WO2005030200A1 - 自己免疫疾患治療剤 - Google Patents

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extract
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food
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Hideharu Odai
Daisuke Fujiwara
Katsunori Sasaki
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Kirin Beer Kabushiki Kaisha
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Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for an autoimmune disease, and more particularly, to a therapeutic agent for an autoimmune disease comprising proanthocyanin as an active ingredient.
  • autoimmune diseases typified by rheumatoid arthritis have been increasing in order to promote the aged society.
  • Autoimmune diseases can be broadly classified into two types with different types of immune responses. One is a disease caused by excessive enhancement of cell-mediated immunity, and the other is a disease mediated by autoantibodies.
  • Non-limiting examples of the former include rheumatoid arthritis (RA), multiple sclerosis (MS), autoimmune thyroiditis (AT), insulin-dependent diabetes such as juvenile diabetes and type I diabetes (IDDM), Autoimmune uveal retinitis (AUR), psoriasis, etc.
  • Non-limiting examples of the latter are myasthenia gravis (MG), systemic lupus erythematosus (SLE), Goodpasture's syndrome, and autoimmune hemolytic anemia.
  • MG myasthenia gravis
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • Goodpasture's syndrome autoimmune hemolytic anemia.
  • immunosuppressants that suppress the immune response non-specifically are typical. Examples include methotrexate, cyclophosphamide, cyclosporin A, tacrolimus, various steroid compounds. These drugs are toxic.
  • biologics have recently come into the spotlight, especially in the treatment of rheumatism.
  • exacerbating factors of cell-mediated immune-dependent autoimmune diseases are inflammatory sites such as TNF, IL1, and IL6, but anti-TNF- ⁇ antibody, soluble TNF- ⁇ receptor, and anti-IL6 receptor Clinical trials have been conducted on body antibodies, IL1 receptor antagonists, and the like. These biologics require continuous administration because they are symptomatic treatments.
  • Thl cells are a subgroup of helper T cells that selectively produce Thl site forces, such as IFN- ⁇ , TNF- ⁇ , and IL-2, upon antigenic stimulation.
  • Antigen for Thl cell differentiation Cytokine called IL-12 produced by presenting cells (eg, dendritic cells, macrophages) is essential, but the amount of IL-12 produced by antigen presenting cells is increased in autoimmune diseases with cellular immunity.
  • Thl cells are more easily induced.
  • T hi cells create a Thl site force-in environment and induce the differentiation of Tel cells, T cells with cytotoxic activity. Therefore, it can be said that suppressing the production of Thl site force-in is effective for the treatment and prevention of autoimmune diseases.
  • proanthocyanin is a condensed tannin widely contained in various plants, and gives anthocyanin by acid treatment. As shown in Fig. 1, it is a polyphenol component polymerized mainly using catechins, ie, flavan 3-ol as a basic unit. That is, proanthocyanin is a general term for a very diverse group of compounds in which monomers having hydroxyl groups at various sites are polymerized based on the flavan skeleton. Of the constituent units of the polymer, the base end is called the terminal unit, and the others are called the extension unit. The degree of polymerization ranges from dimer and trimer to high polymers of 100 and more.
  • proanthocyanin as an antiallergic agent based on the action of inhibiting the release of histamine, leukotriene and the like from basophils has been reported so far.
  • Japanese Unexamined Patent Publication No. 2001-278792 Japanese Unexamined Patent Publication No. 9-291039
  • a matrix proteinase inhibitory action Japanese Unexamined Patent Publication No. 2003-504402
  • a muscle atrophy inhibiting action Japanese Unexamined Patent Publication No. 2002-338464
  • Various publications have been reported, such as an anti-hyperglycemic effect (Japanese Unexamined Patent Publication No. 4253918).
  • the effects of proanthocyanins on the suppression of production of Thl site dyskines, as well as the treatment and prevention of autoimmune diseases are known.
  • the present inventors have found that a specific plant-derived extract suppresses the production of Thl-site force-in in Thl-biased mouse spleen cells, and that the active ingredient that produces the effect is proanthocyanin, a type of polyphenol.
  • proanthocyanins having a specific polymerization degree are particularly effective in suppressing the production of Thl-site force-in, and have completed the present invention.
  • proanthocyanins having a tetramer or more, particularly a pentamer or more, have been experimentally used.
  • the present inventors have also found that high polymerization degree proanthocyanin suppresses the activation of B cells and that high polymerization degree proanthocyanin suppresses autoantibody production in mice in which autoantibodies are induced.
  • the inventors have found that the present invention has been completed, and have completed the present invention.
  • the present invention is effective in treating diseases in which suppression of production of Thl site force-in, such as rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, and insulin-dependent diabetes, is effective for treatment, and suppression of production of autoantibodies is effective in treatment.
  • the purpose is to provide a therapeutic agent for a disease.
  • the Thl site strength comprises as an active ingredient (i) a proanthocyanin having a degree of polymerization of 4 or more, or (ii) an extract of a plant material containing a proanthocyanin.
  • Therapeutic agents for diseases for which suppression of in-product production is effective for treatment and those for which suppression of Z or autoantibody production is effective for treatment, curative treatment for those diseases, and progress inhibitors for those diseases hereinafter ⁇ A "therapeutic agent according to the invention").
  • an extract of (i) a proanthocyanin having a degree of polymerization of 4 or more, or (ii) a plant material containing a proanthocyanin, for producing the therapeutic agent according to the present invention. Use provided.
  • a therapeutically effective amount of (i) a proanthocyanin having a polymerization degree or higher, or (ii) an extract of a plant material containing proanthocyanin, if necessary,
  • a method for treating a disease in which suppression of Thl site force-in production is effective for treatment and a disease in which suppression of production of Z or autoantibodies is effective for treatment comprising administering to a mammal together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a method for the curative treatment of such diseases and a method for inhibiting the progress of those diseases are provided.
  • FIG. 1 is a diagram showing the structural formulas of epicatechin and catechin, which are typical components of a flavane-conjugated product constituting proanthocyanin, and gallic acid, which is often esterified to a hydroxyl group at the 3-position of a flavan ring.
  • FIG. 2 is a diagram showing the preparation of a human multiple sclerosis model mouse and the schedule of intraperitoneal administration of Jatoba.
  • FIG. 3 is a graph showing the evaluation of the anti-autoimmune disease activity of Jatoba in human multiple sclerosis model mice by the change in clinical score.
  • FIG. 4 A graph showing the inhibitory activity of Jatoba on the production activity of IFN- ⁇ , which is a Thl site power-in produced by spleen cells.
  • ⁇ This figure shows the inhibitory activity of Jatoba on the production and life of TNF-a, which is an inflammatory site.
  • + MOG means that the MOG peptide is added to the culture supernatant
  • one MOG means that the MOG peptide is not added to the culture supernatant.
  • FIG. 5 is a graph showing the effect of Jatoba on demyelination.
  • Control mice Control, Score 3 (onset) and mice treated with Jatoba (50 m / kg jatoba, Score 0) (asymptomatic) were necropsied on the 15th day, and the presence or absence of spinal cord demyelination was observed.
  • FIG. 7 A graph showing the change in clinical score with respect to the effect of one prophylactic administration of Jatoba.
  • control Control. Once: —dosed once.
  • B Necropsy on the 11th day, showing the inhibitory activity of IFN- ⁇ , which is a Thl site-producing force of spleen cells, in a single prophylactic administration of Jatoba.
  • + MOG means that the MOG peptide was added to the culture supernatant
  • one MOG means that the MOG peptide was not added to the culture supernatant.
  • FIG. 8 is a graph showing changes in clinical scores when a Jatoba extract treated with PVPP was administered.
  • FIG. 9 A diagram showing the inhibitory activity of Jatoba extract and PVPP-treated Jatoba extract on IFN-y, which is a Thl force-in, and TNF- ⁇ , which is an inflammatory force-in, produced by spleen cells. is there. “+ MOG” means that the MOG peptide is added to the culture supernatant, and “one MOG” means that the MOG peptide is not added to the culture supernatant. By comparing the two, an antigen-dependent reaction can be confirmed. [FIG.
  • Example 7 In Example 7, the Jatoba ethanol extract was subjected to electrospray ionization mass spectrometry, and the procya-gin dimer, trimer, tetramer, pentamer, and hexamer were obtained.
  • FIG. 4 is a diagram showing that a molecular ion peak of the present invention was observed.
  • B In Example 7, the jatoba ethanol extract was subjected to matrix-assisted laser desorption / ionization-time-of-flight mass spectrometry, indicating that a molecular ion peak of procyadine having a degree of polymerization of 20 or more was observed.
  • FIG. 10 In Example 7, the Jatoba ethanol extract was subjected to electrospray ionization mass spectrometry, and the procya-gin dimer, trimer, tetramer, pentamer, and hexamer were obtained.
  • FIG. 4 is a diagram showing
  • FIG. 11 is a diagram schematically showing thiol cleavage which is a reaction of heating proanthocyanin together with toluene ⁇ -thiol under acidic conditions.
  • FIG. 12 is a view showing a chromatogram obtained by analyzing a thiol cleavage reaction product of a Jatoba ethanol extract by reversed-phase column chromatography.
  • FIG. 13 is a view showing that procyadine in a Jatoba ethanol extract was fractionated and precipitated by utilizing the difference in solubility between methanol and black form, and fractionated according to the degree of polymerization. . ⁇ : Prussia - average degree of polymerization ⁇ content of Jin 0/0.
  • FIG. 14 is a graph showing the inhibitory activities of the Jatoba ethanol extract and each fraction (Fr) fractionated in Example 9 against IFN- ⁇ , which is a Thl site force-in produced by spleen cells.
  • + MOG means that the MOG peptide is added to the culture supernatant
  • one MOG means that the MOG peptide is not added to the culture supernatant.
  • FIG. 15 is a proton ( ⁇ H) NMR spectrum of epipicetine benzyl thiol ether (EC-BTE) (deuterated acetone, 20 ° C, 500 MHz), and a diagram for identifying the structure.
  • EC-BTE epipicetine benzyl thiol ether
  • FIG. 17 is a view showing the average degree of polymerization and content% of procyazine, which were calculated by performing HPLC analysis using EC-BTE as a standard and converting each component into moles. *: Average degree of polymerization of procya-zine Z content%.
  • FIG. 22 is a diagram of proton od, 20 ° C, 600 MHz) comparing catechin (CA), a commercial product, with purified catechin benzylthiol ether (CA-BTE).
  • CA catechin
  • CA-BTE purified catechin benzylthiol ether
  • FIG. 1 A first figure.
  • FIG. 1 A first figure.
  • FIG. 25 is a view of an LC MS chromatogram showing that procyazine (Fr. 5 obtained in Example 9) was strictly separated according to the degree of polymerization using a Discovery (registered trademark) HS PEG column.
  • the solid line indicates peak identification by monovalent ions, and the broken line indicates peak identification by divalent ions.
  • Circle numbers 3, 4, 5, 6, 7, and 8 mean degrees of polymerization 3, 4, 5, 6, 7, and 8.
  • FIG. 26 is an LC MS chromatogram showing that procyanidine (Fr. 4 prepared in the same manner as in Example 9) was strictly separated according to the degree of polymerization using a Discovery® HS PEG column. is there.
  • the solid line indicates peak identification by monovalent ions, and the broken line indicates peak identification by divalent ions.
  • the circle numbers 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, and 12 mean the degrees of polymerization 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, and 12, respectively.
  • FIG. 27 is a diagram showing an analysis of the degree of polymerization distribution of procyadine (Fr. 5 prepared in the same manner as in Example 9) using a Discovery (registered trademark) HS PEG column. Circle numbers 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, and 10 mean degrees of polymerization 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, and 10.
  • FIG. 28 is a diagram illustrating the analysis of the degree of polymerization distribution of procyadine (Fr. 4 prepared in the same manner as in Example 9) using a Discovery (registered trademark) HS PEG column. Circled numbers 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, and 13 represent degrees of polymerization 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. , And 13 mean.
  • FIG. 29 is a diagram showing an analysis of the degree of polymerization distribution of procyazine (Fr. 3 prepared in the same manner as in Example 9) using a Discovery (registered trademark) HS PEG column. Circled numbers 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, and 13 represent degrees of polymerization 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. , And 13 mean.
  • FIG. 30 is a view showing the influence of various procydin-containing samples on the EAE clinical score.
  • the numbers in parentheses indicate the average degree of polymerization.
  • FIG. 31 is a view showing the inhibitory activity of samples containing various procydins on IFN-y, which is a Thl site force-in produced by spleen cells.
  • + MOG means that the MOG peptide is added to the culture supernatant
  • One MOG means that the MOG peptide is not added to the culture supernatant! /.
  • FIG. 32 is a graph comparing the activity of producing high-molecular-weight procyazine with other materials to the activity of IFN-a production, which is a Thl site power-in produced by spleen cells. “+ MOG” indicates that the MOG peptide was added to the culture supernatant, and “One MOG” indicates that the MOG peptide was not added to the culture supernatant.
  • V means something. By comparing the two, an antigen-dependent reaction can be confirmed.
  • FIG. 33 is a diagram showing the preparation of a chronic arthritis induction model mouse and the schedule of intraperitoneal administration of Jatoba.
  • FIG. 34 is a graph showing changes in clinical scores of a Jatoba intraperitoneal administration group and a control group in a Type II collagen-induced arthritis model.
  • FIG. 35 is a diagram showing the preparation of a type 1 diabetes induction model mouse and the schedule of intraperitoneal administration of Jatoba.
  • FIG. 37 is a graph showing the inhibitory activity of Jatoba on IFN- ⁇ , which is a Thl site force-in produced by spleen cells, at necropsy at the age of 9 weeks.
  • FIG. 38 is a view showing an experimental schedule of a mouse model of spontaneously developing type 1 diabetes.
  • FIG. 39 is a graph showing the reactivity of antigen-specific spleen cells in a model of spontaneous onset type 1 diabetes in terms of insulin-dependent IFN- ⁇ producing activity.
  • FIG. 40 is a diagram showing a population of spleen cells in a model of spontaneous type 1 diabetes.
  • FIG. 41 is a view showing the surface antigen expression level of macrophages in a spontaneous type 1 diabetes model.
  • FIG. 42 is a graph showing suppression of the incidence rate by Jatoba administration in a spontaneous type 1 diabetes model.
  • FIG. 43 is a view showing a time-dependent change in the proportion of each immunocompetent cell in spleen cells using the ⁇ model.
  • FIG. 44 is a view showing the expression level of cell surface antigen of macrophages in spleen cells in the ⁇ model.
  • FIG. 45 is a graph showing the effects of oral administration of Jatoba extract, polyphenone, and Jatoba extract Fr3 in a rheumatoid model using clinical scores.
  • FIG. 46 is a graph showing the effect of oral administration of Jatoba in a rheumatoid model in terms of the amount of antigen-specific IF ⁇ - ⁇ produced by splenocytes.
  • + Collagen means that type II collagen was added to the culture supernatant, and “one collagen” means that it was not added. By comparing the two, an antigen-dependent reaction can be confirmed.
  • FIG. 47 is a diagram showing the dose dependence of the effect of Jatoba Fr3 as a clinical score using a rheumatoid model.
  • FIG. 48 is a view showing a rheumatoid arthritis score according to the start time of Jatoba administration.
  • FIG. 49 is a view showing suppression of a blood antibody titer by Jatoba extract Fr3 in rheumatoid arthritis.
  • FIG. 50 Each figure shows the activity of IFN- ⁇ , which is a Thl-site force produced by spleen cells. It is a figure which compared activity with an oligomer.
  • FIG. 51 is a drawing comparing the activity of each oligomer with respect to the production activity of IFN- ⁇ , which is a Thl site force-in produced by spleen cells.
  • FIG. 52 is a graph showing the effects of a single administration of a Jatoba EtOH extract and polyphenone on body weight and food consumption.
  • proanthocyanin as an active ingredient refers to catechins, that is, polyphenols having a flavan skeleton as a basic unit. Its constituent units include, for example, flavin 3-ol as catechin, epicatechin, gallocatechin, epigallocatechin, tetekin gallate, epicatechin gallate, gallocatechin gallate, epigallocatechin gallate, epidisteinin (having no hydroxyl group in the B ring), Examples include Afzelechin, epifzelechin, and flavan-4ol, leucoanthocyanin (ie, flavan 3,4-diol), and anthocyanin.
  • the hydroxyl group at position 3 may form an ester (gallate) with gallic acid.
  • the hydroxyl group at any position other than position 3 forms a glycoside or methyl ether (methoxy)! /, (See Figure 1).
  • the main binding site between the structural units of proanthocyanin is any one of the 4-position and 6-position or the 4-position and 8-position (B-type bond), or the 4-position and 8-position, and the 2-position and 7-position. But not limited thereto, and the configuration of these bonds is not particularly limited! /.
  • Proanthocyanidins in which certain monomers are polymerized are given common names, and typical proanthocyanins are defined and classified according to the number of hydroxyl groups in the B ring (see Fig. 1).
  • Propellargodin (4,1OH), procyazine (3, -OH, 4, -OH), and prodelphizine (3,1OH, 4,1OH, 5,1OH) The powers to be mentioned are not limited to these.
  • progaiourtinidin which is a polymer having a component lacking the hydroxyl group at the 5-position of the A ring as a constitutional unit, profisetidine, And prolobinetidin, and other components having common names such as proteracacidin, promelacacidin, proapige-dizine, and proluteolidin, depending on the presence or absence of a hydroxyl group at a specific site.
  • proanthocyanin is preferably procyadine and prodelphidin.
  • the structural units of “procya-zine” can be selected from the same or different catechins, epipicatins, tecchingallates, and epipicatinchin gallates.
  • the structural unit of “Prodelphidin” can be the same or different, and can be selected from gallocatechin, epigallocatechin, gallocatechin gallate, and epigallocatechin gallate.
  • the "proanthocyanin having a degree of polymerization of at least 4" used as an active ingredient can preferably be procyadine and Z or prodelfinidine having a degree of polymerization of at least 5.
  • the proanthocyanin used in the present invention showed high therapeutic activity in an experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model when the degree of polymerization was 5 or more (Example 31). , Figure 50). Therefore, the degree of polymerization of the proanthocyanin used in the present invention is preferably at least 5.
