JP2023507566A - 核酸誘導ヌクレアーゼ編集済み細胞のｉｎ ｖｉｖｏ検出のためのカスケード／ｄＣａｓ３相補性アッセイ - Google Patents

核酸誘導ヌクレアーゼ編集済み細胞のｉｎ ｖｉｖｏ検出のためのカスケード／ｄＣａｓ３相補性アッセイ Download PDF

Info

Publication number
JP2023507566A
JP2023507566A JP2022537479A JP2022537479A JP2023507566A JP 2023507566 A JP2023507566 A JP 2023507566A JP 2022537479 A JP2022537479 A JP 2022537479A JP 2022537479 A JP2022537479 A JP 2022537479A JP 2023507566 A JP2023507566 A JP 2023507566A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
rnap
nucleic acid
cell
editing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022537479A
Other languages
English (en)
Inventor
ミア、アーミル
ガースト、アンドリュー
フェデロビッチ、スティーブン
シーマン、カイル
Original Assignee
インスクリプタ， インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by インスクリプタ， インコーポレイテッド filed Critical インスクリプタ， インコーポレイテッド
Publication of JP2023507566A publication Critical patent/JP2023507566A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Abstract

本開示は、核酸誘導編集を用いる場合に編集済み細胞をｉｎ ｖｉｖｏにおいて同定することが可能になる方法および組成物に関する。追加的に、編集方法および選択方法を行い、組成物を使用するための自動化多モジュール器具が提供される。

