものである。要約すると、ＲＮＡオリゴ（ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）をNuclease-Free IDTEバッファ中で、それぞれ最終濃度２００μＭで再懸濁した。２つのＲＮＡオリゴを等モル濃度で混合し、最終複合濃度４４μＭとした。それから、複合体を９５℃で５分間加熱し、次に卓上で室温（１５～２５℃）まで冷却した。トランスフェクション前に、３６μＭのＣａｓ９タンパク質をｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体と緩やかに事前混合しておき、室温で１０～２０分間インキュベートした。IDTの推奨に従い、実験ごとに新たなｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を調製した。
ＲＮＰを有するＥＬ４細胞を、以下の条件にて、Neon（登録商標）Transfection System（ThermoFisher）を用いてトランスフェクションさせる：電圧（１３８０Ｖ）、幅（５０ｍｓ）、パルス（１）、１００μＬチップ、バッファＲ（ＲＮＰ用）。
ＲＮＰを有する初代Ｔ細胞を、以下の条件にて、Neon（登録商標）Transfection System（ThermoFisher）を用いてトランスフェクションさせる：電圧（１５５０Ｖ）、幅（１０ｍｓ）、パルス（３）、１００μＬチップ、バッファＲ（ＲＮＰ用）。
［ＣＤ４５．２の枯渇実験］
ＣＤ４＋Ｔ細胞を、EasySep Mouse CD4+T Cell Isolation Kit（Stem cell Technologies）を用いて、C57BL6（ＣＤ４５．２）マウスおよびC57BL6類似遺伝子型（ＣＤ４５．１）マウスから単離した。ＲＡＧ ＫＯマウスを、１：１の比率の１０×１０６個のＣＤ４５．２ドナーＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ４５．１ドナーＣＤ４＋Ｔ細胞で再生させた。Ｔ細胞の移植と同日に、マウスにＰＢＳを腹腔内注射する（未処置群）か、あるいは、マウスに枯渇ａ－ＣＤ４ Ａｂ（クローンＧＫ１．５、２５０μｇ）を腹腔内注射した（３日間連続）。ＣＤ４５．２ビオチン化抗体（分子量：１６０ｋＤａ、Biolegend）とストレプトアビジン－ＳＡＰ複合体（ストレプトアビジン１個ごとに２．８個のサポリン分子、分子量：１３５ｋＤａ、Advanced Targeting Systems）とを１：１のモル比で結合させ、その後使用直前にＰＢＳで稀釈して、ＣＤ４５．２－ＺＡＰ抗毒素を調製した。これは、最初の公開（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5179034/）に記載されている方法と同じである。抗毒素、または非複合ＣＤ４５．２抗体を含むコントロールを、静脈注射でin vivo投与した。１週間後、血液、末梢リンパ節（ＬＮ）、腸間膜ＬＮ（ｍｅｓＬＮ）、および脾臓（ＳＰ）を回収し、細胞を以下の蛍光色素複合ｍＡｂで染色した：抗ＣＤ４５．２（１０４）、抗ＣＤ４５．１（Ａ２０）、抗ＣＤ４（ＲＭ４－５）、抗ＣＤ３（１４５－２Ｃ１１）（いずれもBiolegend）。サンプルをBD Fortessa（BD Biosciences）上で捕捉し、FlowJo software（Tree Star）を用いて分析した。
［図７の実験条件］
（ａ）C57BL6/N Thy1.2+マウス、（ｂ）C57BL6 Thy1.1+/Thy1.2+マウス、または（ｃ）C57BL6Thy1.1+マウスの血液を採取し、Ｔｈｙ１．２（ｍＡｂクローン５３－２．１を用いる）およびＴｈｙ１．１（ｍＡｂクローンＯＸ－７を用いる）の発現を、ＦＡＣＳを用いて調べた。ＦＡＣＳプロットは、溶解した全血球に対するゲーティングを表わす。細胞をBD Fortessa上で捕捉し、FlowJo software（Tree Star）を用いて分析した。ｄ）は、mus musculus（C57BL6）のＴｈｙ１．２およびＴｈｙ１．１アイソフォームのゲノム配列を整列させたものである。２つのアイソフォームは、正方形で示す一つのヌクレオチドで異なっている。
［図８の実験条件］
Ｃａｓ９および抗生物質選択マーカー（ピューロマイシン）の哺乳類発現カセットをコードするが、ｓｇＲＮＡは有さないプラスミド（px459）で、ＥＬ－４細胞をエレクトロポレーションした。抗生物質による選択後、細胞を一つずつ選別して、サブクローンを確立させた。Ｃａｓ９の存在は、各サブクローンから抽出されるゲノムＤＮＡをＰＣＲすることによって確認した。（Ａ）ポジティヴ・コントロールとして、Ｃａｓ９遺伝子組み換えマウス由来のゲノムＤＮＡを用いた。ＣＤ４５．２およびＣＤ９０．２を標的とするin vitroで転写したｓｇＲＮＡをトランスフェクションさせて、Ｃａｓ９の機能をテストした。（Ｂ）テストした６つのクローンすべてにおいて、２つのｓｇＲＮＡのコトランスフェクションにより、４８．３～６１％の細胞における両遺伝子の二アレル性欠失が生じた。
［図１３の実験条件］
SM+ Ly5.1由来のＣＤ４細胞を、空のpx458プラスミド、または、ＩＣＯＳおよびＢＣｌ６に対するｓｇＲＮＡを含むプラスミドでトランスフェクションさせた。最初の活性化工程から４８時間後に、ＧＦＰ＋細胞を選別した。５０，０００個の細胞を、C57BL6 Ly5.2レシピエントに静脈内注射した。Ｔ細胞移植から５日後、C57BL6レシピエントに、２×１０５ＰＦＵのアームストロングＬＣＭＶウイルスを腹腔内注射した。ＬＣＭＶ投与から７日後、マウスを安楽死させ、ＬＮ、ｍｅｓＬＮ、ＳＰを摘出し、ＦＡＣＳでＴＦＨマーカーを調べた。