  • the upper limit of the degree of polymerization of the proanthocyanin used in the present invention is not particularly limited, but when the proanthocyanin is derived from a plant, about 20 to 30 mer proanthocyanins are used. Has been confirmed. In the case of synthesizing proanthocyanin organically, the upper limit of the degree of polymerization can be about 20 to 30 mer from the viewpoint of economy and convenience of the synthesis operation. Furthermore, since high therapeutic activity was observed in proanthocyanins having a degree of polymerization of 5 or more, the effects of the present invention can be expected even if the upper limit of the degree of polymerization of proanthocyanins is set to about 10-mers.
  • the degree of polymerization of proanthocyanin can be 4-30 mer, 4-20 mer, or 4-10 mer, preferably 5-30 mer, 5-10 mer. It is a 20 mer or 5-10 mer. Further, in the present invention, the degree of polymerization of proanthocyanin can be pentamer, pentamer, pentamer, pentamer, or pentamer. In the present invention, the degree of polymerization of proanthocyanin can be determined, for example, by mass spectrometry (Jan F. Stevens et al., J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 3435-3443), and specifically, it can be measured according to Example 7, Example 16, Example 17 and Example 19.
  • proanthocyanin can be represented by the formula (I).
  • R 6 and R 7 are the same or different and may be a hydrogen atom
  • a hydroxyl group, or O—R 11 ⁇ 11 represents an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms or a sugar residue.
  • R 3 and R 4 may be the same or different and each may be a hydrogen atom, a hydroxyl group, or a group (II):
  • both R 3 and R 4 do not represent a hydroxyl group, and both R 3 and R 4 do not represent a group (II) .
  • n represents an integer of 4-30, and each structural unit is , In the 4th and 6th or 4th and 8th place! And combined with each other! /, Or in the 4th and 8th place and 2nd and 7th place in the 2nd place are doing.
  • the “alkyl group having 14 to 14 carbon atoms” represented by R 11 is preferably a methyl group.
  • the “sugar residue” represented by R 11 may be a compound of the formula (I) through an ether bond between a hemiacetal or hemiketal hydroxyl group and a hydroxyl group of R 3 or R 4 .
  • Means sugar linked to Examples of the sugar include glucose, arose, altrose, mannose, gulose, idose, galactose, talose, fructose, xylose, ribose, arabinose, lyxose, and rhamnose.
  • the hydroxyl group in the formula ( ⁇ ) may be the same or different and may represent R 11 —O— (R 11 has the same meaning as described above).
  • R 1 and R 2 represent a hydroxyl group or —OR 11 , represents a hydroxyl group or O—R 11 , and R 5 and R 7 represent a hydrogen atom.
  • the compound, and R 1 and R 2 each represent a hydroxyl group, R 6 represents a hydroxyl group, and R 5 and R 7 each represent a hydrogen atom correspond to propellerargin.
  • R 1 and R 2 each represent a hydroxyl group or —OR 11
  • R 6 represents a hydroxyl group or O—R 11
  • R 7 represents a hydrogen atom.
  • the conjugated product and the conjugated product in which R 1 and R 2 represent a hydroxyl group, R 5 and R 6 represent a hydroxyl group, and R 7 represents a hydrogen atom correspond to procyazine.
  • R 6 represents a hydroxyl group or —OR 11 , R 3 represents a hydroxyl group, R 4 and And the structural unit of formula (I) in which R 7 represents a hydrogen atom corresponds to catechin;
  • R 5 is a hydroxyl group or - represents OR 11
  • R 4 represents a hydroxyl group
  • structural units of formula (I) Contact and R 7 represents a hydrogen atom corresponds to Epikatekin
  • R 5 and R 6 represent a hydroxyl group or -OR 11
  • R 3 represents the formula ( ⁇ )
  • R 4 and R 7 represent a hydrogen atom.
  • R 1 and R 2 represent a hydroxyl group or O—R 11
  • R 5 , R 6 , and R 7 represent a hydroxyl group or O—R 11
  • R 1 and R 2 represent a hydroxyl group
  • a compound in which R 6 and R 7 represent a hydroxyl group corresponds to prodelphizine.
  • R 6 and R 7 represent a hydroxyl group or O—R 11 , R 3 represents a hydroxyl group, R 4 represents a hydrogen atom, and the structural unit of formula (I) corresponds to gallocatechin;
  • R 6 and R 7 represent a hydroxyl group or -OR 11 , R 4 represents a hydroxyl group, and R 3 represents a hydrogen atom.
  • the structural unit of formula (I) corresponds to epigallocatechin;
  • R 3 represents formula ([pi), the structural unit of the formula (I) in which R 4 represents a water atom is gallocatechin gallate Corresponding to
  • R 4 represents a formula ( ⁇ )
  • R 3 represents a hydrogen atom.
  • the structural unit of the formula (I) is epigallocatechin gallate. Corresponding.
  • n represents the degree of polymerization (mer) of proanthocyanin.
  • n preferably represents an integer of 5 to 30.
  • n can also be an integer of 4-20, 4-10, 5-20, 5-10, 5-6, 5-7, 5-8, 5-9.
  • Examples of the bonding mode of each structural unit in the formula (I) include an A-type bond and a B-type bond.
  • A-type bonding refers to a bonding mode in which each structural unit is bonded to each other at two positions, that is, positions 4 and 8 and positions 2 and 7.
  • B-type bonding each structural unit is bonded to each other at the 4-position and 6-position or the 4-position and 8-position at an important point, and thus has a bonding mode!
  • the bond of each structural unit may be the same or different for each structural unit.
  • Gallocatechin, epipicatechin, epigallocatechin also includes gallate form).
  • Preferred examples of the proanthocyanin represented by the formula (I) include:
  • Each structural unit can be the same or different
  • R 6 represents a hydroxyl group or -OR 11
  • R 3 represents a hydroxyl group
  • R 4 and R 7 represent a hydrogen atom (catechin)
  • -R 5 and R 6 represent a hydroxyl group or -OR 11
  • R 4 represents a hydroxyl group
  • R 7 represents a hydrogen atom (epicatechin), or
  • R 3 represents the formula ( ⁇ )
  • R 4 and R 7 represent a hydrogen atom (forced gallate)
  • R 4 represents the formula ( ⁇ )
  • R 3 and R 7 represent a hydrogen atom (epetic force teking gallate)
  • R 6 and R 7 represent a hydroxyl group or O—R 11 , R 3 represents a hydroxyl group, R
  • the compound of formula (I) in which 4 represents a hydrogen atom corresponds to gallocatechin,
  • R 5 is a hydroxyl group or - represents OR 11
  • R 4 represents a hydroxyl group
  • R 3 represents a hydrogen atom (Epigarokatekin)
  • R 7 represents a hydroxyl group or -OR 11
  • R 3 represents the formula ( ⁇ )
  • R 4 represents a hydrogen atom (gallocatechin gallate)
  • R 4 represents the formula ( ⁇ )
  • R 3 represents a hydrogen atom (epigallocatechin gallate)
  • n is an integer from 5 to 30,
  • the bond of each structural unit may be the same or different
  • catechin, gallocatechin, epicatechin, and epigallocatechin include gallates
  • compounds of formula (I) include gallates
  • Catechin (4a ⁇ 6 bond) one-way techin; [Epicatechin (4 ⁇ ⁇ 8)] epicatechin; and
  • proanthocyanin represented by the formula (I) include:
  • (Catechin) force wherein R ⁇ R 2 , R 3 , R 5 , and R 6 represent a hydroxyl group, and R 4 and R 7 represent a hydrogen atom.
  • RR 2 , R 4 , R 5, and R 6 represent a hydroxyl group, and R 3 and R 7 represent a hydrogen atom (epicatechin), and n represents an integer of 5-30,
  • the bond of each structural unit may be the same or different
  • the compound of formula (I) may be selected.
  • Proanthocyanin is a component present in many plants, and can be prepared by extracting from plants.
  • Preferred raw materials for preparing proanthocyanin also with plant power include Jatoba, grape seeds, cranberry, cinnamon, and pine peel, and Jatoba is more preferable in view of abundant proanthocyanin content.
  • Plant materials containing proanthocyanin include, for example, Jatoba Peel Dry Powder (Edison 'S.R.L Japan Office), cranberry-derived extract ("Cranberry Powder” (Kikkoman Co., Ltd.)) , Grape seed extract (“Grabinol SL” (Kikkoman Co., Ltd.)), pine husk extract (Materials and Functional Research Institute, Limited), cacao extract (“Riki Kaopolyphenol” (Meiji Seika Co., Ltd.) )). These can be used as they are, or, as described later, those having a high degree of polymerization can be fractionated and purified as appropriate, and used as the active ingredient according to the present invention.
  • an "extract of a plant material containing proanthocyanin” is effective.
  • extracts of plant material containing proanthocyanin include, for example, Jatoba extract, grape seed extract, cranberry extract, cinnamon extract, pine peel extract, and cacao extract.
  • the material is not limited as long as it contains -gin (particularly procydin and Z or prodelphinidin having a degree of polymerization of at least 5).
  • the "extract of plant material containing proanthocyanin" used as an active ingredient preferably contains procyanidin having a degree of polymerization of at least 5 and Z or prodelphidin. It can be an extract of plant material.
  • Table 1 shows examples of the components of proanthocyanin contained in the plant material.
  • R 1 to R 7 correspond to the formula (I)
  • EC epicatechin
  • CA catechin
  • ECG epipicatechin gallate
  • EGCG epigallocatechin gallate
  • G gallate. Represent each.
  • an extraction method for example, a method of immersing a plant material or a crushed product thereof in a solvent by cold immersion, hot immersion, or the like; performing extraction while heating and stirring, and filtering to obtain an extract Method; or a bar correlation method.
  • the obtained extract may be used after removal of solids by filtration or centrifugation, if necessary, depending on the mode of use, or may be used as it is, or may be partially concentrated or dried after distilling off the solvent. . After concentration or drying, it may be further purified by washing with an insoluble solvent, or it may be further dissolved or suspended in an appropriate solvent.
  • the solvent extract obtained as described above can be used as a dry extract extract by ordinary means such as drying under reduced pressure and freeze drying. Therefore, the “extract” in the present invention includes not only the extract itself, but also a concentrate and a dried product of the extract.
  • Examples of the solvent used for the above extraction include water; lower alcohols having 14 to 14 carbon atoms such as methanol, ethanol, propanol and butanol; lower alkyl esters such as ethyl acetate; ethylene glycol, butylene glycol, propylene glycol And known polar organic solvents such as ethyl ether, acetone and acetic acid; hydrocarbons such as benzene and hexane; and non-polar solvents such as ethers such as ethyl ether and petroleum ether. . These solvents may be used alone or in combination of two or more. More preferably, an extraction method using hot water, ethanol, acetone or the like can be mentioned.
  • proanthocyanin utilizes the property of becoming insoluble in a lower concentration of formaldehyde as the degree of polymerization is higher, and by appropriately changing the concentration of formaldehyde, the desired average degree of polymerization is obtained. A fraction can be obtained. Therefore, in the present invention, the “extract” can preferably be a water extract, an ethanol extract, or an acetone extract.
  • a conventional fractionation purification means may be employed. Specifically, adsorbents capable of adsorbing and eluting proanthocyanin, such as styrene dibutylbenzene synthetic adsorption resin, anion exchange resin, octadecyl group chemically bonded silica gel (ODS), gel filtration resin (Sephadex) LH20) is used.
  • ODS octadecyl group chemically bonded silica gel
  • Sephadex gel filtration resin
  • Image purification can be performed. Also, a membrane separation method using a molecular weight fractionation membrane or the like can be used.
  • step (b) A method for producing a cake (filter cake) by subjecting the extract fraction obtained in step (a) to ultrafiltration.
  • step (a) The extraction operation and the plant material in step (a) are as described above.
  • a polar solvent can be preferably used, and particularly, ethanol, water and hydrated acetone are preferable.
  • a plant raw material a plant containing proanthocyanin is preferably used.
  • step (a) the extract is subjected to solvent distillation to obtain an extract fraction, and then the extract is subjected to an extraction operation using a nonpolar organic solvent (eg, ethyl acetate) Z water.
  • a nonpolar organic solvent eg, ethyl acetate
  • Z water e.g., ethyl acetate
  • a water-soluble fraction can be obtained.
  • the extracted fraction obtained in step (a) may be directly subjected to the ultrafiltration operation in step (b)!).
  • the fraction having Thl site force-in production inhibitory activity is left on the ultrafiltration membrane (ie, is not permeated through the ultrafiltration membrane). Cutlet You can set the toe-off value.
  • the relationship between the Thl site force-in production inhibitory activity and the degree of polymerization of proanthocyanin is as described above, and the relationship between the molecular weight of the substance permeating the ultrafiltration membrane and the force-off value is well known to those skilled in the art.
  • those skilled in the art can appropriately set the cutoff value of the ultrafiltration membrane according to the type of proteoprotein to be produced.
  • procyadine having a polymerization degree of at least 5 or more has a high Thl site force-in production inhibitory activity, and the molecular weight of procyadine having a polymerization degree of 5 is about 1442. It can be set to 1400.
  • the degree of polymerization of proanthocyanin contained in the cake may be measured, if necessary.
  • the degree of polymerization can be measured by mass spectrometry (Jan F. Stevens et al, J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 3435-3443).
  • the average polymerization degree may be measured by a thiol cleavage analysis method (Sylvain uuyot, Nathalie Marnet, Ana Jean-Francois Drilleau, J. Agric. Food and hem. 2001, 49, 14-20).
  • the proanthocyanin which is an active ingredient according to the present invention has a degree of polymerization of 4 or more, preferably 5 or more. Therefore, when preparing a proanthocyanin having a plant power, in the case of an extract containing a proanthocyanin having a degree of polymerization of at least 4 or 5 or more as an active ingredient as it is, or as an activity measurement method described in the Examples below.
  • the active ingredient can be fractionated and purified using the activity as an index or the polymerization degree as an index.
  • Extracts having an average degree of polymerization of 3 or less also include those which contain a large amount of active ingredients having a degree of polymerization or higher using the activity as an index or the degree of polymerization as an index by the activity measurement method described in Examples below. Fractionation can be purified and used.
  • a pharmaceutical composition or food contains proanthocyanins having multiple degrees of polymerization, an effective amount of those having a degree of polymerization of 4 or more is contained even if the average degree of polymerization is 4 or less.
  • a proanthocyanin having an average degree of polymerization of about 4 or more can be more preferably used.
  • Proanthocyanins may be prepared by organic chemical synthesis in addition to extraction from plants (for example, Swain et al "1954. Chem Ind, 1144, Eastmond., 1974. J Inst Brew 80, 188. Kozikowski AP et al, 2003, J Org Chem 68, 1641-1658, and JP-T-2002-542240).
  • the extract of a specific plant such as proanthocyanin and Jatoba used in the present invention suppresses the production of Thl site force in (specifically, IFN- ⁇ ) in Thl-biased spleen cells, Improve 'suppress' sexual immunity situations. Therefore, the pharmaceutical composition according to the present invention is effective for treating diseases in which suppression of Thl site force-in production is effective for treatment.
  • Thl site force-in-dependent autoimmune diseases include, for example, Thl site force-in-dependent autoimmune diseases.
  • Thl site force-in-dependent autoimmune disease is used in a sense that includes cell-mediated immunity-dependent autoimmune disease.
  • Thl-dependent autoimmune diseases include multiple sclerosis (MS), rheumatoid arthritis (RA), insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM) such as juvenile diabetes and type I diabetes, and autoimmune thyroid gland.
  • MS multiple sclerosis
  • RA rheumatoid arthritis
  • IDDM insulin-dependent diabetes mellitus
  • AT Inflammation
  • AUR autoimmune uveitis retinitis
  • Hashimoto's disease psoriasis
  • Crohn's disease Crohn's disease
  • alopecia areata.
  • Thl-dependent autoimmune diseases infiltration of lymphocytes (Thl cells) into inflamed areas and increased concentration of Thl site force-in (eg, IFN- ⁇ and TNF-H) in blood have been observed.
  • Thl site force-in eg, IFN- ⁇ and TNF-H
  • the high polymerization degree proanthocyanin used in the present invention suppresses the production of autoantibodies in mice in which autoantibodies have been induced (Example 30).
  • the extract containing high polymerization degree proanthocyanidin used in the present invention is closely related to autoantibody production. Suppresses the activation of B cells with ties (Example 25). Therefore, the pharmaceutical composition according to the present invention is effective for treating diseases in which suppression of autoantibody production and suppression of B cell activation are effective for treatment.
  • Diseases in which suppression of autoantibody production and suppression of B cell activity are effective for treatment include autoantibody-mediated autoimmune diseases (eg, systemic lupus erythematosus, Goodpastia's syndrome, autoimmune hemolytic disease). Anemia, Siedalen syndrome, acute rheumatic fever, pemphigus vulgaris, autoimmune thrombocytopenic purpura, and mixed essential cryoglobulinemia).
  • autoantibody-mediated autoimmune diseases eg, systemic lupus erythematosus, Goodpastia's syndrome, autoimmune hemolytic disease.
  • Anemia Siedalen syndrome, acute rheumatic fever, pemphigus vulgaris, autoimmune thrombocytopenic purpura, and mixed essential cryoglobulinemia.
  • the proanthocyanin used in the present invention can suppress the production of Thl-site force-in. Therefore, the present invention is advantageous over a therapeutic agent used symptomatically in that it can cure a disease in which the production of Thl site force-in is an essential cause or inhibit the progress of the disease. Particularly for rheumatoid arthritis, it is possible to curb inflammation and reduce pain, and unlike conventional treatments used as palliative treatment, it is possible to cure radically or inhibit the progress of the disease.
  • the invention can be said to be advantageous.
  • Curative treatment of rheumatoid arthritis with proanthocyanin improved the clinical score in rheumatoid arthritis model mice in Examples 28 and 29, and suppressed the production of rheumatoid antibodies (autoantibodies) in Example 30. This is supported by the fact.