Description

本開示は、核酸誘導編集と、編集方法および選択方法を行うための自動化多モジュール器具とを用いる場合における、細胞に存在する、意図された編集配列などの特異的核酸配列のｉｎ ｖｉｖｏ同定を可能にするための方法および組成物に関する。
以下の説明において、ある特定の物および方法は、背景目的および導入目的のために記載される。本明細書に含まれるいかなるものも、従来技術の「容認」と解釈されないものとする。出願者は、必要に応じて、本明細書において参照される物および方法が、適用可能な法律の条項の下で従来技術を構成しないことを示す権利を明示的に確保する。
生細胞のゲノムへの正確な標的変化を生じる能力は、生物医学的な研究および開発における長期的目標であった。最近、遺伝子配列、故に遺伝子機能の操作を可能にする様々なヌクレアーゼが同定されてきた。前記ヌクレアーゼとしては、研究者が生細胞における永久的編集を生成することを可能にする核酸誘導ヌクレアーゼが挙げられる。もちろん、得られた細胞集団において適切に編集された細胞を同定することが可能なことが望ましいが、多くの例において、核酸誘導ヌクレアーゼ編集から得られる編集済み細胞のパーセンテージは１桁である可能性がある。
したがって、本技術分野において、適切に編集された細胞のｉｎ ｖｉｖｏにおける迅速でかつ正確な同定のための、改善された方法、組成物、モジュールおよび器具のための核酸誘導ヌクレアーゼ編集の需要がある。本開示は、この需要に対処するものである。
この概要は、発明を実施するための形態で以下にさらに記載される、簡略化された形態の概念の選択を導入するために提供される。この概要は、クレームに係る発明の主題の主要なまたは必須の特徴を同定することを意図するものではなく、クレームに係る発明の主題の範囲を限定するために使用されることを意図するものでもない。クレームに係る発明の主題の他の特徴、詳細、有用性および長所は、添付の図面で示され、添付の特許請求の範囲で定義されるそれらの態様を含む、以下の、書かれた、発明を実施するための形態から明らかであろう。
本開示は、核酸誘導ヌクレアーゼ編集済み細胞を生成し、細胞の大部分、おそらく圧倒的な多数が編集されなかった、得られた細胞集団において適切に編集された細胞をｉｎ ｖｉｖｏで同定することを可能にする方法、組成物、モジュールおよび自動化多モジュール細胞処理器具に関する。本方法および本組成物は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を使用するスプリットタンパク質レポータ系を用いる。スプリットタンパク質レポータ系は、カスケード複合体標的認識の際のＣａｓ３（ＣＡＳ３）リクルートの自然機序を活用する。カスケード複合体に対するＣａｓ３のリクルートによって、特定のＤＮＡ配列、この場合、所望の編集を含むＤＮＡ配列に対するカスケード複合体の高忠実度の標的化に対して特異的な細胞内シグナル増幅事象が開始する。非活性化Ｃａｓ３（ｄＣａｓ３）にスプリットタンパク質の半分を付着させ、カスケードのタンパク質成分にスプリットタンパク質のもう一方の半分を付着させることによって、カスケード複合体（例えば、カスケードおよびｃｒＲＮＡ）が識別可能なＲループを形成し正しい標的ＤＮＡ配列と複合体を形成した場合にのみスプリットタンパク質のその２つの半分が一体となる系が作製される。一実施形態において、スプリットタンパク質は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ＲＮＡＰ）である。カスケード複合体融合および標的配列（例えば、意図された編集）の認識の際、ならびに非活性化Ｃａｓ３－Ｎ末端Ｔ７ ＲＮＡＰ融合タンパク質のリクルートの際、スプリットＴ７ ＲＮＡＰのその２つの半分が近接して、活性Ｔ７ポリメラーゼが生じる。活性Ｔ７ポリメラーゼは、例えば、Ｔ７プロモータの制御下でレポータ遺伝子に対するコード配列を転写することが可能であり、ひいては、意図された編集を有する細胞の集団の単離を可能にする。
したがって、本明細書における一実施形態において、ベクター骨格におけるカスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ融合タンパク質コード配列と、ベクター骨格におけるｄＣａｓ３－Ｔ７－ＲＮＡＰ融合タンパク質コード配列と、ベクター骨格における編集識別（または「編集標的」）ｇＲＮＡに対する配列であって、該編集識別（または「編集標的」）ｇＲＮＡが、ゲノム配列における合理的設計編集済み遺伝子座を認識するが、該ゲノム配列における、未編集状態または不正確な編集状態の該遺伝子座を認識しない、該配列と、Ｔ７プロモータの制御下におけるレポータ遺伝子に対するコード配列と、を含む核酸誘導ヌクレアーゼ編集系が提供される。いくつかの態様において、カスケード－Ｔ７ ＲＮＡＰ融合タンパク質コード配列は、（Ｉ型Ｃ系における）ｃａｓ５ｃのＣ末端または（Ｉ型Ｅ系における）ｃｓｅ１もしくはｃａｓＡのＣ末端およびＴ７ ＲＮＡＰのＣ末端（例えば、アミノ酸１８１～８８３）を含むが、ｄＣａｓ３－Ｔ７ ＲＮＡＰ融合タンパク質コード配列は、ｄＣａｓ３のＮ末端およびＴ７－ＲＮＡＰのＮ末端（例えば、アミノ酸１～１７９）を含む。代替的に、いくつかの態様において、カスケード－Ｔ７ ＲＮＡＰ融合タンパク質コード配列は、（Ｉ型Ｃ系における）ｃａｓ５ｃのＮ末端または（Ｉ型Ｅ系における）ｃｓｅ１もしくはｃａｓＡのＮ末端およびＴ７ ＲＮＡＰのＮ末端（例えば、アミノ酸１～１７９）を含むが、ｄＣａｓ３－Ｔ７ ＲＮＡＰ融合タンパク質コード配列は、ｄＣａｓ３のＣ末端およびＴ７－ＲＮＡＰのＣ末端（例えば、アミノ酸１８１～８８３）を含む。いくつかの態様において、前記レポータ遺伝子は、蛍光タンパク質に対するコード配列であり、いくつかの態様において、前記蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質または青色蛍光タンパク質である。さらに他の態様において、前記レポータ遺伝子は、ルシフェラーゼに対するコード配列であり、いくつかの態様において、前記ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼまたはウミシイタケルシフェラーゼである。さらに他の態様において、前記レポータ遺伝子は、ブロッコリーＲＮＡアプタマーまたはホウレンソウＲＮＡアプタマーをコードする。さらに他の態様において、前記レポータ遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子に対するコード配列である。さらに他の態様において、前記レポータ遺伝子は、細胞表面受容体タンパク質に対するコード配列である。
核酸誘導ヌクレアーゼ編集系のいくつかの態様において、カスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｃ末端融合タンパク質コード配列、ｄＣａｓ３－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｎ末端融合タンパク質コード配列、編集識別ｇＲＮＡに対する配列、およびＴ７プロモータの制御下におけるレポータ遺伝子に対するコード配列は、全て同じベクター上にあり、代替的な態様において、カスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｃ末端融合タンパク質コード配列、ｄＣａｓ３－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｎ末端融合タンパク質コード配列、編集識別ｇＲＮＡに対する配列、およびＴ７プロモータの制御下におけるレポータ遺伝子に対するコード配列は、２つ以上の異なるベクター上にある。
さらに別の実施形態は、ベクター骨格における前記カスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｃ末端融合タンパク質コード配列と、ベクター骨格における前記ｄＣａｓ３－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｎ末端融合タンパク質コード配列と、ベクター骨格における編集識別ｇＲＮＡに対する前記配列であって、前記編集識別ｇＲＮＡが、ゲノム配列における合理的設計編集済み遺伝子座を認識するが、未編集状態または不正確な編集状態の該ゲノム配列における該遺伝子座を認識しない、該配列と、Ｔ７プロモータの制御下におけるレポータ遺伝子に対する前記コード配列と、を含む細胞を提供する。
さらに他の実施形態は、核酸誘導ヌクレアーゼと、ゲノム遺伝子座に相同的なｇＲＮＡと、ゲノム遺伝子座に相同的なドナーＤＮＡとを含む核酸誘導ヌクレアーゼ編集成分で前記細胞を形質転換する工程と、ベクター骨格におけるカスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｃ末端融合タンパク質コード配列と、ベクター骨格におけるｄＣａｓ３－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｎ末端融合タンパク質コード配列と、ベクター骨格における編集識別ｇＲＮＡに対する配列であって、該編集識別ｇＲＮＡが、ゲノム配列における合理的設計編集済み遺伝子座を認識するが、未編集状態または不正確な編集状態の該ゲノム配列における該遺伝子座を認識しない、該配列と、Ｔ７プロモータの制御下におけるレポータ遺伝子に対するコード配列と、を含む核酸誘導ヌクレアーゼ編集系で前記細胞を形質転換する工程と、該核酸誘導ヌクレアーゼ、該ｇＲＮＡおよび該ドナーＤＮＡによって該細胞内における該ゲノム遺伝子座を編集する工程と、該カスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｃ末端融合タンパク質コード配列、編集識別ｇＲＮＡおよびカスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｃ末端融合タンパク質コード配列を該編集済みゲノム遺伝子座に結合させることによってＴ７ ＲＮＡＰ活性を再構成する工程と、Ｔ７ ＲＮＡＰを該Ｔ７プロモータに結合させ、該Ｔ７プロモータ活性化させることによって該レポータ遺伝子を転写するための条件を提供する工程と、を含む、編集済み細胞のｉｎ ｖｉｖｏ同定のための方法を提供する。
本発明のこれらの態様ならびに他の特徴および長所は、さらに詳細に以下に記載される。
本発明の上記のおよび他の特徴および長所は、添付の図面と共に示される例示的な実施形態の以下の詳細な記載からより完全に理解されるであろう。
カスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｃ末端融合タンパク質、ｄＣａｓ３－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｎ末端融合タンパク質、編集識別（または「編集標的」）ｇＲＮＡおよびレポータ遺伝子（まとめて、「スプリットタンパク質レポータ系」）を使用するＩ型核酸誘導ヌクレアーゼ選択を行うための簡潔な処理図。 編集識別（または編集標的）ｇＲＮＡと複合したカスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｃ末端融合タンパク質が野生型（例えば、未編集）ゲノム標的配列に結合しないスプリットタンパク質系の成分の簡略化された概略図。 編集済みゲノム標的配列があるが、編集は、所望の、意図された編集ではないスプリットタンパク質系の成分の簡略化された概略図。したがって、カスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｃ末端融合と複合した編集識別ｇＲＮＡ転写物は、ゲノム標的配列を認識せず、前記ゲノム標的配列に結合せず、カスケード複合体を形成せず、ｄＣａｓ３－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｎ末端融合タンパク質を不正確に編集された標的ゲノム配列にリクルートしない。 適切に編集されたゲノム標的配列があり、カスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｃ末端融合と複合した編集識別ｇＲＮＡ転写物が、適切に編集されたゲノム標的配列に結合し、活性Ｒループを形成することによって、ｄＣａｓ３－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｎ末端融合タンパク質を前記編集されたゲノム配列にリクルートする、スプリットタンパク質系の成分の簡略化された概略図。ｄＣａｓ３－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｎ末端融合タンパク質のリクルートによって、Ｔ７ ＲＮＡＰタンパク質のＮ末端およびＣ末端部分は、機能的に近接する。 スプリットタンパク質レポータ系を用いる核酸誘導ヌクレアーゼ編集を行うための例示的な自動化多モジュール細胞処理器具の図。 スプリットタンパク質レポータ系を用いる核酸誘導ヌクレアーゼ編集を行うための例示的な自動化多モジュール細胞処理器具の図。 スプリットタンパク質レポータ系を用いる核酸誘導ヌクレアーゼ編集を行うための例示的な自動化多モジュール細胞処理器具の図。 本明細書に記載され、図３Ｂ～図３Ｄに関する細胞増殖モジュールと共に使用するための回転増殖バイアルの一実施形態。 細胞増殖モジュールハウジングにおける回転増殖バイアルの一実施形態の斜視図。 図３Ｂからの細胞増殖モジュールの切断図。 ＬＥＤ、検出器および温度調節構成要素に結合された図３Ｂの細胞増殖モジュール。 タンジェントフロー濾過モジュール（例えば、細胞増殖および／または濃縮モジュール）において使用するための保留物部材（上部）および浸透部材（下部）、ならびにタンジェントフロー構築体（下部）に構築された保留物部材および浸透部材。 タンジェントフロー濾過モジュールの貯留器構築体の２つの側面斜視図。 図４Ｂに示される貯留器構築体のために適切な流体ポートおよび空気式ポートならびにガスケットを有する例示的な上部。 図４Ｂに示される貯留器構築体のために適切な流体ポートおよび空気式ポートならびにガスケットを有する例示的な上部。 多モジュール細胞処理器具において使用され得る例示的な組合せ試薬カートリッジおよびエレクトロポレーションデバイス（例えば、形質転換モジュール）。 試薬カートリッジの一部であってもよい例示的なフロースルーエレクトロポレーションデバイスの一実施形態の上面斜視図。 試薬カートリッジの一部であってもよい例示的なフロースルーエレクトロポレーションデバイスの一実施形態の下面斜視図。 図２Ａ～図２Ｃに示されるものなどの多モジュール自動化細胞処理器具において有用なＦＴＥＰデバイスの上面斜視図。 図２Ａ～図２Ｃに示されるものなどの多モジュール自動化細胞処理器具において有用なＦＴＥＰデバイスの断面の上面図。 図２Ａ～図２Ｃに示されるものなどの多モジュール自動化細胞処理器具において有用なＦＴＥＰデバイスの断面の側面斜視図。 固体壁デバイスにおいて細胞を個別化し、編集し、正常化するための作業の流れの簡略化された図。 固体壁デバイスにおいて細胞を実質的に個別化し、編集し、正常化するための作業の流れの変形例の簡略化された図。 固体壁単離インキュベーションおよび正常化（ＳＷＩＩＮ）モジュールの実施形態。 固体壁単離インキュベーションおよび正常化（ＳＷＩＩＮ）モジュールの実施形態。 固体壁単離インキュベーションおよび正常化（ＳＷＩＩＮ）モジュールの実施形態。 加熱器および加熱カバーをさらに含む、図６Ｃ～図６ＥにおけるＳＷＩＩＮモジュールの実施形態。 本明細書に記載されるスプリットタンパク質レポータ系が使用されてもよい例示的な自動化多モジュール細胞処理器具の実施形態の簡略化された処理図。 大腸菌におけるスプリットタンパク質レポータ系を試験するための例示的なベクターマップ。 大腸菌におけるスプリットタンパク質レポータ系を試験するための例示的なベクターマップ。 大腸菌におけるスプリットタンパク質レポータ系を試験するための例示的なベクターマップ。 大腸菌におけるスプリットタンパク質レポータ系を試験するための例示的なベクターマップ。
図面は必ずしも実際のスケール通りに描かれているわけではなく、同様の参照符号は同様の特徴を指すことを理解するべきである。
本明細書に記載される方法、デバイスまたは器具の一実施形態に関連して記載される機能性の全ては、明示的に示される場合、または特徴もしくは機能が追加的な実施形態に不適合である場合を除き、本明細書に記載される方法、デバイスおよび器具の追加的な実施形態に適用可能であることが意図される。例えば、所定の特徴または機能が一実施形態に関連して明示的に記載され、代替的実施形態に関連して明示的に記載されない場合、特徴または機能は、特徴または機能が代替的実施形態に不適合でない限り、代替的実施形態に関連して配置されてもよいか、利用されてもよいか、または実装されてもよいことを理解するべきである。
本明細書に記載される技術の実施は、特に明記しない限り、従来の技術ならびに当業者の熟練の範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学および遺伝子操作技術の記載を用いてもよい。そのような従来の技術および記載は、全てが全ての目的のためにそれらの全体を本願明細書に援用されるグリーンおよびサンブルック（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第４版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、（２０１４）；分子生物学の現行のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、オースベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ）編（２０１７）；ノイマンら（Ｎｅｕｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．）、細胞生物学におけるエレクトロポレーションおよび電気融合（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、プレナムプレス（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９８９；およびチャンら（Ｃｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．）、エレクトロポレーションおよび電気融合の案内（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ）、アガデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、カリフォルニア（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）（１９９２）などの標準的な研究室の説明書に見出され得る。核酸誘導ヌクレアーゼ技術は、例えば、両方が全ての目的のためにそれらの全体を本願明細書に援用されるＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲから分子手術へのゲノム編集およびゲノム操作（Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｒｏｍ ＴＡＬＥＮｓ ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲｓ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｕｒｇｅｒｙ）、アパサニおよびチャーチ（Ａｐｐａｓａｎｉ ａｎｄ Ｃｈｕｒｃｈ）（２０１８）；およびＣＲＩＳＰＲ：方法およびプロトコール（Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、リンドグレンおよびチャーペンチエール（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ ａｎｄ Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ）（２０１５）に見出され得る。
なお、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「前記（ｔｈｅ）」は、文脈が別段明確に規定しない限り、複数の指示物を含む。したがって、例えば、「細胞」に対する参照は、１つまたは複数の細胞を指し、「系」に対する参照は、当業者に知られている同等の工程、方法およびデバイスなどに対する参照を含む。追加的に、本明細書において使用され得る「左」、「右」、「上」、「下」、「前」、「後」、「側」、「高さ」、「長さ」、「幅」、「上側」、「下側」、「内部」、「外部」、「内側」、「外側」などの用語は、単に参照点を記載するだけであり、必ずしも本開示の実施形態を任意の特定の向きまたは構成に限定するものではないことを理解すべきである。さらに、用語、例えば、「第１」、「第２」、「第３」などは、単に、本明細書に開示される通りの多くの部分、構成要素、工程、操作、機能および／または参照点のうちの１つを同定するだけであり、同様に、必ずしも本開示の実施形態を任意の特定の構成または向きに限定するものではない。
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載される全ての刊行物は、記載された本発明に関連して使用されてもよいデバイス、配合物および方法を記載し、開示する目的のために援用される。
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限および下限の間の各中間値と、その規定された範囲内の任意の他の規定値または中間値とは、本発明の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、より小さい範囲内に独立して含まれてもよく、規定された範囲内の任意の具体的に除外された限界に従って本発明の範囲内にも包含される。規定された範囲が前記限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれた限界の一方または両方を除く範囲も本発明に含まれる。
以下の記載において、本発明のより完全な理解を提供するために、多くの具体的な詳細が記載される。しかし、本発明がこれらの具体的な詳細の内１つまたは複数なしで実施されてもよいことは、当業者に明らかであろう。他の例において、当業者によく知られている特徴および手法は、本発明を不明瞭にすることを回避するために記載されなかった。本明細書において使用される用語は、当業者によって理解される通りの、明白で、通常の意味を有することが意図される。
本明細書において使用される通りの「相補的」という用語は、ヌクレオチド間のワトソン－クリック型塩基対を指し、具体的には、２つの水素結合によってアデニン残基に連結したチミン残基またはウラシル残基ならびに３つの水素結合によって連結したシトシン残基およびグアニン残基によって互いに水素結合したヌクレオチドを指す。概して、核酸は、特定の第２ヌクレオチド配列に対する「パーセント相補性」または「パーセント相同性」を有すると記載されるヌクレオチド配列を含む。例えば、ヌクレオチド配列は、配列の１０個の内の８個、１０個の内の９個、または１０個の内の１０個のヌクレオチドが特定の第２ヌクレオチド配列に対して相補的であることを示す、特定の第２ヌクレオチド配列に対する８０％相補性、９０％相補性または１００％相補性を有してもよい。例えば、ヌクレオチド配列３’－ＴＣＧＡ－５’は、ヌクレオチド配列５’－ＡＧＣＴ－３’に対して１００％相補的であり、ヌクレオチド配列３’－ＴＣＧＡ－５’は、ヌクレオチド配列５’－ＴＡＧＣＴＧ－３’の領域に対して１００％相補的である。
「カスケード」または「カスケードエフェクタ」という用語は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のタンパク質エフェクタ複合体を指す。「カスケード複合体」という用語は、ｃｒＲＮＡをさらに含むカスケードエフェクタ複合体を指す。
ＤＮＡ「制御配列」という用語は、レシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写および翻訳をまとめて提供するプロモータ配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製開始点、内部リボソーム侵入部位、核局在化配列、エンハンサおよび同種のものをまとめて指す。適切な宿主細胞において、選択されたコード配列を複製し、転写し、（いくつかの成分について）翻訳することができる限り、これらの型の制御配列の全てが存在する必要があるというわけではない。
本明細書において使用される場合、「ドナーＤＮＡ」または「ドナー核酸」という用語は、核酸誘導ヌクレアーゼを使用する相同的組換えによってＤＮＡ配列修飾（挿入、欠失、置換）を遺伝子座（例えば、標的ゲノムＤＮＡ配列または細胞標的配列）に導入するように設計されている核酸を指す。相同性指向修復のために、ドナーＤＮＡは、ゲノム標的配列における「切断部位」または被編集部位をフランクする領域に対する充分な相同性を有する必要がある。（１つまたは複数の）相同性アームの長さは、例えば、行われる修飾の型および大きさに依存する。多くの例において、好ましくは、ドナーＤＮＡは、ゲノム標的遺伝子座に対しての２つの配列相同領域（例えば、２つの相同性アーム）を有する。好ましくは、「挿入」領域または「ＤＮＡ配列修飾」領域－細胞におけるゲノム標的遺伝子座に導入されることが所望される核酸修飾－は、２つの相同領域の間に位置する。ＤＮＡ配列修飾は、１つの特異的部位または複数の特異的部位において、標的ゲノムＤＮＡ配列の１つまたは複数の塩基を変化させてもよい。変化は、ゲノム標的配列の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００または５００以上の塩基対を変化させることを含んでもよい。欠失または挿入は、ゲノム標的配列の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００または５００以上の塩基対の欠失または挿入であってもよい。
「ガイド核酸」または「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」という用語は、１）ゲノム標的遺伝子座にハイブリダイズすることが可能なガイド配列と、２）核酸誘導ヌクレアーゼと相互作用するか、または複合体を形成することが可能な足場配列と、を含むポリヌクレオチドを指す。
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチドの間、または、さらに多くの場合、本開示の文脈において、２つの核酸分子の間の配列類似性を指す。「相同領域」または「相同性アーム」という用語は、標的ゲノムＤＮＡ配列とのある特定の度合いの相同性を有するドナーＤＮＡ上の領域を指す。相同性は、比較のためにアラインメントされてもよい各配列における位置を比較することによって決定され得る。比較された配列における位置が同じの塩基またはアミノ酸によって占められている場合、分子は、その位置で相同的である。配列間の相同性の度合いは、前記配列によって共有される適合位置または相同位置の数の関数である。
「作動可能に連結される」は、そのように記載される成分がそれらの通常の機能を行うように構成される要素の配置を指す。したがって、コード配列に作動可能に連結される制御配列は、コード配列の転写、および、いくつかの場合、翻訳を行うことが可能である。制御配列は、コード配列の発現を指向するように機能する限り、コード配列に隣接している必要はない。したがって、例えば、非翻訳であるが転写された介在配列がプロモータ配列およびコード配列の間に存在する可能性があり、プロモータ配列は、コード配列に「作動可能に連結されている」と依然として考えられ得る。実際、そのような配列は、同じ隣接ＤＮＡ分子（すなわち、染色体）上に存在する必要はなく、改変された調節を生じる相互作用を依然として有してもよい。
本明細書において使用される場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、交換可能に使用される。タンパク質は、アミノ酸から完全に構成されてもよいか、または構成されなくてもよい。
「プロモータ」または「プロモータ配列」は、ＲＮＡポリメラーゼに結合することが可能であり、かつ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡもしくは核小体低分子ＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、または任意のクラスの任意のＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩもしくはＩＩＩによっても転写される任意の種類のＲＮＡなどのポリヌクレオチドコード配列またはポリペプチドコード配列の転写を開始することが可能なＤＮＡ調節領域である。プロモータは、構成的または誘導性であってもよい。
本明細書において使用される場合、「レポータ遺伝子」は、例えば、ルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質をコードする遺伝子など、遺伝子発現および他の細胞事象のための指標として使用される遺伝子である。本文脈において、レポータ遺伝子は、ゲノム編集の代用として使用される。
本明細書において使用される場合、「選択可能マーカ」という用語は、人為選択のために適切な形質を付与する、細胞に導入された遺伝子を指す。一般使用選択マーカは、当業者によく知られており、前記選択マーカとしては、アンピシリン／カルベニシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、ノウルセオトライシンＮ－アセチルトランスフェラーゼ、エリスロマイシン、テトラサイクリン、ゲンタマイシン、ブレオマイシン、ストレプトマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ブラストサイジンおよびＧ４１８が挙げられ、または他の選択マーカを用いてもよい。
本明細書において使用される通りの「特異的に結合する」という用語は、約１０－７Ｍ、約１０－８Ｍ、約１０－９Ｍ、約１０－１０Ｍ、約１０－１１Ｍ、約１０－１２Ｍ、約１０－１３Ｍ、約１０－１４Ｍまたは約１０－１５Ｍの解離定数によって表される結合親和性を有する、２つの分子、例えば、操作されたペプチド抗原および結合標的の間の相互作用を含む。
「標的ゲノムＤＮＡ配列」、「細胞標的配列」、「標的配列」または「ゲノム標的遺伝子座」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏにおける、または核酸誘導ヌクレアーゼ編集系を使用した少なくとも１つのヌクレオチドの変化が所望される細胞もしくは細胞集団の核酸（例えば、ゲノムまたはエピソーム）における任意の遺伝子座を指す。標的配列は、ゲノム遺伝子座または染色体外遺伝子座であることができる。「編集済み標的配列」または「編集済み遺伝子座」という用語は、編集済み標的配列が所望の編集を含む、編集が行われた後の標的ゲノム配列または標的配列を指す。
「変異体」という用語は、参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとは異なるが必須の特性を保持するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指してもよい。ポリペプチドの典型的な変異体は、別の参照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。概して、差は、参照ポリペプチドおよび変異体の配列が全体的にほとんど同様であり、多くの領域において、同一であるように限定される。変異体および参照ポリペプチドは、１つまたは複数の修飾（例えば、置換、添加および／または欠失）によってアミノ酸配列が異なってもよい。ポリペプチドの変異体は、保存的に修飾された変異体であってもよい。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによってコードされるものであってもよいし、なくてもよい（例えば、非天然アミノ酸）。ポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体など、天然に生じてもよいか、または天然に生じることが知られていない変異体であってもよい。
「ベクター」は、細胞に送達され、かつ／または発現する所望の１つの配列または複数の配列を含む様々な核酸のいずれかである。ベクターは、ＲＮＡベクターも利用可能であるが、典型的にはＤＮＡで構成される。ベクターとしては、プラスミド、ホスミド、ファージミド、ウイルスゲノム、合成染色体および同種のものが挙げられるが、それらに限定されるものではない。本方法のいくつかの実施形態において、２種のベクター、すなわちヌクレアーゼに対するコード配列を含むエンジンベクターと、ｇＲＮＡ配列とドナーＤＮＡ配列とを含む編集ベクターとが使用される。代替的実施形態において、ヌクレアーゼ、ｇＲＮＡ配列およびドナーＤＮＡ配列を含む全ての編集成分は、全て同じベクター（例えば、複合編集／エンジンベクター）上にある。いくつかの実施形態において、カスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｃ末端融合タンパク質、ｄＣａｓ３－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｎ末端融合タンパク質、編集識別ｇＲＮＡ、およびＴ７プロモータの制御下においてレポータ遺伝子に対するコード配列は、全ての単一のレポータベクター上に位置するが、他の実施形態において、これらの成分のうちの１種または複数種は、エンジンベクター、編集ベクター、または１種もしくは複数種の異なるレポータベクター上に位置してもよい。
一般的なヌクレアーゼ指向ゲノム編集
本明細書に記載される組成物および方法は、所望の編集を細胞集団に導入するためにヌクレアーゼ－指向ゲノム編集を行うことを可能にし、次いで、編集済み細胞をｉｎ ｖｉｖｏで迅速に同定することを可能にするために用いられる。いくつかの実施形態において、編集が前の回で編集された細胞への後続回の編集で導入される場合、再帰的細胞編集が行われる。細胞において適切な合成ガイド核酸と複合体を形成した核酸誘導ヌクレアーゼは、所望の位置で細胞のゲノムを切断することができる。ガイド核酸は、核酸誘導ヌクレアーゼが特異的標的配列におけるＤＮＡを認識し、切断することに役立つ。核酸誘導ヌクレアーゼは、適切なプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）が近くにある限り、ガイド核酸のヌクレオチド配列を操作することによって、切断のための任意のＤＮＡ配列を標的とするようにプログラムされてもよい。ある特定の態様において、核酸誘導ヌクレアーゼ編集系は、ガイド核酸、例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）として機能するように結合する２種の別々のガイド核酸分子を使用してもよい。他の態様において、好ましくは、ガイド核酸は、１）ゲノム標的遺伝子座にハイブリダイズすることが可能なガイド配列と、２）核酸誘導ヌクレアーゼと相互作用するか、複合体を形成することが可能な足場配列との両方を含む単一のガイド核酸構築物である。
概して、ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、適合性の核酸誘導ヌクレアーゼと複合体を形成し、次いで標的配列とハイブリダイズすることによってヌクレアーゼを標的配列に指向させることが可能である。ガイド核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、代替的には、ガイド核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ガイド核酸は、修飾ヌクレオチドまたは非天然に生じるヌクレオチドを含んでもよい。ガイド核酸がＲＮＡを含む場合、ｇＲＮＡは、プラスミド、線状構築物などのポリヌクレオチド分子上のＤＮＡ配列によってコードされてもよいか、またはコード配列は、編集カセット内に存在してもよく、好ましくは存在する。編集カセットを設計し、合成するための方法および組成物は、米国特許第１０，２４０，１６７号、米国特許第１０，２６６，８４９号、米国特許第９，９８２，２７８号、米国特許第１０，３５１，８７７号、米国特許第１０，３６４，４４２号および米国特許第１０，４３５，７１５号、ならびに２０１９年２月１４日に出願された米国特許出願第１６／２７５，４６５号に記載されており、それらの全ては本願明細書に援用される。
ガイド核酸は、ガイド配列が、標的配列とハイブリダイズし、複合体が形成された核酸誘導ヌクレアーゼの配列特異的結合を標的配列に指向させるために標的配列との充分な相補性を有するポリヌクレオチド配列である、ガイド配列を含む。ガイド配列および対応する標的配列の間の相補性の度合いは、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインメントされる場合、約５０％以上、約６０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７．５％以上、約９９％以上である。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定されてもよい。いくつかの実施形態において、ガイド配列は、長さが約１０個以上、約１１個以上、約１２個以上、約１３個以上、約１４個以上、約１５個以上、約１６個以上、約１７個以上、約１８個以上、約１９個以上、約２０個以上、約２１個以上、約２２個以上、約２３個以上、約２４個以上、約２５個以上、約２６個以上、約２７個以上、約２８個以上、約２９個以上、約３０個以上、約３５個以上、約４０個以上、約４５個以上、約５０個以上、約７５個以上のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ガイド配列は、長さが約７５個未満、約５０個未満、約４５個未満、約４０個未満、約３５個未満、約３０個未満、約２５個未満、約２０個未満のヌクレオチドである。好ましくは、ガイド配列は、１０～３０個もしくは１５～２０個のヌクレオチドの長さであるか、または長さが１５個、１６個、１７個、１８個、１９個もしくは２０個のヌクレオチドである。