Figure 0007148494000001
Figure 0007148494000002
Figure 0007148494000003

Claims (13)

  1. 疾患の治療または予防に用いる医薬組成物であって、当該医薬組成物は編集済み細胞を含み、当該編集済み細胞は、
    ゲノム位置を編集することにより、表面タンパク質の第１アイソフォームをコードする核酸配列が、当該第１アイソフォームとは異なる当該表面タンパク質の第２アイソフォームへと、アミノ酸マーカーに関して改変されており、
    上記第１アイソフォームは天然アイソフォームであり、
    上記第２アイソフォームは改変アイソフォームであり、
    上記天然アイソフォームおよび上記改変アイソフォームは、当該天然アイソフォームおよび当該改変アイソフォームに特異的かつ選択的にそれぞれ結合する２種類の異なるリガンドによって区別可能であり、
    上記改変アミノ酸マーカーは、２種類の異なるリガンドと、表面タンパク質の２種類のアイソフォームとの結合特性に関与しており、
    上記編集済み細胞は、上記医薬組成物を投与することによりそれを必要とする宿主に移植され、
    移植された上記編集済み細胞または上記宿主の非編集細胞は、上記表面タンパク質の上記第１アイソフォームまたは上記第２アイソフォームの発現に基づいて、選択的に枯渇され、
    上記表面タンパク質は、ＣＤ９０またはＣＤ４５である、医薬組成物。
  2. 選択的な細胞枯渇が、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有する細胞、によって達成される、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 上記第２アイソフォームは、人工変異、または、稀だが天然に生じる変異を含み、
    上記人工変異、または、上記稀だが天然に生じる変異は、内因性表面タンパク質の抗原性を変えて、改変エピトープを提供するよう設計されており、
    上記改変エピトープは、（i）上記改変エピトープを特異的かつ選択的に認識するリガンドによって、上記編集済み細胞を枯渇させること、または（ii）天然エピトープを選択的に認識するが上記改変エピトープを認識しないリガンドによる枯渇に対する抵抗性を、上記編集済み細胞に与えること、に用いられる、
    請求項１または２に記載の医薬組成物。
  4. 下記（i）または（ii）を満たす、請求項１から３のいずれか１項に記載の医薬組成物：
    （i）上記第２アイソフォームに特異的なリガンドは、上記第２アイソフォームに選択的に結合する抗体である；
    （ii）上記第１アイソフォームに特異的なリガンドは、上記第１アイソフォームに選択的に結合する抗体である。
  5. 被験体における、移植片対宿主病を治療するために、
    上記第２アイソフォームの発現に基づいて、上記被験体内において排除される、請求項１から４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  6. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  7. 上記第２アイソフォームは、ＣＤ９０の天然アイソフォームから改変されたＣＤ９０の改変アイソフォームであり、
    上記ＣＤ９０の改変アイソフォームは、ＣＤ９０の天然エピトープから改変されたエピトープを有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  8. 上記第２アイソフォームは、ＣＤ４５の天然アイソフォームから改変されたＣＤ４５の改変アイソフォームであり、
    上記ＣＤ４５の改変アイソフォームは、ＣＤ４５の天然エピトープから改変されたエピトープを有する、請求項１から７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  9. 上記編集済み細胞は、ＣＤ９０の天然エピトープまたはＣＤ４５の天然エピトープを認識するキメラ抗原受容体をさらに有し、
    上記医薬組成物は、それを必要とする被験体において、
    ＣＤ９０＋造血細胞またはＣＤ４５＋造血細胞を枯渇させるために用いられ、
    ＣＤ９０の改変エピトープまたはＣＤ４５の改変エピトープを有する編集済み細胞は枯渇させないために用いられる、
    請求項７または８に記載の医薬組成物。
  10. ＣＤ９０の改変エピトープまたはＣＤ４５の改変エピトープを有する編集済み細胞が、枯渇段階より前または枯渇段階中に、被験体に移植される、請求項９に記載の医薬組成物。
  11. 上記編集済み細胞は、造血細胞である、請求項１から１０に記載の医薬組成物。
  12. ＣＤ４５の天然エピトープを認識するキメラ抗原受容体を有する細胞（ＣＡＲ４５細胞）を含む医薬組成物であって、
    それを必要とする被験体における造血悪性腫瘍および他の非悪性造血疾患の治療に用いられ、
    上記被験体は、ＣＤ４５の改変エピトープを発現するように編集された編集済み造血細胞を移植され、
    上記編集済み造血細胞は、上記ＣＡＲ４５細胞によって枯渇され得ない、医薬組成物。
  13. 上記編集済み造血細胞は、自系の造血幹細胞、または異質遺伝子型の造血幹細胞である、請求項１２に記載の医薬組成物。
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