  • inhibition of the progression of rheumatoid arthritis by proanthocyanin has In Examples 28 and 29, the clinical score was improved in the rheumatoid arthritis model mice even after primary immunization was established, and the production of rheumatoid antibodies (autoantibodies) was suppressed in Example 30, which is supported by the results. .
  • T cells specifically, Thl cells
  • T cells are activated in the early stage of the disease, and symptoms begin to appear along with the activation. It has been reported that T cells promote the production of B cell autoantibodies, and abnormally produced autoantibodies lead to chronic and severe symptoms (Cin Exp Immunol 1998; 111: 521-526; Springer). Semin Immunopathol. 2003 Aug; 25 (l): 3-18; Immunol Rev. 1990 Dec; 118: 193-232). It has also been reported that rheumatism was suppressed by lowering IgG levels in mice (Ann Rheum
  • proanthocyanin inhibits Thl site force in, suppresses Thl cell activation, and stimulates autoantibodies stimulated by Thl cell activation. Production of rheumatoid antibodies was actually suppressed.
  • the active ingredient according to the present invention suppressed the activation of B cells closely related to the production of autoantibodies. Therefore, the proanthocyanin used in the present invention is advantageous in that it can be used not only in the treatment of rheumatoid arthritis in its early stages but also in the treatment of chronic and severe conditions.
  • proanthocyanins having a degree of polymerization of 4 or more preferably, procyadins and Z or prodelphidin having a degree of polymerization of 5 or more
  • proanthocyanins -A therapeutic agent for the curative treatment of chronic rheumatoid arthritis comprising as an active ingredient an extract of a plant material containing -gin (preferably procyadine having a degree of polymerization of 5 or more and Z or prodelphi-gin) and its progress An inhibitor is provided.
  • a therapeutically effective amount of (i) a proanthocyanin having a degree of polymerization of not less than 5 (preferably a procyadine and Z or prodelphidin having a degree of polymerization of 5 or more), Or (ii) extracts of plant material containing proanthocyanins (preferably procyadins with a degree of polymerization of 5 or more and Z or prodelphidin), if necessary, are pharmaceutically acceptable
  • a therapeutic agent for the curative treatment of rheumatoid arthritis and a progress inhibitor thereof.
  • proanthocyanin having a degree of polymerization of 4 or more preferably, procyazine and Z or prodelphidin having a degree of polymerization of 5 or more
  • proanthocyanin preferably, And an extract of a plant material containing procydin and Z or prodelphidin having a degree of polymerization of 5 or more.
  • treatment is used in a sense including improvement, regulation, delay, and prevention of a disease (particularly, prevention of onset and prevention of recurrence).
  • the therapeutic agent according to the present invention can be physiologically acceptable by using the above-described proanthocyanin, which is an active ingredient according to the present invention, or a plant extract containing the same as a partially purified product of the extract as an active ingredient. It can be produced by mixing with a carrier, excipient, binder, diluent and the like.
  • the therapeutic agent according to the present invention can be administered orally or parenterally.
  • Oral preparations include granules, powders, tablets (including sugar-coated tablets), pills, capsules, syrups, emulsions and suspensions.
  • Parenteral preparations include injections (e.g., subcutaneous injections, intravenous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections), instillations, and external preparations (e.g., nasal preparations, transdermal preparations, ointments) ), Suppositories (eg, rectal suppositories, vaginal suppositories).
  • These preparations can be formulated together with pharmaceutically acceptable carriers (eg, excipients, additives) by a method commonly used in the art.
  • Pharmaceutically acceptable excipients and additives include carriers, binders, flavors, buffers, thickeners, coloring agents, stabilizers, emulsifiers, dispersants, suspending agents, preservatives, and the like.
  • Can be Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, magnesium carbonate, magnesium stearate, talc, sugar, ratatose, pectin, dextrin, starch, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium ruboxymethylcellulose, low melting wax, cacao Butter and the like.
  • the preparation can be produced, for example, as follows.
  • Oral preparations include, as active ingredients, excipients (eg, lactose, sucrose, starch, mannitol), disintegrants (eg, calcium carbonate, calcium carboxymethylcellulose), binders (eg, pregelatinized starch, Gum arabic, carboxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, hydroxypropylcellulose) or a lubricant (eg, talc, magnesium stearate, polyethylene glycol 6000) is added and compression-molded. If necessary, it can be produced by coating by a method known per se for the purpose of masking taste, enteric coating or sustaining.
  • excipients eg, lactose, sucrose, starch, mannitol
  • disintegrants eg, calcium carbonate, calcium carboxymethylcellulose
  • binders eg, pregelatinized starch, Gum arabic, carboxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, hydroxypropylcellulose
  • a lubricant
  • the coating agent examples include ethinoresenololose, hydroxymethinoresenorelose, polyoxyethylene glycolone, cenorellose acetate phthalate, hydroxypropyl methylcellulose phthalate and Eudragit (manufactured by Rohm, Germany, methacrylic acid / acrylic acid Polymer) can be used.
  • Injectables are prepared by dispersing the active ingredient into a dispersant (for example, Tween 80 (manufactured by Atlas Powder Co., USA), HCO 60 (manufactured by Nikko Chemicals), polyethylene glycol, carboxymethyl cellulose, sodium alginate, etc.)
  • a dispersant for example, Tween 80 (manufactured by Atlas Powder Co., USA), HCO 60 (manufactured by Nikko Chemicals), polyethylene glycol, carboxymethyl cellulose, sodium alginate, etc.
  • An aqueous solvent eg, distilled water, etc.
  • a preservative eg, methylparaben, propylparaben, benzyl alcohol, chlorobutanol, phenol
  • an isotonic agent eg, sodium salt, glycerin, sorbitol, glucose, invert sugar
  • a physiological saline solution for example, Ringer's solution or the like or an oily solvent (for example, vegetable oil such as olive oil, sesame oil, cottonseed oil, corn oil, propylene glycol) and the like.
  • an oily solvent for example, vegetable oil such as olive oil, sesame oil, cottonseed oil, corn oil, propylene glycol
  • a solubilizing agent for example, sodium salicylate, sodium acetate
  • a stabilizer for example, human serum albumin
  • a soothing agent for example, benzalco-dum, pro-pro-in hydrochloride
  • the external preparation can be produced by preparing the active ingredient into a solid, semi-solid or liquid composition.
  • the solid composition may contain the active ingredient as it is, or excipients (eg, ratatose, mannitol, starch, microcrystalline cellulose, sucrose), thickeners (eg, natural gums, cellulose derivatives). And acrylic acid polymer) are added and mixed to make a powder.
  • the liquid composition can be produced in almost the same manner as in the case of injection.
  • the semi-solid composition is preferably an aqueous or oily gel or a cartilage.
  • compositions each include a pH adjuster (for example, carbonic acid, phosphoric acid, formic acid, hydrochloric acid, sodium hydroxide), a preservative (for example, noroxybenzoic acid esters, chlorobutanol, Benzalco-chloride) and the like.
  • a pH adjuster for example, carbonic acid, phosphoric acid, formic acid, hydrochloric acid, sodium hydroxide
  • a preservative for example, noroxybenzoic acid esters, chlorobutanol, Benzalco-chloride
  • Suppositories can be prepared by preparing the active ingredient as an oily or aqueous solid, semi-solid or liquid composition.
  • oily base used in the composition glycerides of higher fatty acids (for example, cocoa butter, Witepsols (manufactured by Dynamite Nobel)], intermediate fatty acids [eg, miglyols (manufactured by Dynamite Nobel)], or vegetable oils (eg, sesame oil, soybean oil, cottonseed oil).
  • aqueous base examples include polyethylene glycols and propylene glycol.
  • aqueous gel base include natural gums, cellulose derivatives, vinyl polymers, and acrylic acid polymers.
  • one or more medically effective active ingredients other than the active ingredient according to the present invention may be further added and blended!
  • one or more medically active ingredients other than the active ingredient according to the present invention may be administered in combination.
  • Such other active ingredients include, but are not limited to, anti-inflammatory agents, anti-inflammatory analgesics, immunosuppressants, and other agents for treating autoimmune diseases.
  • Anti-inflammatory agents include steroid anti-inflammatory agents and non-steroidal anti-inflammatory agents.
  • Steroid anti-inflammatory agents include cortisone acetate, hydrocortisone, paramethasone acetate, prednisolone, prednisolone, methylprednin, dexamethasone, triamcinolone, and betamethasone.
  • Non-steroidal anti-inflammatory drugs include salicylic acid-based non-steroidal anti-inflammatory drugs such as aspirin, diflu-sal, aspirin'ascorbic acid and aspirin dialuminate; diclofenac sodium, sulindac, fenbufen, indomethacin, indomethacin fuarnesyl, and acemetasin , Non-steroidal anti-inflammatory drugs such as allylic acid, such as proglamitacin maleate, sodium amphenac sodium, nabumetone, moezolac, etodolag; non-steroidal anti-inflammatory drugs, such as mefenamic acid, aluminum flufenamic acid, tolufenamic acid, and froctafenine Agents: ibuprofen, flurbiprofen, ketoprofen, naproxen, pranoprofen, fenoprofen calcium, tyaprofen, oxaprofin, lox
  • Immunosuppressants include cyclosporin, FK506.
  • Other therapeutic agents for autoimmune diseases include therapeutic agents for multiple sclerosis such as interferon ⁇ .
  • other active ingredients such as anti-inflammatory agents, anti-inflammatory analgesics, immunosuppressants and the like, it is possible to provide a multifunctional therapeutic agent with further enhanced therapeutic activity. It can.
  • a therapeutic agent that can be expected to provide fundamental treatment and symptomatic treatment of an autoimmune disease by using the active ingredient according to the present invention in combination with a drug used for symptomatic treatment of an autoimmune disease such as an anti-inflammatory drug or an anti-inflammatory drug. can be provided.
  • the active ingredient according to the present invention by combining the active ingredient according to the present invention with a drug such as an immunosuppressant which is expected to undergo fundamental treatment, it is possible to provide a therapeutic agent having an enhanced fundamental treatment effect for autoimmune diseases.
  • the active ingredient according to the present invention may be administered in combination with chondroitin or darcosamine containing mucopolysaccharide as a main component.
  • the therapeutic agent according to the present invention is intended for application not only to pharmaceuticals but also to foods. Therefore, when applying the therapeutic agent according to the present invention to food, the description about food as described below can be referred to.
  • the food according to the present invention is a food containing an effective amount of proanthocyanin, which is an active ingredient according to the present invention.
  • the effective amount of the active ingredient is contained means that the content of the active ingredient is within the range described below when an individual food or drink is ingested in an amount normally consumed in V. !
  • the active ingredient according to the present invention can be incorporated into the food as it is or in the form of a composition as described above. More specifically, the food according to the present invention is prepared as a food or drink as it is from the above-mentioned proanthocyanin, which is an active ingredient according to the present invention, or a plant extract containing the same, which is partially purified from the extract.
  • the “food” is not a medicine, and the form is not particularly limited as long as it can be taken by mammals.
  • food is used to mean a health food (eg, a food for specified health use, a nutritionally functional food, a dietary supplement), a functional food, and a food for the sick.
  • a health food eg, a food for specified health use, a nutritionally functional food, a dietary supplement
  • a functional food e.g., a food for the sick.
  • the form of "food” is not particularly limited, and may be, for example, a drink.
  • a proanthocyanin having a degree of polymerization of at least 4 was applied to one adult per day.
  • a healthy food comprising an intake of 50 to 2000 mg (preferably 400 to 2000 mg).
  • a proanthocyanin having a degree of polymerization of at least 5 is contained in an amount of 50 to 2000 mg (preferably 400 to 2000 mg) per adult per day. Food is provided.
  • the proanthocyanin contained in the health food may also be selected from a group consisting of a Jatoba extract, a grape seed extract, a cranberry extract, a cinnamon extract, a pine peel extract, and a cocoa extract. Extract having a degree of polymerization of at least 4 or at least 5 and may be provided in the form of an extract.
  • the health food may be in the form of a normal food or a dietary supplement (for example, a supplement).
  • the active ingredient according to the present invention suppresses the production of Thl-site force-in (specifically, IFN- ⁇ ) in Thl-biased spleen cells, and improves the state of hypercellular immunity. Have.
  • the active ingredient according to the present invention also suppresses the production of autoantibodies in mice in which autoantibodies have been induced. For this reason, by adding the active ingredient of the present invention or an extract such as jatoba to a daily food or a health food or a functional food to be taken as a supplement, the function of suppressing the production of Thl site force-in and suppressing the production of autoantibodies are added.
  • the present invention can provide a food having both a function or a function of improving or alleviating a condition associated with increased production of Thl site force-in and a condition associated with autoantibody production, particularly a therapeutic function for an autoimmune disease.
  • a proanthocyanin having a degree of polymerization of at least 4 preferably, a procyazine and Z or prodelphidin having a degree of polymerization of at least 5
  • Thl containing an extract of a plant material containing proanthocyanin preferably an extract of a plant material containing procyazine and Z or prodelphidin having a degree of polymerization of at least 5
  • Cytokine production inhibitory function, autoantibody production inhibition function, or condition associated with increased Thl site force-in production or autoantibody production e.g., Thl-site force-in dependent autoimmune disease or autoantibody-mediated Foods that have the function of improving or alleviating systemic tone and joint discomfort characteristic of autoimmune diseases Goods are provided.
  • Such labeling may be on the body of the food, container, packaging, instructions, package insert, or promotional material.
  • a proanthocyanin having a degree of polymerization of at least 4 preferably, a procyadine and Z or prodelphidin having a degree of polymerization of at least 5
  • a proanthocyanin -A food product comprising an effective amount of an extract of a plant material containing gin (preferably an extract of a plant material containing procydin and Z or prodelphidin having a degree of polymerization of at least 5)
  • a proanthocyanin having a degree of polymerization of at least 4 preferably, a procyazine and Z or prodelphidin having a degree of polymerization of at least 5
  • a proanthocyanin A food comprising an effective amount of an extract of a plant material containing cyanidin (preferably, an extract of a plant material containing procyadine and Z or prodelphidin having a degree of polymerization of at least 5).
  • an extract of a plant material containing proanthocyanidin which is capable of suppressing the production of Thl-site force-in, improving the condition associated with an increase in Thl-site force-in production, or
  • a food comprising an extract having a palliative function, an autoantibody production-suppressing function, or a ameliorating or palliative function associated with autoantibody production is provided.
  • the food according to the present invention has a Thl site force-in production inhibitory function, an autoantibody production inhibitory function, or a condition associated with an increase in Thl site force-in production or a condition associated with autoantibody production, or an alleviating function. It can be provided as food suitable for consumers expecting the function of, ie, food for specified health use.
  • the term ⁇ food for specified health use '' as used herein refers to the suppression of Thl site force-in production, suppression of autoantibody production, or the improvement or alleviation of conditions associated with increased Thl site force-in production or conditions associated with autoantibody production.
  • Additives such as the active ingredient of the present invention or the extract of jatoba and the like, the foods to be ingested on a daily basis include carbohydrate-containing foods and drinks such as rice, fish, bread and pasta; Confectionery such as confectionery such as cakes and cakes, Japanese confectionery such as buns and yokan, confectionery such as candy, gums, yogurt, pudding, jelly, etc .; various beverages such as juice, soft drinks and milk drinks; Processed products using eggs, seafood (squid, octopus, shellfish, eel, etc.), processed products of meat (including offal such as liver) (including delicacies) can be exemplified. There is no particular limitation.
  • foods to be added and blended include drinks (eg, tea drinks and milk drinks) and yogurt.
  • the tea beverage refers to a beverage for infusing tea leaves (tea leaves), which are an evergreen tree of the camellia family, or leaves or grains of plants other than tea leaves, such as fermented tea and semi-fermented tea. Both tea and unfermented tea are included.
  • tea beverages include Japanese tea (for example, green tea and barley tea), black tea, herbal tea (for example, jasmine tea), Chinese tea (for example, Chinese green tea, oolong tea), and roasted tea.
  • the dairy beverage refers to a beverage mainly containing raw milk, milk, or the like or a food produced using these as a raw material.
  • a raw material for example, nutrient-enriched milk, flavor-added milk, etc.
  • processed milk such as milk and sugar-decomposed milk.
  • the yogurt includes any of a hard type, a soft type, and a drink type, and further includes a processed yogurt product using yogurt as a raw material.
  • Examples of foods to be added to and blended with the active ingredient of the present invention or extracts such as jatoba, which are taken daily, include foods originally containing proanthocyanin.
  • the active ingredient of the present invention or an extract such as Jatoba By adding and blending the active ingredient of the present invention or an extract such as Jatoba with a food originally containing proanthocyanin, the function of inhibiting the production of Thl-site force, the function of suppressing the production of autoantibodies, or the function of inhibiting the production of Thl-site can be obtained.
  • the amelioration or alleviation of conditions associated with increased production or autoantibody production can be enhanced.
  • “enhancement” means that the amount of the active ingredient initially contained in the food is less than the amount required for the expression of the expected function.
  • “foodstuffs originally containing proanthocyanin” include, for example, cranberry products such as cranberry juice and cranberry jam; power products such as chocolate sweets and cocoa; cinnamon sticks, cinnamon sugar, and cinnamon Cinnamon products such as gum, cinnamon tea, etc. Powers not limited to these.
  • Examples of the form of the health food or functional food to be taken as a subliment to which the active ingredient of the present invention or the extract such as jatoba is added and blended include drinks such as juice and tea, jellies, capsules, and granules. Agents, granules and pastes.
  • the active ingredient of the present invention or an extract such as Jatoba is calmed in the form of a beverage, jelly, capsule, granule, granule, paste, etc., alone or in combination with other ingredients (for example, plant material).
  • Health function such as supplements that have a function to suppress Thl-site force-in production, suppress autoantibody production, or improve or alleviate conditions associated with increased Thl-site force-in production or conditions associated with autoantibody production.
  • It can be provided as food or functional food.
  • other components other than the active ingredient according to the present invention which are considered to have anti-inflammatory, anti-inflammatory, analgesic, or immunosuppressive effects, conditions associated with increased production of Thl site force-in and The amelioration or alleviation of conditions associated with autoantibody production can be further enhanced.