概して、標的配列における編集を生成するために、ｇＲＮＡ／ヌクレアーゼ複合体は、ガイドＲＮＡによって決定される通りの標的配列に結合し、ヌクレアーゼは、標的配列に隣接するプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を認識する。標的配列は、細胞に対して内因性もしくは外因性の、またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける任意のポリヌクレオチドであることができる。例えば、標的配列は、細胞の核内に存在するポリヌクレオチドであることができる。標的配列は、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列、または非コード配列（例えば、調節性ポリヌクレオチド、イントロン、ＰＡＭ、制御配列または「ジャンク」ＤＮＡ）であることができる。
ガイド核酸は、細胞標的配列を標的とするドナー核酸をコードする編集カセットの一部であってもよく、好ましくは前記一部である。別の場合、ガイド核酸は、編集カセットの一部でなくてもよく、代わりに、編集ベクター骨格上でコードされてもよい。例えば、ガイド核酸をコードする配列を、まずベクター骨格に構築するか、または挿入した後、例えば、編集カセット内のドナー核酸の挿入を行うことが可能である。他の場合、例えば編集カセット内におけるドナー核酸を、まずベクター骨格に挿入するか、または構築した後、ガイド核酸をコードする配列の挿入を行うことが可能である。好ましくは、ガイド核酸をコードする配列とドナー核酸とが合理的設計編集カセット内で一緒に位置し、線状プラスミドまたはベクター骨格にギャップ修復を介して同時に挿入されるか、または構築されて、編集ベクターが作製される。
標的配列は、ｇＲＮＡ／ヌクレアーゼ複合体によって認識される短いヌクレオチド配列であるプロトスペーサ突然変異（ＰＡＭ）に関連している。異なる核酸誘導ヌクレアーゼのための正確な好ましいＰＡＭ配列および長さの要件は変化するが、ＰＡＭは、典型的には、標的配列に隣接するか、または近接する２～７つの塩基対の配列であり、ヌクレアーゼに応じて、標的配列に対して５’または３’であることができる。核酸誘導ヌクレアーゼのＰＡＭ相互作用ドメインの操作によって、ＰＡＭ特異性の改変が可能になってもよいか、標的部位認識忠実度が向上してもよいか、標的部位認識忠実度が停会してもよいか、または核酸誘導ヌクレアーゼの多用性が増加してもよい。
ほとんどの実施形態において、細胞標的配列のゲノム編集は、細胞標的配列、例えば、細胞のゲノムＤＮＡに所望のＤＮＡ変化を導入することと、細胞標的配列におけるプロトスペーサ突然変異（ＰＡＭ）領域を除去するか、変異させるか、または不活化する（例えば、標的部位をさらなるヌクレアーゼ結合に対して免疫性にする）こととの両方を行う。細胞標的配列におけるＰＡＭを不活化することによって、例えば、編集の後の回における合成ガイド核酸と複合体を形成した核酸誘導ヌクレアーゼに対する後続の曝露の際に、その細胞標的配列における細胞ゲノムのさらなる編集が阻止される。したがって、細胞標的配列に対して相補的な合成ガイド核酸と複合体を形成した核酸誘導ヌクレアーゼを使用することによって、所望の細胞標的配列編集と改変されたＰＡＭとを有する細胞を選択することが可能である。最初の編集事象を受けなかった細胞は、二本鎖ＤＮＡを切断して切断され、したがって、生存可能であることを継続しない。所望の細胞標的配列編集とＰＡＭ改変とを含む細胞は、これらの編集済み細胞が、必要なＰＡＭ部位をもはや含まないので、切断されず、増殖し、繁殖することを継続する。
核酸誘導ヌクレアーゼ編集系のヌクレアーゼ成分に関して、核酸誘導ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、細菌細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞などの特定の細胞型の発現のために最適化されたコドンであることができる。用いられる核酸誘導ヌクレアーゼの選択は、どの型の編集が標的配列において為されるのか、また、適切なＰＡＭが所望の標的配列の近くに位置しているのかどうかなど、多くの要因に依存する。本明細書に記載される方法における使用のヌクレアーゼとしては、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２／ＣｐｆＩ、ＭＡＤ２もしくはＭＡＤ７または他のＭＡＤｚｙｍｅが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
核酸誘導ヌクレアーゼ系の別の成分は、細胞標的配列に対する相同性を含むドナー核酸である。ドナー核酸は、同じベクター上にあり、ガイド核酸と同じ編集カセット内にもあり、好ましくは、編集ｇＲＮＡと同じプロモータ（すなわち、編集ｇＲＮＡおよびドナー核酸の両方の転写を駆動する単一のプロモータ）の制御下に（必ずというわけではないが）ある。ドナー核酸は、ｇＲＮＡ／ヌクレアーゼ複合体の一部としての核酸誘導ヌクレアーゼによってニッキングされるか、または切断される細胞標的配列との相同組換えのための鋳型の役割を果たすように設計される。ドナー核酸ポリヌクレオチドは、２０１９年２月１４日に出願された米国特許出願第１６／２７５，４６５号に記載される通りの二重ｇＲＮＡ構築物と組み合わせられる場合、長さが約２０個以上、約２５個以上、約５０個以上、約７５個以上、約１００個以上、約１５０個以上、約２００個以上、約５００個以上または約１０００個以上のヌクレオチド、ならびに長さが最高で２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂおよび最高で２０ｋｂなどの任意の適切な長さであってもよい。ある特定の好ましい態様において、ドナー核酸は、２０～３００個の間のヌクレオチド、より好ましくは５０～２５０個の間のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドとして提供され得る。ドナー核酸は、細胞標的配列の一部に対して相補的である領域（例えば、相同性アーム）を含む。最適にアラインメントされる場合、ドナー核酸は、例えば、約２０個以上、約２５個以上、約３０個以上、約３５個以上、約４０個以上、約５０個以上、約６０個以上、約７０個以上、約８０個以上、約９０個以上のヌクレオチドによって、細胞標的配列と重なる（相補的である）。多くの実施形態において、ドナー核酸は、突然変異、またはドナー核酸および細胞標的配列の間の差をフランクする２つの相同性アーム（細胞標的配列に対して相補的な領域）を含む。ドナー核酸は、細胞標的配列と比較して少なくとも１つの突然変異または改変、例えば、細胞標的配列と比較して挿入、欠失、修飾またはそれらのいずれかの組合せを含む。
ｇＲＮＡに関連して記載されるように、ドナー核酸は、好ましくは、編集プラスミド骨格が、編集カセットが編集プラスミド骨格に挿入される場合に編集ｇＲＮＡおよびドナーＤＮＡの転写を駆動するためのプロモータを含んでもよい、（酵母、好ましくは線状プラスミド骨格における）編集プラスミド骨格に挿入される合理的設計編集カセットの一部として提供される。その上、編集ベクターに挿入された１つより多い、例えば、２つ、３つ、４つ以上の編集ｇＲＮＡ／ドナー核酸合理的設計編集カセットがあってもよく、代替的に、単一の合理的設計編集カセットは、各編集ｇＲＮＡが別々の異なるプロモータ、別々の類似のプロモータの制御下にあるか、または全てのｇＲＮＡ／ドナー核酸対が単一のプロモータの制御下にある２つからいくつかの編集ｇＲＮＡ／ドナーＤＮＡ対を含んでもよい。いくつかの実施形態において、編集ｇＲＮＡおよびドナー核酸の転写を駆動する（または、１つより多い編集ｇＲＮＡ／ドナー核酸対を駆動する）プロモータは、任意選択で誘導性プロモータである。
ドナー核酸に加えて、編集カセットは、１つまたは複数のプライマー部位を含んでもよい。例えば、プライマー部位が、編集カセットの他の成分のうちの１つまたは複数をフランクする場合、オリゴヌクレオチドプライマーを使用することによって編集カセットを増幅するためにプライマー部位を使用することができる。さらに、編集カセットは、バーコードを含んでもよい。バーコードは、バーコードが対応する細胞標的配列に対して為された編集を同定し得るようにドナーＤＮＡ配列に対応する固有のＤＮＡ配列である。バーコードは、典型的には４個以上のヌクレオチドを含む。さらに、編集カセットは、バーコードを保存すると共に、ドナーＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡの制御欠失を可能にする一組のＦＬＰ／ＦＲＴまたはＣｒｅ／Ｌｏｘ組換え部位を含んでもよい。いくつかの実施形態において、編集カセットは、例えば、編集ｇＲＮＡおよびドナー核酸の遺伝子全体またはゲノム全体のライブラリを表す、ｇＲＮＡを編集し、ドナー核酸のコレクションまたはライブラリを含む。編集カセットのライブラリは、例えば異なる各ドナー核酸が異なるバーコードに関連付けられるベクター骨格にクローニングされる。好ましい実施形態において、核酸誘導ヌクレアーゼ系の成分をコードする編集ベクターまたはプラスミドは、特にヌクレアーゼ配列の要素として、約１以上、約２以上、約３以上、約４以上、約５以上、約６以上、約７以上、約８以上、約９以上、約１０以上のＮＬＳなどの１つまたは複数の核局在化配列（ＮＬＳ）を含む核酸誘導ヌクレアーゼもさらにコードする。いくつかの実施形態において、操作されたヌクレアーゼは、アミノ末端における、もしくはその近くのＮＬＳ、カルボキシ末端における、もしくはその近くのＮＬＳ、または組合せを含む。
スプリットタンパク質レポータ系を介してｉｎ ｖｉｖｏでヌクレアーゼ指向編集済み細胞を同定する効率性の増加
本開示は、核酸誘導ヌクレアーゼ編集を行った後で生細胞に対して為された編集のｉｎ ｖｉｖｏ検出の効率性を増加させるために作られる。核酸誘導ヌクレアーゼ編集技術を使用するゲノム編集は、編集ベクターとの相同的組換えを介したヌクレアーゼ誘導ＤＮＡ鎖切断（例えば、二本鎖切断または一本鎖ニック）の正確な修復を必要とする。核酸誘導ヌクレアーゼによって引き起こされる細胞における二本鎖ＤＮＡ切断は、３つの主要な結果、すなわち、１）切断が修復されない場合における細胞死、２）多くの場合インデルにつながる相同的修復鋳型なしで切断を修復する非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、および３）切断を修復するために補助的（ここでは、外因性）相同的ＤＮＡ（例えば、編集ベクターに挿入された編集カセットに由来するドナーＤＮＡ配列）を使用する相同組換え（ＨＲ）が伴う。本方法および組成物は、ＨＲによって編集された細胞のｉｎ ｖｉｖｏ同定のために作られる。
本方法および組成物は、上記の通りの核酸誘導ヌクレアーゼ編集系に加えて、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系と、２つの融合構築物と、編集識別ｇＲＮＡまたは編集標的ｇＲＮＡと、Ｔ７プロモータの制御下におけるレポータ遺伝子とを含むスプリットタンパク質レポータ系を利用する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの型および亜型の中心的特徴は、非常に遺伝子的にかつ機能的に多様な、異なるｃａｓタンパク質である。互いに固有のシグネチャ遺伝子、すなわち、Ｉ型系におけるＣａｓ３、ＩＩ型系におけるＣａｓ９、およびＩＩＩ型系におけるＣａｓ１０によって区別される３つの主要な型のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系がある。Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ系は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて編集済み細胞を同定するための手がかりを提供するために本方法および組成物において活用される標的ＤＮＡを分解するために、２成分構造を利用する。Ｉ型系において、シグネチャ遺伝子であるＣａｓ３は、ヘリカーゼ活性を有する巨大タンパク質をコードする。
Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のエフェクタ複合体は、Ｉ型Ｃ系においてはＣａｓ５ｃ、Ｃａｓ７ｃおよびＣａｓ８ｃタンパク質サブユニットから、Ｉ型Ｅ系においてはＣａｓＡ／Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃａｓ７ｅ、Ｃａｓ５ｅおよびＣａｓ６ｅから構成される、緻密な構築物を示す。Ｃａｓ５ｃサブユニットは、ｃｒＲＮＡの５’－ハンドルに結合し、大きいＣａｓ８ｃサブユニットと相互作用する。（Ｃａｓ５ｃ、Ｃａｓ７ｃ、Ｃａｓ８ＣおよびｃｒＲＮＡから構成される）Ｉ型Ｃカスケード複合体は、標的ＤＮＡ配列に結合し、ＲＮＡガイドおよび標的ＤＮＡ鎖とＲループ複合体を形成する。Ｒループ形成後、カスケード複合体は、非標的鎖をニッキングし、かつ前進性ＤＮＡ分解を開始するＣａｓ３をリクルートする。Ｉ型Ｃ系が、例えば、最適な細胞へのペイロード送達を減少させることになる、それらのより小さい大きさのために好ましいものの、Ｉ型Ｃ系またはＩ型Ｅ系のいずれかを利用してもよい。
本方法および組成物は、特定のＤＮＡ配列に対するカスケード複合体の高忠実の標的化に対して特異的な細胞内のシグナル増幅事象を開始するためのカスケード複合体標的認識の際のＣａｓ３リクルートの自然機序に対して作られる。非活性化Ｃａｓ３（ｄＣａｓ３）にスプリットタンパク質の半分を付着させ、カスケードのタンパク質成分にスプリットタンパク質のもう一方の半分を付着させることによって、カスケード複合体が識別可能なＲループを形成し、正しい標的ＤＮＡ配列と複合体を形成した場合にのみタンパク質の２つのスプリット部分が一体となる系が作製される。
本方法によれば、多くの異なるタンパク質を使用してもよいが、特に興味深いものは、タンパク質相補性アッセイにおける使用のためにすでに検証されているＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ＲＮＡＰ）である（例えば、シスら（Ｓｈｉｓ，ｅｔ ａｌ．）、ＰＮＡＳ、１１０：および５０２８～５０３３（２０１３）；およびプーら（Ｐｕ，ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ１３：４３２～４３８（２０１７）参照）。スプリットＴ７ ＲＮＡＰの場合、好ましい実施形態において、Ｃ末端Ｔ７ ＲＮＡＰ断片（例えば、アミノ酸１８１～８８３）は、（Ｉ型Ｃ系における）Ｃａｓ５ｃのＣ末端または（Ｉ型Ｅ系における）ｃａｓＡ／ｃｓｅ１タンパク質のＣ末端を介してカスケード複合体に融合し、Ｔ７ ＲＮＡＰ断片のＮ末端（例えば、アミノ酸１～１７９）は、非活性化ｄＣａｓ３タンパク質のＮ末端に融合している。Ｔ７ ＲＮＡＰのＣ末端を含むカスケードタンパク質は、カスケード複合体を形成する編集識別ｃｒＲＮＡと複合体を形成する。カスケード複合体および標的配列の認識の際（例えば、標的配列が意図された編集を含み、Ｒループが形成される）、ならびにＴ７ ＲＮＡＰのＮ末端に融合したｄＣａｓ３のリクルートの際、スプリットＴ７ ＲＮＡＰの２つの半分は近接し、活性Ｔ７ポリメラーゼが生じる。活性のＴ７ポリメラーゼは、細胞に導入される線状ｄｓＤＮＡ断片または環状ｄｓＤＮＡ断片を転写することができる。
本方法において、Ｔ７ポリメラーゼによって転写される線状ｄｓＤＮＡは、レポータ遺伝子、例えば、例示的な実施形態において、Ｔ７プロモータの制御下におけるルシフェラーゼ遺伝子（または、緑色蛍光タンパク質コード配列などの蛍光タンパク質、抗生物質耐性遺伝子、細胞表面マーカをコードする遺伝子など）に対するコード配列を含む。再構成されたＴ７ポリメラーゼは、Ｔ７プロモータに結合し、レポータ遺伝子コード配列を転写する。レポータ遺伝子がルシフェラーゼをコードする場合、転写配列は、ルシフェラーゼ酵素に翻訳される。ルシフェラーゼの基質であるルシフェリンが存在する場合、ルシフェラーゼは、２工程酸化処理を触媒して光を生じ、それによって、ＦＡＣＳにおいて細胞を選別するのに充分な蛍光が得られ、ひいては意図された編集を有する細胞の集団の単離が可能になる。
本開示が与えられる当業者は、本明細書における考察が、カスケードタンパク質複合体のＣ末端（例えば、Ｉ型Ｃ系におけるｃａｓ５ｃのＣ末端、またはＩ型Ｅ系におけるｃｓｅ１もしくはｃａｓＡのＣ末端）にＴ７ ＲＮＡＰのＣ末端部分を融合させることと、Ｔ７ ＲＮＡＰのＮ末端部分をｄＣａｓ３のＮ末端に融合させることとに焦点を合わせるものの、代替的実施形態が、Ｔ７ ＲＮＡＰのＣ末端部分をｄＣａｓ３のＣ末端に融合させることと、Ｔ７ ＲＮＡＰのＮ末端部分をカスケードタンパク質複合体のＮ末端（例えば、Ｉ型Ｃ系におけるｃａｓ５ｃのＮ末端、またはＩ型Ｅ系におけるｃｓｅ１もしくはｃａｓＡのＮ末端）に融合させることとを想定することに留意するべきである。追加的に、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を利用するスプリットタンパク質レポータ系の他の組合せは、前記組合せが、標的ＤＮＡ配列における意図された編集の認識の際におけるカスケード複合体の形成と、Ｒループの形成と、ｄＣａｓ３のリクルートと、スプリットタンパク質の活性の再構成とを含む限り、想定されてもよい。
図１Ａは、核酸誘導ヌクレアーゼ編集を介して適切に編集された細胞のｉｎ ｖｉｖｏ検出のための簡潔な工程図である。方法の第１工程１００において、カスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｃ末端融合構築物およびｄＣａｓ３－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｎ末端融合構築物を合成する（１０２）。Ｔ７ ＲＮＡＰのＮ末端部分とＣ末端部分の間の適切な「スプリット」は、前記２つの部分が互いに近接すると再構成されたポリメラーゼを生成するものであるが、実験に基づいて決定され得る。ポリメラーゼは、ｄＣａｓ３とカスケード複合体の会合による物理的近接がない状態でＴ７ ＲＮＡＰのＮ末端部分とＣ末端部分の間の自発的な会合がない位置で「スプリット」されるが、ｄＣａｓ３とカスケード複合体との会合が存在する場合、「スプリット」は、ポリメラーゼのＮ末端部分とＣ末端部分の会合、すなわちポリメラーゼ活性の再構成を可能にしなければない。ポリメラーゼのための適切な「スプリット」が決定されると、適切なカスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ融合構築物およびｄＣａｓ３－Ｔ７－ＲＮＡＰ融合構築物を設計し、合成することが可能になる。一実施形態において、Ｔ７ ＲＮＡＰのＮ末端部分は、Ｔ７ ＲＮＡＰタンパク質のおおよそアミノ酸１～１７９を含み、Ｔ７ ＲＮＡＰのＣ末端部分は、Ｔ７ ＲＮＡＰタンパク質のおおよそアミノ酸１８１～８８３を含む。例示的な一実施形態において、Ｔ７ ＲＮＡＰのＣ末端部分は、カスケードタンパク質複合体のＣ末端（例えば、Ｉ型Ｃ系におけるｃａｓ５ｃのＣ末端、またはＩ型Ｅ系におけるｃｓｅ１もしくはｃａｓＡのＣ末端）に融合しており、Ｔ７ ＲＮＡＰのＮ末端部分はｄＣａｓ３のＮ末端に融合している。
適切なカスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｃ末端融合構築物およびｄＣａｓ３－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｎ末端融合構築物は、合成されると、最適な細胞に形質転換される（１１０）ベクターに挿入される（１０４）。この例示的な実施形態において、最適な細胞は、Ｔ７プロモータの制御下におけるレポータ遺伝子のコード配列を含み、編集識別ｇＲＮＡまたは編集標的ｇＲＮＡに対する配列を含む。しかし、代替的実施形態において、Ｔ７プロモータの制御下におけるレポータ遺伝子のコード配列および／または編集識別ｇＲＮＡは、（以下に記載される通りの）融合構築物を有するレポータベクター上に、またはエンジンベクターもしくは編集ベクター（これらのベクターは、以下に簡潔に記載される）上に位置してもよい。この例示的な実施形態において、カスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｃ末端融合構築物およびｄＣａｓ３－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｎ末端融合構築物は、核酸誘導ヌクレアーゼコード配列を有するエンジンベクター上にも位置する。代替的な実施形態において、カスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｃ末端融合構築物およびｄＣａｓ３－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｎ末端融合構築物は、（例えば、Ｔ７プロモータの制御下におけるレポータ遺伝子に対するコード配列および／または編集識別ｇＲＮＡと共に）エンジンベクターとは別の単一のレポータベクター上に含まれてもよく、ここで両融合構築物は、同じプロモータの制御下にあるか、または異なるプロモータの制御下にある。さらに別の実施形態において、カスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｃ末端融合構築物およびｄＣａｓ３－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｎ末端融合構築物は、別々のレポータベクター上に含まれてもよい（例えば、図８Ａ～図８Ｄ参照）。さらに別の代替例において、カスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｃ末端融合構築物およびｄＣａｓ３－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｎ末端融合構築物の一方または両方が細胞ゲノムに安定的に統合されてもよい。
本明細書において想定される通りのレポータ遺伝子は、適当なゲノム編集の指標として使用される遺伝子であり、Ｔ７プロモータの制御下にある。Ｔ７プロモータは、長さが１９の塩基対である、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモータである。レポータ遺伝子は、遺伝子発現についての分子生物学において、細胞事象を研究するために広く使用される。典型的には、レポータ遺伝子は、次いで細胞に形質転換されるか、またはトランスフェクトされる発現ベクターにクローニングされる。次いで、細胞は、ＧＦＰ、ＲＦＰおよびＢＦＰなどの蛍光タンパク質、細胞表面マーカまたは抗生物質耐性などのレポータを有する系におけるものなどのレポータタンパク質そのものを直接測定することによって、または基質（例えば、ルシフェラーゼ）上におけるレポータタンパク質の酵素活性を測定することによって、または例えばＲＮＡアプタマーを有する系などの蛍光発生素の存在下で化合物の蛍光を測定することによって、レポータの存在についてアッセイされてもよい。
本方法および組成物において、レポータ遺伝子はＴ７プロモータの制御下にあり、レポータ遺伝子は、カスケード複合体が前記編集済み標的遺伝子座を認識し、前記編集済み標的遺伝子座に結合する場合、カスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｃ末端融合構築物およびｄＣａｓ３－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｎ末端融合構築物の近接を介して、Ｔ７ ＲＮＡＰの活性の再構成の際だけにおいて転写される。緑色蛍光タンパク質および青色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質を用いてもよいが、いくつかの実施形態において、前記組成物は、蛍光タンパク質と比較して感度、ダイナミックレンジおよび多用性が増加しているルシフェラーゼレポータアッセイを用いる。別の場合、ホウレンソウおよびブロッコリーなどのＲＮＡアプタマーも、Ｔ７プロモータの制御下におけるレポータ遺伝子として発現され得、ＤＦＨＢＩ（（５Ｚ）－５－［（３，５－ジフルオロ－４－ヒドロキシフェニル）メチレン］－３，５－ジヒドロ－２－メチル－３－（２，２，２－トリフルオロエチル）－４Ｈ－イミダゾール－４－オン）の存在下で蛍光を示すことができる。生物発光レポータアッセイは、１０～１０００倍高いアッセイ感度を送達するという点で、蛍光アッセイと比較して長所を有する。本明細書において用いることができる通りのルシフェラーゼレポータ技術は、酵素ルシフェラーゼ（「レポータ遺伝子」が対象とするコード配列）と、生物発光の処理によって光を放出する発光基質ルシフェリンとの相互作用に基づく。２つの一般に用いられるルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼであり、前記ホタルルシフェラーゼは翻訳後修飾を必要としない６１ｋＤａの酵素であり、前記ウミシイタケルシフェラーゼも翻訳後修飾を必要としない３６ｋＤａの酵素である。ルシフェラーゼ遺伝子のコード配列にＴ７プロモータを連結することによって、Ｔ７ ＲＮＡＰ活性を再構成するための編集済み標的遺伝子座へのＣ末端Ｔ７ ＲＮＡＰ融合とｄＣａｓ３－Ｎ末端Ｔ７ ＲＮＡＰとを有するカスケード複合体の結合を検出することができる。さらに、上記したように、レポータ遺伝子は、抗生物質耐性によって編集済み細胞を同定することができるように抗生物質耐性遺伝子を含んでもよいか、またはレポータ遺伝子は、細胞表面マーカタンパク質に対する抗体を介して細胞を選別することができるように細胞表面マーカタンパク質を含んでもよい。
スプリットタンパク質レポータ系の第４の成分は、編集識別ｇＲＮＡである。編集識別ｇＲＮＡは、適切に編集された標的配列に特異的に結合し、未編集（例えば、野生型）配列または不正確に編集された配列には結合しないように操作される。この例において、編集識別ｇＲＮＡは、ドナーＤＮＡ（または相同性アーム）を含む編集カセットの一部ではない。その代わりに、編集識別ｇＲＮＡは、カスケード複合体にｄＣａｓ３をリクルートするために使用され、すなわち、編集識別ｇＲＮＡは、配列認識のために使用され、編集を容易にするために使用されない。
したがって、核酸誘導ヌクレアーゼ編集成分およびスプリットタンパク質レポータ系成分は、目的の細胞に形質転換されるか、またはトランスフェクトされなければならない。形質転換は、外因性核酸配列（例えば、エンジンベクターおよび／または編集ベクター）を標的細胞に導入するための、本技術分野で認められている様々な技術を含むことが意図されており、本明細書で使用される通りの「形質転換」という用語は、全ての形質転換技術およびトランスフェクション技術を含む。そのような方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、オプトポレーション、注入、微量沈降、微量注入、リポソーム、粒子衝突、ソノポレーション、レーザ誘導穿孔、ビーズトランスフェクション、リン酸カルシウム共沈もしくは塩化カルシウム共沈、またはＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクションが挙げられるが、それらに限定されるものではない。例えば、スクロース洗浄物、ソルビトール洗浄物またはグリセロール洗浄物を使用するベクター取り込みのために、細胞を調製することもできる。追加的に、機械的トランスフェクション方法および化学的トランスフェクション方法の能力を活用するハイブリッド技術、例えば、化学的トランスフェクションを機械的方法と組み合わせるトランスフェクション方法であるマグネトフェクションを使用することができる。別の例において、カチオン性脂質が遺伝子銃またはエレクロトポレータと併用して採用され得る。標的細胞を形質転換するか、またはトランスフェクトするための適切な材料および方法は、例えば、グリーンおよびサンブルック（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第４版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、２０１４）に見出され得る。自動化多モジュール細胞処理器具を使用する本自動化方法は、図５Ｂ～図５Ｆに示される例示的なデバイスなどのフロースルーエレクトロポレーションを利用する。
同時に、または次に、編集カセットライブラリを設計する（１０６）。編集カセットを設計し、合成するための方法および組成物は、米国特許第１０，２４０，１６７号、米国特許第１０，２６６，８４９号、米国特許第９，９８２，２７８号、米国特許第１０，３５１，８７７号、米国特許第１０，３６４，４４２号および米国特許第１０，４３５，７１５号、ならびに２０１９年２月１４日に出願された米国特許出願第１６／２７５，４６５号に記載されている。２０１９年２月１４日に出願された米国特許出願第１６／２７５，４６５号には、本明細書に記載される組成物および方法のいくつかの実施形態において使用される化合物編集カセットが記載されている。化合物編集カセットは、１つより多いｇＲＮＡと１つより多いドナーＤＮＡとを含む編集カセットである。編集カセットのライブラリは、設計され、合成されると（１０６）、増幅され、精製され、編集ベクターに挿入されて（１０８）、編集ベクターのライブラリを生成する。次いで、編集ベクターのライブラリを、すでにカスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｃ末端融合構築物およびｄＣａｓ３－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｎ末端融合構築物で形質転換されている細胞に形質転換する（１１０）。代替的実施形態において、編集ベクター、エンジンベクターおよび（１つまたは複数の）レポータベクターを同時に細胞に形質転換してもよい。さらに他の実施形態において、スプリットタンパク質レポータ系のための成分の内の１種または複数種を細胞ゲノムに統合してもよい。
形質転換されると、細胞を回収することが可能であり、（１つまたは複数の）レポータベクター、エンジンベクターおよび／または編集ベクター（これら全てがほとんど多くの場合選択可能マーカを含む）で形質転換される細胞について選択するために、任意選択で選択を行う。上記のように、アンピシリン／カルベニシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、ノウルセオトライシンＮ－アセチルトランスフェラーゼ、エリスロマイシン、テトラサイクリン、ゲンタマイシン、ブレオマイシン、ストレプトマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ブラストサイジンおよびＧ４１８などの薬物選択マーカ、または他の選択マーカを用いてもよい。次の工程において、編集が生じるように条件を提供する（１１２）。例えば、ヌクレアーゼまたはｇＲＮＡ／ドナーＤＮＡカセットの一方または両方などの編集成分のいずれかが誘導性プロモータの制御下にある場合、（１つまたは複数の）誘導性プロモータを活性化する条件が提供される。細胞が編集されたならば（１１２）、この時、例えばルミネセンスを介して細胞を選択する（例えば、選別する）（１１４）。編集済み細胞について細胞が濃縮されるように細胞が選別されたならば、編集済み細胞を、研究に用いてもよいか、再びエレクトロコンピテントになるように所望のＯＤに増殖させた後、別の回の編集を行ってもよい。
図１Ｂは、ｇＲＮＡが野生型（例えば、未編集）ゲノム標的配列に結合しないスプリットタンパク質系の成分の簡略化された概略図である。Ｔ７プロモータの制御下におけるルシフェラーゼなどのレポータ遺伝子は、図１Ｂの上部にある。編集識別ｇＲＮＡまたは編集標的ｇＲＮＡ、カスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｃ末端融合構築物およびｄＣａｓ３－Ｃ－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｎ末端融合構築物も示される。この例において、標的ゲノム配列は、編集識別ｇＲＮＡによって認識されない「野生型」配列または未編集配列である。編集識別ｇＲＮＡが野生型ゲノム配列を認識しないので、カスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｃ末端融合構築物および編集識別ｇＲＮＡは、目的のゲノム遺伝子座においてＲループ複合体を形成することができない。目的のゲノム遺伝子座においてＲループが形成されない場合、ｄＣａｓ３－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｎ末端融合構築物は目的の遺伝子座にリクルートされず、Ｔ７ ＲＮＡＰのＮ末端部分およびＣ末端部分は近接しない。Ｔ７ ＲＮＡＰのＮ末端部分およびＣ末端部分が近接しない場合、Ｔ７ ＲＮＡＰの活性は再構成されず、Ｔ７プロモータは活性化されず、レポータ遺伝子は転写されない（または翻訳されない）。すなわち、カスケード複合体およびｄＣａｓ３は、Ｔ７ ＲＮＡＰが「再構成」および活性化され得るようにゲノム標的配列に結合することができないので、レポータはサイレントである。
図１Ｃは、編集済みゲノム標的配列があるが、編集済みゲノム標的配列は、正確なまたは所望の編集ではないスプリットタンパク質系の成分の簡略化された概略図である。この例において、編集識別ｇＲＮＡは、不正確に編集されたゲノム標的配列に結合しない。図１Ｂと同様に、図１Ｃの上部に、Ｔ７プロモータの制御下にあるルシフェラーゼなどのレポータ遺伝子がある。ｇＲＮＡ、カスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｃ末端融合構築物およびｄＣａｓ３－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｎ末端融合構築物も示される。ここで、標的ゲノム配列は、例えば、正確で所望の編集を生じる相同組換え（ＨＲ）によってではなく、相同的修復なしで標的ゲノムにおける二本鎖の切断を修復する非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって引き起こされる編集から生じる「インデル」または不正確な編集配列を含む。野生型ゲノム標的配列と同様に、インデル（例えば、不正確な編集）は、編集識別ｇＲＮＡによって認識されない。編集識別ｇＲＮＡが不正確に編集されたゲノム配列を認識しないので、カスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｃ末端融合構築物およびｇＲＮＡは、ゲノム遺伝子座におけるＲループ複合体を形成することができない。目的の遺伝子座におけるＲループ複合体が形成されない場合、ｄＣａｓ３－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｎ末端融合構築物は目的の遺伝子座にリクルートされず、Ｔ７ ＲＮＡＰのＮ末端部分およびＣ末端部分は近接しない。Ｔ７ ＲＮＡＰのＮ末端部分およびＣ末端部分が近接しない場合、Ｔ７ ＲＮＡＰの活性は再構成されず、Ｔ７プロモータは活性化されず、レポータ遺伝子は転写されない（または翻訳されない）。すなわち、図１Ｂに示される処理と同様に、カスケード複合体およびｄＣａｓ３は、Ｔ７ ＲＮＡＰが「再構成」および活性化され得るようにゲノム標的配列に結合することができないので、レポータはサイレントである。
図１Ｄは、適切に編集されたゲノム標的配列があり、レポータ遺伝子が活性化されるスプリットタンパク質系の成分の簡略化された概略図である。図１Ｄの上部に、Ｔ７プロモータの制御下におけるルシフェラーゼなどのレポータ遺伝子がある。ゲノム標的配列に結合した編集識別ｇＲＮＡ、カスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｃ末端融合構築物およびｄＣａｓ３－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｎ末端融合構築物も示される。この例において、標的ゲノム配列は、編集識別ｇＲＮＡによって認識される、適切に編集された配列である。ここで、編集識別ｇＲＮＡおよびカスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｃ末端融合構築物は標的ゲノム遺伝子座においてＲループ複合体を形成することが可能であり、ここで、ｄＣａｓ３－Ｔ７－ＲＮＡＰ－Ｎ末端融合構築物は標的ゲノム遺伝子座にリクルートされることによって、Ｔ７ ＲＮＡＰのＮ末端部分およびＣ末端部分が機能的に近接することが可能である。Ｔ７ ＲＮＡＰのＮ末端部分およびＣ末端部分が機能的に近接する場合、Ｔ７ ＲＮＡＰの活性が再構成され、Ｔ７プロモータが活性化されることによって、本実施形態においてはルシフェラーゼであるレポータ遺伝子が転写される。この図１Ｄにおいて、検出可能なルミネセンスへのＤ－ルシフェリン（基質）の転化を触媒する、転写された（かつ翻訳された）ルシフェラーゼ酵素を示す概略図も示される。
細胞において核酸誘導ヌクレアーゼ編集を行うための自動化細胞編集器具およびモジュール
自動化細胞編集器具