  • Other components which are considered to have an anti-inflammatory effect, anti-inflammatory analgesic effect, or immunosuppressive effect can be selected from known components. Examples of components having an anti-inflammatory effect include aricin, capsaicin, bromelin, and sulfuryl.
  • plant materials containing aricin include onions, leek, garlic, yura and onions, and plant materials containing capsaicin include pepper and bromelin.
  • Pineapple is included as a plant material containing aryl sulfide, and asagi, garlic shallot, green onion, green onion, yura, and squid are included as plant materials containing aryl sulfide.
  • Glycyrrhetinic acid is exemplified as a component having an immunosuppressive action
  • Kanzo is exemplified as a plant material containing glycyrrhetinic acid.
  • Raito Koto is said to be effective for rheumatism; Ninjin-to is said to be effective for type I diabetes; Kanran is said to be effective for multiple sclerosis: It is said to be effective for psoriasis Plant materials such as Polvpodium Leucotomos can be combined.
  • the function according to the present invention is A multifunctional food can be provided by combining it with another component exhibiting an external function or another functional food.
  • a proanthocyanin having a degree of polymerization of at least 5 (preferably, a procyadine and Z or prodelphidin having a degree of polymerization of at least 5) is added to the Thl site.
  • Foods originally containing proanthocyanin for the purpose of suppressing the production, suppressing the production of autoantibodies, or improving or alleviating the conditions associated with increased production of Thl site force-in and the conditions associated with the production of autoantibodies. can be added to
  • the active ingredient or the extract according to the present invention is used as it is for edible use, or when it is added to and blended with raw materials of general food to make a food, a range in which the bitterness of the active ingredient does not affect the taste of the food It is preferable to use it in such a way that the bitterness is masked.
  • the bitterness can be masked by applying the active ingredient or extract to capsules or by coating with a suitable coating.
  • the encapsulated form include a gelatin capsule and a pullulan capsule. Dragees may be mentioned as coated forms.
  • the food according to the present invention can take various forms, and the food according to the present invention may be produced according to known pharmaceutical production techniques. In such a case, it can be produced using the carriers and additives for pharmaceutical preparations described in the section of the production of the therapeutic agent according to the present invention. It can be manufactured using manufacturing additives.
  • Proanthocyanin which is an active ingredient according to the present invention, is contained in a large amount in cacao grape which has been ingested by humans for many years as a food, and therefore has low toxicity in mammals (eg, human, mouse, rat). , Egos, dogs, cats, dogs, horses, pigs, monkeys) You can do it.
  • the dose or intake of the active ingredient according to the present invention depends on the recipient, age and weight of the recipient, symptoms, administration time, dosage form, administration It can be determined depending on the method, combination of drugs, and the like.
  • the amount of proanthocyanin is 50 to 5000 mg, preferably 50 to 2000 mg per adult per day, and 5 to 500 mg, preferably 5 to 500 mg when administered parenterally.
  • Drugs having other mechanisms of action to be used in combination with the active ingredient according to the present invention can also be appropriately determined based on the clinically used dose.
  • the active ingredient according to the present invention can be incorporated into the food such that the amount of the active ingredient per person per adult is in the range of 50-5000 mg, preferably 50-2000 mg.
  • procyanidin and Z or prodelphidin having a degree of polymerization of at least 5 (i) procyanidin and Z or prodelphidin having a degree of polymerization of at least 5 or (ii) procyanidin and Z having a degree of polymerization of at least 5
  • treatment of diseases in which suppression of production of Thl-site force-in is effective for treatment which comprises an extract of plant material containing prodelphidin as an active ingredient (particularly, Thl-site force-in dependent autoimmune disease)
  • the present invention provides an agent, a curative agent for treating those diseases, and an inhibitor for progression of those diseases.
  • a therapeutic agent for a disease in which suppression of production of Thl site force-in is effective for treatment (particularly, a Thl site force-in dependent autoimmune disease), and a curative treatment for those diseases And (i) procyadins and Z or prodelphidin having a degree of polymerization of at least 5 or (ii) a degree of polymerization of at least 5 Use is made of extracts of plant material containing procydin and Z or prodelphidin.
  • a therapeutically effective amount of (i) a procyadine and Z or prodelphidin having a degree of polymerization of at least 5 or (ii) a procydin having a degree of polymerization of at least 5 is also provided.
  • Diseases that are effective especially Thl site force-in dependence
  • a method for the curative treatment of the disease and a method for inhibiting the progress of the disease.
  • a proanthocyanin having a degree of polymerization of at least 4 (preferably a procyazine and Z or prodelphidin having a degree of polymerization of at least 5), or (ii) a proanthocyanin is used.
  • Production of Thl-site force-in comprising as an active ingredient an extract of a plant material containing the same (preferably an extract of a plant material containing procyadine and Z or prodelphidin having a degree of polymerization of at least 5)
  • An inhibitor is provided.
  • a proanthocyanin having a degree of polymerization of at least 4 preferably a procyadine having a degree of polymerization of at least 5 and And /
  • an extract of a plant material containing proanthocyanin preferably a plant material containing procyadine and Z or prodelphidin which has a degree of polymerization of at least 5). Extract
  • an effective amount of (i) a proanthocyanin having a degree of polymerization of at least 4 (preferably, a procyadine and Z or prodelphidin having a degree of polymerization of at least 5), or (ii) administering an extract of a plant material containing proanthocyanin (preferably an extract of a plant material containing procyadine and Z or prodelphidin having a degree of polymerization of at least 5) to a mammal;
  • a method for inhibiting the production of Thl site force-in is provided.
  • the Thl site force in is preferably IFN- ⁇ .
  • the inhibitor of the production of Thl-site force-in is not only applied to pharmaceuticals intended to suppress the production of Thl-site force-in, but also to foods intended to suppress the production of Thl-site force-in. Is illustrated. Therefore, for the implementation of the Thl site force-in production inhibitor according to the present invention, the description regarding the therapeutic agent and the description regarding food as described above can be referred to.
  • a proanthocyanin having a degree of polymerization of at least 4 preferably a procyadine and Z or prodelphidin having a degree of polymerization of at least 5
  • a proanthocyanin -An extract of plant material containing gin preferably with a degree of polymerization of at least 5
  • An extract of a plant material containing procydin and Z or prodelphidin as an active ingredient.
  • a proanthocyanin having a degree of polymerization of at least 4 for producing an autoantibody production inhibitor.
  • Z or prodelphidin or
  • an effective amount of (i) a proanthocyanin having a degree of polymerization of at least 4 (preferably, a procyazine and Z or prodelphidin having a degree of polymerization of at least 5), or (ii) administering an extract of a plant material containing proanthocyanin (preferably an extract of a plant material containing procyadine and Z or prodelphidin having a degree of polymerization of at least 5) to a mammal; And a method for suppressing the production of autoantibodies, comprising the steps of:
  • the autoantibody production inhibitor is intended for application not only to pharmaceuticals for suppressing the production of autoantibodies but also to foods for the purpose of suppressing the production of autoantibodies. Therefore, when implementing the autoantibody production inhibitor according to the present invention, the description relating to the therapeutic agent and the description relating to food as described above can be referred to.
  • a method for assaying Thl site force-in production inhibitory activity comprising a step of measuring the degree of polymerization of proanthocyanin in a sample, wherein the detection of bronthocyanin having a degree of polymerization of 4 or more is performed. Has a Thl site force-in production inhibitory activity.
  • Samples to be tested include, for example, extracts and dry powders derived from plant raw materials.
  • Plant materials include not only plant materials containing proanthocyanin but also plant materials whose proanthocyanin content is unknown.
  • Examples of the extract include an extract with water and an organic solvent.
  • Examples of the sample to be assayed include a synthesized proanthocyanin and a sample in which it is unknown whether or not the proanthocyanin is contained.
  • the degree of polymerization of proanthocyanin can be measured by, for example, electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) or matrix-assisted laser desorption / ionization-time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). it can.
  • the assay method of the present invention it can be used as an index whether or not a sample contains proanthocyanin having a degree of polymerization of 5 or more. As shown in Example 31 and FIG. 50, proanthocyanins having a degree of polymerization of 5 or more show high therapeutic activity in EAE model mice. Therefore, by employing such an index, it can be determined whether or not the sample has a strong Thl site force-in production inhibiting activity.
  • the assay method of the present invention can also be used for assaying the therapeutic activity of a disease in which suppression of production of Thl site force-in is effective for treatment.
  • Example l IFN-// of each bran Amazon herb extract using Thl-biased mouse spleen cells
  • Dracontium loretense Krause was dried and dried powder (Edison S. R. Japan Co., Ltd.) 10 g was added with 200 mL of ethanol and stirred overnight. After filtration, the solvent was distilled off to obtain an ethanol extract (Table 2). Each extract was dissolved in 1% ethanol to prepare a sample for administration.
  • Table 2 In the examples of the present invention, the weight of the ethanol extract of Samambaia, Jatoba, Jack Row, Sidium and Helgon Satchya is shown.
  • IFN- ⁇ was measured using an OptEIA ELISA Set (Bettaton, Dateskinson).
  • Splenocytes prepared by the method of experimental animals were suspended in RPMI 1640 (Sigma) + 10% FCS (Rosh) + lmg OVA medium to 5 x 10 6 cells Zml, and 96 wells were prepared with 200 ⁇ l Z-well. Dispensed into plates. Further each herb extract to be tested was added at 100 or 500 gZ ml. One week later, the culture supernatant was collected, and IFN- ⁇ was measured as the Thl site force.
  • Table 3 Using the spleen cells of Thl-biased mice, shows the activity of inhibiting or enhancing various Amazon noves against IFN- ⁇ , which is a Thl cytokine produced specifically for antigen
  • Example 2 In Vitro Jatoba Extract Concentration Dependency of IFN-y Inhibitory Activity Investigation 1 was carried out to examine the concentration dependence of IFN-y inhibitory activity of Jatoba extract in vitro. [0131] 1. Experimental method
  • OVA was emulsified with CF A and immunized twice with C57BLZ6 to prepare Thl-biased mice.
  • IFN- ⁇ was measured using an OptEIA ELISA Set (Bettaton, Dateskinson).
  • Splenocytes were cultured in RPMI1640 (Sigma) + 10% FCS (Roche) + 100 ⁇ g / ml OVA medium at 37 ° C and 5% CO for 1 week, and the culture supernatant was collected and IFN- ⁇ Concentration measurement
  • the addition concentration of the Jatoba extract was 0 (control), 15.5,31,62.5,125,250,500 ⁇ g Zml.
  • Table 4 shows the IFN- ⁇ concentration in the culture supernatant after 7 days.
  • strong IFN- ⁇ production was observed with Kaju added with OVA.
  • IFN- ⁇ production was suppressed in a Jatoba concentration-dependent manner, and almost no production was observed at 125 gZml or more.
  • Jatoba has an activity of inhibiting Thl site force in the mouth of Invito. This suggests that it may be effective in the prevention and treatment of autoimmune diseases caused by excessive cellular immunity.
  • Table 4 shows the dose dependence of the inhibitory activity of Jatoba on IFN- ⁇ , a Thl kinekine produced in an antigen-specific manner, using spleen cells of Thl-biased mice.
  • Example 2 The one prepared in Example 2 was used.
  • mice On day 0, C57BL / 6, male, 6-8 week old mice were mixed with 200 ⁇ g of Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide (hereinafter referred to as “MOG peptide”: Qiagen) with CFA 800 / zg Then, the emmalgilonyi was subcutaneously administered, and on the first and third days, 200 ng of pertussis toxin (PTX: Calbiochem) was intraperitoneally administered to induce experimental autoimmune encephalomyelitis. . Mice were fed standard chow CE-2 (standard composition by the National Institutes of Nutrition) throughout the study. Tap water was used as drinking water.
  • CE-2 standard composition by the National Institutes of Nutrition
  • C57BL / 6, male, 6-8 weeks old were divided into a control group, a 20 mg Zkg group, a 50 mg Zkg group, and a 50 mg Zkg pre-administration group with 10 animals per group.
  • 1% ethanol was intraperitoneally administered three times a week after MOG antigen administration on day 0 until day 30.
  • MOTO antigen was administered on the 0th day, and then Jatoba was dosed three times a week until the 30th day.
  • Jatoba was administered with 50 mgZkg a total of 7 times 2 weeks before MOG antigen administration, and switched to 1% ethanol after antigen sensitization.
  • Figure 2 shows the experimental schedule.
  • Score 0 Normal, Score 1: Tail paralysis, Score 2: Righting dysfunction, Score 3: Hind limb hemiplegia, Score 4: Bihedral palsy, Score 5: Front and back limb paralysis, Score 6: Death, day 55 The clinical score of each individual was recorded daily until the eyes.
  • tissue sections were prepared and observed.
  • spinal cords were excised from mice in the control group and Jatoba group, fixed in a 20% formalin solution, embedded in paraffin, and 5 ⁇ m sections were prepared using a microtome RM2145 (Leica).
  • the sections were deparaffinized, stained with myelin sheath using Luxol Fast Blue solution (Muto Chemical), washed with water, and stained with cold Schiff reagent to stain cytoplasm. Finally, the nuclei were stained with hematoxylin and observed under a microscope.
  • FIG. 3 is a graph showing the change over time in the average value of the clinical scores.
  • onset began on day 9 and on day 16 the mean score exceeded 3.5.
  • 20 mgZkg group onset began around day 15 and peaked around day 21, with an average peak score of 1.5, after which the symptoms resolved.
  • 50 mgZkg I did not develop any symptoms.
  • onset occurred around day 30 and the average peak score reached about 2 on day 41, but recovered thereafter.
  • Jatoba had a clear EAE onset suppression effect. It was also found that if administered before EAE induction, there is also a prophylactic effect that onset is delayed for 3 weeks.
  • FIG. 4 shows the amount of ex vivo site force production.
  • IFN- ⁇ a high productivity of 60,000 pg / ml was observed in the control group! / Pull power was reduced to about 30, OOOpg / ml in the 20 mg / kg group, and was reduced to about 5000 pgZml in the 50 mgZkg group And fell sharply.
  • TNF- ⁇ also decreased to around 180 pgZml in the control group, to around lOpgZml in the 20 mgZkg group, and sharply decreased to around 20 pgZml in the 50 mgZkg group.
  • FIG. 5 shows the results of observation of spinal cord slices by Luxorfast blue staining.
  • Example 4 In vivo effect of Jatoba yuzu using an EAE model II
  • Example 3 To show that the effect of Example 3 depends on the type of mouse, an experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model was examined using a mouse type different from that of Example 3.
  • EAE autoimmune encephalomyelitis
  • Example 2 The one prepared in Example 2 was used.
  • PGP peptide Proteolipid protein peptide
  • Example 3 The operation was performed in the same manner as in Example 3. However, the antigen added during the culture was 2 MPLP peptide.
  • Example 5 In vivo effect of single pre-administration of Jatoba extract using ⁇ model
  • EAE was induced by immunizing the C57BLZ6 mouse shown in Example 3 with the MOG antigen.
  • One group consisted of 10 animals, half of which were dissected on day 12.
  • Jatova 50 mg / kg is intraperitoneally administered once on the first day before MOG antigen administration on the 0th day.
  • Jatoba extract was treated with polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) and the activity of the non-adsorbed fraction was determined by experimental autoimmune encephalomyelitis ( ⁇ ) The model was verified.
  • PVPP polyvinylpolypyrrolidone
  • EAE was induced by immunizing the C57BLZ6 mouse shown in Example 3 with the MOG antigen.
  • One group consisted of 10 animals, half of which were dissected on day 12.
  • the control group was intraperitoneally injected with 1% ethanol three times a week until day 30.
  • the Jatoba group received the Jatoba ethanol extract and the Jatoba PVPP-treated group received the PVPP-treated Jatoba ethanol extract three times a week at 50 mg / kg.
  • mice were dissected in each group to prepare splenocytes.
  • Splenocytes were cultured in RPMI1640 (SIGM A) + 10% FCS (Roche) MOG 2 ⁇ , and the IFN-y concentration of the supernatant after one week of culture was determined. The concentration was measured.
  • OptEIA ELISA Set (Bettaton 'Dickinson) was used.
  • Fig. 8 shows the results.
  • PVPP has a property of strongly adsorbing polyphenol and is known as a polyphenol removing agent (Loomis, WD, Battaile, J., 1966. Phytochem. 5, 423-438., Loomis, WD, 1969). .
  • Lowenstein, JM, (Ed.) Methods in
  • Example 6 suggests that the active ingredient of Jatoba may be polyphenol. Life The following experiments were performed on the Jatoba ethanol extract in order to further pursue the sex body.
  • the Jatoba ethanol extract was subjected to the butanol hydrochloride method according to the method of the literature (J. Agric. Food Chem. 1998, 46, 1698-1705). That is, a 4 mg / mL methanol solution of the Jatoba ethanol extract was prepared, and 250 L of this was supplemented with 1.5 mL of 1-butanol containing 5% hydrochloric acid and 50 ⁇ L of 2N hydrochloric acid containing 2% ammonium sulfate. The mixture was polished and reacted at 95 ° C for 50 minutes. The reaction solution was returned to room temperature, and the absorbance at 550 nm was measured. As a control for measurement, 4 mg ZmL (methanol solution) of Jatoba ethanol extract was used.
  • the Jatoba ethanol extract was subjected to ESI-MS.
  • the equipment used was ThermoQuest LCQ.
  • the measurement conditions were as follows: infusion method, negative ion mode, flow rate 6 ⁇ l / min, Sheath gas flow rate 60 arb, bpray voltage 4.5 kV, Capillary temp 200. I did it.
  • MALDI-TOF-MS Matrix-assisted laser desorption ionization—time-of-flight mass spectrometry
  • the Jatoba ethanol extract was subjected to MALDI-TOF-MS.
  • the equipment used was PerSeptive Biosystems, voyager, and 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) was used as the matrix.
  • NP-HPLC can detect an oligomer component of proanthocyanin as an elution peak.
  • components with a higher degree of polymerization are strongly adsorbed to the column, giving a characteristic broad chromatogram in the latter half of the elution.
  • the chromatogram of the Jatoba ethanol extract showed eight elution peaks followed by a characteristic broad shape, suggesting the presence of not only proanthocyanin oligomers but also a higher degree of polymerization.
  • MALDI-TOF-MS confirmed the presence of a high degree of polymerization procyadine, which could not be observed by ESI-MS, but belongs to a further high molecular range. That is, as shown in FIG. 10B, molecular ion peaks extending to procyadine 20 mer or more were observed.
  • Example 7 showed that the main component of the ethanol extract of Jatoba was procyadine.
  • the method of Guyot et al. (Sylvain Guyot, Nathalie Marnet, and Jean-Francois Drilleau, J. Agric. Food Chem. 2001, 49) was used to precisely identify constituent units, calculate binding modes, calculate the degree of polymerization, and perform quantitative analysis. , 14-20), and thiol cleavage analysis was performed.
  • the ionization mode of the MS was ESI, and the apparatus used was a Waters micromass ZQ2000.
  • the change in ⁇ value at 280 nm due to the addition of toluene ⁇ -thiol to epicatechin was calculated using propicin-zin2, an epicatechin dimer. That is, procyandin-2 was thiol-cleaved under the conditions of (1) and subjected to RP-HPLC analysis.
  • proanthocyanin gives a monomer component derived from the terminal unit and a benzylthioether adduct derived from the extension unit by thiol cleavage. Can be separated, identified and quantified.
  • thiol cleavage of the Jatoba ethanol extract as shown in FIG. 12, two peaks were observed at 21.6 minutes and 42.8 minutes. For the former, the elution position was in agreement with the epicatechin (EC). Other than these two, they gave no peak.
  • A-type bond remains without being cleaved by the thiol cleavage reaction.
  • thiol cleavage produces a dimeric benzylthioether adduct linked by A-type and is detected by RP-HPLC.
  • the results of thiol cleavage analysis revealed that proto-zine of Jatoba had no A-type linkage and was therefore composed of only B-type linkage.
  • the content of procyadine in a Jatoba ethanol extract can be determined.
  • the reaction rate of thiol cleavage required for quantitative analysis was determined by quantifying the generated EC using procyazin B2 as an external standard. The reaction rate was generally 83%.
  • the content of procyanidin in the jatobaethanol extract was calculated to be 76.0% (w / w).
  • procyazine can be fractionated according to the degree of polymerization.
  • the ethyl acetate fraction was subjected to solid-phase extraction using a C18 column, and further fractionated into two fractions. That is, Fr. 7 was eluted first with getyl ether (DEE) and then with MeOH to obtain Fr. The weight of each fraction is shown in FIG.
  • the average polymerization degree and content of procyadine were calculated by thiol cleavage analysis (for the method, see Example 8). As shown in FIG. 13, procyadine fractions having different average degrees of polymerization could be easily prepared by this method.
  • Example 10 IFN-y inhibitory activity of a Jatoba-derived fraction sample using an EAE model
  • Example 9 The sample fractionated in Example 9 was intraperitoneally administered to an EAE model mouse, and the IFN- ⁇ inhibitory activity of splenocytes was examined.
  • Example 9 The Jatoba ethanol extract of Example 2 and the fraction Fr. 1-7 fractionated in Example 9 were used.
  • 1% ethanol was intraperitoneally administered on day 0, 2, 4, 7, 9 after MOG antigen administration for a total of 5 times.
  • the Jatoba group received 5 Omg / kg on the same schedule.
  • Each fraction was dosed at 50 mg / kg on the same schedule.
  • Necropsy was performed on the 11th day, splenocytes were co-cultured with MOG, and the amount of IFN- ⁇ production in the culture supernatant was measured by ELISA.
  • the results are shown in FIG.
  • the control group produced about 20000 pgZml of IFN- ⁇ .
  • the Jatoba group hardly produced IFN- ⁇ .
  • Fr5-7 produced slightly more IFN ⁇ compared to the control.
  • Frl-4 almost no IFN ⁇ was produced.
  • the activity to suppress the production of IFN- ⁇ , an exacerbation factor of autoimmune disease is remarkably strong at an average degree of polymerization of 6.5 or more, and the higher the degree of polymerization, the higher the activity. was suggested.
  • Example 8 thiol cleavage analysis was performed for the purpose of accurately identifying the structural units of procyadine contained in Jatoba, determining the bonding mode, calculating the degree of polymerization, and performing quantitative analysis precisely.
  • Purification and isolation of the toluene a-thiol adduct derivative of epicatechin (EC) (EC-BTE) for the purpose of strictly determining the average degree of polymerization and quantitative analysis of procyadine, followed by high-resolution mass spectrometry (HR-MS) It was subjected to a magnetic resonance spectrum (NMR) to determine the structure. After that, HPLC analysis was performed using this as a sample. By performing analysis using the purified and isolated preparations, it was possible to more accurately identify the constituent units of procyadine, determine the bonding method, and calculate the degree of polymerization.
  • HR-MS high-resolution mass spectrometry
  • the EC-BTE obtained in the previous section was first subjected to HR-MS for the purpose of obtaining a precise molecular weight.
  • the device used was JeoUMS-700 (JEOL Ltd.), the ionization mode was fast atom bombardment (FAB), and the ionization voltage was 70 eV.
  • a proton NMR spectrum was measured to compare the signal with the literature value.
  • the apparatus used was UNITY INOVA-500 (500 MHz) manufactured by Varian.
  • Example 8 HPLC analysis was performed under the conditions shown in Example 8 to calculate the average polymerization degree and content of the protein.
  • the average degree of polymerization was calculated as follows.
  • E molar amount of extension unit (EC-BTE)
  • the content was determined in terms of EC-converted weight% of the amount of procyazin in the sample.
  • Example 10 From Example 10, it was found that the active substance of Jatoba was procyadine having a specific degree of polymerization or higher. Therefore, another material containing procyadine was searched for.
  • Gravinol SL (Kikkoman Co., Ltd.), Polyphenon (Tokyo Tetano Food Co., Ltd.), Applephenon (Nitsuka Co., Ltd.), Cranberry Powder I (Kikkoman Co., Ltd.), and Kakao Polyphenol (Meiji Seika Co., Ltd.) ), Pine peel extract (Materials and Functional Research Laboratories), and cinnamon powder (SB Food Co., Ltd.) were used as samples.
  • cranberry powder a sample containing highly polymerized procyadine was prepared. That is, 9 g of cranberry powder was dissolved in 600 mL of water, and applied to a column ( ⁇ 2.6 cm ⁇ 72 cm) packed with Sephadex LH-20 ⁇ fat. After elution with 1 L of water and methanol at a flow rate of 5 mLZ, finally elution was performed with 1 L of 70% acetone Z water. This column chromatography was performed three times.
  • procyadine contained in each sample and the cinnamon sample prepared in (1) and the cranberry sample prepared in (2) was quantified, and the average degree of polymerization, constituent components, and binding mode were determined. It was determined. Also, depending on the sample, kaln with gallate attached to the hydroxyl group at the 3-position of the flavan ring, the change in the molar extinction coefficient at 280 nm (the change in ⁇ , Epicatechin (EC) and Epicatechin Gallate (ECG).
  • Table 5 shows the results of analysis of procyadine contained in each sample. See Example 8 for Jatoba. The peak identification of the gallate adduct and its modified product was performed as described in Example 8, 1.
  • Table 5 In Examples of the present invention, contained in Jatoba, Gravinol SL, polyphenone, applephenone, purified cranberry highly polymerized fraction, cacao polyphenol, pine peel extract, and crude cinnamon fraction The analysis results of the average degree of polymerization, the content, and the constituent components of the procyazine to be used are shown below.
  • J CSJ CO CO oo Polyphenone is a crudely purified polyphenol derived from green tea.
  • the procyanidin oligosaccharide is not detected, and the main components are epigallocatechin gallate (EGCG), EC ECG, and power techin (CA).
  • EGCG epigallocatechin gallate
  • CA power techin
  • Gravinol SL is derived from grape seeds
  • Applephenon is a crudely purified procyanidin derived from apples.
  • C ECG.
  • pine peel extract, cocoa polyphenol, and cinnamon procyanidine were composed of CA and EC.
  • the average degree of polymerization of the samples ranged from 1 to 6.8, with the average degree of polymerization of Jatoba being the highest.
  • Apple phenone had an average polymerization degree of 2.7.
  • a sample that had not undergone thiol cleavage was subjected to LC-MS under the conditions of Example 8 1.
  • RP-HPLC reversed-phase liquid chromatography
  • Example 12 In order to further scrutinize the knowledge obtained in Example 12, the same as in Example 9 for commercially available materials such as cinnamon (Okada Pharmacy), Pycnogenol (Valentine), and Gravinol (Kikko-Ichiman). Was subjected to a precipitation fractionation method using black porridge with black mouth.
  • the resulting precipitate (Fr. 1) was filtered through a glass funnel (pore size P16), fractionated, and the filtrate was added with 150 mL of chloroform to form a clope: methanol (60:40, vZv) solution
  • the resulting precipitate (Fr. 2) was separated in the same manner, and 250 mL of a black-mouthed form was added to the filtrate to obtain a black-mouthed form: methanol (70:30, v / v) solution.
  • the resulting precipitate (Fr. 4) was separated, and the filtrate was evaporated to Fr.
  • Table 6 shows the weight and weight ratio of each fraction obtained as a result of fractionating procyanidins of cinnamon, pycnogenol, and gravinol by black-hole form precipitation fractionation.
  • Table 6 Shows the weights of the fractions obtained in (1) to (3).
  • Example 12 Each preparation obtained in Example 12 was subjected to a thiol cleavage reaction for the purpose of accurately performing the average polymerization degree and quantitative analysis of procyadine, and the calculation was performed in the same manner as in Example 11. That is, a toluene ⁇ - thiol adduct derivative of epicatechin gallate (ECG) (ECG - BTE) and toluene a Chioru addition derivatives of catechin (CA) (CA- BTE) Purified 'isolated, high resolution mass spectrometry (HR - subjected to MS) and nuclear magnetic resonance (NMR), was carried out the identification of structure Thereafter, HPLC analysis of the components was performed using each as a sample.
  • ECG epicatechin gallate
  • CA- BTE toluene a Chioru addition derivatives of catechin
  • HR - subjected to MS high resolution mass spectrometry
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • Enzodinol (Valentine Co., Ltd.), a pine rind extract from New Zealand, was cleaved with thiol by the method of Example 8, and the reaction product was subjected to HPLC to collect a peak of CA-BTE.
  • the column conditions are shown below.
  • Procyanidin B3 (CA dimer) was subjected to thiol cleavage for the purpose of identifying the CA-BTE peak.
  • VA-600 600 MHz was used.
  • proton () NMR of a commercial product, CA (Funakoshi Co., Ltd.) was measured.
  • HPLC analysis was performed to calculate the average degree of polymerization and the content of procyadin.
  • the average degree of polymerization was calculated as follows.
  • ⁇ molar amount of terminal unit (EC, ECG, CA)
  • E molar amount of extension unit (EC-BTE, ECG-BTE, CA-BTE)
  • Table 7 shows the average polymerization degree and content% (w / w) of procyazine in each preparation obtained as a result of HPLC analysis using BTE as a standard.
  • Table 7 Procyanin contained in Jatoba, Gravinol SL, Polyphenone, Applephenone, purified product of highly polymerized cranberry fraction, cocoa polyphenol, pine peel extract, and crude cinnamon fraction , Average degree of polymerization, content, and results of analysis of constituent components are shown.
  • Example 13 For each of the fractions derived from cinnamon, pycnidol, and gravinol obtained in Example 13, the thiol cleavage reaction was performed in the same manner as in Example 8, and then the identification of the procyanidin structural units and the degree of polymerization were performed in the same manner as in Example 14. Calculation and quantitative analysis of the content.
  • ⁇ molar amount of terminal unit (EC, ECG, CA)
  • E molar amount of extension unit (EC-BTE, ECG-BTE, CA-BTE)
  • HPLC analysis was performed using EC, CA, ECG, EC-BTE, CA-BTE, and ECG-BTE, each of which was produced by thiol cleavage, as a standard.
  • Table 8 shows the degree of polymerization and the content% (w / w).
  • Table 8 Average polymerization degree and content% (w / w) of procyadin (PC) in each fraction obtained as a result of fractionating cinnamon, pycnogenol, and gravinol by black form precipitation separation method It is a table shown. Jatoba figures are attached for reference.
  • Detection wavelength 280nm (Waters 2996 multi-wavelength detector)
  • Fr. 5 was prepared by adding 60 ⁇ L of methanol to 10 ⁇ L of a methanol solution having a concentration of 100 juguL, and injecting 100 L of a solution diluted to 120 L with water. Set the UV detector outlet flow path to 1
  • the ionization mode was the negative ion mode of ESI, and procyadine with a molecular weight of 2,000 or more was detected with divalent ions.
  • the cone voltage was 40V.
  • the column, mobile phase, mobile phase flow rate and detection wavelength were the same as in (1), the pump was Hitachi L-7100, and the detector was Hitachi L-7455 (multi-wavelength detector).
  • the sample loop volume is 1 mL, and Fr
  • a sample prepared by dissolving 150 mg of the above in 1.5 mL of a methanol: water (50:50, vZv) solvent was used as a single amount of intactate.
  • Example 17 Purification of jatova procyanidin hexamer-1 9mer
  • Detection wavelength 280nm (Waters 2996 multi-wavelength detector)
  • the column, mobile phase flow rate, and detection wavelength were the same as in (1), and the mobile phase was 0.1% ( ⁇ ) methanol containing formic acid: 0.1% 7)
  • Formic acid water (80:20, vZv) pump was replaced by Hitachi L— 7100, the detector was Hitachi L-7455 (multi-wavelength detector).
  • the volume of the sample loop was 1 mL, and a sample prepared by dissolving 150 mg of Fr.4 in 900 ⁇ L of a methanol: water (70:30, v / v) solvent was used as the amount of an indigest.
  • Example 17 In order to calculate the content of procyazine-% (w / w) in the fractions obtained in Example 16 and Example 17, thiol cleavage analysis was performed by the method of Example 8, The result in the way was analyzed. In thiol cleavage analysis, the average degree of polymerization can be calculated in addition to the content of procyazine-% (wZw). The hexamer used was that obtained in Example 17.
  • Table 9 shows the content of the procya-zine content (w / w) in each fraction of the trimer to the 9-mer.
  • the content of procyan-gin (PC) was as low as 71.3% (hexamer) and as high as 83.0% (trimer).
  • the average degree of polymerization calculated for each was consistent with the desired degree of polymerization, indicating that the accuracy of the thiol cleavage analysis method itself was extremely good.
  • Table 9 trimer one 9-mer Prussian - Jin and thiolysis analyzed with the method of Example 8, the average degree of polymerization and Prussian - Jin (PC) content 0/0 (w / w) This is the result of analyzing by the method of Example 11.
  • the oligomer purity% (w / w) is a result of quantification by HPLC in Examples 16 and 17, and the total purity is a value obtained by multiplying the PC content by the oligomer purity.
  • the average degree of polymerization and content% (wZw) of procyadine were analyzed by thiol cleavage analysis in Examples 8 and 11, and the distribution of polymer was analyzed by mass spectrometry in Examples 7, 16 and 17.
  • Ability to be achieved By setting the HPLC conditions of Examples 16 and 17 as follows, it becomes possible to detect the distribution of procyazine-oligomer up to a higher degree of polymerization.
  • Detection wavelength 280nm (Waters 2996 multi-wavelength detector)
  • Fr.5, Fr.4, and Fr.3 prepared in the same manner as in Example 9, 100 ⁇ L of a solution obtained by diluting 80 ⁇ L of a 100 gZ methanol solution to 120 ⁇ L with water was injected. .
  • the outlet channel of the UV detector was split into 1Z6 and introduced into the MS.
  • the ionization mode was the negative ion mode of ESI, and detection was performed using divalent ions for procyadine with a molecular weight of 2,000 or more.
  • the cone voltage was 40V.
  • Example 20 In vivo effects of samples derived from various plants using the EAE model In order to examine the autoimmune disease ameliorating effects of the dizines, samples derived from various plant materials of Example 8 were examined in EAE model mice.
  • the Jatoba ethanol extract of Example 2 and each sample of Example 12 were used.
  • a 1% ethanol solution was prepared so that the content of the procyazine was the same as that of the Jatoba ethanol extract.
  • the type of procyadine contained in the sample in which the effect was recognized is not limited to a single type.
  • the binding mode of A type and B type, the components, and the presence or absence of gallate addition may not correlate with the activity. It became apparent. From these facts, it is easily deduced that the number of hydroxyl groups in the flavan basic skeleton is not related to the activity. That is, it was revealed that only the degree of polymerization is involved in the activity, and that proanthocyanins having a degree of polymerization of 4 or more have an autoimmune disease ameliorating effect.
  • m2i For materials containing highly polymerized procyanidins:
  • IFN- ⁇ measurement was performed using the OptEIA ELISA Set (Bettaton 'Decktonson) did.
  • splenocytes were cultured in RPMI1640 (Sigma) + 10% FCS (Roche) ⁇ 2 / z MMOG medium at 37 ° C and 5% CO for 7 days, and the culture supernatant is collected.
  • Example 2 The Jatoba ethanol extract of Example 2 was used.
  • DBAZU mice male
  • 8 weeks old Purchased by Charrriva Co., Ltd.
  • the emulsion was induced by intradermal administration.
  • Each group was divided into a control group and a Jatoba group with 10 animals.
  • the control group received 1% ethanol intraperitoneally three times a week from day 0 to day 30.
  • the Jatoba group received the Jatoba ethanol extract intraperitoneally at 50 mgZkg on the same schedule.
  • Fig. 33 shows the experimental schedule.
  • Score 0 Normal
  • Score 1 Only one small joint such as a finger on the limb swells and redness
  • Score 2 Two or more small knuckles, or a large joint such as a wrist or ankle swells and redness
  • Score 3 Hands and feet Overall redness and swelling
  • score 4 Further swelling of one hand or foot has reached the maximum.Clinical score is observed for all four feet according to the above criteria, and the sum of the four is recorded as a score did.