図２Ａは、例えば、本明細書に記載される通りのスプリットタンパク質レポータ系を含む例示的な作業の流れのうちの１つを行うための例示的な自動化多モジュール細胞処理器具２００を示す。器具２００は、例えば、研究室環境内における使用のためのスタンドアロンデスクトップ器具として設計されてもよく、好ましくは設計される。器具２００は、自動化ゲノム切断の実施、および／または人間の介入なしの細胞における編集における様々な統合された処理を行うための、再使用可能で、かつ使い捨て可能な構成要素の混合物を組み込んでもよい。例えば、人間の介入なしの複数のモジュールの中における細胞処理を可能にする気体置換ピペッター２３２を含む、例えば自動化（すなわち、ロボティック）液体取り扱い系２５８にＸＹＺ軸運動制御を供給する自動化機械的運動系（作動器）（図示せず）を提供するガントリ２０２が示される。いくつかの自動化多モジュール細胞処理器具において、気体置換ピペッター２３２はガントリ２０２によって移動し、様々なモジュールおよび試薬カートリッジは静止したままであるが、他の実施形態では、液体取り扱い系２５８は静止したままであってもよいが、一方で様々なモジュールおよび試薬カートリッジは移動する。自動化多モジュール細胞処理器具２００には、貯留器２１２および形質転換モジュール２３０（例えば、図５Ｂ～図５Ｆに関連して詳細に記載される通りのフロースルーエレクトロポレーションデバイス）ならびに洗浄貯留器２０６、細胞入力貯留器２５１および細胞出力貯留器２５３を含む試薬カートリッジ２１０も含まれる。洗浄貯留器２０６は、大きいチューブ、例えば、洗浄溶液、または、多くの場合、反復的処理にわたって使用される溶液を収容するように構成されてもよい。試薬カートリッジ２１０の内の２つは、図２Ａにおいて洗浄貯留器２０６を含むものの、洗浄貯留器は、その代わりに、試薬カートリッジおよび洗浄カートリッジが別々のカートリッジである洗浄カートリッジに含まれることが可能である。そのような場合、試薬カートリッジ２１０および洗浄カートリッジ２０４は、その中に挿入される消耗品（様々な挿入物の中に含まれる試薬または他の構成要素）を除いて同一であってもよい。
いくつかの実施態様において、試薬カートリッジ２１０は、自動化多モジュール細胞処理／編集器具２００における使用のための試薬および細胞を含む使い捨て可能なキットである。例えば、使用者は、細胞処理を活性化する前に、自動化多モジュール細胞編集器具２００のシャシーの中に、様々な所望の挿入物および試薬を含む試薬カートリッジ２１０の各々を開き、位置決めしてもよい。さらに、試薬カートリッジ２１０の各々は、その中に含まれる試薬のために適切な異なる温度ゾーンを有するシャシー内の収納部に挿入されてもよい。
図２Ａには、ガントリ２０２と気体置換ピペッター２３２とを含むロボティック液体取り扱い系２５８も示される。いくつかの例において、ロボティック取り扱い系２５８は、スイス、メンネドルフ（Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のテカングループ社（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．）、米国ネバダ州リノ（Ｒｅｎｏ、ＮＶ）のハミルトン・カンパニー（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）（例えば、ＷＯ２０１８０１５５４４Ａ１参照）、または米国コロラド州フォートコリンズ（Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ、ＣＯ．）のベックマン・コールター社（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）（例えば、ＵＳ２０１６００１８４２７Ａ１参照）によって製造されるものなどの自動化液体取り扱い系を含んでもよい。ピペットチップは、気体置換ピペッター２３２と共に使用するためのピペットトランスファーチップ供給源（図示せず）において提供されてもよい。
いくつかの実施態様において、試薬カートリッジ２１０の挿入物または構成要素は、ロボティック取り扱い系２５８による認識のための、機械で読み取り可能な表示（図示せず）、例えば、バーコードでマークされる。例えば、ロボティック液体取り扱い系２５８は、試薬カートリッジ２１０の各々の中の１つまたは複数の挿入物を走査して、内容物を確認してもよい。他の実施態様において、機械で読み取り可能な表示は、各試薬カートリッジ２１０上にマークされてもよく、自動化多モジュール細胞編集器具２００の処理系（図示しないが、図２Ｂの要素２３７参照）は、機械で読み取り可能な表示に基づいて保存材料マップを同定してもよい。図２Ａに示される実施形態において、細胞増殖モジュールは、（図３Ａ～図３Ｄに関連して、以下でさらに詳細に記載される）細胞増殖バイアル２１８を含む。追加的に、（図４Ａ～図ａＥに関連して、上記で詳細に記載される）ＴＦＦモジュール２２２が示される。例えば、ロボティック液体手渡し系（ｒｏｂｏｔｉｃ ｌｉｑｕｉｄ ｈａｎｄｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）２５８および気体置換ピペッター２３２が適合する、図６Ｃ～図６Ｆに関連して、本明細書に記載される個別化モジュール２４０（ここで、例えば、固体壁単離、インキュベーションおよび規格化デバイス（ＳＷＩＩＮデバイス）が示される）も、図２Ａの自動化多モジュール細胞処理器具２００の一部として示される。追加的に、選択モジュール２２０が示される。３つのヒートシンク２５５の配置にも留意されたい。
図２Ｂは、図２Ａに示される例示的な多モジュール細胞処理器具２００の内容物の簡略化された図である。例えば、カートリッジベース源材料（例えば、試薬カートリッジ２１０における）は、気体置換ピペッター２３２によるアクセスのための器具２００のデッキ上の所定領域内に位置してもよい。多モジュール細胞処理器具２００のデッキは、器具２００のモジュールのいずれかから流出するか、滴るか、またはあふれる汚染物が保護シンクのリップ内に含まれるように、保護シンクを含んでもよい。異なる領域のために適切な温度ゾーンを生じることが可能な熱的構築体２１１と共に設けられることが示される試薬カートリッジ２１０も示される。なお、試薬カートリッジのうちの１つは、ＦＴＥＰインターフェース（例えば、マニホールドアーム）および作動器２３１が適合するフロースルーエレクトロポレーションデバイス２３０（ＦＴＥＰ）も含む。ＴＦＦインターフェース（例えば、マニホールドアーム）および作動器２３３がＴＦＦモジュールに適合する、隣接する熱的構築体２２５を有するＴＦＦモジュール２２２も示される。熱的構築体２２５、２３５および２４５は、ペルチェデバイスなどの熱電子デバイス、ならびにヒートシンク、ファンおよび冷却器を包含する。回転増殖バイアル２１８は、２つの熱的構築体２３５が増殖モジュールに適合する増殖モジュール２３４の中にある。選択モジュールは、２２０で示される。ＳＷＩＩＮモジュールが、熱的構築体２４５、照明２４３（本実施形態において、背面照明）、蒸発および凝結制御部２４９も含み、ＳＷＩＩＮインターフェース（例えば、マニホールドアーム）および作動器２４７がＳＷＩＩＮモジュールに適合する、ＳＷＩＩＮカートリッジ２４１を含むＳＷＩＩＮモジュール２４０も示される。この図において、タッチスクリーンディスプレイ２０１、ディスプレイ作動器２０３、照明２０５（多モジュール細胞処理器具２００の両側のもの）およびカメラ２３９（多モジュール細胞処理器具２００の両側の照明デバイス）も示される。最後に、要素２３７は、回路制御板、高電圧増幅器、電源および電力エントリなどの電子機器、ならびにポンプ、弁およびセンサなどの空気圧機器を含む。
図２Ｃは、自動化多モジュール細胞編集器具２００のデスクトップバージョンにおける使用のための多モジュール細胞処理器具２００の正面斜視図を示す。例えば、シャシー２９０は、幅が約６０．９６センチメートル（約２４インチ）～１２１．９２センチメートル（４８インチ）、高さが約６０．９６センチメートル（約２４インチ）～１２１．９２センチメートル（４８インチ）、および深さが約６０．９６センチメートル（約２４インチ）～１２１．９２センチメートル（４８インチ）であってもよい。シャシー２９０は、自動化細胞処理において使用される全てのモジュールおよび使い捨て可能供給品を保持し、かつ人間の介入なしで必要とされる全ての処理を行うように設計されてもよく、好ましくは設計され、すなわち、シャシー２９０は、統合されたスタンドアロン自動化多モジュール細胞処理器具を提供するように構成される。図２Ｃに示されるように、シャシー２９０は、タッチスクリーンディスプレイ２０１と、内部ファン（図示せず）を介した空気の流れを可能にする冷却格子２６４とを含む。タッチスクリーンディスプレイは、自動化多モジュール細胞編集器具２００の処理状態に関する情報を使用者に提供し、細胞処理を行うための使用者からの入力を受け入れる。本実施形態において、シャシー２９０は、調整可能脚部２７０ａ、２７０ｂ、２７０ｃおよび２７０ｄによって持ち上げられる（この図２Ｃでは、脚部２７０ａ～２７０ｃが示される）。調整可能脚部２７０ａ～２７０ｄは、例えば、シャシー２９０の下のさらなる空気の流れを可能にする。
いくつかの実施態様において、ガントリに沿って設けられるロボティック液体取り扱い系、フロースルーエレクトロポレーションデバイスを含む試薬カートリッジ２１０、細胞増殖モジュール２３４における回転増殖バイアル２１８、タンジェントフロー濾過モジュール２２２、ＳＷＩＩＮモジュール２４０、ならびに様々なモジュールのためのインターフェースおよび作動器を含む、図２Ａおよび図２Ｂに関連して記載される構成要素のほとんど、または全ては、シャシー２９０の内部にある。さらに、シャシー２９０は、制御回路、液体取り扱いチューブ、空気ポンプ制御部、弁、センサ、熱的構築体（例えば、加熱部および冷却部）および他の制御機構を収容する。多モジュール細胞編集器具の例について、全体が本願明細書に援用される、２０１９年４月９日に発行された米国特許第１０，２５３，３１６号、２０１９年６月２５日に発行された米国特許第１０，３２９，５５９号、２０１９年６月１８日に発行された米国特許第１０，３２３，２４２号、２０１９年９月２４日に発行された米国特許第１０，４２１，９５９号、２０１９年１１月５日に発行された米国特許第１０，４６５，１８５号、２０１９年５月１４日に出願された米国特許出願第１６／４１２，１９５号、２０１９年９月１４日に出願された米国特許出願第１６／５７１，０９１号、および２０１９年１０月２９日に出願された米国特許出願第１６／６６６，９６４号を参照されたい。
回転細胞増殖モジュール
図３Ａは、細胞増殖デバイスと共に、本明細書に記載される自動化多モジュール細胞処理器具において使用するための回転増殖バイアル３００の一実施形態を示す。回転増殖バイアル３００は、液体培地および細胞を収容するための開口端３０４と、細胞を増殖させるための１次容器を規定する中央バイアル領域３０６と、少なくとも１つの光路３１０を規定する先細り～収縮領域（ｔａｐｅｒｅｄ－ｔｏ－ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）３１８と、閉成端３１６と、駆動係合機構３１２とを有する光学的に透明な容器である。回転増殖バイアル３００は、バイアルが回転する中央長手方向軸線３２０を有し、光路３１０は、バイアルの長手方向軸線に対して概して垂直である。第１光路３１０は、先細り～収縮領域３１８の下側の収縮部分内に位置する。任意選択で、回転増殖バイアル３００のいくつかの実施形態は、先細り～収縮領域３１８の先細り領域内の第２光路３０８を有する。本実施形態における両光路は、常に細胞培養物（細胞＋増殖培地）が充填される回転増殖バイアルの領域内に位置し、増殖バイアルの回転速度に影響を受けない。第１光路３１０は、第２光路３０８よりも短いが、このことは、バイアル内の細胞培養物のＯＤ値が（例えば、細胞増殖処理における後期に）高レベルである場合にＯＤ値の感度が高い測定を可能にするが、一方で第２光路３０８は、バイアル内の細胞培養物のＯＤ値が（例えば、細胞増殖処理における早期に）より低いレベルである場合に、ＯＤ値の感度が高い測定を可能にする。
駆動係合機構３１２は、モータ（図示せず）に係合して、バイアルを回転させる。いくつかの実施形態において、モータは、回転増殖バイアル３００が一方向にのみ回転し、他の実施形態において、回転増殖バイアル３００が、第１の時間または周期で第１方向に回転し、第２の時間または周期で第２方向（すなわち、逆方向）に回転するように、駆動係合機構３１２を駆動し、この処理は、回転増殖バイアル３００（および細胞培養内容物）が振動運動に供されるように繰り返されてもよい。さらに、培養物が振動に供されるかどうかの選択と、そのための周期とは、使用者によって選択されてもよい。第１時間および第２時間は、同じであってもよいか、または異なってもよい。時間は、１秒、２秒、３秒、４秒、５秒以上でもよいか、または１分、２分、３分、４分以上であってもよい。別の実施形態において、細胞増殖の早期の段階において、回転増殖バイアル４００を、第１周期（例えば、６０秒毎）で振動させてもよく、次いで、細胞増殖の後期段階で、回転増殖バイアル３００を、第１周期と異なる第２周期（例えば、１秒毎）で振動させてもよい。
回転増殖バイアル３００は、再使用可能でもよいか、または、好ましくは、回転増殖バイアルは消耗可能であってもよい。いくつかの実施形態において、回転増殖バイアルは、消耗可能であり、事前に増殖培地が充填されていることが使用者に示され、ここでバイアルは、箔シールで開口端３０４において密封される。このような方法で包装された培地充填回転増殖バイアルは、スタンドアロン細胞増殖デバイスと共に、または自動化多モジュール細胞処理系の一部である細胞増殖モジュールと共に使用するためのキットの一部であってもよい。バイアルに細胞を導入するために、使用者は、所望の量の細胞をピペットで吸い上げ、ピペットチップを使用してバイアルの箔シールを穿孔するだけでよい。開口端３０４は、細胞増殖デバイスに重なり、係合するために、延長リップ４０２を任意選択で含んでもよい。自動化された系において、回転増殖バイアル４００は、自動化された系の一部である走査器またはカメラ（図示せず）によって読み取ることが可能なバーコードまたは他の同定手段が付けられてもよい。
回転増殖バイアル３００の量と、（増殖培地を含む）細胞培養物の量とは、大きく変化してもよいが、回転増殖バイアル３００の量は、指定総数の細胞を生成するために充分大きくなければならない。実際には、回転増殖バイアル４００の量は、１～２５０ｍＬ、２～１００ｍＬ、５～８０ｍＬ、１０～５０ｍＬ、または１２～３５ｍＬの範囲であってもよい。同様に、細胞培養物（細胞＋増殖培地）の量は、回転増殖バイアル４００内における適当な通気および混合を可能にするために適切であるべきである。適当な通気によって、増殖培地中の均一な細胞呼吸が促進される。したがって、細胞培養物の量は、増殖バイアルの量の約５～８５％、または増殖バイアルの量の２０～６０％であるべきである。例えば、３０ｍＬの増殖バイアルについて、細胞培養物の量は、約１．５ｍＬ～約２６ｍＬ、または６ｍＬ～約１８ｍＬである。
回転増殖バイアル３００は、好ましくは、生物適合性の光学的に透明な材料から製作されるか、または（１つまたは複数の）光路を含むバイアルの少なくとも部分が透明である。追加的に、温度ベース細胞アッセイおよび低温での長期保管の両方に対応するために、回転増殖バイアルが製作される材料を約４℃以下に冷却し、約５５℃以上に加熱することが可能であるべきである。さらに、バイアルを製作するために使用される材料は、スピンの間に変形することなく最高で５５℃の温度に耐えることが可能でなければならない。適切な材料としては、環式オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ガラス、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリアミド、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリスルホン、ポリウレタン、ならびにこれらおよび他のポリマーのコポリマーが挙げられる。好ましい材料としては、ポリプロピレン、ポリカーボネートまたはポリスチレンが挙げられる。いくつかの実施形態において、回転増殖バイアルは、例えば、射出成形または押出しによって、安価に製作される。
図３Ｂは、細胞増殖デバイス３３０の一実施形態の斜視図である。図３Ｃは、図３Ｂの細胞増殖デバイス３３０の切断図を示す。両図において、回転増殖バイアル３００は、主要ハウジング３３６の上に延長する回転増殖バイアル３００の延長リップ３０２を有する主要ハウジング３３６の内部に位置することが示される。追加的に、端部ハウジング３５２、下側ハウジング３３２およびフランジ３３４が両図に示される。フランジ３３４は、細胞増殖デバイス３３０を加熱／冷却手段または他の構造（図示せず）に取り付けるために使用される。図３Ｃは、追加的な詳細を示す。図３Ｃにおいて、上側ベアリング３４２および下側ベアリング３４０は、主要ハウジング３３６内に位置することが示される。上側ベアリング３４２および下側ベアリング３４０は、回転増殖バイアル３００の垂直荷重を支持する。下側ハウジング３３２は、駆動モータ３３８を含む。図３Ｃの細胞増殖デバイス３３０は、２つの光路、すなわち、１次光路３４４および２次光路３５０を含む。光路３４４は、回転増殖バイアル３００の先細り～収縮部分の収縮部分内に位置する光路３１０に相当し、光路３５０は、回転増殖バイア（ｒｏｔａｔｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｖｉａ）３１６の先細り～収縮部分の先細り部分内の光路３０８に相当する。光路３１０および３０８は、図３Ｃに示されないが、図３Ａに示され得る。光路３４４および３４０に加えて、（１つまたは複数の）光路を照明するための発光板３４８と、光が回転増殖バイアル３００内の細胞培養液を進行した後で光を検出するための検出器板３４６とがある。
モータ３３８は、駆動機構３１２と係合し、回転増殖バイアル３００を回転させるために使用される。いくつかの実施形態において、モータ３３８は、０から約３０００ＲＰＭの間の一定の毎分回転数（ＲＰＭ）を保持するように設定され得る、組み込まれた駆動制御部を有するブラシレスＤＣ型駆動モータである。別の場合、ステッパ、サーボ、ブラシ付きＤＣおよび同種のものなどの他のモータ型を使用することが可能である。任意選択で、モータ３３８は、回転方向の逆転を可能にするための方向制御部と、実際のＲＰＭを検知し、かつ報告するためのタコメータとを有してもよい。モータは、例えば、処理装置にプログラムされる標準的プロトコールおよび／または使用者の入力に従って、処理装置（図示せず）によって制御され、モータは、ＲＰＭを変化させて、細胞培養物の軸線方向の歳差を引き起こすことによって、混合を増強して、例えば、細胞凝集を阻止し、通気を増加させ、細胞呼吸を最適化するように構成されてもよい。
細胞増殖デバイス３３０の主要ハウジング３３６、端部ハウジング３５２および下側ハウジング３３２は、アルミニウム、ステンレス鋼、およびプラスチックなどの他の熱伝導性材料など、任意の適切で堅牢な材料から製作されてもよい。これらの構造またはそれらの部分は、様々な技術、例えば、金属製作、射出成形、融合された構造層の作製などによって作製され得る。回転増殖バイアル３００は、いくつかの実施形態において、再使用可能であるが、好ましくは消耗可能であることが想定されるのに対して、細胞増殖デバイス３３０の他の構成要素は、好ましくは再使用可能であり、スタンドアロンベンチトップデバイスとして、または多モジュール細胞処理系におけるモジュールとして機能する。
細胞増殖デバイス３３０の処理装置（図示せず）は、増殖細胞培養物のための「ブランク」または対照として使用される情報によってプログラムされてもよい。「ブランク」または対照は、１００％の透過率と０のＯＤとを生じる細胞増殖培地だけを含む容器であるが、一方で細胞試料は、光線を屈折させ、より低いパーセント透過率と、より高いＯＤとを有する。細胞が培地中で増殖し、密度がより高くなるにつれて、透過率は減少し、ＯＤは増加する。細胞増殖デバイス３３０の処理装置（図示せず）は、典型的には、細胞培養物（例えば、哺乳動物細胞、細菌細胞、動物細胞、酵母細胞などであるかを問わない）において使用される増殖培地に相応したブランクのための波長値を使用するためにプログラムされてもよい。別の場合、第２の分光光度計および容器は、細胞増殖デバイス３３０内に含まれてもよく、ここで第２の分光光度計は、所定の間隔でブランクを読み取るために使用される。
図３Ｄは、光源３９０と、検出器３９２と、熱的構成要素３９４とに結合された図３Ｂの細胞増殖デバイス３３０を含む構築体の一部としての細胞増殖デバイス３３０を示す。回転増殖バイアル３００は、細胞増殖デバイスに挿入される。光源３９０および（例えば、５－ｌｏｇをカバーするための利得制御によるフォトダイオードなどの）検出器３９２の構成要素は、細胞増殖デバイスの主要ハウジングに連結される。回転増殖バイアル３００を回転させるモータを収容する下側ハウジング３３２が、細胞増殖デバイス３３０を構築体に固定するフランジ３３４のうちの１つとして示される。示される熱的構成要素３９４は、ペルチェデバイスまたは熱電冷却器でもある。本実施形態において、熱的制御部は、下側ハウジング３３２の基部上のフランジ３３４を介した熱的構成要素３９４への細胞増殖デバイス３３０の取り付けおよび電気的組込みによって達成される。熱電冷却器は、接合部の両側に熱を「ポンプ移送」し、電流フローの方向に依存して表面を冷却するか、または表面を加熱することが可能である。一実施形態において、サーミスタは、主要ハウジングの温度を測定するために使用され、次いで、標準的電子比例積分微分（ＰＩＤ）制御器ループによって、回転増殖バイアル３００は、約±０．５℃に制御される。
使用において、箔シールまたは膜に穴をあけることによって、回転増殖バイアル３００の事前に充填された増殖培地中に、細胞を接種する（例えば、自動化液体取り扱い系から、または使用者によって、細胞をピペットで移すことができる）。細胞増殖デバイス３３０のプログラムされたソフトウェアは、制御部温度を、増殖のために、典型的には３０℃に設定し、次いで、回転増殖バイアル３００の回転を徐々に開始する。細胞／増殖培地混合物は、遠心力のために壁を垂直に徐々に上がり、それによって、回転増殖バイアル３００は、混合物の広い表面積を正常酸素環境に曝露させる。増殖モニタリング系は、事前に設定された、または事前にプログラムされた時間間隔で、ＯＤの連続読取値またはＯＤ測定値のいずれかを受け取る。これらの測定値は、内部メモリに保存され、要求された場合、ソフトウェアは、増殖曲線を表示するために、時間に対する測定値をプロットする。例えば増殖条件を最適化するために、増強された混合が必要とされる場合、液体の軸線方向の歳差を引き起こすためにバイアル回転の速度を変化させることが可能であり、かつ／または、プログラムされた間隔で完全な方向変化を行うことが可能である。所定のＯＤで増殖段階を自動的に終了させ、次いで、より低い温度に混合物を迅速に冷却して、さらなる増殖を阻害するために、増殖モニタリングをプログラムすることが可能である。
細胞増殖デバイス３３０のための１つの適用は、増殖細胞培養物の光学密度を常に測定することである。記載される細胞増殖デバイスの１つの長所は、光学密度を連続的に（キネティックモニタリング）または特定の時間間隔で、例えば、５秒毎、１０秒毎、１５秒毎、２０秒毎、３０秒毎４５秒毎もしくは６０秒毎、または１分毎、２分毎、３分毎、４分毎、５分毎、６分毎、７分毎、８分毎、９分毎もしくは１０分毎に測定することが可能であるということである。細胞増殖デバイス３３０は、増殖細胞培養物の光学密度（ＯＤ）を測定する文脈で記載されたが、細胞培養物ＯＤに加えて、または前記細胞培養物ＯＤの代わりに、他の細胞増殖パラメータを測定することが可能であることは、本明細書の教示が与えられる当業者によって理解されるべきである。上記記載される固体壁デバイスまたはモジュールに関連する細胞増殖の任意選択の測定と同様に、可視光、ＵＶ光または近赤外（ＮＩＲ）光を使用するスペクトロスコピーによって、細胞培養物中の栄養素および／または廃物の濃度をモニタすることが可能になり、他の分光測定を行ってもよく、すなわち、他のスペクトル特性は、例えば、誘電インピーダンススペクトロスコピー、可視蛍光、蛍光偏光またはルミネセンスを介して測定され得る。追加的に、細胞増殖デバイス４３０は、例えば、溶存酸素、二酸化炭素、ｐＨ、伝導率および同種のものを測定するための追加的なセンサを含んでもよい。回動増殖バイアルおよび細胞増殖デバイスに関するさらなる詳細については、２０１９年３月２１日に出願された米国特許出願第１６／３６０，４０４号および２０１９年３月２１日に出願された米国特許出願第１６／３６０，４２３号を参照されたい。
細胞濃度モジュール
回転増殖バイアルおよび細胞増殖モジュールに関連して上記記載のように、形質転換またはトランスフェクションのために適切な数の細胞を得るために、典型的には、目的の細胞の増殖のために適切な培地中における特定の光学密度に細胞を増殖させるが、有効な形質転換またはトランスフェクションのために、細胞の量を減少させ、緩衝液交換または培地交換を介して細胞をコンピテントにすることが望ましい。したがって、上記の処理のための細胞処理系において所望される１つの亜成分またはモジュールは、細胞のゲノムを操作するか、または編集するために必要な核酸によって前記細胞を形質転換することができるか、またはトランスフェクトすることができるように、増殖することが可能であり、緩衝液交換を行うことが可能であり、かつ／または細胞を濃縮して前記細胞をコンピテントにすることが可能なモジュールまたは成分である。
図４Ａは、保留物部材４２２（上）、浸透部材４２０（中）、および保留物部材４２２と、膜４２４（図４Ａに示されない）と、浸透部材４２０（前記浸透部材４２０も示されない）とを含むタンジェントフロー構築体４１０（下）を示す。図４Ａにおいて、保留物部材４２２は、保留物部材４２２の一方の下側コーナにおいて－具体的には、保留物ポート４２８において－開始し、保留物部材４２２を横切り、上昇し、次いで下降し、横切り、第２保留物ポート４２８における保留物部材４２２の他方の下側コーナで終わる蛇行構成を有するタンジェントフローチャネル４０２を含む。膜またはフィルタ（この図４Ａに示されない）が存在する領域に外接し、チャネル４０２の領域の間に互いに嵌合するエネルギーディレクタ４９１も保留物部材４２２上に示される。本実施形態におけるエネルギーディレクタ４９１は、浸透／濾液部材４２０に嵌合し、（右における）浸透／濾液部材４２０上におけるエネルギーディレクタ構成要素４９１を介した前記浸透／濾液部材４２０との保留物部材４２２の超音波溶接または結合を容易にすることに役立つ。追加的に、皿穴４２３が示され得るが、２つは保留物部材４２２の下部にあり、１つは上部の中央にある。皿穴４２３は、タンジェントフロー構築体４１０を貯留器構築体（この図４Ａには示されないが、図４Ｂに示される）に連結するために使用される。
浸透／濾液部材４２０は、図４Ａの中央に示され、エネルギーディレクタ４９１に加えて、（保留物部材４２２の下部コーナにおける保留物ポート４２８のための貫通孔と嵌合する）各下部コーナにおける保留物ポート４２８のための貫通孔と、浸透部材４２０の上部および中央に位置するタンジェントフローチャネル４０２および２つの浸透／濾液ポート４２６とを含む。本実施形態におけるタンジェントフローチャネル４０２の構造は、蛇行構成および起伏形状を有するが、他の形状を使用してもよい。浸透部材４２０は、保留物部材４２０上の皿穴４２３と一致する皿穴４２３も含む。
この図４Ａに示される保留物部材４２２および浸透部材４２０を含むタンジェントフロー構築体４１０は、図４Ａの左にある。この図において、保留物部材４２２は、図の「上部に」あり、膜（構築体の中でこの図において示されない）は、保留物部材４２２に隣接し、前記保留物部材４２２の下にあり、浸透部材４２０（前記浸透部材４２０も構築体のこの図において示されない）は、前記膜に隣接し、前記膜の下にある。再度、皿穴４２３が示されるが、ここで、保留物部材４２２および浸透部材４２０における皿穴は一致し、貯留器構築体（図４Ａには示されないが、図４Ｂに示される）に設けられる皿穴のためのねじ山または嵌合要素と嵌合するように構成される。
膜またはフィルタは、保留物および浸透部材の間に設けられ、ここで、膜の中を流れることが、流体は可能であるが、細胞は可能ではなく、したがって、前記細胞は、保留物部材に設けられるフローチャネルに保持される。ＴＦＦデバイス／モジュールにおける使用のために適切なフィルタまたは膜は、耐溶剤性であり、濾過の間に汚染がなく、目的の細胞型および大きさを保持することが可能であるものである。例えば、細菌細胞などの小細胞型を保持するために、細孔径は、最小０．２μｍであり得るが、他の細胞型については、細孔径は、最大２０μｍであり得る。実際、ＴＦＦデバイス／モジュールにおいて有用な細孔径は、大きさが０．２０μｍ、０．２１μｍ、０．２２μｍ、０．２３μｍ、０．２４μｍ、０．２５μｍ、０．２６μｍ、０．２７μｍ、０．２８μｍ、０．２９μｍ、０．３０μｍ、０．３１μｍ、０．３２μｍ、０．３３μｍ、０．３４μｍ、０．３５μｍ、０．３６μｍ、０．３７μｍ、０．３８μｍ、０．３９μｍ、０．４０μｍ、０．４１μｍ、０．４２μｍ、０．４３μｍ、０．４４μｍ、０．４５μｍ、０．４６μｍ、０．４７μｍ、０．４８μｍ、０．４９μｍ、０．５０μｍ以上であるフィルタを含む。フィルタは、セルロース混合エステル（セルロースニトレートおよびセルロースアセテート）（ＣＭＥ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルサルホン（ＰＥＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ナイロン、ガラスファイバ、またはレーザエッチングまたは電気化学エッチングの場合のような金属基板などの任意の適切な非反応性材料から製作されてもよい。
チャネル構造４０２の長さは、増殖させる細胞培養物の量と濃縮させる細胞培養物の光学密度とに応じて変化してもよい。チャネル構造の長さは、典型的には、６０ｍｍ～３００ｍｍ、または７０ｍｍ～２００ｍｍ、または８０ｍｍ～１００ｍｍである。フローチャネル４０２の断面構成は、円形、楕円形、長円形、正方形、矩形、台形または不規則である。概してまっすぐな側面を有する正方形、矩形または他の形状である場合、断面は、幅が約１０μｍ～１０００μｍ、または幅が２００μｍ～８００μｍ、または幅が３００μｍ～７００μｍ、または幅が４００μｍ～６００μｍであり、高さが約１０μｍ～１０００μｍ、または高さが２００μｍ～８００μｍ、または高さが３００μｍ～７００μｍ、または高さが４００μｍ～６００μｍである。フローチャネル１０２の断面が概して円形、長円形または楕円形である場合、チャネルの半径は、水力半径が約５０μｍ～１０００μｍ、または水力半径が５μｍ～８００μｍ、または水力半径が２００μｍ～７００μｍ、または水力半径が３００μｍ～６００μｍの幅、または水力半径が約２００～５００μｍであってもよい。その上、保留物部材４２２および浸透部材４２０におけるチャネルの量は、各部材におけるチャネルの深さに応じて異なってもよい。
図４Ｂは、図４Ａに示されるタンジェントフロー構築体４１０と共に使用されるように構成された貯留器構築体４５０の正面斜視図（右）および後面斜視図（左）を示す。浸透貯留器４５４の両側の保留物貯留器４５２は、正面斜視図（例えば、「正面」は、図４Ａに示されるタンジェントフロー構築体４１０に連結される貯留器構築体４５０の側面である）に示される。浸透ポート４２６、保留物ポート４２８、および皿穴４２３（この図４Ｂには、皿穴４２３は示されない）のための３つのねじ山または嵌合要素４２５も示される。皿穴４２３のためのねじ山または嵌合要素４２５は、（図４Ａに示される）タンジェントフロー構築体４１０を貯留器構築体４５０に嵌合させるか、連結するように構成される。代替的に、または、さらに、タンジェントフロー構築体４１０を貯留器構築体４５０に嵌合するか、または連結するために、締結具、音波溶接またはヒートステークを使用してもよい。さらに、貯留器構築体４５０の上部を覆うガスケット４４５が示される。ガスケット４４５は、図４Ｅに関連して詳細に記載される。貯留器構築体１２５０の後面斜視図が図４Ｂの左にあるが、ここで「後面」は、タンジェントフロー構築体に連結されない貯留器構築体４５０の側面である。保留物貯留器４５２、浸透貯留器４５４およびガスケット４４５が示される。
ＴＦＦデバイスは、ステンレス鋼、ケイ素、ガラス、アルミニウム、または環式オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、アクリロニトリルブタジエン、ポリカーボネート、ポリエーテルエーテルケトン（ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｅｔｈｅｋｅｔｏｎｅ）（ＰＥＥＫ）、ポリ（メチルメチルアクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリスルホンおよびポリウレタン、ならびにこれらおよび他のポリマーのコポリマーなどのプラスチックを含むチャネル（およびチャネル分岐）が粉砕されてもよい任意の堅牢な材料から製作されてもよい。前記ＴＦＦデバイス／モジュールは、使い捨て可能である場合、好ましくはプラスチックで作製される。いくつかの実施形態において、ＴＦＦデバイス／モジュールを製作するために使用される材料は、細胞培養物が所望の温度に加熱されてもよいか、または冷却されてもよいように熱伝導性である。ある特定の実施形態において、ＴＦＦデバイスは、この量産技術に適した上記の材料を使用する、（金属デバイスのための）精密機械加工、レーザ加工、放電加工；（ケイ素デバイスのための）ウェットエッチングもしくはドライエッチング；ドライエッチングもしくはウェットエッチング、粉末もしくはサンドブラスト、（ガラスデバイスのための）光構造化；または（プラスチックデバイスのための）熱成形、射出成形、熱エンボス加工もしくはレーザ加工、によって形成される。
図４Ｃは、図４Ｂに示される貯留器構築体４５０の上面図を示す。図４Ｄは、図４Ｂに示される貯留器構築体４５０のためのカバー４４４を示し、４Ｅは、図４Ｂに示される貯留器構築体４５０のカバー４４４に操作中に設けられるガスケット４４５を示す。図４Ｃは、浸透貯留器４５４の両側上のものである２つの保留物貯留器４５２の上部を示す貯留器構築体４５０の上面図である。空気圧式ポート（図示せず）と嵌合する溝４３２、ならびに浸透部材４２０および膜４２４（前記浸透部材４２０および前記膜４２４も図示せず）における保留物ポートのための貫通孔を介して保留物ポート４２８（図示せず）に保留物貯留器４５２を流体工学的に連結する保留物貯留器４５２の下部に存在する流体チャネル４３４も示される。図４Ｄは、貯留器構築体４５０の上部に設けられるように構成されるカバー４４４を示す。カバー４４４は、保留物貯留器４５２および浸透／濾液貯留器４５４の上部において円形のカットアウトを有する。保留物貯留器４５２の下部において、再度、流体チャネル４３４が保留物ポート４２８（図示せず）に保留物貯留器４５２を流体工学的に連結する流体チャネル４３４が示され得る。各保留物貯留器４５２および浸透／濾液貯留器４５４のための３つの空気圧式ポート４３０も示される。図４Ｅは、貯留器構築体４５０のカバー４４４に設けられるように構成されるガスケット４４５を示す。各保留物貯留器４５２のための、および浸透／濾液貯留器４５４のための３つの流体移送ポート４４２が示される。再度、各保留物貯留器４５２のための、および浸透／濾液貯留器４５４のための３つの空気圧式ポート４３０が示される。
細胞増殖のための全体的なワークフローは、全て、例えば連続的にまたは所望の間隔で保留物貯留器における細胞培養物の光学密度を測定すると共に、第１保留物貯留器に増殖させる細胞培養物を負荷し、任意選択で細胞培養物を通して空気または適切なガスを泡立たせ、浸透ポート４０６の一方または両方を通して培地または緩衝液を回収すると共に、第１保留物ポートを通して、次いで接線方向にＴＦＦチャネル構造を通して細胞培養物を通過させるかまたは流し、第２保留物貯留器に第２保留物ポート４０４を通して細胞培養物を回収し、任意選択でさらなるまたは異なる培地を細胞培養物に加え、任意選択で細胞培養物を通して空気またはガスを泡立たせ、次いで処理を繰り返すことを含む。プログラムされた時間間隔における光学密度（ＯＤ）の測定は、増殖細胞を含む（１つまたは複数の）保留物貯留器内に光学部品を通して円柱形状にされた６００ｎｍ発光ダイオード（ＬＥＤ）を使用して達成される。光は、（デジタル）利得制御シリコーンフォトダイオードからなる検出系に集光光学部品を通して続く。概して、光学密度は、光学減衰器の電力伝達係数の底を１０とする対数の絶対値、すなわち、ＯＤ＝－ｌｏｇ１０（出力電力／入力電力）、として示される。ＯＤは、光学減衰の測度、すなわち、吸収、散乱、反射の合計であるので、ＴＦＦデバイスＯＤ測定は、全体的な電力伝達を記録し、細胞が増殖して、集団内でより密集するにつれて、ＯＤ（信号損失）は増加する。ＯＤ系は、測定プログラムがアクセス可能なオンボードメモリーに保存されるこれらの値でＯＤ基準値に対して事前に較正される。
チャネル構造において、フローチャネルを２つに分ける膜は、膜の一方の側（保留物側４２２）に細胞を保持し、不所望の培地または緩衝液が、デバイスの濾液側または浸透側（例えば、浸透部材４２０）へ膜を横切って流れるようにする。細胞培養物を通して空気または他の適切なガスを泡立たせることによって、培養物の通気および混合の両方が行われて、細胞増殖が増強される。処理の間、チャネル構造を通る流れの間に除去される培地は、浸透／濾液ポート４０６を通して除去される。あるいは、一方の貯留器から他方にＴＦＦチャネルを通して細胞を通過させることなく、泡立ちまたは撹拌によって、一方の貯留器において細胞を増殖させることができる。
ＴＦＦデバイス／モジュールを使用する細胞濃度のための全体的なワークフローは、接線方向にチャネル構造を通して細胞培養物または細胞試料を流すことを含む。細胞増殖処理と同様に、フローチャネルを２つに分ける膜は、膜の一方の側の細胞を保持し、不所望の培地または緩衝液を、膜を横切ってデバイスの浸透／濾液側（例えば、浸透部材４２０）に流す。この処理において、細胞試料が保留物ポート４０４のうちの１つに回収され、膜を通過した培地／緩衝液が、浸透／濾液ポート４０６の一方または両方を通して回収されるまで、培地または緩衝液中における一定の量の細胞がデバイスに通される。ＴＦＦデバイスにおいて、全ての型の原核細胞および真核細胞－付着細胞および非付着細胞の両方－を増殖させることが可能である。ＴＦＦデバイスを通して流れる培地中において懸濁させたビーズまたは他の細胞足場において付着細胞を増殖させてもよい。
細胞濃縮デバイス／モジュールにおいて細胞を懸濁するために使用される培地または緩衝液は、ＬＢ、ＳＯＣ、ＴＰＤ、ＹＰＧ、ＹＰＡＤ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ、ハンクス液、ＰＢＳ、リンガー液など、形質転換されるか、またはトランスフェクトされる細胞型のための任意の適切な培地または緩衝液であってもよく、ここで培地は、キットの一部として試薬カートリッジ内で提供されてもよい。付着細胞の培養のために、細胞は、培地中において懸濁されるビーズ、マイクロキャリアまたは他の型の足場に設けられてもよい。ほとんどの正常哺乳動物組織由来細胞－造血系から誘導されるものを除く－は、付着依存性であり、正常増殖のための表面または細胞培養支持体を必要とする。本明細書に記載される回転増殖バイアルにおいて、マイクロキャリア技術が活用される。特定の使用のマイクロキャリアは、典型的には直径が１００～３００μｍであり、密度が培養培地よりもわずかに大きいが（したがって、例えば培地交換のための細胞および培地の簡単な分離を容易にする）、密度も、細胞の流体力学的損傷を回避するために最小限の撹拌割合におけるキャリアの完全懸濁を可能にするために充分に低くなければならない。多くの異なる型のマイクロキャリアが利用可能であり、異なるマイクロキャリアが異なる型の細胞ために最適化される。Ｃｙｔｏｄｅｘ１（デキストランベース、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＤＥ－５２（セルロースベース、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｌａｂｗａｒｅ）、ＤＥ－５３（セルロースベース、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｌａｂｗａｒｅ）およびＨＬＸ１１－１７０（ポリスチレンベース）などの正に荷電したキャリア；Ｃｙｔｏｄｅｘ３（デキストランベース、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）もしくはＨｙＱ－ｓｐｈｅｒｅ Ｐｒｏ－Ｆ１０２－４（ポリスチレンベース、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などのコラーゲンもしくはＥＣＭ（細胞外マトリックス）コーティングキャリア；ＨｙＱ－ｓｐｈｅｒｅ Ｐ１０２－４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などの非荷電性キャリア；またはゼラチンに基づいたマクロ多孔性キャリア（Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒｅ、Ｐｅｒｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｙｔｉｃａ）もしくはセルロースに基づいたマクロ多孔性キャリア（Ｃｙｔｏｐｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）がある。
細胞増殖処理および細胞濃縮処理の両方において、細胞試料をＴＦＦデバイスに通過させ、浸透／濾液ポート４０６のうちの１つにおいて培地を回収すると共に、保留物ポート４０４の１つにおいて細胞を回収することは、細胞試料の「１通過」であると考えられる。保留物貯留器間の移送は、培養物を「反転させる」。所定の通過のための、それぞれ細胞および培地を回収する保留物ポートおよび浸透（ｐｅｒｍｅａｔｅｅ）ポートは、保留物および浸透／濾液側のための２つの別個のフロー層があるように配置された流体連結を有するＴＦＦデバイス／モジュールの同じ端部上に存在するが、保留物ポート４０４がデバイス／モジュールの保留物部材上に存在する（すなわち、細胞は膜の上のチャネルに通され、濾液（培地）は膜の下のチャネルの部分に通る）場合、浸透／濾液ポート４０６は、デバイス／モジュールの浸透部材上に存在し、逆もまた同じである（すなわち、細胞試料が膜の下のチャネルに通される場合、濾液（培地）は、膜より上のチャネルの部分に通る）。ＴＦＦデバイスのフローチャネルを通して細胞培養物および流体を移送するために使用される高圧力のため、重力の効果は無視することができる。
増殖処理および濃縮処理のいずれかにおける「通過」の終了時に、細胞試料は、保留物ポート４０４を通過して保留物貯留器（図示せず）内に至ることによって回収される。別の「通過」を開始するために、この時、第１の通過から逆のフロー方向に再度ＴＦＦデバイスを通して細胞試料を通過させる。細胞試料は、保留物ポート４０４を通過して、第１の通過の間に細胞を回収するために使用された保留物ポート４０４からデバイス／モジュールの反対端部における保留物貯留器（図示せず）内に至ることによって回収される。同様に、第２の通過において膜を通過する培地／緩衝液は、第１の通過の間に濾液を回収するために使用された浸透ポート４０６からデバイス／モジュールの反対端部における浸透ポート４０６を通して、または両ポートを通して回収される。デバイス／モジュールを通して保留物（濃縮細胞試料）を通過させるこの交互の処理は、細胞が所望の光学密度に増殖するまで、かつ／または所望の量に濃縮されるまで繰り返され、操作時間を減少させるために通過の間に両浸透ポート（すなわち、２つ以上ある場合）を開くことができる。さらに、別の「通過」を開始する前に保留物貯留器における細胞試料に所望の緩衝液（または、新鮮な培地）を加え、古い培地または緩衝液が希釈され、濾過されて除去され、細胞が新鮮な培地または緩衝液中に存在するまで、この処理を繰り返すことによって、緩衝液交換を行ってもよい。なお、緩衝液交換および細胞増殖は、（典型的には）同時に生じてもよく、緩衝液交換および細胞濃縮は、（典型的には）同時に生じてもよい。ＴＦＦに関するさらなる情報および代替的実施形態については、例えば、２０１８年９月７日に出願された米国特許出願第６２／７２８，３６５号、２０１９年６月５日に出願された米国特許出願第６２／８５７，５９９号および２０１９年６月２７日に出願された米国特許出願第６２／８６７，４１５号を参照されたい。
細胞形質転換モジュール
図５Ａは、ＴＦＦモジュールと共に自動化多モジュール細胞処理器具において使用されてもよい例示的な組合せの試薬カートリッジおよびエレクトロポレーションデバイス５００（「カートリッジ」）を示す。さらに、ある特定の実施形態において、カートリッジ５００が、試薬貯留器または貯留器５０４における試薬を加熱するか、または冷却する、ペルチェデバイスまたは熱電冷却器などの熱的デバイス（図示せず）に接触する場合、ある特定の実施形態において、カートリッジを製作するために使用される材料は熱伝導性である。試薬貯留器または貯留器５０４は、試薬の個別のチューブが図５Ａに示すように挿入されている貯留器であってもよいか、または、試薬リザーバは、挿入されたチューブなしで試薬を保持してもよい。追加的に、試薬カートリッジ内の貯留器は、チューブ、共接合チューブ、および試薬の直接充填材の任意の組合せのために構成されてもよい。
一実施形態において、試薬カートリッジ５００の試薬貯留器または貯留器５０４は、例えば、２５０ｍＬのチューブ、２５ｍＬのチューブ、１０ｍＬのチューブ、５ｍＬのチューブ、およびＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブまたは微小遠心チューブなどの様々な大きさのチューブを保持するように構成される。さらに別の実施形態において、全ての貯留器は、同じ大きさのチューブ、例えば、５ｍＬのチューブを保持するように構成されてもよく、貯留器挿入物は、試薬貯留器内により小さいチューブを収容するために使用されてもよい。さらに別の実施形態において、特に、試薬カートリッジが使い捨て可能である実施形態において、試薬貯留器は、挿入されたチューブなしで試薬を保持する。この使い捨て可能な実施形態において、試薬カートリッジは、試薬カートリッジに試薬が事前に充填されており、収納部または貯留器が、例えば、箔、ヒートシールアクリルまたは同種のもので密封されて消費者に提示され、ここで試薬カートリッジが、次いで自動化多モジュール細胞処理器具において使用されてもよいキットの一部であってもよい。当業者が与えられた本開示を認識するように、試薬カートリッジに含まれる試薬は、ワークフローに応じて変わり、すなわち、試薬は、細胞が自動化多モジュール細胞処理器具において供される処理、例えば、タンパク質作製、細胞形質転換および細胞培養、細胞編集などに応じて変わる。
細胞試料、酵素、緩衝液、核酸ベクター、発現カセット、タンパク質またはペプチドなどの試薬、（例えば、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、核酸構築体試薬、ギャップ修復試薬および同種のものなどの）反応成分、洗浄溶液、エタノール、ならびに核酸の精製および単離のための磁気ビーズなどは、知られている位置で試薬カートリッジ内に位置してもよい。カートリッジ５００のいくつかの実施形態において、カートリッジは、試薬を分注するための処理装置（図示せず）によって読み込み可能なスクリプト（図示せず）を含む。また、自動化多モジュール細胞処理器具における１つの構成要素としてのカートリッジ５００は、自動化多モジュール細胞処理器具によって行われる２つ、３つ、４つ、５つ、１０以上の処理を特定するスクリプトも含んでもよい。ある特定の実施形態において、試薬カートリッジは使い捨て可能であり、前記試薬カートリッジには、特定の細胞処理プロトコール（例えば、ゲノム編集またはタンパク質作製の実施）に適合させた試薬が事前にパッケージ化される。自動化多モジュール細胞処理器具または系の構成要素／モジュールは変化しない可能性があるが、試薬カートリッジの内容物は変化するので、特定の試薬カートリッジに関連したスクリプトは、使用される試薬と、行われる細胞処理とに適合する。したがって、例えば、試薬カートリッジには、ゲノム編集のための試薬と、自動化多モジュール細胞処理器具においてゲノム編集を行うための処理工程を特定するスクリプトとが、または、例えば、タンパク質発現のための試薬と、自動化多モジュール細胞処理器具においてタンパク質発現を行うための処理工程を特定するスクリプトとが、事前にパッケージ化されてもよい。
例えば、試薬カートリッジは、貯留器からコンピテント細胞をピペットで移し、細胞を形質転換モジュールに移送し、試薬カートリッジにおける別の貯留器から発現カセットによってベクターを含む核酸溶液をピペットで移し、核酸溶液を形質転換モジュールに移送し、形質転換処理を、規定時間、開始し、次いで、形質転換細胞を、試薬カセットにおけるさらに別の貯留器に、または自動化多モジュール細胞処理器具における細胞増殖モジュールなどの別のモジュールに移動するためのスクリプトを含んでもよい。別の例において、試薬カートリッジは、試薬カセットにおける貯留器からベクターを含む核酸溶液と、試薬カセットにおける貯留器におけるオリゴヌクレオチドカセットを編集することを含む核酸溶液と、存在する場合、別の貯留器から核酸構築体／脱塩モジュールへ核酸構築体混合物とを移送するためのスクリプトを含んでもよい。スクリプトは、自動化多モジュール細胞処理器具における他のモジュールによって行われる処理工程も特定してもよい。例えば、スクリプトは、核酸構築体／脱塩貯留器を、３０分間、５０℃に加熱して、構築生成物を生成し、磁気ビーズベース核酸精製を介した構築生成物の脱塩および再懸濁が、磁気ビーズ、エタノール洗浄および緩衝液の一連のピペット移送および混合を含むことを特定してもよい。
以下の図５Ｂおよび図５Ｃに関連して記載されるように、自動化多モジュール細胞処理器具における使用のための例示的な試薬カートリッジは、１つまたは複数のエレクトロポレーションデバイス、好ましくはフロースルーエレクトロポレーション（ＦＴＥＰ）デバイスを含んでもよい。さらに他の実施形態において、試薬カートリッジは、形質転換モジュールとは別である。エレクトロポレーションは、電気刺激によって細胞膜内に一時的に孔を生成することによって働く細胞膜の透過化のための広く使用される方法である。エレクトロポレーションの適用は、哺乳動物細胞（ヒト細胞など）、植物細胞、古細菌、酵母、他の真核細胞、細菌および他の細胞型などの様々な細胞へのＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、抗体、薬物または他の物質の送達を含む。ハイブリドーマまたは他の融合細胞の作製における細胞融合のために、電気刺激も使用してもよい。典型的なエレクトロポレーション手法の間、細胞生存のために良好である緩衝液または培地中で細胞を懸濁させる。細菌細胞エレクトロポレーションのために、多くの場合、水、グリセロール溶液および同種のものなどの低コンダクタンス媒質を使用して、過渡高電流による熱産生を低下させる。従来のエレクトロポレーションデバイスにおいて、細胞にエレクトロポレーション処理される細胞および材料（まとめて「細胞試料」）は、放電のための２つの平面電極が埋込まれたキュベット内に配置される。例えば、Ｂｉｏ－Ｒａｄ（米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）は、キュベット内の細胞をエレクトロポレーション処理するためのＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ ＸＣＥＬＬ（商標）を作る製品ラインを製造する。伝統的に、エレクトロポレーションは、高い場の強度を必要とするが、試薬カートリッジに含まれるフロースルーエレクトロポレーションデバイスは、低毒性で高効率性細胞エレクトロポレーションを達成する。本開示の試薬カートリッジは、気体置換ピペッターなどの自動化された器具および系において典型的には使用されるロボティック液体取り扱い器具装備との特に簡単な組込みを可能にする。そのような自動化された器具装備としては、Ｔｅｃａｎ（スイス、メンネドルフ）、Ｈａｍｉｌｔｏｎ（米国ネバダ州リノ）、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（米国コロラド州フォートコリンズ）などの既製品の自動化液体取り扱い系が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
図５Ｂおよび図５Ｃは、図５Ａの試薬カートリッジ５００の一部（例えば、前記試薬カートリッジ５００内の構成要素）であってもよいか、またはスタンドアロンモジュールであってもよい、すなわち、試薬カートリッジまたは他のモジュールの一部ではない、例示的なＦＴＥＰデバイス５５０の、それぞれ上面斜視図および下面斜視図である。図５Ｂは、ＦＴＥＰデバイス５５０を示す。ＦＴＥＰデバイス５５０は、細胞試料入口５５２および細胞試料出口５５４を規定するウェルを有する。図５Ｃは、図５ＢのＦＴＥＰデバイス５５０の下面斜視図である。入口ウェル５５２および出口ウェル５５４は、この図に示され得る。ウェル５５２に対応する入口５６２の下部、出口ウェル５５４に対応する出口５６４の下部、規定されたフローチャネル５６６の下部、およびフローチャネル５６６の両側の２つの電極５６８の下部も図５Ｃに示される。ＦＴＥＰデバイスは、多通過エレクトロポレーション手法を可能にするためのプッシュプル空気圧式手段を含んでもよく、すなわち、エレクトロポレーション処理される細胞は、入口から、エレクトロポレーションの１通過のための出口の方へ「引かれ」てもよく、次いで、エレクトロポレーションの別の通過のための電極の間の再度の通過のためにＦＴＥＰデバイスの出口端部から入口端部の方へ「押され」てもよい。さらに、この処理は、１回から多くの回数、繰り返されてもよい。ＦＴＥＰデバイスに関するさらなる情報については、例えば、２０１８年９月２８日に出願された米国特許出願第１６／１４７，１２０号、２０１８年９月２８日に出願された米国特許出願第１６／１４７，３５３号、２０１９年５月３０日に出願された米国特許出願第１６／４２６，３１０号、２０１８年９月３０日に出願された米国特許出願第１６／１４７，８７１号、および２０１９年６月１８日に発行された米国特許第１０，３２３，２５８号を参照されたい。さらに、試薬カートリッジの他の実施形態は、２０１８年８月２２日に出願された米国特許出願第１６／１０９，１５６号に記載されているものなど、ＦＴＥＰデバイスとして構成されないエレクトロポレーションデバイスを提供してもよいか、または収容してもよい。本自動化多モジュール細胞処理器具において有用な試薬カートリッジについては、例えば、２０１９年８月１３日に発行された米国特許第１０，３７６，８８９号、および２０１９年６月２５日に出願された米国特許出願第１６，４５１，６０１号を参照されたい。
ＦＴＥＰデバイスのさらなる詳細は、図５Ｄ～図５Ｆに示される。なお、図５Ｄ～図５ＦのＦＴＥＰデバイスにおいて、電極は、第１電極が入口とフローチャネルの狭化領域との間に配置され、第２電極がフローチャネルの狭化領域と出口との間に配置されるように配置される。図５Ｄは、細胞と外因性材料とを含む流体をＦＴＥＰデバイス５５０に導入するための入口５５２と、エレクトロポレーション後にＦＴＥＰから形質転換細胞を除去するための出口５５４とを有するＦＴＥＰデバイス５５０の上面平面図を示す。電極５６８は、デバイスにおけるチャネル（図示せず）を通して導入される。図５Ｅは、フローチャネル５６６に対して位置する入口５５２と出口５５４と電極５６８とを有するＦＴＥＰデバイス５５０の上部からの切取図を示す。図５Ｆは、入口５５２と入口チャネル５７２と出口５５４と出口チャネル５７４とを有するＦＴＥＰデバイス５５０の側面切取図を示す。電極５６８は、フローチャネル５６６と流体連通するが、フローチャネル５６６を通って進行する細胞の経路内に直接的にはないように電極チャネル５７６内に位置する。なお、第１電極は、入口とフローチャネルの狭化領域との間に配置され、第２の電極は、フローチャネルの狭化領域と出口との間に配置される。デバイスのこの態様における電極５６８は、細胞と外因性材料とを含む流体がフローチャネル５６６を通って入口チャネル５７２から出口チャネル５７４に流れ、処理において、流体が電極チャネル３７６内に流れて電極５６８に接触するように、フローチャネル５６６に対して概して垂直である電極チャネル５７６内に位置する。この態様において、入口チャネル、出口チャネルおよび電極チャネルは、全て、デバイスの同じ平面側から始まる。しかし、ある特定の態様において、電極は、入口チャネルおよび出口チャネルとはＦＴＥＰデバイスの異なる平面側から導入されてもよい。
本開示のＦＴＥＰデバイスにおいて、形質転換の毒性レベルによって、細胞に導入される細胞型および核酸に応じて、エレクトロポレーション後に３０％超の生存細胞、好ましくは、形質転換後に３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、またはさらに９９％の生存細胞が生じる。
ＦＴＥＰデバイスのハウジングは、ＦＴＥＰデバイスが再使用されることになっているか、オートクレーブ処理されることになっているか、または使い捨て可能であるかどうかに応じて、ステンレス鋼、ケイ素、ガラス、樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリアミド、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、アクリロニトリルブタジエン、ポリカーボネート、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリスルホンおよびポリウレタン、ならびにこれらおよび他のポリマーのコポリマーなどの多くの材料から作製され得る。同様に、デバイスにおけるチャネルの壁は、シリコーン、樹脂、ガラス、ガラスファイバ、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、アクリロニトリルブタジエン、ポリカーボネート、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリスルホンおよびポリウレタン、ならびにこれらおよび他のポリマーのコポリマーなどの任意の適切な材料で作製され得る。好ましい材料としては、電極と、例えば、存在する場合、下部封止膜とを除いて、一体となって、射出成形によってデバイスを完全に形成することが可能になる結晶スチレン、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）および環式オレフィン（ｏｌｅｐｈｉｎ）コポリマー（ＣＯＣ）が挙げられる。
本明細書に記載されるＦＴＥＰデバイス（またはＦＴＥＰデバイスの部分）は、例えば、全体的なデバイスとして、または、融合されるか、もしくは、それ以外の場合、連結される構造的層の作製によって、様々な技術を介して、作製または製作され得る。例えば、金属ＦＴＥＰデバイスについては、製作は、精密な機械加工またはレーザ加工を含んでもよく、ケイ素ＦＴＥＰデバイスについては、製作は、ドライエッチングまたはウェットエッチングを含んでもよく、ガラスＦＴＥＰデバイスについては、製作は、ドライエッチングもしくはウェットエッチング、粉末ブラスト、サンドブラストまたは光構造化を含んでもよく、プラスチックＦＴＥＰデバイスについては、製作は、熱成形、射出成形、熱エンボス加工またはレーザ加工を含んでもよい。ＦＴＥＰデバイスの構成要素は、別々に製造されて、次いで構築されてもよいか、または、ＦＴＥＰデバイス（もしくは、電極以外の全体的なＦＴＥＰデバイスも）のある特定の構成要素は、（例えば、３Ｄプリントを使用して）製造されてもよいか、もしくは単一の実体として（例えば、射出成形を使用して）成形されてもよく、他の構成要素は成形後に加えられる。例えば、ハウジングおよびチャネルは、単一の実体として製造されるか、または成形されてもよく、電極は、後で加えられて、ＦＴＥＰユニットを形成する。あるいは、ＦＴＥＰデバイスは、個別に製造され、かつ／または成形され、製造後に構築される２つ以上の平行層、例えば、水平なチャネルおよびフィルタを有する層、垂直のチャネルを有する層、ならびに入口ポートおよび出口ポートを有する層の中に形成されてもよい。
具体的な態様において、ＦＴＥＰデバイスは、回路板を基部として使用して製造され得るが、電極、フィルタおよび／またはフローチャネルは、回路板上の所望の構成において形成され、例えば、１つまたは複数の入口チャネルおよび出口チャネルならびに／またはフローチャネルを含むデバイスの残りのハウジングは、次いで回路板上に封止される別々の層として形成される。回路板上へのハウジングの上部の封止によって、本開示のＦＴＥＰデバイスの異なる要素の所望の構成が提供される。また、２～多数のＦＴＥＰデバイスは、単一基板上に製造されてもよく、次いで、その後に互いに分離されるか、または、同時に使用されてもよい。ある特定の実施形態において、ＦＴＥＰデバイスは再使用可能であり、いくつかの実施形態において、ＦＴＥＰデバイスは使い捨て可能である。さらなる実施形態において、ＦＴＥＰデバイスは、オートクレーブ処理が可能であってもよい。
電極４０８は、銅、ステンレス鋼、チタン、アルミニウム、黄銅、銀、ロジウム、金もしくは白金、または黒鉛などの任意の適切な金属から形成され得る。１つの好ましい電極材料は、合金３０３（ＵＮＳ３３０３００）オーステナイト系ステンレス鋼である。印加された電界は、アルミニウムなどの金属から作製された電極を破壊する可能性がある。多重使用（すなわち、使い捨て可能でない）フロースルーＦＴＥＰデバイスが所望される場合（使い捨て可能な１回使用フロースルーＦＴＥＰデバイスと対照的に）、電極板は、電気化学的腐食に対して耐性がある金属でコーティングされ得る。電極板を保護するために、貴金属、例えば、金などの伝導性コーティングを使用することができる。
上述のように、ＦＴＥＰデバイスは、多通過エレクトロポレーション手法を可能にするためのプッシュプル空気圧式手段を含んでもよく、すなわち、エレクトロポレーション処理される細胞は、入口から、エレクトロポレーションの１通過のための出口の方へ「引かれ」てもよく、次いで、エレクトロポレーションの別の通過のための電極の間の再度の通過のためにフロースルーＦＴＥＰデバイスの出口端部から入口端部の方へ「押され」てもよい。この処理は、１回から多くの回数、繰り返されてもよい。
エレクトロポレーション処理される細胞の型（例えば、細菌、酵母、哺乳動物）と、電極の構成とに応じて、フローチャネルにおける電極の間の距離は広く変化し得る。例えば、フローチャネルの幅が減少する場合、フローチャネルは、１０μｍ～５ｍｍの間、または２５μｍ～３ｍｍの間、または５０μｍ～２ｍｍの間、または７５μｍ～１ｍｍの間に細くなってもよい。フローチャネルにおける電極間の距離は、１ｍｍ～１０ｍｍの間、または２ｍｍ～８ｍｍの間、または３ｍｍ～７ｍｍの間、または４ｍｍ～６ｍｍの間であってもよい。ＦＴＥＰデバイスの全体的大きさは、長さが３ｃｍ～１５ｃｍ、または長さが４ｃｍ～１２ｃｍ、または長さが４．５ｃｍ～１０ｃｍであってもよい。ＦＴＥＰデバイスの全体的幅は、０．５ｃｍ～５ｃｍ、または０．７５ｃｍ～３ｃｍ、または１ｃｍ～２．５ｃｍ、または１ｃｍ～１．５ｃｍであってもよい。
細くなるフローチャネルの領域は、少なくとも２つの細胞が並んで細い部分に適合することができるように充分に広い。例えば、典型的な細菌細胞は、直径が１μｍであり、したがって、そのような細菌細胞を形質転換するために使用されるＦＴＥＰデバイスのフローチャネルの細い部分は、広さが少なくとも２μｍとなる。別の例において、哺乳動物細胞が、直径が約５０μｍである場合、そのような哺乳動物細胞を形質転換するために使用されるＦＴＥＰデバイスのフローチャネルの細い部分は、広さが少なくとも１００μｍとなる。すなわち、ＦＴＥＰデバイスの細い部分は、物理的に歪まないか、または形質転換される細胞を「圧搾する」。
貯留器が細胞と外因性材料とをＦＴＥＰデバイスに導入するために使用されるＦＴＥＰデバイスの実施形態において、貯留器は、容量が１００μＬ～１０ｍＬ、または５００μＬ～７５ｍＬ、または１ｍＬ～５ｍＬの範囲である。ＦＴＥＰにおける流速は、１分間当たり０．１ｍＬ～５ｍＬ、または１分間当たり０．５ｍＬ～３ｍＬ、または１分間当たり１．０ｍＬ～２．５ｍＬの範囲である。ＦＴＥＰデバイスにおける圧力は、１～３０ｐｓｉ、または２～１０ｐｓｉ、または３～５ｐｓｉの範囲である。
電極間における異なる電界強度を回避するために、電極は、平行に配置されるべきである。さらに、電極の表面は、ピン穴またはピークなしで、できるだけ平滑であるべきである。粗さＲｚが１～１０μｍの電極が好ましい。本発明の別の実施形態において、フロースルーエレクトロポレーションデバイスは、大地電位をＦＴＥＰデバイスに印加する少なくとも１つのさらなる電極を含む。（スタンドアロン器具としての、または自動化多モジュール系におけるモジュールとしての）フロースルーエレクトロポレーションデバイスは、例えば、２０１８年９月２８日に出願された米国特許出願第１６／１４７，１２０号、２０１８年９月２８日に出願された米国特許出願第１６／１４７，３５３号、２０１８年９月３０日に出願された米国特許出願第１６／１４７，８６５号、２０１９年５月３０日に出願された米国特許出願第１６／４２６，３１０号、および２０１９年６月１８日に発行された米国特許第１０，３２３，２５８号に記載される。
細胞個別化および濃縮デバイス
図６Ａは、固体壁デバイス６０５０と、固体壁デバイスにおけるマイクロウェルにおける細胞を個別化するためのワークフローとを示す。図（ｉ）の左上に、マイクロウェル６０５２を有する固体壁デバイス６０５０が示される。基板６０５０の切片６０５４は、マイクロウェル６０５２も示す（ｉｉ）に示される。（ｉｉｉ）では、固体壁デバイス６０５０の側面断面が示され、本実施形態においてポアソンまたは実質的ポアソン負荷が生じたマイクロウェル６０５２が負荷され、すなわち、各マイクロウェルは、１つの細胞を有するか、細胞を有さず、いずれか１つのマイクロウェルが２つ以上の細胞を有する可能性は低い。（ｉｖ）では、マイクロウェル６０５２を有する基板６０５０が、１つのマイクロウェルにつき１つ細胞を有するマイクロウェル６０５６と、マイクロウェル内に細胞を有さないマイクロウェル６０５７と、マイクロウェル内に２つの細胞を有する１つのマイクロウェル６０６０とを示すワークフロー６０４０が示される。工程６０５１において、マイクロウェル内の細胞を、約２～１５０回、倍加させて、クローンコロニーを形成し（ｖ）、次いで、編集６０５３を生じさせる。
編集６０５３の後、活性編集によって引き起こされる二本鎖の切断の結果として、編集された細胞のコロニー内の多くの細胞が死滅し、生存するが、編集後に修復し、回収しなければならない編集済み細胞についての増殖における遅延がある（マイクロウェル６０５８）が、編集を受けない細胞は成育する（マイクロウェル６０５９）（ｖｉ）。全ての細胞の増殖を継続させ、コロニーを確立し、正常化し、ここでマイクロウェル６０５８内の編集済み細胞のコロニーの大きさおよび／または細胞数は、編集を受けないマイクロウェル６０５９内の細胞に追いつく（ｖｉｉ）。細胞コロニーが正常化されると、マイクロウェル内の全ての細胞のいずれかの貯留６０６０が生じる可能性があり、その場合、非編集細胞からバイアスを除去し、編集から適応効果を除去することによって、細胞を編集済み細胞のために濃縮させるが、代替的には、編集後にマイクロウェル内におけるコロニー増殖をモニタし、増殖が遅いコロニー（例えば、マイクロウェル６０５８内の細胞）を同定し、選択し６０６１（例えば、「いいものだけを選択し」）、それによって編集済み細胞の濃縮がさらに大きくなる。
細胞の増殖において、使用される培地は、もちろん、編集される細胞の型（例えば、細菌、酵母または哺乳動物）に依存する。例えば、酵母細胞増殖のための培地としては、ＬＢ、ＳＯＣ、ＴＰＤ、ＹＰＧ、ＹＰＡＤ、ＭＥＭおよびＤＭＥＭが挙げられる。
図６Ｂは、固体壁デバイス６０５０と、細胞を実質的に個別化するための固体壁デバイスにおけるマイクロウェルにおけるワークフローとを示す。図（ｉ）の左上において、マイクロウェル６０５２を有する固体壁デバイス３５０が示される。基板６０５０の切片６０５４は、マイクロウェル６０５２も示す（ｉｉ）に示される。（ｉｉｉ）において、固体壁デバイス６０５０の側面断面が示され、マイクロウェル６０５２を負荷したが、ここで、本実施形態において、実質的ポアソン負荷が生じ、すなわち、いくつかのマイクロウェル６０５７は細胞を有さず、いくつかのマイクロウェル６０７６、６０７８は、いくつかの細胞を有する。図６Ｂにおいて、活性ｇＲＮＡを有する細胞は黒丸として示され、不活性ｇＲＮＡを有する細胞は白丸として示される。（ｉｖ）において、マイクロウェル６０５２を有する基板６０５０が、全て活性ｇＲＮＡを有するいくつかの細胞を有する３つのマイクロウェル６０７６と、細胞を有さないマイクロウェル６０５７と、活性ｇＲＮＡを有するいくつかの細胞と不活性ｇＲＮＡｓを有するいくつかの細胞とを有する２つのマイクロウェル６０７８と、を示す、ワークフロー６０７０が示される。工程６０７１において、マイクロウェル内の細胞を、約２～１５０回、倍加させて、クローンコロニーを形成し（ｖ）、次いで、編集６０７３が生じる。
編集６０７３の後、活性編集によって引き起こされる二本鎖の切断の結果として、編集された細胞のコロニー内の多くの細胞が死滅し、生存するが、編集後に修復し、回収しなければならない編集済み細胞についての増殖における遅延がある（マイクロウェル６０７６）が、編集を受けない細胞は成育する（マイクロウェル６０７８）（ｖｉ）。したがって、活性ｇＲＮＡを有する細胞（黒丸によって示される細胞）だけが存在するマイクロウェル６０７６において、ほとんどの細胞は死ぬが、不活性ｇＲＮＡを有する細胞（白丸によって示される細胞）を含むマイクロウェル６０７８において、細胞は、増殖することを継続し、活性編集の影響を受けない。各マイクロウェル（６０７６および６０７８）における細胞の増殖を継続させ、コロニーを確立し、正常化し、ここでマイクロウェル６０７６内の編集済み細胞のコロニーの大きさおよび／または細胞数は、編集を受けないマイクロウェル６０７８内の未編集細胞に追いつく（ｖｉｉ）。なお、このワークフロー６０７０において、マイクロウェルにおける細胞のコロニーはクローンではなく、すなわち、ウェルにおける全ての細胞が単一の細胞から生じるというわけではない。その代わり、ウェルにおける細胞コロニーは混合コロニーであってもよく、それによって、多くのウェルにおいて、２つからいくつかの異なる細胞が生じる。細胞コロニーが正常化されると、マイクロウェル内の全ての細胞のいずれかの貯留６０９０が生じる可能性があり、その場合、非編集細胞からバイアスを除去し、編集から適応効果を除去することによって、細胞を編集済み細胞のために濃縮させるが、代替的には、編集後にマイクロウェル内におけるコロニー増殖をモニタし、増殖が遅いコロニー（例えば、マイクロウェル６０７６内の細胞）を同定し、選択し６０９１（例えば、「いいものだけを選択し」）、それによって編集済み細胞の濃縮がさらに大きくなる。
図６Ａおよび図６Ｂに示される方法を実施するために有用であるモジュールは、固体壁単離、インキュベーションおよび正常化（ＳＷＩＩＮ）モジュールである。図６Ｃは、分解上面斜視図からのＳＷＩＩＮモジュール６５０の実施形態を示す。ＳＷＩＩＮモジュール６５０において、保留物部材は、ＳＷＩＩＮモジュール構成要素の上部の下部に形成され、浸透部材は、ＳＷＩＩＮモジュール構成要素の下部の上部に形成される。
図６ＣにおけるＳＷＩＩＮモジュール６５０は、上から下に、貯留器ガスケットまたはカバー６５８と、保留物部材６０４（この図６Ｃには、保留物フローチャネルを示すことができない）と、フィルタがスエージ加工された穿孔部材６０１（図６Ｃには、フィルタが示されない）と、統合貯留器（浸透貯留器６５２および保留物貯留器６５４）を含む浸透部材６０８と、浸透貯留器６５２および保留物貯留器６５４の下部を封止する２つの貯留器封止材６６２とを含む。浸透部材６０８の上部に設けられ、蛇行チャネル６６０ａの隆起部分６７６によって規定された浸透チャネル６６０ａが示され得、同様に、浸透部材６０８の上部に設けられた超音波タブ６６４が示され得る。この図６Ｃには、穿孔部材６０１上のウェルを形成する穿孔は示されないが、超音波タブ６６４を収容するための貫通孔６６６は示される。さらに、ＳＷＩＩＮモジュール６５０を支持し、かつ貯留器６５２および６５４の上方に浸透部材６０８および保留物部材６０４を上昇させて、浸透貯留器から蛇行チャネル６６０ａへの流体経路、または保留物貯留器から蛇行チャネル６６０ｂへの流体経路（この図６Ｃには、いずれの流体経路も示されない）に入る泡または空気を最小限に抑えるために、支持体６７０がＳＷＩＩＮモジュール６５０の両端部に設けられる。
この図６Ｃにおいて、浸透部材６０８の上部に設けられる蛇行チャネル６６０ａが、浸透貯留器６５２と保留物貯留器６５４とを含む浸透部材６０８の部分を除いて浸透部材６０８の長さのほとんどについて、かつ浸透部材６０８の幅のほとんどについて、浸透部材６０８を横断することが示され得る。保留物部材または浸透部材における分配チャネルに関して本明細書において使用される場合、「長さのほとんど」は、保留物部材もしくは浸透部材の長さの約９５％、または保留物部材もしくは浸透部材の長さの約９０％、約８５％、約８０％、約７５％もしくは約７０％を意味する。保留物部材もしくは浸透部材における分配チャネルに関して本明細書において使用される場合、「幅のほとんど」は、保留物部材もしくは浸透部材の幅の約９５％、または保留物部材もしくは浸透部材の幅の約９０％、約８５％、約８０％、約７５％もしくは約７０％を意味する。
ＳＷＩＩＮモジュールのこの実施形態において、穿孔部材は、浸透部材に設けられる超音波タブを収容するための貫通孔を含む。したがって、本実施形態において、穿孔部材は、３１６ステンレス鋼から製作され、フィルタまたは膜がマイクロウェルの下部を形成するために使用されると共に、穿孔はマイクロウェルの壁を形成する。典型的には、穿孔（マイクロウェル）は、直径が約１５０μｍ～２００μｍであり、穿孔部材は、深さが約１２５μｍであり、それによって、マイクロウェルの容量が約２．５ｎＬとなり、合計で約２００，０００のマイクロウェルとなる。中心から中心へのマイクロウェル間の距離は、約２７９μｍである。ここでは、マイクロウェルは、容量が約２．５ｎＬであるが、マイクロウェルの容量は、１～２５ｎＬ、または、好ましくは２～１０ｎＬ、および、さらに好ましくは２～４ｎＬであってもよい。以前に記載されているフィルタなどのフィルタまたは膜に関して、使用のために適切なフィルタは、耐溶剤性であり、濾過の間に汚染がなく、目的の細胞の型および大きさを保持することが可能である。例えば、細菌細胞などの小細胞型を保持するために、細孔径は、最小０．１０μｍであり得るが、他の細胞型について（例えば、哺乳動物細胞についてなど）は、細孔径は、１０．０μｍ～２０．０μｍ以上も大きいことが可能である。実際、細胞濃縮デバイス／モジュールにおいて有用な細孔径は、大きさが０．１０μｍ、０．１１μｍ、０．１２μｍ、０．１３μｍ、０．１４μｍ、０．１５μｍ、０．１６μｍ、０．１７μｍ、０．１８μｍ、０．１９μｍ、０．２０μｍ、０．２１μｍ、０．２２μｍ、０．２３μｍ、０．２４μｍ、０．２５μｍ、０．２６μｍ、０．２７μｍ、０．２８μｍ、０．２９μｍ、０．３０μｍ、０．３１μｍ、０．３２μｍ、０．３３μｍ、０．３４μｍ、０．３５μｍ、０．３６μｍ、０．３７μｍ、０．３８μｍ、０．３９μｍ、０．４０μｍ、０．４１μｍ、０．４２μｍ、０．４３μｍ、０．４４μｍ、０．４５μｍ、０．４６μｍ、０．４７μｍ、０．４８μｍ、０．４９μｍ、０．５０μｍ以上であるフィルタを含む。フィルタは、セルロース混合エステル（セルロースニトレートおよびセルロースアセテート）（ＣＭＥ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルサルホン（ＰＥＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ナイロンまたはガラスファイバなどの任意の適切な材料から製作されてもよい。
嵌合された蛇行チャネルの断面構成は、円形、楕円形、長円形、正方形、矩形、台形または不規則である。概してまっすぐな側面を有する正方形、矩形または他の形状である場合、断面は、幅が約２ｍｍ～１５ｍｍ、または幅が３ｍｍ～１２ｍｍ、または幅が５ｍｍ～１０ｍｍであってもよい。嵌合された蛇行チャネルの断面が概して円形、長円形または楕円形である場合、チャネルの半径は、水力半径が約３ｍｍ～２０ｍｍ、または水力半径が５ｍｍ～１５ｍｍ、または水力半径が８ｍｍ～１２ｍｍであってもよい。