  • FIG. 34 shows a graph showing the time course of the clinical scores.
  • a secondary immunization was performed on day 21 (assumed to be day 0), and the onset began 2 days after the second immunization, and almost complete onset within 2 weeks (score 16). did.
  • the onset of the onset started around the sixth day after the second immunization, one week after the onset.
  • the Jatoba extract was also effective for rheumatoid arthritis.
  • Example 2 The Jatoba ethanol extract of Example 2 was used.
  • NODZLtj mice females
  • 4-week-old mice Purchase: Charlriva Co., Ltd.
  • 300 mg Zkg of cyclophosphamide (Cy) at the age of 10 weeks.
  • Each group was divided into a control group and a Jatoba group with 20 animals.
  • the control group was intraperitoneally administered 1% ethanol twice a week from the age of 4 weeks.
  • the Jatoba group received the Jatoba ethanol extract intraperitoneally at 50 mgZkg on the same schedule.
  • 5 mice were necropsied, spleen cells were co-cultured with insulin, one of the antigens, and the amount of IFN- ⁇ production in the culture supernatant was measured by ELISA.
  • the remaining 15 animals received Cy at the age of 10 weeks and were clinically administered until day 35 after Cy administration. The score was observed.
  • Figure 35 shows the experimental schedule.
  • the incidence of diabetes was determined to be positive if the value was 250 mg / dl or more when a small amount of blood was collected from the tail with Daltest Ace (Sanwa Chemical Laboratory Co., Ltd.).
  • Figure 36 shows the incidence of diabetes. On the 28th day after administration of Cy in the control group, 39% of the patients developed power. In the Jatoba group, 13% of the power developed.
  • Example 23 cyclophosphamide was administered to mice to induce type I diabetes, and the mouse was used in experiments.
  • the effects of the active ingredient according to the present invention will be more accurately verified by using a long-term model mouse with spontaneous type I diabetes for experiments.
  • NODZLtj mouse female
  • 4 weeks old Purchased from: Charl Sliver
  • a group of 20 type I diabetic spontaneous model mice, NODZLtj were purchased at the age of 4 weeks.
  • lmgZmouse of Jatoba EtOH extract and 1% EtOH for the control group were started intraperitoneally twice a week at 200%.
  • the treatment was switched to weekly, and administration was continued until week 33, when the study of the incidence was completed.
  • IFN- ⁇ was measured using an OptEIA ELISA Set (Bettaton's Dickinson).
  • the incidence of diabetes was determined to be positive if the value was 250 mg / dl or more when a small amount of blood was collected from the tail with Daltest Ace (Sanwa Chemical Laboratory Co., Ltd.).
  • the Jatoba EtOH extract (Example 2) was dissolved in a 1% EtOH solution to a concentration of 5 mg Zml. A 1% EtOH solution was used for the control group.
  • mice The C57BLZ6 mice were immunized with the MOG antigen and EAE was induced in each group. Three mice were necropsied on days 0, 2, 4, 8, and 15 with time.
  • the immunocompetent cells analyzed are T cells (CD3) ⁇ CD4 positive (CD4) T cells, CD8 positive (CD8) T cells, regulatory (CD4ZCD25) T cells ⁇ , B cells (B220), NK cells (DX5), Macrophages (CD1 lb) and dendritic cells (CD1 lc) were used with the cell surface markers in parentheses as indices.
  • CD40, CD80, CD86, and MHC class II antibodies were used as cell surface markers indicating the maturity of macrophages.
  • spleen cells on day 10 were further analyzed in order to examine the maturity of the macrophages, which increased in the Jatoba administration group.
  • cell surface markers CD40, CD80, CD86 and MHC glass II, costimulatory molecules that are said to reflect the ability to present antigen, were used.
  • Jatoba administration tended to suppress the expression of any of the costimulatory molecules examined, and in particular, for CD80 involved in inflammation amplification by Thl response and MHC class II mainly involved in antigen presentation, It was significantly suppressed.
  • Example 26 T VO e II collagen good clinical score by Jatoba oral administration in induced arthritis model
  • DBAZU mice male, 8-week-old, mixed 150 ⁇ g of psi type II collagen (Cosmo Bio) with 400 ⁇ g of CFA containing 400 ⁇ g of killed Mycobacterium tuberculosis (H37Ra: Difco) and emulsified on day 0
  • the disease was induced by intradermal administration (primary immunization) and intraperitoneal administration (secondary immunization) on the 21st day after 3 weeks.
  • the experiment was performed with 13 animals per group.
  • the secondary immunization day was set as day 0, and clinical symptoms were observed until day 31 thereafter.
  • the scoring was performed according to Example 22.
  • Example 27 by Jatoba oral administration in T VO e II collagen-induced arthritis model
  • the Jatoba administration group was administered with a Jatoba EtOH extract (Example 2) dissolved in a 10% EtOH solution to a concentration of 50 mgZml. A 10% EtOH solution was used for the control group.
  • DBAZU mice male
  • 150 ⁇ g of psi type II collagen (Cosmo Bio) was mixed with CFA containing 400 / zg H37Ra for 8 weeks of age, and emulsified and intradermally administered. The experiment was performed with 20 animals per group.
  • IFN- ⁇ was measured using an OptEIA ELISA Set (Bettaton's Dickinson).
  • the control group was gavaged with 250% 10% EtOH 250 1 and the Jatoba-administered group 250 ⁇ l 50% Zml (l% EtOH solvent) 5 times a week.
  • Necropsy was performed on day 14 and spleen cells were prepared. Splenocytes are cultured in RPMI1640 (Sigma) + 10% FCS (Roche) ⁇ 25 ⁇ g Zml collagen medium at 37 ° C and 5% CO for 3 days, and the culture supernatant is collected
  • FIG. 46 An antigen-dependent increase in IFN- ⁇ in the control group and significant suppression in the Jatoba administration group were confirmed (FIG. 46). This shows that oral administration improves clinical scores through suppression of IFN- ⁇ production, which is a Thl-type cytodynamic force, as in intraperitoneal administration.
  • Example 28 Tv Oe ⁇ collagen hum Dose dependence of clinical score B by Jatoba enduro in a model of arthritis
  • Fr3 (Example 9), which is a Rapid Fractionation fraction of the Jatoba extract, was dissolved in a 10% EtOH solution to 50 mg / ml, 37.5 mg / ml, and 25 mgZml, respectively.
  • a 10% EtOH solution was used for the control group.
  • the control group received 250 ⁇ l of 10% EtOH, 250 ⁇ l of 50 mg / ml, 37.5 mg / ml, and 25 mg of Zr25 ml of Fr3, 5 times a week from the first immunization start day to the 40th day.
  • the dose per animal would be 12.5, 9.375, and 6.25 mgZ mice in Fr3 conversion, respectively.
  • DBAZU mice male, 8-week-old, mixed 150 ⁇ g of psi type II collagen (Cosmo Bio) with 400 ⁇ g of CFA containing killed M. tuberculosis (H37Ra: Difco) and emulsified on day 0
  • Intracutaneous administration primary immunization
  • intraperitoneal administration on day 21 3 weeks later (secondary immunization) Disease.
  • the experiment was performed with 12 animals per group.
  • Oral administration was performed 5 times a week from the 0th day of the first immunization to the 46th day under the following conditions. (The onset at day 21 was the onset period, the start at day 28 was the acute period, and the start at day 35 was the chronic period.) The dose of Jatoba Fr3 per dose was 12.5 mg / mouse. is there.
  • Control group From the start of primary immunization to the end of the experiment, 250 1 of a 10% EtOH solution was orally administered.
  • Jatoba administration group The primary immunity initiation power was also oral administration of Jatoba Fr3 until the end of the experiment.
  • Day 21 starting group 250 1 10% EtOH from the start of primary immunization to day 20 and oral administration of Jatoba Fr3 from day 21 of secondary immunization to the end of experiment.
  • Fig. 48 shows the transition of the average score. It was shown that the administration on day 21 and day 28 suppressed the deterioration of the disease state by starting treatment. The anti-autoimmune disease effect of high polymerization degree procyadine was shown to be effective even after primary immunization was established.
  • the purpose of this study was to confirm the suppression of blood antibody titers in addition to the clinical symptoms of the rheumatoid arthritis model.
  • Jatoba Fr3 (Example 9) dissolved in 10% EtOH so as to be 50 mg Zml was used.
  • DBAZ1J mouse male
  • 8-week-old mixed 150 ⁇ g of psi type II collagen (Cosmo Bio) with 400 ⁇ g of CFA containing killed M. tuberculosis (H37Ra: Difco) and emulsified on day 0
  • the disease was induced by intradermal administration (primary immunization) and intraperitoneal administration (secondary immunization) on the 21st day after 3 weeks.
  • the experiment was performed with 12 animals per group.
  • Type II collagen prepared at 3 ⁇ g / ml with phosphate buffer was coated at 4 ° C with a 500-5000-fold diluted serum sample on a plate coated with calorie.
  • a 500-fold diluted AP-conjugate anti-total IgG antibody, anti-IgGl antibody, and anti-IgG2a antibody (Cosmo Bio) were used, followed by color development with pNPP (Funakoshi) and detection at 410 nm.
  • the procyadine fraction from the trimer to the hexamer was dissolved in a 1% EtOH solution so that each was 5 mgZml in terms of procydin.
  • epicatechin Sigma
  • Procyanidin B2 Frakoshi
  • a 1% EtOH solution was used for the control group.
  • EAE was induced by immunizing C57BLZ6 mice with the MOG antigen described in Example 3. Necropsy was performed on day 11 in 12 animals per group.
  • IFN- ⁇ was measured using an OptEIA ELISA Set (Bettaton's Dickinson).
  • FIG. 50 shows the measurement results of IFN- ⁇ . From the comparison of the activity from the monomer (i) epicatechin to the hexamer, IFN- ⁇ suppression was observed in procyadine of pentamer or more. From this, the inhibitory effect of Jatoba extract administration on Thl site force-in, which had been observed so far, was
  • Example 31 In order to examine the effects of the 7-mer to the 9-mer, the experiment was carried out at a dose half that of Example 31.
  • procyadine from trimer to 9-mer were each dissolved in a 1% EtOH solution so as to obtain 2.5 mg Zml in terms of procyadine.
  • epicatechin Sigma
  • Procyanidin B2 Frakoshi
  • a 1% EtOH solution was used for the control group.
  • EAE was induced by immunizing C57BLZ6 mice with the MOG antigen described in Example 31. Necropsy was performed on day 11 in 12 animals per group.
  • IFN- ⁇ was measured using an OptEIA ELISA Set (Bettaton's Dickinson).
  • FIG. 51 shows the measurement results of IFN- ⁇ .
  • Example 31 the ability to show activity of procyanidins of pentamer or more
  • the dosage was reduced, and the activity was further compared to the 9-mer.
  • the activity of the pentamer weakened due to the decrease in the dose, but the activity of the procyadine with pentamer and higher increased with the degree of polymerization, and the correlation between the degree of polymerization and the activity increased to 9-mer. I was able to confirm.
  • a Jatoba EtOH extract (Example 2) and polyphenol (Mitsui Norin) as green tea polyphenol (monomer) were dissolved in 10% EtOH to a volume of 200 mgZml. A 10% EtOH solution was used for the control group.

Abstract

本願では、（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物を有効成分として含んでなる、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患および／または自己抗体の産生抑制が治療に有効である疾患の治療剤、それらの疾患の根治治療剤、およびそれらの疾患の進行阻害剤が開示される。

Description

明 細 書
自己免疫疾患治療剤
発明の背景
[0001] 発明の分野
本発明は、自己免疫疾患治療剤に関し、詳細には、プロアントシァ-ジンを有効成 分として含んでなる自己免疫疾患治療剤に関する。
[0002] 背景 術
近年、高齢ィ匕社会をむ力えて慢性関節リウマチに代表される自己免疫疾患が増加 している。自己免疫疾患には免疫応答のタイプの違う 2種類に大別することができる 。ひとつは細胞性免疫の過剰な亢進による疾患であり、もうひとつは自己抗体に媒介 される疾患である。前者の非限定的な例は、慢性関節リウマチ (RA)、多発性硬化症 (MS)、自己免疫性甲状腺炎 (AT)、若年性糖尿病や I型糖尿病等のインスリン依存 型糖尿病 (IDDM)、自己免疫ブドウ膜網膜炎 (AUR)、乾癬症などである。後者の 非限定的な例は、重症筋無力症 (MG)、全身性エリテマトーデス（SLE)、グッドパス チヤ一症候群、自己免疫性溶血性貧血などである。これら自己免疫疾患の既存の治 療法としては、非特異的に免疫反応を抑制する免疫抑制剤が代表的である。例とし てはメトトレキサート、シクロホスフアミド、サイクロスポリン A、タクロリムス、各種ステロイ ド化合物などがある。これらの薬剤は毒性 *副作用が深刻であるば力りでなぐ治療期 間中は免疫反応が抑制されているため感染症に罹患する危機にさらされる。このよう な背景の中、最近特にリウマチ治療において生物製剤が脚光を浴びている。細胞性 免疫依存型の自己免疫疾患の増悪因子は TNF ひ、 IL 1、 IL 6などの炎症性サ イト力インであるが、抗 TNF— α抗体、可溶性 TNF— α受容体、抗 IL 6受容体抗体 、 IL 1受容体アンタゴニストなどについて臨床試験が行われている。これらの生物製 剤は、対症療法であるため継続的な投与を要する。
[0003] ところで、自己免疫疾患の中で患者数が多いのは細胞性免疫亢進型自己免疫疾 患である。このタイプでは、 Thl細胞や Tel細胞が発症機序の中心的な役割を持つ ている。 Thl細胞はヘルパー T細胞の亜群であり、抗原刺激に対して選択的に IFN - γ、 TNF— α、 IL— 2などの Thlサイト力インを産生する。 Thl細胞の分化には抗原 提示細胞 (例えば、榭状細胞、マクロファージ）が産生する IL 12と呼ばれるサイト力 インが必須であるが、細胞性免疫亢進型自己免疫疾患では抗原提示細胞による IL- 12産生量が増加しており、いっそう Thl細胞が誘導されやすい環境となっている。 T hi細胞は Thlサイト力イン環境を作り出し、細胞障害活性をもつ T細胞である Tel細 胞の分化を誘導する。従って Thlサイト力インの産生を抑制することが自己免疫疾患 の治療および予防に有効であると言える。
[0004] 漢方薬を始めとする民間療法もこの分野では試みられることが多ぐある種の植物 素材も自己免疫疾患に効果があることが経験的に知られている。
[0005] 例えば、雷公藤はリウマチに効果があることが報告され (BMC Pharmacol,
2004,4(1):2)、人参湯は I型糖尿病に効果があることが報告され (Microbiol. Immunol, 2000, 44(4):299-305)、カンランは多発性硬化症に効果があることが報告されている (Arzneimittelforschung, 1998, 48(6):668-74)。また、シダの 1糠である PolvDodium Leucotomosは古くから乾癬症の治療に使われて ヽる（Padilla HC, 1974. Int J Dermatol 13, 276—282; Gonzales S., et al, 2000, Anticancer Res.20, 1567—1576)。 また、同じシダ類であるサマンバイァ (Polvpodium lepidopteris)のエキスには CD4+T 細胞や B細胞の数に影響を与えることなく、 CD8+T細胞の数を増カロさせる作用があ ることが知られている (Hostettmann K., et.al" 1995 Phytochemistry of Plants Used in Traditional Medicine, Proceedings of the Phytochemical Society of Europe.