蛇行チャネル６６０ａおよび６６０ｂは、ほとんど同じ量または異なる量を有することができる。例えば、蛇行チャネルの各「側面」または部分６６０ａ、６６０ｂは、容量が、例えば、２ｍＬであってもよいか、または、浸透部材６０８の蛇行チャネル６６０ａは、容量が２ｍＬであってもよく、保留物部材６０４の蛇行チャネル６６０ｂは、容量が、例えば、３ｍＬであってもよい。蛇行チャネル内の流体の量は、約２ｍＬ～約８０ｍＬ、または約４ｍＬ～６０ｍＬ、または５ｍＬ～４０ｍＬ、または６ｍＬ～２０ｍＬの範囲であってもよい（注：これらの量は、例えば、５０～５００Ｋの穿孔部材を含むＳＷＩＩＮモジュールに適用する）。貯留器の容量は、５ｍＬ～５０ｍＬ、または７ｍＬ～４０ｍＬ、または８ｍＬ～３０ｍＬ、または１０ｍＬ～２０ｍＬの範囲であってもよく、全ての貯留器の容量は同じであってもよいか、または貯留器の容量は異なってもよい（例えば、浸透貯留器の容量は、保留物貯留器よりも大きい）。
それぞれ浸透部材６０８および保留物部材６０４の蛇行チャネル部分６６０ａおよび６６０ｂは、長さが約２００ｍｍ、幅が１３０ｍｍ、厚さが４ｍｍであるが、他の実施形態においては、保留物および浸透部材は、長さが７５ｍｍ～４００ｍｍ、または長さが１００ｍｍ～３００ｍｍ、または長さが１５０ｍｍ～２５０ｍｍであることが可能であり、幅が５０ｍｍ～２５０ｍｍ、または幅が７５ｍｍ～２００ｍｍ、または幅が１００ｍｍ～１５０ｍｍであることが可能であり、厚さが２ｍｍ～１５ｍｍ、または厚さが４ｍｍ～１０ｍｍ、または厚さが５ｍｍ～８ｍｍであることが可能である。実施形態では、保留物（および浸透）部材は、ＰＭＭＡ（ポリ（メチルメタクリレート））から製作されてもよいか、またはポリカーボネート、環式オレフィン共重合体（ＣＯＣ）、ガラス、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリアミド、ポリプロピレン、ポリスルホン、ポリウレタン、ならびにこれらおよび他のポリマーのコポリマーなどの他の材料が使用されてもよい。好ましくは、少なくとも保留物部材は、細胞を視覚化することができるように透明材料から製作される（例えば、図６Ｆおよびその記載参照）。例えば、ビデオカメラは、例えば、位相差による、空のウェルの画像に基づいた密度変化測定によって、または、例えば、色素形成タンパク質などの色素形成マーカが識別可能な色を細胞に加えるために使用される場合、細胞増殖をモニタするために使用されてもよい。蛍光細胞マーカ、蛍光タンパク質および化学発光細胞マーカを使用してもよいものの、ブリッツェンブルー（ｂｌｉｔｚｅｎ ｂｌｕｅ）、ドレイデルティール（ｄｒｅｉｄｅｌ ｔｅａｌ）、ヴァージニアヴァイオレット（ｖｉｒｇｉｎｉａ ｖｉｏｌｅｔ）、ビクセンパープル（ｖｉｘｅｎ ｐｕｒｐｌｅ）、プランサーパープル（ｐｒａｎｃｅｒ ｐｕｒｐｌｅ）、ティンセルパープル（ｔｉｎｓｅｌ ｐｕｒｐｌｅ）、マカビーパープル（ｍａｃｃａｂｅｅ ｐｕｒｐｌｅ）、ドナーマゼンタ（ｄｏｎｎｅｒ ｍａｇｅｎｔａ）、キューピッドピンク（ｃｕｐｉｄ ｐｉｎｋ）、セラフィナピンク（ｓｅｒａｐｈｉｎａ ｐｉｎｋ）、スクルージオレンジ（ｓｃｒｏｏｇｅ ｏｒａｎｇｅ）およびレオールオレンジ（ｌｅｏｒ ｏｒａｎｇｅ）（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐａｉｎｔｂｏｘ、全てＡＴＵＭ（米国カリフォルニア州ニューアーク）から入手可能）などの色素形成マーカによって、蛍光を使用する必要性がなくなる。
保留物部材は、好ましくは透明であるので、ＳＷＩＩＮモジュールにおけるコロニー増殖は、ＪｏＶＥ（ＳｃａｎＬａｇ（商標）システム、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）によって販売されているものなどの自動化デバイスによってモニタされ得る（レビン－レイスマンら（Ｌｅｖｉｎ－Ｒｅｉｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、７：７３７～３９（２０１０）も参照）。例えば、哺乳動物細胞についての細胞増殖は、例えば、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（米国ミシガン州アナーバー）によって販売されている増殖モニタによってモニタされてもよい（チョードリー（Ｃｈｏｕｄｈｒｙ）、ＰＬｏｓ Ｏｎｅ、１１（２）：ｅ０１４８４６９（２０１６）も参照）。さらに、例えば、ＴＥＣＡＮ（Ｐｉｃｋｏｌｏ（商標）システム、スイス、メンネドルフ）、Ｈｕｄｓｏｎ Ｉｎｃ．（ＲａｐｉｄＰｉｃｋ（商標）、米国ニュージャージー州スプリングフィールド）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（ＱＰｉｘ４００（商標）システム、米国カリフォルニア州サンノゼ）、およびＳｉｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ＰＩＸＬ（商標）システム、英国サマセット）によって販売されるものなどの自動化コロニーピッカーを用いてもよい。
ＳＷＩＩＮモジュールの加熱および冷却のため、凝結は、増殖細胞コロニーの正確な視覚化に干渉し得る保留物部材に累積してもよい。ＳＷＩＩＮモジュール６５０の凝結は、例えば、ＳＷＩＩＮモジュール６５０の（例えば、保留物部材）の上部にわたって加熱空気を移動させることによって、または保留物部材６０４の少なくとも蛇行チャネル部分６６０ｂにわたって透明被加熱蓋を適用することによって制御されてもよい。例えば、図６Ｆおよび以下のその記載を参照されたい。
ＳＷＩＩＮモジュール６５０において、（穿孔部材のマイクロウェルにおける細胞のポアソンまたは実質的ポアソン分布のために適切な希釈度における）細胞および培地は、保留物部材６０４におけるポートから蛇行チャネル６６０ｂ内に流され、細胞は、マイクロウェル内に沈降するが、一方で培地は、フィルタを通して浸透部材６０８における蛇行チャネル６６０ａ内に至る。細胞がフィルタ６０３を通ることができない場合、細胞は穿孔部材６０１のマイクロウェル内に保持される。適切な培地は、浸透ポート６１１を通して浸透部材６０８に導入されてもよい。培地がフィルタ６０３を通して上方へ流れて、穿孔部材６０１のマイクロウェル（穿孔）内の細胞に栄養分を与える。追加的に、保留物部材および浸透部材を通して培地を循環させることによって、緩衝液交換を行うことができる。操作において、細胞をマイクロウェル内に沈澱させ、最初に、例えば、２～１００回の倍加で増殖させ、例えば、４２℃にＳＷＩＩＮの温度を上昇させて温度誘導性プロモータを誘導することによって、または浸透部材から増殖培地を除去し、増殖培地を、誘導性プロモータを誘導する化学成分を含む培地と置換することによって、編集を誘導する。
編集が生じた際、ＳＷＩＩＮの温度が低下する可能性があるか、または、誘導培地を除去して、化学成分を含まない新鮮な培地で置換することによって、誘導性プロモータを非活性化してもよい。次いで、細胞は、マイクロウェル内の細胞コロニーの増殖が正常化されるまでＳＷＩＩＮモジュール６５０内で増殖し続ける。正常化プロトコールについては、コロニーが正常化されると、浸透部材蛇行チャネル６６０ａに、および、しかるに、フィルタ６０３に流体圧力もしくは空気圧力（または両方）を印加することによって、コロニーをマイクロウェルから洗浄し、プールする。別の場合、いいものだけを選択することが所望される場合、マイクロウェル内の細胞コロニーの増殖をモニタし、増殖が遅いコロニーを直接選択するか、または増殖が早いコロニーを除去する。
図６Ｄは、部分断面における保留物部材と穿孔部材とを有するＳＷＩＩＮモジュールの上面斜視図である。この図６Ｄにおいて、蛇行チャネル６６０ａが、浸透部材６０８の上部に設けられ、隆起部分６７６によって規定され、浸透貯留器と保留物貯留器とを含む浸透部材６０８の部分を除いて、浸透部材６０８の長さおよび幅のほとんどについて、浸透部材６０８を横断する（注：１つの保留物貯留器６５２だけが示され得る）。左から右に移動する際、貯留器ガスケット６５８は、保留物部材６０４の統合貯留器カバー６７８（この図６Ｄには、カバーは示されない）上に設けられる。ガスケット６５８は、貯留器アクセス穴６３２ａ、６３２ｂ、６３２ｃおよび６３２ｄ、ならびに空気圧式ポート６３３ａ、６３３ｂ、６３３ｃおよび６３３ｄを含む。支持体６７０は、一番左端にもある。２つの貯留器封止材６６２の一方が浸透貯留器６５２の下に設けられていることが示され得る。断面にある保留物部材に加えて、穿孔部材６０１およびフィルタ６０３（この図６Ｄには、フィルタ６０３は示されない）は断面にある。なお、穿孔部材６０１の貫通孔６６６を通して広がる超音波タブ６６４など、ＳＷＩＩＮモジュール６５０の右端において、および蛇行チャネル６６０ａのチャネルの折り返しを規定する隆起部分６７６上に設けられる多くの超音波タブ６６４がある。支持体６７０は、浸透部材６０８の末端遠位貯蔵器６５２、６５４にもある。
図６Ｅは、右から左に、保留物部材６０４の統合貯留器カバー６７８（図示せず）上に設けられた貯留器ガスケット６５８を含む構築ＳＷＩＩＩＮモジュール６５０の側面斜視図である。ガスケット６５８は、ゴム、シリコーン、ニトリルゴム、ポリテトラフルオロエチレン、プラスチックポリマー、例えばポリクロロトリフルオロエチレン、または他の可撓性の圧縮性材料から製作されてもよい。ガスケット６５８は、貯留器アクセス穴６３２ａ、６３２ｂ、６３２ｃおよび６３２ｄ、ならびに空気圧式ポート６３３ａ、６３３ｂ、６３３ｃおよび６３３ｄを含む。浸透部材６０８の支持体６７０は、一番左端にもある。さらに、浸透貯留器６５２、ならびに１つの貯留器封止材６６２が示され得る。第２支持体６７０は、一番右端にある。
ＳＷＩＩＮのウェルにおいて増殖する細胞コロニーの画像化は、例えば、細胞増殖およびデバイスパーフォーマンスの両方をモニタするためのほとんどの実施態様において所望され、画像化は、いいものだけを選択する実施態様のために必要である。ＳＷＩＩＮにおける細胞増殖のリアルタイムモニタリングは、背面照明と、保留物板（上板）凝結管理と、温度制御、空気の流れおよび熱管理に対する系レベルのアプローチとを必要とする。いくつかの実施態様において、画像化には、個別のウェルを画像化することが可能であるために充分な分解能を有するカメラまたはＣＣＤデバイスが用いられる。例えば、いくつかの構成において、９ピクセルのピッチを有する（すなわち、各ウェルについて、中心から中心の間が９ピクセルである）カメラが使用される。画像の処理は、いくつかの実施態様において、グレイスケールで画像を読み込むことと、低いものから高いものに各ピクセルを評価することとを利用するが、ここで細胞がないウェルは、（バックライトからの完全な、またはほとんど完全な光透過によって）最も明るく、細胞があるウェルは、（バックライトから光透過を遮断する細胞によって）暗い。画像を処理した後、どのピクセルが「明るい」または「暗い」と呼ばれるかを決定するために閾値化を行い、明るいピクセルを発見し、それらのピクセルをブロックへと配置するために、スポットの発見を行い、次いで、前記スポットに対応するピクセルの六角形グリッド上に前記スポットを配置する。配置された際、例えば、スポットの中央における１つもしくは複数のピクセルを見るか、ランダムに、もしくは予め設定された位置のいくつかから多くのピクセルを見るか、またはスポットにおけるピクセルのＸ数を平均することによって、各ウェルの強度の測度を抽出する。さらに、背景強度を減算してもよい。各ウェルを陽性である（例えば、細胞を含む）と呼ぶか、または陰性（例えば、ウェル内に細胞がない）と呼ぶために、再び閾値化を使用する。細胞増殖のモニタリングを行うための時点で画像を撮影することを含む、いくつかの方法で、画像化情報を使用してもよい。例えば、増殖の早い細胞の「マフィントップ」を除去した後、全ての細胞を除去するか、もしくは上記の「回」内の細胞を除去するか、または特定のウェル（例えば、増殖の遅い細胞コロニー）から細胞を回収するために、細胞増殖のモニタリングを使用することが可能であり、代替的には、増殖の早い細胞を含むウェルを同定することが可能であり、それらの細胞の増殖を照射するか、または阻害するために、増殖の早い細胞コロニーをカバーするＵＶ光の領域をＳＷＩＩＮ上へ投影する（または、シャッターでラスターする）ことが可能である。蛇行チャネル６６０内の適当な流体の流れを保証するために、画像化を使用してもよい。
図６Ｆは、加熱器と加熱カバーとを含む熱管理系をさらに含む、図６Ａ～図６ＥにおけるＳＷＩＩＮモジュールの実施形態を示す。加熱器カバーは、画像化のために必要とされる凝結管理を容易にする。構築体６９８は、１つの浸透貯留器６５２が示される、断面において長手方向に示されるＳＷＩＩＮモジュール６５０を含む。カバー６９４は、ＳＷＩＩＮモジュール６５０の直ぐ上に設けられ、画像化を可能にするバックライト６８０は、ＳＷＩＩＮモジュール６５０の直ぐ下に設けられる。ヒートシンク６８４にわたって設けられる断熱材６８２は、前記バックライトおよび前記ＳＷＩＩＮモジュールの真下にあり、かつ前記バックライトおよび前記ＳＷＩＩＮモジュールに隣接している。この図６Ｆにおいて、ヒートシンクのフィンは、ページのインアウトである。さらに、軸線方向ファン６８６およびヒートシンク６８８、ならびに２つの熱電冷却器６９２、空気圧を制御するための制御器６９０、熱電冷却器、ファン、ソレノイド弁などもある。矢印は、ユニットに入る冷風と、ユニットから除去される熱風とを示す。加熱の制御によって、多くの異なる型の細胞（原核および真核）と、例えば、温度感受性などがある細胞の株との増殖が可能になり、温度感受性プロモータの使用が可能になることに留意するべきである。温度制御によって、プロトコールを調整することが可能になり、形質転換効率性、細胞増殖および生存率の差の原因となる。固体壁単離インキュベーションおよび正常化デバイスに関するさらに多くの詳細については、２０１９年４月３０日に出願された米国特許出願第１６／３９９，９８８号、２０１９年６月２６日に出願された米国特許出願第１６／４５４，８６５号、および２０１９年８月１４日に出願された米国特許出願第１６／５４０，６０６号を参照されたい。代替的な単離、インキュベーションおよび正常化モジュールについては、２０１９年８月８日に出願された米国特許出願第１６／５３６，０４９号を参照されたい。
細胞選択モジュール
本明細書に記載されるスプリットタンパク質レポータ系は、適切に編集された細胞のための読出しとして、蛍光細胞または生物発光細胞を提供する。適切に編集された細胞は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を介して、編集されていないか、または不適切に編集された細胞から選別され得る。ＦＡＣｓは、増強された度合いの機能性を加えるフローサイトメトリの派生物である。ＦＡＣｓを使用して、生細胞の異種混合物を異なる集団に選別することができる。ＦＡＣｓは、内部染色または細胞内タンパク質発現に基づいて細胞を単離するための、唯一の利用可能な精製手法であり、大きさ、粒度および蛍光に基づいた個別の細胞の精製を可能にする。懸濁液中の細胞を、各液滴が目的の単一の細胞を含む液滴の流れとして通す。液滴は、レーザの前を通る。光学検出系は、所定の光学パラメータ（例えば、蛍光パラメータまたは生物発光パラメータ）に基づいて、目的の細胞を検出する。器具は、目的の細胞を含む液滴に電荷を印加し、静電偏向系は、適切なチューブまたはウェルに荷電した液滴の回収を容易にする。選別パラメータは、純度および収率の要件に依存して調整されてもよい。スプリットタンパク質レポータ系を使用して、適切に編集された細胞は生物発光であり、不適切に編集された、または未編集の細胞は生物発光でなく、したがって、所望の細胞は、不所望の細胞から容易に選別される。
自動化多モジュール細胞処理器具の使用
本明細書に記載される方法を実施することが可能な自動化多モジュール細胞処理器具の一実施形態が図７に示される。細胞処理器具７００は、ハウジングと、例えば、細胞が形質転換される試薬カートリッジ内における細胞７０４の貯留器とを含んでもよい。貯留器から細胞増殖および濃縮モジュール７０８に細胞を移す。本実施形態において、細胞増殖および濃縮モジュールは、ＴＦＦなどの単一モジュールであるが、他の実施形態において、細胞増殖および濃縮モジュールは、回転増殖モジュールを含む細胞増殖モジュール、およびＴＦＦを含む細胞濃縮デバイスなど、別々であってもよい。例えば、試薬カートリッジ内の貯留器から、細胞が標的ＯＤに達するまで培養される細胞増殖モジュール７０８に、処理対象の細胞を移す。細胞が標的ＯＤに達すると、細胞増殖モジュールは、後の処理のための細胞を冷却してもよいか、または細胞は細胞濃縮に直接進行してもよく、ここで緩衝液交換または培地交換を行い、細胞はコンピテントになり、細胞の量は、形質転換モジュール７１０において細胞形質転換のために最適な量に減少する。形質転換モジュール７１０は、例えば、フロースルーエレクトロポレーションデバイスであってもよい。
細胞を保存するための貯留器に加えて、試薬カートリッジは、編集カセットを含む編集ベクター７０６を保存するための貯留器と、例えば、ヌクレアーゼに対するコード配列と、カスケード－Ｃ末端Ｔ７ ＲＮＡＰ融合構築物およびｄＣａｓ３－Ｎ末端Ｔ７ ＲＮＡＰ融合構築物に対するコード配列とを含むエンジンベクター７０２を保存するための貯留器とを含んでもよい。図１Ａに関連して上記で記載されるように、カスケード－Ｃ末端Ｔ７ ＲＮＡＰ融合構築物およびｄＣａｓ３－Ｎ末端Ｔ７ ＲＮＡＰ融合構築物は、エンジンベクター（例えば、ヌクレアーゼに対するコード配列を含むベクター）上に位置してもよいか、カスケード－Ｃ末端Ｔ７ ＲＮＡＰ融合構築物およびｄＣａｓ３－Ｎ末端Ｔ７ ＲＮＡＰ融合構築物は、両方とも、Ｔ７プロモータの制御下におけるレポータ遺伝子と共に単一レポータベクター上に位置してもよいか、またはスプリットタンパク質系の様々な成分は、異なるレポータベクター上、編集ベクター上、および／もしくはエンジンベクター上にあってもよい。次いで、編集ベクター、エンジンベクターおよびレポータベクター（別々である場合、図示せず）を形質転換モジュール７１０に移し、細胞にエレクトロポレーション処理する。
細胞が形質転換されると、編集のための、上記の通りのＳＷＩＩＮモジュールなどの編集モジュール７１２に細胞を移してもよい。さらに、形質転換モジュールおよび編集モジュールの間の別個のモジュール内で選択を行ってもよいか、または編集モジュール内で選択を行ってもよい。この場合における選択は、選択マーカを含むベクターによって適切に形質転換された細胞のための選択であって、しかるに、細胞が、核酸誘導ヌクレアーゼ編集のための、および適当な編集を報告するための両方についての全てのベクターを収容したことを保証する選択を指す。選択の後、編集のために条件が提供される。核酸誘導ヌクレアーゼ編集系の任意の成分が誘導性プロモータの制御下にある場合、編集のための誘導性プロモータを活性化するために条件が提供される。細胞を編集している間、スプリットタンパク質レポータ系は活性でもよく、ここで適切に編集された細胞は発光するが、代替的には、融合構築物（例えば、カスケード－Ｃ末端Ｔ７ ＲＮＡＰ融合構築物またはｄＣａｓ３－Ｎ末端Ｔ７ ＲＮＡＰ融合構築物）の一方もしくは両方、および／または編集識別ｇＲＮＡは、誘導性プロモータの制御下であってもよく、細胞が編集されるまでスプリットタンパク質レポータ系は活性化されない。編集中であろうと編集後であろうと、スプリットタンパク質レポータ系は、活性である場合、生物発光を介して適切に編集された細胞の同定を可能にする。編集後に、細胞を選別することが可能な選択モジュール７１４に細胞を移す。
次いで、スプリットタンパク質レポータ系が活性であり（例えば、発光細胞）、発光性でない細胞から分離された細胞を、別の回の編集のために増殖させ、調製する。多モジュール細胞処理器具は、１つもしくは複数のスクリプトによって指向されるように、または使用者の入力もしくはスクリプトの組合せとして、使用者の入力に基づいて器具を操作するように構成された処理装置７１６によって制御される。処理装置７１６は、器具７００の様々なモジュールのタイミング、継続時間、温度および操作、ならびに試薬カートリッジからの試薬の分注を制御してもよい。処理装置は、使用者が選択してもよい標準的プロトコールパラメータによってプログラムされてもよいか、使用者は、１つもしくは複数のパラメータを手作業で特定してもよいか、または試薬カートリッジに関連した１つもしくは複数のスクリプトは、１つもしくは複数の操作および／もしくは反応パラメータを特定してもよい。さらに、処理装置は、細胞が標的ＯＤに達し、コンピテントになり、濃縮され、かつ／または多モジュール器具における様々なモジュールにおける細胞の進行に関して使用者を更新することを（例えば、スマートフォンまたは他のデバイスへの適用を介して）使用者に通知してもよい。
多モジュール細胞編集器具の例については、全体が本願明細書に援用される、２０１９年４月９日に発行された米国特許第１０，２５３，３１６号、２０１９年６月２５日に発行された米国特許第１０，３２９，５５９号、２０１９年６月１８日に発行された米国特許第１０，３２３，２４２号、２０１９年９月２４日に発行された米国特許第１０，４２１，９５９号、２０１９年１１月５日に発行された米国特許第１０，４６５，１８５号、２０１９年５月１４日に出願された米国特許出願第１６／４１２，１９５号、２０１９年９月１４日に出願された米国特許出願第１６／５７１，０９１号、２０１９年１０月２９日に出願された米国特許出願第１６／６６６，９６４号を参照されたい。
記載されている処理が、再帰的で、かつ多重化されてもよく、すなわち、細胞が、図７に関連して記載されるワークフローを経てもよく、次いで、得られた編集済み培養物が、異なる編集ベクターによる別の（またはいくつか、もしくは多くの）回のさらなる編集（例えば、再帰的編集）を経てもよいことは、本開示が与えられる当業者にとって明らかであるべきである。例えば、１回目の編集からの細胞を希釈してもよく、編集ベクターＡによって編集された編集済み細胞のアリコートを編集ベクターＢと組み合わせてもよく、編集ベクターＡによって編集された編集済み細胞のアリコートを編集ベクターＣと組み合わせてもよく、編集ベクターＡによって編集された編集済み細胞のアリコートを編集ベクターＤと組み合わせてもよく、２回目の編集についても同様である。２回目の後、二重編集済み細胞の各々のアリコートを、例えば、ＡＢ編集済み細胞、ＡＣ編集済み細胞、ＡＤ編集済み細胞の各々のアリコートを編集ベクターＸ、ＹおよびＺなどのさらなる編集ベクターと組み合わせる３回目の編集に供してもよい。すなわち、二重編集済み細胞ＡＢは、ベクターＸ、ＹおよびＺと組み合わされ、編集されて、三重編集された編集済み細胞ＡＢＸ、ＡＢＹおよびＡＢＺを生成してもよく、二重編集済み細胞ＡＣは、ベクターＸ、ＹおよびＺと組み合わされ、編集されて、三重編集済み細胞ＡＣＸ、ＡＣＹおよびＡＣＺを生成してもよく、二重編集済み細胞ＡＤは、ベクターＸ、ＹおよびＺと組み合わされ、編集されて、三重編集済み細胞ＡＤＸ、ＡＤＹおよびＡＤＺを生成してもよく、その他も同様であってもよい。この処理において、編集の多くの順列および組合せを実行することが可能であり、それによって、非常に多様な細胞集団および細胞ライブラリが生じる。
任意の再帰的処理において、以前のエンジンベクターおよび編集ベクター（または単一のベクター系における単一エンジン＋編集ベクター）を「治癒する（ｃｕｒｅ）」ことが有利である。「治癒」は、前の回の編集において使用される１つまたは複数のベクターが形質転換細胞から除去される処理である。例えば、治癒プラスミドを使用して（１つまたは複数の）ベクターを切断することによって編集ベクターおよび／またはエンジンベクター（または、単一の組み合わされたエンジン／編集ベクター）を機能しないようにすること、細胞増殖を介して細胞集団内における（１つまたは複数の）ベクターを希釈すること（すなわち、細胞が経る増殖サイクルが多くなると、（１つまたは複数の）編集ベクターまたはエンジンベクターを保持する娘細胞が少なくなる）、または、例えば、編集ベクターまたはエンジンベクター（または組み合わされたエンジン＋編集ベクター）上における感熱性複製開始点を利用することによって、治癒を達成することができる。治癒のための条件は、治癒のために使用される機構、すなわち、この例においては、どのようにして治癒プラスミドが編集ベクターおよび／またはエンジンベクターを切断するのかに依存する。
以下の実施例は、本発明を製作し、使用する方法の完全な開示および記載を当業者に提供するように示されるが、本発明者らがそれらの発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではなく、以下の実験が、行われた実験の全てまたは唯一の実験であることを表し、含意することを意図するものでもない。広範に記載される通りの本発明の精神または範囲から逸脱することなく、特定の態様に示されるように、本発明に対して多くの変更および／または改変を行ってもよいことは、当業者によって認識されるであろう。したがって、本態様は、あらゆる点において、例示的であるが、限定的でないものと考えられる。
実施例Ｉ：完全自動化シングルプレックスＲＧＮ指向編集の実行
本開示の自動化多モジュール器具によって、ＭＡＤ７ヌクレアーゼを使用するシングルプレックス自動化ゲノム編集を正常に行った。米国特許第９，９８２，２７９号、ならびに２０１８年６月３０日に出願された米国特許出願第１６／０２４，８３１号、２０１８年６月３０日に出願された米国特許出願第１６／０２４，８１６号、２０１８年９月２８日に出願された米国特許出願第１６／１４７，３５３号、２０１８年９月３０日に出願された米国特許出願第１６／１４７，８６５号、および２０１８年６月３０日に出願された米国特許出願第１６／１４７，８７１号を参照されたい。
自動化器具に含まれる等温核酸構築モジュールにおける「編集ベクター」内に、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）を介して、ａｍｐＲプラスミド骨格およびｌａｃＺ＿Ｆ１７２＊編集カセットを構築した。ｌａｃＺ＿Ｆ１７２は、ｌａｃＺ遺伝子を機能的にノックアウトする。「ｌａｃＺ＿Ｆ１７２＊」は、ｌａｃＺアミノ酸配列における１７２番目の残基で編集が生じることを示す。構築後、ＡＭＰｕｒｅビーズを使用して等温核酸構築モジュール内で生成物を脱塩し、８０％エタノールで洗浄し、緩衝液に溶出させた。構築された編集ベクターおよびリコンビニアリング（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）の準備ができているエレクトロコンピテント大腸菌細胞をエレクトロポレーションのための形質転換モジュールに移した。細胞および核酸を組み合わせて、１分間混合させ、エレクトロポレーションを３０秒間行った。穿孔パルス（ｐｏｒｉｎｇ ｐｕｌｓｅ）についてのパラメータは、電圧が２４００Ｖ、長さが５ｍｓ、間隔が５０ｍｓ、パルス数が１、極性が＋であった。トランスファーパルス（ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｕｌｓｅｓ）についてのパラメータは、電圧が１５０Ｖ、長さが５０ｍｓ、間隔が５０ｍｓ、パルス数が２０、極性が±であった。エレクトロポレーション後、細胞を回復モジュール（別の増殖モジュール）に移し、クロラムフェニコールを含有するＳＯＣ培地中において回収した。１時間後、カルベニシリンを培地に加え、細胞をさらに２時間回収した。回収後、細胞を、使用者が回収するまで４℃で保持した。
自動化処理および回収の後、ラクトース（糖基質として）とクロラムフェニコールとカルベニシリンとが補充されたマッコンキー寒天基部上で細胞のアリコートを平板培養し、コロニーが出現するまで増殖させた。白色のコロニーは、機能的に編集された細胞を表し、紫色のコロニーは、未編集の細胞を表した。自動化多モジュール細胞処理器具の自動化液体取り扱いデバイスによって全ての液体移送を行った。
自動化処理の結果は、約１．０Ｅ０３個の総細胞が形質転換され（従来のベンチトップ結果と同等）、編集効率は８３．５％であったというものであった。細胞のゲノムの編集済み領域の配列決定によって、白色のコロニーにおけるｌａｃＺ＿１７２編集を確認した。さらに、自動化細胞処理の工程をウェブカメラによって遠隔で観察し、テキストメッセージを送信して自動化処理手法の状態を更新した。
実施例ＩＩ：完全自動化再帰的編集の実行
自動化多モジュール細胞処理系を使用して、再帰的編集を正常に達成した。自動化系に含まれる等温核酸構築モジュールにおける「編集ベクター」内に、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）を介して、ａｍｐＲプラスミド骨格およびｌａｃＺ＿Ｖ１０＊編集カセットを構築した。ｌａｃＺ＿Ｆ１７２編集と同様に、ｌａｃＺ＿Ｖ１０編集は、ｌａｃＺ遺伝子を機能的にノックアウトする。「ｌａｃＺ＿Ｖ１０」は、ｌａｃＺアミノ酸配列におけるアミノ酸位置１０で編集が生じることを示す。構築後に、ＡＭＰｕｒｅビーズを使用して等温核酸構築モジュール内で生成物を脱塩し、８０％エタノールで洗浄し、緩衝液に溶出させた。最初に構築された編集ベクターおよびリコンビニアリングの準備ができているエレクトロコンピテント大腸菌細胞をエレクトロポレーションのための形質転換モジュールに移した。細胞および核酸を組み合わせて、１分間混合させ、エレクトロポレーションを３０秒間行った。穿孔パルスについてのパラメータは、電圧が２４００Ｖ、長さが５ｍｓ、間隔が５０ｍｓ、パルス数が１、極性が＋であった。トランスファーパルスについてのパラメータは、電圧が１５０Ｖ、長さが５０ｍｓ、間隔が５０ｍｓ、パルス数が２０、極性が±であった。エレクトロポレーション後、クロラムフェニコールを含有するＳＯＣ培地中において回収された回復モジュール（別の増殖モジュール）に細胞を移した。１時間後、カルベニシリンを培地に加え、細胞をさらに２時間増殖した。次いで、細胞を遠心分離モジュールに移し、次いで、培地交換を行った。クロラムフェニコールおよびカルベニシリンを含有するＴＢにおいて細胞を再懸濁させ、ここで細胞をＯＤ６００が２．７になるまで増殖させ、次いで濃縮し、エレクトロコンピテントとした。
細胞増殖の間、等温核酸構築モジュールにおいて第２編集ベクターを調製した。第２編集ベクターはカナマイシン耐性遺伝子を含み、編集カセットはｇａｌＫ Ｙ１４５＊編集を含んだ。成功した場合、ｇａｌＫ Ｙ１４５＊編集は、ガラクトースを取り込み、代謝する能力を細胞に付与する。ｇａｌＫ Ｙ１５４＊カセットによって生成された編集は、チロシンアミノ酸を停止コドンに変化させた１５４番目のアミノ酸残基（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｅ）における停止コドンを導入する。この編集によって、ｇａｌＫ遺伝子産物は機能しなくなり、細胞がガラクトースを代謝し得ることを阻害する。構築後、ＡＭＰｕｒｅビーズを使用して等温核酸構築モジュール内で第２編集ベクター生成物を脱塩し、８０％エタノールで洗浄し、緩衝液に溶出させた。上記で詳細に述べたものと同じパラメータを使用して、構築された第２編集ベクターおよび（第１編集ベクターで形質転換され、選択された）エレクトロコンピテント大腸菌細胞をエレクトロポレーションのための形質転換モジュールに移した。エレクトロポレーション後、カルベニシリンを含有するＳＯＣ培地中において回収された回復モジュール（別の増殖モジュール）に細胞を移した。回収後、細胞を、取得するまで４℃で保持し、その後、クロラムフェニコールおよびカナマイシンが補充されたＬＢ寒天上に細胞のアリコートを平板培養した。ｌａｃＺ編集およびｇａｌＫ編集の両方を定量するために、２つの培地型、すなわち、１）ラクトース（糖基質として）とクロラムフェニコールとカナマイシンとが補充されたマッコンキー寒天基部、および２）ガラクトース（糖基質として）とクロラムフェニコールとカナマイシンとが補充されたマッコンキー寒天基部上にレプリカパッチプレートを生成した。自動化多モジュール細胞処理系の自動化液体取り扱いデバイスによって全ての液体移送を行った。
この再帰的編集実験において、スクリーニングされたコロニーの４１％は、ｌａｃＺ編集およびｇａｌＫ編集を有したが、その結果は、「ベンチトップ」または手作業アプローチを使用して得られた二重編集効率と同等であった。
実施例ＩＩＩ：集団における特定の遺伝子型を有する細胞の単離
自動化シングルプレックスまたは再帰的編集を実行した後、完全な意図された編集、不完全な編集、未編集細胞または野生型細胞に対応する複数の特異的遺伝子型を含む細胞集団を生成する。完全な意図された編集だけを同定し、単離するために、スプリットＴ７ ＲＮＡＰの２つの半分（例えば、スプリットタンパク質レポータ系の部分）が、それぞれカスケード複合体および非活性化ｃａｓ３ヌクレアーゼ上に融合された、修飾Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ系を利用する。編集識別ｃｒＲＮＡとのカスケード複合体の間のＲループの形成を介した、完全な意図された編集の識別認識の後、非活性化ｃａｓ３融合タンパク質は、Ｒループの部位にリクルートされ、カスケード複合体に結合する。この結合事象によって、スプリットＴ７ ＲＮＡＰの２つの半分が近接して、活性Ｔ７ポリメラーゼが形成される。次いで、活性Ｔ７ポリメラーゼは、レポータ遺伝子を転写する。
Ｔ７ Ｃ末端断片に融合したＴ．フスカ（ｆｕｓｃａ）ＸＹカスケード複合体を、ＬＢ培地上に増殖する大腸菌ＢＬ２１細胞における３つのプラスミド共発現系を介して、組換え発現させ、精製した。第１プラスミドは、クロラムフェニコール耐性を含むｐＴＡＣ－ＭＡＴ－Ｔａｇ１（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）ベクター上における２０ａａフレキシブルＧｌｙＳｅｒリンカーを有するＣ末端上に融合したＴ７ ＲＮＡＰポリメラーゼのＣ末端断片（アミノ酸１８１～８８３）とのＴ．フスカＸＹカスケード複合体のｃｓｅ１タンパク質を含んだ（図８Ａ参照）。アンピシリン耐性を有するｐＴＡＣ－ＭＡＴ－Ｔａｇ１ベクター上における第２プラスミドは、３７℃におけるＲループ形成とｃａｓ７遺伝子のＣ末端上におけるＳＶ４０ ＮＬＳシグナルとを促進して、ｐＴＡＣ－ｃｓｅ２－ｃａｓ７－ＮＬＳ－ｃａｓ５ｅ－ｃａｓ６ｅを作製するｃｓｅ２上のＮ２３Ａ突然変異を有する残りのカスケード複合遺伝子、ｃｓｅ２－ｃａｓ７－ＮＬＳ－ｃａｓ５ｅ－ｃａｓ６ｅを含んだ（図＞８Ｂ参照）。第３プラスミドは、合成ＣＲＩＳＰＲアレイから発現してｐＴＡＣ－ｃｒＲＮＡ－ＧＦＰを作製したｃｒＲＮＡを含んだ（図８Ｃ）。全ての３つのプラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１細胞を０．６のＯＤに増殖させ、ＩＰＴＧを０．５ｍＭの濃度になるように加えた後、細胞を一晩増殖させることによって、発現を誘導した。次いで、細胞を採取し、リゾチームを使用して溶解し、製造業者のプロトコールに従って、Ｎｉ－ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）によって融合Ｔ７－Ｃ末端ＲＮＡＰとのカスケード複合体を精製した。
別々に、非活性化Ｔ．フスカＸＹ ｃａｓ３を組換え発現させ、精製した。Ｔ７ ＲＮＡＰ（アミノ酸１～１７９）のＮ末端融合の後に１４ａａフレキシブルＧｌｙＳｅｒリンカーならびにＣ末端ＳＶ４０ ＮＬＳおよび６ｘＨｉｓタグを有するＴ．フスカＸＹ ｃａｓ３ Ｄ８４Ａ Ｄ４８１ＡをｐＴＡＣ－ＭＡＴ－Ｔａｇ１（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）にクローニングして、ｐＴＡＣ－Ｔ７－Ｎ末端－ｃａｓ３－ＮＬＳ－Ｈｉｓを作製した（図８Ｄ）。プラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１細胞を０．６のＯＤに増殖させ、ＩＰＴＧを１ｍＭの濃度になるように加えることによって発現を誘導した後、細胞を１８℃で一晩増殖させた。次いで、細胞を溶解し、Ｎｉ－ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）によって非活性化ｃａｓ３－Ｔ７－Ｎ末端融合を精製した。
Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ系（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、前に編集されたＨＥＫ２９３Ｔ－ＧＦＰ細胞のプールをエレクトロポレーション処理した。編集済み細胞をトリプシン処理し、１×ＤＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で洗浄し、Ｎｅｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｒで再懸濁した。Ｔ７プロモータによって駆動される８０ｐｍｏｌのカスケード－Ｔ７－Ｃ末端、２０ｐｍｏｌのｃａｓ３－Ｔ７－Ｎ末端、および５ｐｍｏｌのＦ３０－２ｘｄＢｒｏｃｃｏｌｉ（ｐＪｉｎ１４１）を緩衝液Ｒ中において約１．０Ｅ０５個の細胞と混合した。混合物を１０μＬのＮｅｏｎチップによってエレクトロポレーション処理し（１１００Ｖ、２０ｍｓ、２パルス）、２４ウェルプレート内で平板培養した。７２時間後、最高の蛍光に基づいて、ＢＤ ＦＡＣＳＭｅｌｏｄｙ（商標）細胞選別機において細胞を選別し、カスケードｃｒＲＮＡによってのためにプログラムされた、完全な意図された編集を含んだ細胞だけを回収した。
本発明が、本発明の好ましい実施形態に関して詳細に記載されるように、多くの異なる形における実施形態によって満たされると共に、本開示は、本発明の原理の例示であると考えられ、本明細書において例示され、記載される具体的な実施形態に本発明を限定することを意図されるものではないということが理解される。本発明の精神から逸脱することなく、当業者によって、多くの変更が行われてもよい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびそれらの均等物によって判断されるであろう。要約書および発明の名称は、それらの目的が、適切な当局および一般市民が本発明の一般的性質を迅速に決定することを可能にすることであるので、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるものではない。以下の請求項において、「手段」という用語が使用されない限り、その中に列挙される特徴または要素のいずれも、米国特許法第１１２条第６パラグラフに規定されるミーンズプラスファンクションの限定として解釈されるべきではない。