Oxford University Press: Oxford, NY)。このような素材で得られる効果については、 科学的な解明はされていないが、安価で手軽に試みられる利点がある。また、ジャト ノ (Hvmenaea courbariL別名：ァスカル *ヮーョ）の榭皮、榭液、榭脂、葉などは下痢 止めや膀胱炎、肝炎、前立腺炎、咳の自然薬として用いられてきた (Rutter, R.A. 1990 Catalogo de Plantas Utiles de la Amazonia Peruana. Institute Linguistico de Verano. Yarinacocha, Peru. 349)。現在でも、ジャトバ榭皮から作るお茶や液体ェキ スは食欲促進、疲労回復、滋養強壮、栄養補給剤として広く受け入れられている（ Silva. , 1930. Catalogo de xtractos Fluidos, Araija e Cia.Ltd., Rio de Janeiro, Brazil: Cruz GL., 1995. Dicionario das Plantas Uteis Do Brasil, 5th Ed. Rio de Janeiro: Bertrand Brazil)。また、ジャトバの樹皮に含まれているァチルビンと呼ばれる フラボノイドが、抗酸化効果や肝臓保護特性を生み出すことや抗菌作用とテルペン やフエノールとの因果関係が報告されている（Closa D et al.， 1997. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 5o, 331-334 ; Pinheiro de SM., et.al., 1974. Molluscicidal activity of plants from Northeast Brazil. Rev Bras Fpesq Med Biol, 74:
389-394;Rouquayrol MZ., et al, 1980. Rev Brasil Pesq Med Biol 13, 135—143)。し 力しながら、これらの成分の Thlサイト力イン産生に対する効果や自己免疫疾患に対 する効果はこれまで報告がなされて ヽな 、。
[0006] ところで、プロアントシァ-ジンは様々な植物に広く含有される縮合型タンニンであ り、酸処理によってアントシァ-ジンを与える。図 1に示すように、主としてカテキン類 すなわちフラバン 3—オールを基本単位として重合したポリフエノール成分である。 すなわち、プロアントシァ-ジンとはフラバン骨格を基本として種々な部位に水酸基 を有する単量体が重合した、非常に多様な化合物群の総称である。重合体の構成 単位のうち、基端部をターミナルユニット、その他をエクステンションユニットと呼び、 重合度は二量体、三量体のものから 100量体以上の高分子にまで及ぶ。
[0007] これまでに、プロアントシァ-ジンの好塩基球からのヒスタミン、ロイコトリェンなどの 遊離抑制作用に基づく抗アレルギー剤としての利用が報告されている。（特開 2001 —278792号公報)また、抗肥満作用（特開平 9— 291039号公報）、マトリックスプロ テアーゼ阻害作用（特表 2003— 504402号公報)、筋肉萎縮抑制作用（特開 2002— 338464号公報）、血糖降下作用（特開平 4 253918号公報)など多様な報告がな されている。しかしながら、自己免疫疾患の治療および予防はもちろん、 Thlサイト力 インの産生抑制に関するプロアントシァ-ジンの作用は知られて 、な 、。
発明の概要
[0008] 本発明者らは、特定の植物由来エキスが Thl偏向マウス脾臓細胞において Thlサ イト力インの産生を抑制すること、その効果をもたらす有効成分がポリフエノールの一 種であるプロアントシァ-ジンであること、特定の重合度を有するプロアントシァ-ジ ンが特に Thlサイト力インの産生抑制に有効であること等を見出し、本発明を完成す るに至った。
[0009] 本発明者等はまた、 4量体以上、特に 5量体以上のプロアントシァ-ジンが実験的 自己免疫性脳脊髄炎 (EAE)モデルにお ヽて高 、治療活性を示すこと等を確認した
[0010] 本発明者らはまた、高重合度プロアントシァ-ジンが B細胞の活性ィ匕を抑制するこ と、自己抗体が誘導されたマウスにおいて高重合度プロアントシァ-ジンが自己抗体 の産生を抑制すること等を見出し、本発明を完成するに至った。
[0011] 本発明は、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、インスリン依存型糖尿病をはじめと する Thlサイト力インの産生抑制が治療に有効である疾患や自己抗体の産生抑制が 治療に有効である疾患の治療剤の提供を目的とする。
[0012] 本発明によれば、（i)重合度が 4以上のプロアントシァ-ジン、または（ii)プロアント シァ-ジンを含有する植物素材の抽出物を有効成分として含有してなる、 Thlサイト 力インの産生抑制が治療に有効である疾患および Zまたは自己抗体の産生抑制が 治療に有効である疾患の治療剤、それら疾患の根治治療剤、およびそれら疾患の進 行阻害剤 (以下、「本発明による治療剤」という）が提供される。
[0013] 本発明によればまた、本発明による治療剤の製造のための、（i)重合度が 4以上の プロアントシァ-ジン、または（ii)プロアントシァ-ジンを含有する植物素材の抽出物 の使用が提供される。
[0014] 本発明によれば更に、治療上の有効量の (i)重合度力 以上のプロアントシァ-ジ ン、または (ii)プロアントシァ-ジンを含有する植物素材の抽出物を、必要であれば 薬学上許容される担体とともに哺乳類に投与することを含んでなる、 Thlサイト力イン の産生抑制が治療に有効である疾患および Zまたは自己抗体の産生抑制が治療に 有効である疾患の治療方法、それら疾患の根治治療方法、およびそれら疾患の進行 阻害方法が提供される。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]プロアントシァ-ジンを構成するフラバンィ匕合物の代表成分であるェピカテキン およびカテキン並びにフラバン環 3位水酸基にしばしばエステル付加する没食子酸 の構造式をそれぞれ示した図である。
[図 2]ヒト多発性硬化症モデルマウスの作成とジャトバ腹腔内投与のスケジュールを 示した図である。 [図 3]ヒト多発性硬化症モデルマウスにおける、ジャトバの抗自己免疫疾患活性を臨 床スコアの変動により評価した図である。
[図 4]A :脾臓細胞の産生する Thlサイト力インである IFN— γの産生活性に対するジ ャトバの抑制活性を示した図である。 Β：炎症性サイト力インである TNF— aの産生活 性に対するジャトバの抑制活性を示した図である。「 + MOG」は MOGペプチドを培 養上清中に添カ卩したもの、「一 MOG」は MOGペプチドを培養上清中に添カ卩しな 、も のを意味する。両者の比較により抗原依存的な反応を確認できる。
[図 5]ジャトバの脱髄抑制効果を示した図である。コントロールマウス（Control, Score 3) (発症）とジャトバ投与マウス（50m/kg jatoba, Score 0) (無症状）を第 15日目に剖 検し、脊髄の脱髄の有無を観察した。
[図 6]SJLZJマウスに PLPペプチドを用いて誘導した EAEモデルを第 12日目で剖 検し、脾臓細胞の産生する Thlサイト力インである IFN— γに対するジャトバの産生 抑制活性を示した図である。「 + PLP」は PLPペプチドを培養上清中に添加したもの 、「一 PLP」は PLPペプチドを培養上清中に添カ卩しないものを意味する。両者の比較 により抗原依存的な反応を確認できる。
[図 7]A :ジャトバの予防投与 1回の効果について臨床スコアの変動を示した図である 。 control :コントロール。 Once :—回投与。 B :第 11日目で剖検し、脾臓細胞の産生す る Thlサイト力インである IFN— γへジャトバの予防投与 1回での抑制活性を示した 図である。「 + MOG」は MOGペプチドを培養上清中に添カ卩したもの、「一 MOG」は MOGペプチドを培養上清中に添加しないものを意味する。両者の比較により抗原 依存的な反応を確認できる。
[図 8]PVPP処理したジャトバ抽出物を投与した場合の臨床スコアの変動を示した図 である。
[図 9]脾臓細胞の産生する Thlサイト力インである IFN— yおよび炎症性サイト力イン である TNF— αに対する、ジャトバ抽出物および PVPP処理したジャトバ抽出物の抑 制活性を示した図である。「 + MOG」は MOGペプチドを培養上清中に添カ卩したもの 、「一 MOG」は MOGペプチドを培養上清中に添カ卩しないものを意味する。両者の比 較により抗原依存的な反応を確認できる。 [図 10]A:実施例 7において、ジャトバエタノール抽出物を電子スプレーイオンィ匕質量 分析に供し、プロシア-ジン二量体、三量体、四量体、五量体、そして六量体の分子 イオンピークを観測したことを示した図である。 B :実施例 7において、ジャトバエタノ ール抽出物をマトリックス支援レーザー脱離イオン化—飛行時間型質量分析に供し、 20以上の重合度を有するプロシア-ジンの分子イオンピークが観測されたことを示し た図である。
[図 11]プロアントシァ-ジンを酸性条件下、トルエン α—チオールと共に加熱する反 応であるチオール開裂を模式的に示した図である。
[図 12]ジャトバエタノール抽出物のチオール開裂反応生成物を逆相カラムクロマトグ ラフィで分析したクロマトグラムを示した図である。
[図 13]ジャトバエタノール抽出物中のプロシア-ジンを、メタノールとクロ口ホルムに対 する溶解性の違 ヽを利用して分別沈殿し、重合度別に分画したことを示した図である 。※：プロシア-ジンの平均重合度 Ζ含量0 /0。
[図 14]脾臓細胞の産生する Thlサイト力インである IFN— γに対する、ジャトバエタノ ール抽出物および実施例 9で分画された各画分 (Fr)の抑制活性を示した図である。 「 + MOG」は MOGペプチドを培養上清中に添カ卩したもの、 「一 MOG」は MOGぺプ チドを培養上清中に添加しないものを意味する。両者の比較により抗原依存的な反 応を確認できる。
[図 15]ェピカテキン ベンジルチオールエーテル（EC— BTE)のプロトン (^H) NMR スペクトル（重アセトン、 20°C、 500MHz)であり、構造を同定する図である。
[図 16]ベンジルチオールがフラバン環の 4位に付カ卩していることを証明する、ェピカ テキンーベンジルチオールエーテル（EC— BTE)の HMBCスペクトル（重アセトン、 2 0°C、 500MHz)の図である。
[図 17]EC— BTEを標品として HPLC分析を行ない、さらに各成分をモル換算して計 算したプロシア-ジンの平均重合度と含量％を示す図である。※：プロシア-ジンの 平均重合度 Z含量％。
[図 18]アップルフエノン (登録商標）に含有されるプロシア-ジンを逆相カラムクロマト グラフィで定量分析し、さらに液体クロマトグラフ質量分析によってそのメインピークが 三量体であることを示した図である。
[図 19]巿販標品ェピカテキンガレート (ECG)と精製したェピカテキンガレートーベン ジルチオールエーテル（EC—BTE)を比較するプロトン (^P^ NMR (cd od、 20°C、 6
3
00 MHz)の図である。
[図 20]ベンジルチオールがフラバン環の 4位に付カ卩して!/、ることを証明する、ェピカ テキンガレートーベンジルチオールエーテル（ECG— BTE)の HMBCスペクトル (cd
3 od、 20。C、 600 MHz)の図である。
[図 21]ェピカテキンガレートーベンジルチオールエーテル（ECG— BTE)の HSQC (c d od、 20。C、 600 MHz)であり、フラノくン環 4位、ベンジルチオールの SCH部位の
3 2 カーボンを帰属した図である。
[図 22]巿販標品カテキン (CA)と精製したカテキン ベンジルチオールエーテル (CA —BTE)を比較するプロトン od、 20°C、 600 MHz)の図である。
Figure imgf000009_0001
[図 23]ベンジルチオールがフラバン環の 4位に付カ卩していることを証明する、カテキン —ベンジルチオールエーテル（CA— BTE)の HMBC (cd od、 20°C、 600 MHz)の
3
図である。
[図 24]カテキン ベンジルチオールエーテル（CA— BTE)の HSQC (cd od、 20°C、
3
600 MHz)であり、フラバン環 4位、ベンジルチオールの SCH部位のカーボンを帰
2
属した図である。
[図 25]Discovery (登録商標） HS PEGカラムを用いてプロシア-ジン（実施例 9で 得られた Fr. 5)を重合度別に厳密に分離したことを示す LC MSクロマトグラムの図 である。実線枠は 1価イオンによるピーク同定を、破線枠は 2価イオンによるピーク同 定を、それぞれ示す。丸数字 3、 4、 5、 6、 7、および 8は重合度 3、 4、 5、 6、 7、およ び 8を意味する。
[図 26]Discovery (登録商標） HS PEGカラムを用いてプロシア-ジン（実施例 9と 同様にして調製した Fr. 4)を重合度別に厳密に分離したことを示す LC MSクロマト グラムの図である。実線枠は 1価イオンによるピーク同定を、破線枠は 2価イオンによ るピーク同定を、それぞれ示す。丸数字 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、および 12は 重合度 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、および 12を意味する。 [図 27]Discovery (登録商標） HS PEGカラムを用いてプロシア-ジン（実施例 9と 同様にして調製した Fr. 5)の重合度分布を分析した図である。丸数字 2、 3、 4、 5、 6 、 7、 8、 9、および 10は重合度 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、および 10を意味する。
[図 28]Discovery (登録商標） HS PEGカラムを用いてプロシア-ジン（実施例 9と 同様にして調製した Fr. 4)の重合度分布を分析した図である。丸数字 2、 3、 4、 5、 6 、 7、 8、 9、 10、 11、 12、および 13は重合度 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 および 13を意味する。
[図 29]Discovery (登録商標） HS PEGカラムを用いてプロシア-ジン（実施例 9と 同様にして調製した Fr. 3)の重合度分布を分析した図である。丸数字 2、 3、 4、 5、 6 、 7、 8、 9、 10、 11、 12、および 13は重合度 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 および 13を意味する。
[図 30]EAE臨床スコアへの各種プロシア-ジン含有サンプルの影響を示した図であ る。括弧内の数字は平均重合度を示す。
[図 31]脾臓細胞の産生する Thlサイト力インである IFN— yへの各種プロシア-ジン 含有サンプルの抑制活性を示した図である。「 + MOG」は MOGペプチドを培養上 清中に添カ卩したもの、「一 MOG」は MOGペプチドを培養上清中に添カ卩しな!/、ものを 意味する。両者の比較により抗原依存的な反応を確認できる。
[図 32]脾臓細胞が産生する Thlサイト力インである IFN— a産生活性に対する他素 材の高重合度プロシア-ジン活性を比較した図である。「 + MOG」は MOGペプチド を培養上清中に添加したもの、「一 MOG」は MOGペプチドを培養上清中に添加しな
V、ものを意味する。両者の比較により抗原依存的な反応を確認できる。
[図 33]慢性関節炎誘導モデルマウスの作成とジャトバ腹腔内投与のスケジュールを 示した図である。
[図 34]TypeIIコラーゲン誘導関節炎モデルにおける、ジャトバ腹腔内投与群とコント ロール群の臨床スコアの変動を示した図である。
[図 35]1型糖尿病誘導モデルマウスの作成とジャトバ腹腔内投与のスケジュールを示 した図である。
[図 36]1型糖尿病誘導モデルマウスにおける、インビボにおけるジャトバ腹腔内投与 群とコントロール群の糖尿発症率の変動を示した図である。
[図 37]9週齢で剖検し、脾臓細胞の産生する Thlサイト力インである IFN— γに対す るジャトバの抑制活性を示した図である。
[図 38]1型糖尿病自然発症モデルマウス実験スケジュールを示した図である。
[図 39]1型糖尿病自然発症モデルにおける抗原特異的な脾臓細胞の反応性を、イン スリン依存的な IFN- γ産生活性で示した図である。
[図 40]1型糖尿病自然発症モデルにおける脾臓細胞のポピュレーションを示した図で める。
[図 41]1型糖尿病自然発症モデルにおけるマクロファージの表面抗原発現レベルを 示した図である。
[図 42]1型糖尿病自然発症モデルにおけるジャトバ投与による発症率抑制を示した図 である。
[図 43]ΕΑΕモデルを用い、脾臓細胞における各免疫担当細胞割合の経時変化を示 した図である。
[図 44]ΕΑΕモデルにおける脾臓細胞中のマクロファージの細胞表面抗原発現量を 示した図である。
[図 45]リウマチモデルにおけるジャトバ抽出物、ポリフエノン、ジャトバ抽出物 Fr3の経 口投与の効果を臨床スコアで示した図である。
[図 46]リウマチモデルにおけるジャトバの経口投与の効果を脾細胞の抗原特異的 IF Ν- γ産生量で示した図である。「 +コラーゲン」はタイプ IIコラーゲンを培養上清中 に添加したもの、「一コラーゲン」は添加しないものを意味する。両者を比較することに より抗原依存的な反応を確認できる。
[図 47]リウマチモデルを用い、ジャトバ Fr3の効果について用量依存性を臨床スコア で示した図である。
[図 48]ジャトバ投与の開始時期別に慢性関節炎リウマチスコアを示した図である。
[図 49]慢性関節リウマチにおけるジャトバ抽出物 Fr3による血中抗体価の抑制を示し た図である。
[図 50]脾臓細胞の産生する Thlサイト力インである IFN— γの産生活性に対する各 オリゴマーでの活性を比較した図である。
[図 51]脾臓細胞の産生する Thlサイト力インである IFN— γの産生活性に対する各 オリゴマーでの活性を比較した図である。
[図 52]ジャトバ EtOH抽出物およびポリフエノンの単回投与による体重、摂餌量への 影響を示した図である。
発明の具体的説明
[0016] 有効成分
本発明において有効成分である「プロアントシァ-ジン」とは、カテキン類、すなわち 、フラバン骨格を基本単位とするポリフエノール類をいう。その構成単位としては、例 えば、フラバン 3—オールとしてカテキン、ェピカテキン、ガロカテキン、ェピガロカテ キン、力テキンガレート、ェピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、ェピガロカテキ ンガレート、ェピディステニン（B環に水酸基を有さない）、ァフゼレチン (Afzelechin)、 ェピアフゼレチン（epiafzelechin)が挙げられ、さらにフラバン 4 オール、ロイコアント シァニン（すなわち、フラバン 3, 4—ジオール）、およびアントシァ-ジン等が挙げら れる。
[0017] 3位の水酸基は没食子酸とエステル (ガレート）を形成していてもよぐ 3位以外のい ずれかの部位の水酸基が配糖体あるいはメチルエーテル (メトキシ)を形成して！/、て もよい (図 1参照)。
[0018] プロアントシァ-ジンの構成単位同士の主たる結合部位としては、 4位と 6位または 4位と 8位のいずれか 1箇所 (Bタイプ結合）、あるいは 4位と 8位および 2位と 7位酸素 の 2箇所 (Aタイプ結合）が挙げられるがこれらに限定されるものではなぐまたこれら 結合の立体配置も特に限定されるものではな!/、。