Claims (20)

  1. ベクター骨格におけるカスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ融合タンパク質コード配列と、
    ベクター骨格におけるｄＣａｓ３－Ｔ７－ＲＮＡＰ融合タンパク質コード配列と、
    ベクター骨格におけるｇＲＮＡに対する配列であって、前記ｇＲＮＡが、ゲノム配列における合理的設計編集済み遺伝子座を認識するが、未編集状態または不正確な編集状態の該ゲノム配列における該遺伝子座を認識しない、前記ｇＲＮＡに対する前記配列と、
    Ｔ７プロモータの制御下におけるレポータ遺伝子に対するコード配列と
    を含む核酸誘導ヌクレアーゼ編集系。
  2. 前記カスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ融合タンパク質コード配列が前記Ｔ７ ＲＮＡＰのＣ末端を含む、請求項１に記載の核酸誘導ヌクレアーゼ編集系。
  3. 前記Ｔ７ ＲＮＡＰの前記Ｃ末端がＴ７ ＲＮＡＰのアミノ酸残基１８１～８８３を含む、請求項２に記載の核酸誘導ヌクレアーゼ編集系。
  4. 前記Ｔ７－ＲＮＡＰの前記Ｃ末端がＣａｓ５のＣ末端またはｃｓｅ１／ｃａｓＡのＣ末端に融合している、請求項２に記載の核酸誘導ヌクレアーゼ編集系。
  5. 前記ｄＣａｓ３－Ｔ７ ＲＮＡＰ融合タンパク質コード配列が前記Ｔ７ ＲＮＡＰのＮ末端を含む、請求項１に記載の核酸誘導ヌクレアーゼ編集系。
  6. 前記Ｔ７ ＲＮＡＰの前記Ｎ末端がＴ７ ＲＮＡＰのアミノ酸残基１～１７９を含む、請求項５に記載の核酸誘導ヌクレアーゼ編集系。
  7. 前記Ｔ７ ＲＮＡＰの前記Ｎ末端がｄＣａｓ３のＮ末端に融合している、請求項５に記載の核酸誘導ヌクレアーゼ編集系。
  8. 前記レポータ遺伝子が、蛍光タンパク質に対するコード配列である、請求項１に記載の核酸誘導ヌクレアーゼ編集系。
  9. 前記レポータ遺伝子が、抗生物質耐性遺伝子に対するコード配列である、請求項１に記載の核酸誘導ヌクレアーゼ編集系。
  10. 前記レポータ遺伝子が、細胞表面マーカタンパク質に対するコード配列である、請求項１に記載の核酸誘導ヌクレアーゼ編集系。
  11. 前記レポータ遺伝子が、ルシフェラーゼに対するコード配列である、請求項１に記載の核酸誘導ヌクレアーゼ編集系。
  12. 前記ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼである、請求項１１に記載の核酸誘導ヌクレアーゼ編集系。
  13. 前記ルシフェラーゼがウミシイタケルシフェラーゼである、請求項１１に記載の核酸誘導ヌクレアーゼ編集系。
  14. 前記カスケード－Ｔ７ ＲＮＡＰ融合タンパク質コード配列と、前記ｄＣａｓ３－Ｔ７ ＲＮＡＰ融合タンパク質コード配列と、前記ｇＲＮＡに対する前記配列と、Ｔ７プロモータの制御下におけるレポータ遺伝子に対するコード配列とが、全て、同じベクター上にある、請求項１に記載の核酸誘導ヌクレアーゼ編集系。
  15. 前記カスケード－Ｔ７ ＲＮＡＰ融合タンパク質コード配列と、前記ｄＣａｓ３－Ｔ７ ＲＮＡＰ融合タンパク質コード配列と、前記ｇＲＮＡに対する前記配列と、Ｔ７プロモータの制御下におけるレポータ遺伝子に対するコード配列とが、２つ以上の異なるベクター上にある、請求項１に記載の核酸誘導ヌクレアーゼ編集系。
  16. 請求項１に記載のベクター骨格を含む細胞。
  17. 前記カスケード－Ｔ７－ＲＮＡＰ融合タンパク質コード配列が前記Ｔ７ ＲＮＡＰのＮ末端を含む、請求項１に記載の核酸誘導ヌクレアーゼ編集系。
  18. 前記Ｔ７－ＲＮＡＰの前記Ｎ末端がＣａｓ５のＮ末端またはｃｓｅ１／ｃａｓＡのＮ末端に融合している、請求項１７に記載の核酸誘導ヌクレアーゼ編集系。
  19. 前記ｄＣａｓ３－Ｔ７ ＲＮＡＰ融合タンパク質コード配列が前記Ｔ７ ＲＮＡＰのＣ末端を含む、請求項１に記載の核酸誘導ヌクレアーゼ編集系。
  20. 前記Ｔ７ ＲＮＡＰの前記Ｃ末端がｄＣａｓ３のＣ末端に融合している、請求項１９に記載の核酸誘導ヌクレアーゼ編集系。
JP2022537479A 2019-12-18 2020-12-15 核酸誘導ヌクレアーゼ編集済み細胞のｉｎ ｖｉｖｏ検出のためのカスケード／ｄＣａｓ３相補性アッセイ Pending JP2023507566A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962949472P 2019-12-18 2019-12-18
US62/949,472 2019-12-18
PCT/US2020/065168 WO2021126886A1 (en) 2019-12-18 2020-12-15 Cascade/dcas3 complementation assays for in vivo detection of nucleic acid-guided nuclease edited cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023507566A true JP2023507566A (ja) 2023-02-24

Family

ID=75910368

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022537479A Pending JP2023507566A (ja) 2019-12-18 2020-12-15 核酸誘導ヌクレアーゼ編集済み細胞のｉｎ ｖｉｖｏ検出のためのカスケード／ｄＣａｓ３相補性アッセイ

Country Status (9)

Country Link
US (6) US11008557B1 (ja)
EP (1) EP4069851A4 (ja)
JP (1) JP2023507566A (ja)
KR (1) KR20220118498A (ja)
CN (1) CN114829607A (ja)
AU (1) AU2020407048A1 (ja)
CA (1) CA3157127A1 (ja)
IL (1) IL292895A (ja)
WO (1) WO2021126886A1 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9988624B2 (en) 2015-12-07 2018-06-05 Zymergen Inc. Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform
US11208649B2 (en) 2015-12-07 2021-12-28 Zymergen Inc. HTP genomic engineering platform
CN117384867A (zh) * 2022-09-16 2024-01-12 北京普译生物科技有限公司 一种经修饰的Cas3移位酶及其应用

Family Cites Families (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6391582B2 (en) 1998-08-14 2002-05-21 Rigel Pharmaceuticlas, Inc. Shuttle vectors
SE9900530D0 (sv) 1999-02-15 1999-02-15 Vincenzo Vassarotti A device for concentrating and/or purifying macromolecules in a solution and a method for manufacturing such a device
US6986993B1 (en) 1999-08-05 2006-01-17 Cellomics, Inc. System for cell-based screening
AU2001280968A1 (en) 2000-07-31 2002-02-13 Menzel, Rolf Compositions and methods for directed gene assembly
US20020139741A1 (en) 2001-03-27 2002-10-03 Henry Kopf Integral gasketed filtration cassette article and method of making the same
US7166443B2 (en) 2001-10-11 2007-01-23 Aviva Biosciences Corporation Methods, compositions, and automated systems for separating rare cells from fluid samples
US8106255B2 (en) 2002-01-23 2012-01-31 Dana Carroll Targeted chromosomal mutagenasis using zinc finger nucleases
US20040110253A1 (en) 2002-08-13 2004-06-10 Kappler John W. Method for identifying MHC-presented peptide epitopes for T cells
US20040138154A1 (en) 2003-01-13 2004-07-15 Lei Yu Solid surface for biomolecule delivery and high-throughput assay
PL2325332T3 (pl) 2005-08-26 2013-03-29 Dupont Nutrition Biosci Aps Zastosowanie genów związanych z CRISPR (genów CAS)
EP2155868A2 (en) 2007-04-19 2010-02-24 Codon Devices, Inc Engineered nucleases and their uses for nucleic acid assembly
WO2009025690A2 (en) 2007-05-23 2009-02-26 Nature Technology Corporation Improved e. coli plasmid dna production
GB0724860D0 (en) 2007-12-20 2008-01-30 Heptares Therapeutics Ltd Screening
EP2279253B1 (en) 2008-04-09 2016-11-16 Maxcyte, Inc. Engineering and delivery of therapeutic compositions of freshly isolated cells
US9845455B2 (en) 2008-05-15 2017-12-19 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method for cell expansion
US20100076057A1 (en) 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
CN105624193B (zh) 2008-09-26 2021-07-13 索元生物医药(美国)有限公司 重组载体
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
WO2010093966A2 (en) 2009-02-12 2010-08-19 Fred Hutchinson Cancer Research Center Generation of a dna nicking enzyme that stimulates site-specific gene conversion from a homing endonuclease
GB0922434D0 (en) 2009-12-22 2010-02-03 Ucb Pharma Sa antibodies and fragments thereof
PL2510096T5 (pl) 2009-12-10 2018-06-29 Regents Of The University Of Minnesota Modyfikacja DNA zależna od efektora TAL
SG185481A1 (en) 2010-05-10 2012-12-28 Univ California Endoribonuclease compositions and methods of use thereof
EP2395087A1 (en) 2010-06-11 2011-12-14 Icon Genetics GmbH System and method of modular cloning
US9361427B2 (en) 2011-02-01 2016-06-07 The Regents Of The University Of California Scar-less multi-part DNA assembly design automation
US8332160B1 (en) 2011-11-17 2012-12-11 Amyris Biotechnologies, Inc. Systems and methods for engineering nucleic acid constructs using scoring techniques
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
EA038924B1 (ru) 2012-05-25 2021-11-10 Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния Способы и композиции рнк-специфической модификации днк-мишени и рнк-специфической модуляции транскрипции
LT2864531T (lt) 2012-06-25 2019-03-12 Gen9, Inc. Nukleorūgšties konstravimo ir aukšto produktyvumo sekvenavimo būdai
EP2877490B1 (en) 2012-06-27 2018-09-05 The Trustees of Princeton University Split inteins, conjugates and uses thereof
CN116622704A (zh) 2012-07-25 2023-08-22 布罗德研究所有限公司 可诱导的dna结合蛋白和基因组干扰工具及其应用
KR102531576B1 (ko) 2012-12-06 2023-05-11 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 Crispr-기초된 유전체 변형과 조절
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
WO2014143381A1 (en) 2013-03-09 2014-09-18 Agilent Technologies, Inc. Methods of in vivo engineering of large sequences using multiple crispr/cas selections of recombineering events
US9499855B2 (en) 2013-03-14 2016-11-22 Elwha Llc Compositions, methods, and computer systems related to making and administering modified T cells
GB2584364A (en) 2013-03-15 2020-12-02 Abvitro Llc Single cell bar-coding for antibody discovery
US9234213B2 (en) 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
CN115261411A (zh) 2013-04-04 2022-11-01 哈佛学院校长同事会 利用CRISPR/Cas系统的基因组编辑的治疗性用途
WO2014191518A1 (en) 2013-05-29 2014-12-04 Cellectis A method for producing precise dna cleavage using cas9 nickase activity
WO2014207016A1 (en) 2013-06-25 2014-12-31 Tetra Laval Holdings & Finance S.A. Membrane filtration device having a hygienic suspension arrangement
CN116042726A (zh) 2013-07-09 2023-05-02 哈佛大学校长及研究员协会 多重rna向导的基因组工程
US9322037B2 (en) * 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US10822606B2 (en) 2013-09-27 2020-11-03 The Regents Of The University Of California Optimized small guide RNAs and methods of use
US20150098954A1 (en) 2013-10-08 2015-04-09 Elwha Llc Compositions and Methods Related to CRISPR Targeting
US10767156B2 (en) 2013-10-24 2020-09-08 Yeda Research And Development Co., Ltd. Polynucleotides encoding BREX system polypeptides and methods of using same
WO2015088643A1 (en) 2013-12-11 2015-06-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the targeted modification of a genome
JP6712948B2 (ja) 2013-12-12 2020-06-24 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 組成物、及びヌクレオチドリピート障害におけるｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ系の使用方法
US10787654B2 (en) 2014-01-24 2020-09-29 North Carolina State University Methods and compositions for sequence guiding Cas9 targeting
EP3690044B1 (en) 2014-02-11 2024-01-10 The Regents of the University of Colorado, a body corporate Crispr enabled multiplexed genome engineering
WO2015143558A1 (en) 2014-03-27 2015-10-01 British Columbia Cancer Agency Branch T-cell epitope identification
US20170022499A1 (en) 2014-04-03 2017-01-26 Massachusetts Institute Of Techology Methods and compositions for the production of guide rna
CN106459967A (zh) 2014-04-29 2017-02-22 Illumina公司 使用模板转换和标签化的多重单细胞基因表达分析
WO2015183025A1 (ko) 2014-05-28 2015-12-03 주식회사 툴젠 표적 특이적 뉴클레아제를 이용한 표적 dna의 민감한 검출 방법
US20160053272A1 (en) 2014-07-18 2016-02-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods Of Modifying A Sequence Using CRISPR
US20160053304A1 (en) 2014-07-18 2016-02-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods Of Depleting Target Sequences Using CRISPR
CN107075452A (zh) 2014-07-25 2017-08-18 诺沃吉股份有限公司 来源于解脂耶氏酵母和解腺嘌呤阿氏酵母的启动子及其使用方法
US20160076093A1 (en) 2014-08-04 2016-03-17 University Of Washington Multiplex homology-directed repair
CN113930455A (zh) 2014-10-09 2022-01-14 生命技术公司 Crispr寡核苷酸和基因剪辑
WO2016061481A1 (en) 2014-10-17 2016-04-21 The Penn State Research Foundation Methods and compositions for multiplex rna guided genome editing and other rna technologies
DK3242950T3 (da) 2015-01-06 2021-12-20 Dsm Ip Assets Bv Crispr-cas-system til en trådformet svampeværtscelle
US20180284125A1 (en) 2015-03-11 2018-10-04 The Broad Institute, Inc. Proteomic analysis with nucleic acid identifiers
KR20170126500A (ko) 2015-03-16 2017-11-17 막스-델부뤽-센트럼 퓌어 몰레쿨라레 메디친 인 데어 헬름홀츠-게마인샤프트 Mhc 세포 라이브러리를 이용하여 신규한 면역원성 t 세포 에피토프를 검출하고 신규한 항원-특이적 t 세포 수용체를 단리하는 방법
CA2982759A1 (en) 2015-04-13 2016-10-20 Maxcyte, Inc. Methods and compositions for modifying genomic dna
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
SG10201913682QA (en) 2015-06-25 2020-03-30 Icell Gene Therapeutics Llc CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS (CARs), COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
WO2017009399A1 (en) 2015-07-13 2017-01-19 Institut Pasteur Improving sequence-specific antimicrobials by blocking dna repair
WO2017028083A1 (zh) * 2015-08-15 2017-02-23 黄冠明 根据床压调控温度的方法和空调系统
CN108369230B (zh) 2015-09-25 2021-09-17 阿布维特罗有限责任公司 用于对天然配对t细胞受体序列进行t细胞受体靶向鉴别的高通量方法
JP7109784B2 (ja) * 2015-10-23 2022-08-01 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 遺伝子編集のための進化したＣａｓ９蛋白質
WO2017075265A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute, Inc. Multiplex analysis of single cell constituents
WO2017075294A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Board Institute Inc. Assays for massively combinatorial perturbation profiling and cellular circuit reconstruction
US11261435B2 (en) 2015-11-05 2022-03-01 Agency For Science, Technology And Research Chemical-inducible genome engineering technology
EP3374494A4 (en) 2015-11-11 2019-05-01 Coda Biotherapeutics, Inc. CRISPR COMPOSITIONS AND METHODS OF USE FOR GENE THERAPY
US9988624B2 (en) 2015-12-07 2018-06-05 Zymergen Inc. Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform
MX2018007290A (es) 2015-12-18 2019-01-10 Danisco Us Inc Metodos y composiciones para expresion de acido ribonucleico (arn) guia basada en polimerasa ii (pol-ii).
EP3402890A1 (en) 2016-01-12 2018-11-21 SQZ Biotechnologies Company Intracellular delivery of complexes
EP3199632A1 (en) 2016-01-26 2017-08-02 ACIB GmbH Temperature-inducible crispr/cas system
US9896696B2 (en) 2016-02-15 2018-02-20 Benson Hill Biosystems, Inc. Compositions and methods for modifying genomes
US11565237B2 (en) 2016-03-18 2023-01-31 Qt Holdings Corp Compositions, devices, and methods for cell separation
CN109072191B (zh) 2016-04-04 2024-03-22 苏黎世联邦理工学院 用于蛋白生产和文库产生的哺乳动物细胞系
US11499168B2 (en) 2016-04-25 2022-11-15 Universitat Basel Allele editing and applications thereof
WO2017193107A2 (en) 2016-05-06 2017-11-09 Juno Therapeutics, Inc. Genetically engineered cells and methods of making the same
EP3272867B1 (en) 2016-06-02 2019-09-25 Sigma Aldrich Co. LLC Using programmable dna binding proteins to enhance targeted genome modification
WO2017212400A2 (en) 2016-06-06 2017-12-14 The University Of Chicago Proximity-dependent split rna polymerases as a versatile biosensor platform
EP3475416A4 (en) 2016-06-22 2020-04-29 Icahn School of Medicine at Mount Sinai VIRAL DELIVERY OF RNA USING SELF-CLeavING RIBOZYMES AND CRISPR-BASED APPLICATIONS
CN109688820B (zh) 2016-06-24 2023-01-10 科罗拉多州立大学董事会（法人团体） 用于生成条形码化组合文库的方法
US20190264193A1 (en) 2016-08-12 2019-08-29 Caribou Biosciences, Inc. Protein engineering methods
CN109715804A (zh) 2016-09-23 2019-05-03 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于宿主细胞的指导rna表达系统
EP3526326A4 (en) 2016-10-12 2020-07-29 The Regents of The University of Colorado, A Body Corporate NEW MODIFIED AND CHEMERICAL NUCLEASES
KR102606929B1 (ko) 2016-11-07 2023-11-27 제노비에 에이비 동족 항원과 t-세포 수용체 상호작용의 발견 및 특징규명을 위한 조작된 2-부분 세포 디바이스
US20190323019A1 (en) * 2016-12-21 2019-10-24 Yi-Hua Hsu Composition for editing a nucleic acid sequence and method using the same
EP4317447A3 (en) 2017-02-15 2024-05-01 2seventy bio, Inc. Donor repair templates multiplex genome editing
JP2020513824A (ja) 2017-03-24 2020-05-21 キュアバック アーゲー Ｃｒｉｓｐｒ関連タンパク質をコードする核酸、及びその使用
US20180362590A1 (en) 2017-04-14 2018-12-20 Synthetic Genomics, Inc. Polypeptides with type v crispr activity and uses thereof
KR102541398B1 (ko) * 2017-06-08 2023-06-07 고꾸리쯔 다이가꾸 호우징 오사까 다이가꾸 Dna가 편집된 진핵 세포를 제조하는 방법 및 당해 방법에 사용되는 키트
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
KR20220104847A (ko) 2017-06-30 2022-07-26 인스크립타 인코포레이티드 자동 세포 처리 방법, 모듈, 기기 및 시스템
EP3682004A4 (en) 2017-09-15 2021-05-26 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University MULTIPLEX PRODUCTION AND GENETICALLY MODIFIED CELL BAR CODING
JP7394752B2 (ja) 2017-10-12 2023-12-08 ザ ジャクソン ラボラトリー トランスジェニック選択方法および組成物
US20190225928A1 (en) 2018-01-22 2019-07-25 Inscripta, Inc. Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems comprising filtration devices
US10376889B1 (en) 2018-04-13 2019-08-13 Inscripta, Inc. Automated cell processing instruments comprising reagent cartridges
WO2019209926A1 (en) 2018-04-24 2019-10-31 Inscripta, Inc. Automated instrumentation for production of peptide libraries
US10227576B1 (en) * 2018-06-13 2019-03-12 Caribou Biosciences, Inc. Engineered cascade components and cascade complexes
AU2019292919A1 (en) 2018-06-30 2021-03-11 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
EP3827074A2 (en) 2018-07-26 2021-06-02 Ospedale Pediatrico Bambino Gesù Therapeutic preparations of gamma-delta t cells and natural killer cells and methods for manufacture and use
EP3844272A1 (en) 2018-08-28 2021-07-07 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Methods and compositions for modulating a genome
US11965154B2 (en) 2018-08-30 2024-04-23 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
GB201816522D0 (en) 2018-10-10 2018-11-28 Autolus Ltd Methods and reagents for analysing nucleic acids from single cells
US20220177863A1 (en) 2019-03-18 2022-06-09 The Broad Institute, Inc. Type vii crispr proteins and systems
MX2021011426A (es) 2019-03-19 2022-03-11 Broad Inst Inc Metodos y composiciones para editar secuencias de nucleótidos.
GB201905651D0 (en) 2019-04-24 2019-06-05 Lightbio Ltd Nucleic acid constructs and methods for their manufacture
CN113939593A (zh) 2019-06-06 2022-01-14 因思科瑞普特公司 用于递归的核酸指导的细胞编辑的处治
US10927385B2 (en) 2019-06-25 2021-02-23 Inscripta, Inc. Increased nucleic-acid guided cell editing in yeast
US10704033B1 (en) 2019-12-13 2020-07-07 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US20210317444A1 (en) 2020-04-08 2021-10-14 Inscripta, Inc. System and method for gene editing cassette design

Also Published As

Publication number Publication date
US11198857B2 (en) 2021-12-14
US20220073892A1 (en) 2022-03-10
CA3157127A1 (en) 2021-06-24
EP4069851A4 (en) 2023-11-22
US11104890B1 (en) 2021-08-31
IL292895A (en) 2022-07-01
AU2020407048A1 (en) 2022-06-09
WO2021126886A1 (en) 2021-06-24
US11359187B1 (en) 2022-06-14
EP4069851A1 (en) 2022-10-12
US20220177865A1 (en) 2022-06-09
US11008557B1 (en) 2021-05-18
CN114829607A (zh) 2022-07-29
US20220267747A1 (en) 2022-08-25
US11286471B1 (en) 2022-03-29
KR20220118498A (ko) 2022-08-25
US20210355467A1 (en) 2021-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11066675B2 (en) Increased nucleic-acid guided cell editing in yeast
US11198857B2 (en) Cascade/dCas3 complementation assays for in vivo detection of nucleic acid-guided nuclease edited cells
US11279919B2 (en) Simultaneous multiplex genome editing in yeast
US11001831B2 (en) Simultaneous multiplex genome editing in yeast
EP3997221A1 (en) Increased nucleic acid-guided cell editing via a lexa-rad51 fusion protein
US11891609B2 (en) Methods for increasing observed editing in bacteria
US20220315907A1 (en) Split crispr nuclease tethering system
US20220002725A1 (en) Nucleic acid-guided nuclease of nickase fusion editing of methylated nucleotides
US20210254105A1 (en) Increased nucleic-acid guided cell editing in yeast
US20220002755A1 (en) Nucleic acid watermarks to assess and improve nucleic acid-guided nuclease or nickase fusion editing
US20210246441A1 (en) Use of editing cassettes for targeted sequencing
US20230136423A1 (en) Nuclease-mediated plasmid integration
US20240076697A1 (en) Methods for increased nucleic acid-guided cell editing
US20230086008A1 (en) Engineered microbial population dynamics for biosensing and information processing
WO2023102481A1 (en) Trackable nucleic acid-guided editing
WO2022251179A1 (en) Crispr editing in diploid genomes