[0019] ある特定の単量体が重合したプロアントシァニジンには慣用名が与えられ、代表的 なプロアントシァ-ジンとしては、 B環（図 1参照）の水酸基の数に応じて定義 ·分類さ れた、プロペラルゴ-ジン（4，一 OH)、プロシア-ジン（3，— OH, 4，— OH)、プロデル フィ-ジン（3，一 OH, 4，一 OH, 5，一 OH)が挙げられる力 プロアントシァ-ジンはこ れらに限定されるものではない。例えば、 A環 5位の水酸基を欠く成分を構成単位と した重合体であるプロガイボールチ-ジン（progu¾ourtinidin)、プロフイセチ-ジン、 およびプロロビネチ-ジンがあり、さらにその他特定部位の水酸基の有無に応じて、 プロテラカシジン、プロメラカシジン、プロアピゲ-二ジン、プロルテオリ-ジン等の慣 用名を持つ成分が挙げられる。
[0020] 本発明にお 、て「プロアントシァ-ジン」は、好ましくは、プロシア-ジンおよびプロ デルフィ-ジンである。「プロシア-ジン」の構成単位は、同一または異なっていても よぐカテキン、ェピカテキン、力テキンガレート、およびェピカテキンガレートから選択 できる。「プロデルフィ-ジン」の構成単位は、同一または異なっていてもよぐガロカ テキン、ェピガロカテキン、ガロカテキンガレート、およびェピガロカテキンガレートか ら選択でさる。
[0021] 本発明にお 、て有効成分として用いる「重合度が少なくとも 4のプロアントシァ-ジ ン」は、好ましくは、重合度が少なくとも 5のプロシア-ジンおよび Zまたはプロデルフ ィニジンであることができる。
[0022] 本発明において用いられるプロアントシァ-ジンは、その重合度が 5以上の場合に 実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE)モデルにお 1ヽて高 ヽ治療活性を示した (実施例 31、図 50)。従って、本発明において用いられるプロアントシァ-ジンの重合度は、 少なくとも 5であることが好ましい。
[0023] 本発明において用いられるプロアントシァ-ジンの重合度の上限は特に限定される ものではないが、プロアントシァ-ジンが植物由来である場合には、 20量体一 30量 体程度のプロアントシァ-ジンが確認されて 、る。またプロアントシァ-ジンを有機合 成する場合には、経済性および合成操作の便宜の観点から 20量体一 30量体程度 を重合度の上限とすることができる。更に、重合度が 5以上のプロアントシァ-ジンに 高い治療活性が認められたことから、プロアントシァ-ジンの重合度の上限を 10量体 程度としても、本発明による効果を期待できる。従って本発明においては、プロアント シァ-ジンの重合度は、 4一 30量体、 4一 20量体、あるいは 4一 10量体とすることが でき、好ましくは、 5— 30量体、 5— 20量体、あるいは 5— 10量体である。また本発明 においては、プロアントシァ-ジンの重合度を、 5— 6量体、 5— 7量体、 5— 8量体、 および 5— 9量体とすることができる。本発明においてプロアントシァ-ジンの重合度 は、例えば、質量分析法（Jan F. Stevens et al.， J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 3435-3443)により測定することができ、具体的には、実施例 7、実施例 16、実施例 1 7、および実施例 19に従って測定することができる。
本発明にお!/、て、プロアントシァ-ジンは式 (I)で表すことができる。
[化 1]
Figure imgf000014_0001
(上記式中、
Figure imgf000014_0002
R6、および R7は、同一または異なっていてもよぐ水素原子
、水酸基、または O— R11 ^11は炭素数 1一 4のアルキル基または糖残基を表す。 ) を表し、 R3および R4は、同一または異なっていてもよぐ水素原子、水酸基、または 基 (II) :
[化 2]
Figure imgf000014_0003
を表し、但し、 R3および R4の両方が水酸基を表すことはなぐ R3および R4の両方が基 (II)を表すことはなぐ nは 4一 30の整数を表し、各構成単位は、 4位と 6位または 4位 と 8位の一力所にお!、て互いに結合して!/、る力、あるいは 4位と 8位および 2位と 7位 の二力所において互いに結合している。 ) 式 (I)中、 R11が表すことがある「炭素数 1一 4のアルキル基」は、好ましくは、メチル 基である。
[0025] 式 (I)中、 R11が表すことがある「糖残基」は、へミアセタール性またはへミケタール性 水酸基と R3または R4の水酸基とのエーテル結合を通じて式 (I)の化合物に結合した 糖を意味する。糖としては、例えば、グルコース、ァロース、アルトロース、マンノース、 グロース、イドース、ガラクトース、タロース、フルクトース、キシロース、リボース、ァラビ ノース、リキソース、ラムノースが挙げられる力 これらに限定されるものではない。
[0026] 式 (I)中、構成単位の 2位、 4位、 6位、または 8位を通じて各構成単位同士が結合 する場合には、 2位、 4位、 6位、または 8位には水素原子の代わりに単結合が存在す る。
[0027] 式 (I)中、構成単位の 7位を通じて各構成単位同士が結合する場合には、 7位には
R2の代わりに、 O—が存在する。
[0028] 式 (I)における各構成単位に存在する置換基は、すべて同一であっても、構成単位 ごとに異なっていてもよい。
[0029] 式 (Π)中の水酸基は、同一または異なっていてもよぐ R11— O— (R11は前記と同義 である）を表すことができる。
[0030] 式 (I)中、各構成単位において、 R1および R2が水酸基または- O-R11を表し、 が 水酸基または O— R11を表し、 R5および R7が水素原子を表すィ匕合物、および R1およ び R2が水酸基を表し、 R6が水酸基を表し、 R5および R7が水素原子を表すィ匕合物は 、プロペラルゴ-ジンに対応する。これらの場合において、 R3および R4いずれか一方 が水酸基または基 (Π)を表し、他方が水素原子を表す場合が好ま U、。
[0031] 式 (I)中、各構成単位において、 R1および R2が水酸基または- O-R11を表し、 お よび R6が水酸基または O— R11を表し、 R7が水素原子を表すィ匕合物、および R1およ び R2が水酸基を表し、 R5および R6が水酸基を表し、 R7が水素原子を表すィ匕合物は 、プロシア-ジンに対応する。これら場合において、 R3および R4いずれか一方が水 酸基または基 (Π)を表し、他方が水素原子を表す場合が好ま 、。
[0032] 式 (I)が表す構成単位のうち
-
Figure imgf000015_0001
および R6が水酸基または- O-R11を表し、 R3が水酸基を表し、 R4お よび R7が水素原子を表す式 (I)の構成単位はカテキンに対応し、
- R5、および R6が水酸基または- O-R11を表し、 R4が水酸基を表し、 お よび R7が水素原子を表す式 (I)の構成単位はェピカテキンに対応し、
- R5、および R6が水酸基または- O-R11を表し、 R3が式 (Π)を表し、 R4およ び R7が水素原子を表す式 (I)の構成単位は力テキンガレートに対応し、
- R5、および R6が水酸基または- O-R11を表し、 R4が式 (Π)を表し、 R3およ び R7が水素原子を表す式 (I)の構成単位はェピカテキンガレートに対応する。
式 (I)中、各構成単位において、 R1および R2が水酸基または O— R11を表し、 R5、 R6、および R7が水酸基または O— R11を表すィ匕合物、および R1および R2が水酸基を 表し、
Figure imgf000016_0001
R6、および R7が水酸基を表すィ匕合物は、プロデルフィ-ジンに対応する。 これら場合において、 R3および R4いずれか一方が水酸基または基 (Π)を表し、他方 が水素原子を表す場合が好まし ヽ。
[0033] 式 (I)が表す構成単位のうち
-
Figure imgf000016_0002
R6、および R7が水酸基または O— R11を表し、 R3が水酸基を表し、 R 4が水素原子を表す式 (I)の構成単位はガロカテキンに対応し、
-
Figure imgf000016_0003
R6、および R7が水酸基または- O-R11を表し、 R4が水酸基を表し、 R 3が水素原子を表す式 (I)の構成単位はェピガロカテキンに対応し、
- R2、 R5、 R6が R7が水酸基または- O-R11を表し、 R3が式 (Π)を表し、 R4が水 素原子を表す式 (I)の構成単位はガロカテキンガレートに対応し、
- R5、 R6、および R7が水酸基または- O-R11を表し、 R4が式 (Π)を表し、 R3 が水素原子を表す式 (I)の構成単位はェピガロカテキンガレートに対応する。
[0034] 式 (I)中、 nはプロアントシァ-ジンの重合度（量体）を表す。 nは好ましくは 5— 30の 整数を表す。 nはまた、 4一 20、 4一 10、 5— 20、 5— 10、 5— 6、 5— 7、 5— 8、 5—9 の整数であることができる。
[0035] 式 (I)における各構成単位の結合様式としては、 Aタイプ結合と Bタイプ結合が挙げ られる。 Aタイプ結合は、各構成単位が 4位と 8位および 2位と 7位の二力所において 互いに結合している結合様式をいう。 Bタイプ結合は、各構成単位が 4位と 6位または 4位と 8位の一力所にぉ 、て互いに結合して 、る結合様式を!、う。本発明にお 、ては 、式 (I)における構成単位同士の結合すベて力 S Aタイプ結合である場合や Bタイプ結 合である場合のみならず、 Aタイプ結合と Bタイプ結合が混在して ヽる場合も含まれる 。各構成単位の結合は、すべて同一であっても、構成単位ごとに異なっていてもよい
[0036] 式 (I)における各構成単位の結合様式の好ま U、例は下記の通りである（カテキン
、ガロカテキン、ェピカテキン、ェピガロカテキンにはガレート体も含まれる）。
[0037] ェピカテキン Zェピガロカテキンー (4 β→8結合)一力テキン Ζガロカテキン；
ェピカテキン Ζェピガロカテキンー (4 β→8結合)ーェピカテキン/ェピガロカテキン カテキン Ζガロカテキンー (4 a→8結合)一力テキン Zガロカテキン；
ェピカテキン Zェピガロカテキンー (4 β→6結合)ーェピカテキン/ェピガロカテキン カテキン Ζガロカテキンー (4 a→6結合)一力テキン Zガロカテキン；
[ェピ力テキン ェピガロカテキンー (4 β→8) ]一ェピカテキン ェピガロカテキン；
2
および
ェピカテキン Ζェピガロカテキンー（2 β→7, 4 β→8結合)一力テキン Ζガロカテキ ン。
[0038] 式 (I)が表すプロアントシァ-ジンのうち好ましい例としては、
各構成単位が、同一または異なっていてもよぐ
-
Figure imgf000017_0001
および R6が水酸基または- O-R11を表し、 R3が水酸基を表し、 R4お よび R7が水素原子を表す (カテキン)か、
- R5、および R6が水酸基または- O-R11を表し、 R4が水酸基を表し、 お よび R7が水素原子を表す (ェピカテキン)か、
- R5、および R6が水酸基または- O-R11を表し、 R3が式 (Π)を表し、 R4およ び R7が水素原子を表す (力テキンガレート)か、
- R5、および R6が水酸基または- O-R11を表し、 R4が式 (Π)を表し、 R3およ び R7が水素原子を表す (ェピ力テキンガレート)か、
-
Figure imgf000017_0002
R6、および R7が水酸基または O— R11を表し、 R3が水酸基を表し、 R 4が水素原子を表す式 (I)の化合物はガロカテキンに対応し、
- R5、 R6、および R7が水酸基または- O-R11を表し、 R4が水酸基を表し、 R 3が水素原子を表す (ェピガロカテキン)か、
- R\ R2、 R5、 R6が R7が水酸基または- O-R11を表し、 R3が式 (Π)を表し、 R4が水 素原子を表す (ガロカテキンガレート）か、
- R5、 R6、および R7が水酸基または- O-R11を表し、 R4が式 (Π)を表し、 R3 が水素原子を表し (ェピガロカテキンガレート）
nが 5— 30の整数を表し、
各構成単位の結合が、同一または異なっていてもよぐ
ェピカテキン Zェピガロカテキンー (4 β→8結合)一力テキン/ガロカテキン； ェピカテキン Ζェピガロカテキンー (4 β→8結合)ーェピカテキン/ェピガロカテキン カテキン Ζガロカテキンー (4 a→8結合)一力テキン Zガロカテキン；
ェピカテキン Zェピガロカテキンー (4 β→6結合)ーェピカテキン/ェピガロカテキン カテキン Ζガロカテキンー (4 a→6結合)一力テキン Zガロカテキン；
[ェピ力テキン ェピガロカテキンー (4 β→8) ]一ェピカテキン ェピガロカテキン；
2
および
ェピカテキン Ζェピガロカテキンー（2 β→7, 4 β→8結合)一力テキン Ζガロカテキ ン
から選択される（但し、カテキン、ガロカテキン、ェピカテキン、ェピガロカテキンには ガレート体も含まれる）、式 (I)の化合物が挙げられる。
[0039] 式 (I)における各構成単位の結合様式の特に好ま 、例は下記の通りである。
[0040] ェピカテキン (4 β→8結合)一力テキン；
ェピカテキン (4 β→8結合)ーェピカテキン；
カテキン (4 a→8結合)一力テキン；
ェピカテキン (4 β→6結合)ーェピカテキン；
カテキン (4 a→6結合)一力テキン； [ェピカテキン (4 β→8) ]ーェピカテキン；および
2
ェピカテキン- (2 |8→7, 4 |8→8結合) -カテキン。
[0041] 式 (I)が表すプロアントシァ-ジンのうち特に好ましい例としては、
各構成単位が、同一または異なっていてもよぐ R\ R2、 R3、 R5、および R6が水酸 基を表し、かつ R4および R7が水素原子を表す (カテキン)力 あるいは R R2、 R4、 R 5、および R6が水酸基を表し、かつ R3および R7が水素原子を表し (ェピカテキン）、 nが 5— 30の整数を表し、
各構成単位の結合が、同一または異なっていてもよぐ
ェピカテキン (4 β→8結合)一力テキン；
ェピカテキン (4 β→8結合)ーェピカテキン；
カテキン (4 a→8結合)一力テキン；
ェピカテキン (4 β→6結合)ーェピカテキン；
カテキン (4 a→6結合)一力テキン；
[ェピカテキン (4 β→8) ]ーェピカテキン；および
2
ェピカテキン一（2 |8→7, 4 |8→8結合)一力テキン
力 選択される、式 (I)の化合物が挙げられる。
[0042] プロアントシァ-ジンは多くの植物に存在する成分であり、植物から抽出することに より調製することができる。プロアントシァ-ジンを植物力も調製するための好ま ヽ 原料としては、ジャトバ、葡萄種子、クランベリー、シナモン、および松榭皮等が挙げ られ、プロアントシァ-ジンの含有量の豊富な点からジャトバがより好ましい。プロアン トシァ-ジンを含有する植物素材としては、例えば、ジャトバ榭皮乾燥粉末 (有限会 社エジソン 'エス ·アール.エル日本事務所）、クランベリー由来抽出物（「クランベリー パウダー」（キッコーマン (株)）、葡萄種子由来抽出物（「グラビノール SL」（キッコーマ ン (株)）、松榭皮由来抽出物 (有限会社素材機能研究所)、カカオ由来抽出物（「力 カオポリフエノール」（明治製菓 (株)）が挙げられ、これらをそのまま、あるいは後述す るように所望の程度に高重合度のものを適宜分画精製し、本発明による有効成分と して用いることができる。
[0043] 従って本発明では、「プロアントシァ-ジンを含有する植物素材の抽出物」を有効 成分として使用することができる。「プロアントシァ-ジンを含有する植物素材の抽出 物」としては、例えば、ジャトバ抽出物、葡萄種子抽出物、クランベリー抽出物、シナ モン抽出物、松榭皮抽出物、カカオ抽出物が挙げられる力 プロアントシァ-ジン (特 に重合度が少なくとも 5のプロシア-ジンおよび Zまたはプロデルフィ二ジン）を含有 する限り、その素材は限定されない。
[0044] 本発明にお 、て有効成分として用いる「プロアントシァ-ジンを含有する植物素材 の抽出物」は、好ましくは、重合度が少なくとも 5のプロシア二ジンおよび Zまたはプロ デルフィ-ジンを含有する植物素材の抽出物であることができる。
[0045] 植物素材に含まれているプロアントシァ-ジンの構成成分を例示すると、表 1の通り である。
[表 1]
Figure imgf000020_0001
※！？ R2, R5, R6は全て OH
(表中、 R1乃至 R7は式 (I)に対応し、 ECはェピカテキンを、 CAはカテキンを、 ECG はェピカテキンガレートを、 EGCGはェピガロカテキンガレートを、 Gはガレートをそれ ぞれ表す。 ) 本発明による有効成分であるプロアントシァ-ジンおよび抽出物を、前述したような 植物原料から分画精製する方法として、具体的には、該植物原料をそのままもしくは 粉砕後、抽出操作に供することによって調製することができる。抽出方法としては、例 えば、溶媒中に植物原料あるいは、その粉砕物などを冷浸、温浸等によって浸漬す る方法;加温し攪拌しながら抽出を行 、、濾過して抽出液を得る方法；またはバーコ レーシヨン法等を挙げられる。得られた抽出液は、必要に応じてろ過または遠心分離 によって固形物を除去した後、使用の態様により、そのまま用いるか、または溶媒を 留去して一部濃縮若しくは乾燥して用いてもよい。また濃縮乃至は乾燥後、さらに非 溶解性溶媒で洗浄して精製して用いても、またこれを更に適当な溶剤に溶解もしくは 懸濁して用いることもできる。更に、本発明においては、例えば、上記のようにして得 られた溶媒抽出液を、減圧乾燥、凍結乾燥等の通常の手段により抽出エキス乾燥物 として使用することもできる。従って、本発明における「抽出物」には、抽出物そのもの のみならず、抽出物の濃縮物や乾燥物も含まれる。
上記抽出に用いられる溶媒としては、例えば、水;メタノール，エタノール，プロパノ ールおよびブタノール等の炭素数 1一 4の低級アルコール；酢酸ェチルエステル等の 低級アルキルエステル；エチレングリコール、ブチレングリコール、プロピレングリコー ル、グリセリンなどのグリコール類；その他ェチルエーテル、アセトン、酢酸等の極性 溶媒；ベンゼンやへキサン等の炭化水素；ェチルエーテルや石油エーテルなどのェ 一テル類等の非極性溶媒の公知の有機溶媒が挙げられる。これら溶媒は、単独で用 いてもよぐ二種以上を組み合わせて使用することもできる。より好ましくは、熱水、ェ タノール、またはアセトン等を用いた抽出方法を挙げることができる。特に、平均重合 度の高いプロアントシァ-ジン画分を分画する場合には、 70%アセトンあるいはエタ ノールによる抽出が有効である。更に特定平均重合度の画分を取得したい場合には 、以下に述べるように 70%アセトンあるいはエタノール抽出物を酢酸ェチル Z水によ り抽出した後、水層画分をメタノールに再溶解し、 Saucierらの方法 (J Agric Food Chem 49, 5732-5735(2001))に従いクロ口ホルムを用いた分画をおこなってもよい。 即ち、プロアントシァ-ジンは重合度が高いほど低い濃度のクロ口ホルムで不溶とな る性質を利用し、クロ口ホルム濃度を適宜変えていくことにより、所望の平均重合度の 画分を得ることができる。従って本発明において「抽出物」は、好ましくは、水抽出物 、エタノール抽出物、またはアセトン抽出物であることができる。
[0047] 上記のような溶媒抽出 Z沈殿操作に加えて、さらに慣用の分画精製手段を採用し ても良い。具体的には、プロアントシァ-ジンを吸着かつ溶離できる吸着剤、例えば スチレンージビュルベンゼン系の合成吸着樹脂、陰イオン交換榭脂、ォクタデシル 基化学結合型シリカゲル (ODS)、ゲルろ過榭脂 (Sephadex LH20など)などが使用 される。これらの吸着剤を充填したカラムに上記の清澄抽出液や清澄果汁液などを 通すことによりプロアントシァ-ジンを吸着させ、洗浄後、それぞれに適した溶出液を 通すことにより、プロアントシァニジンの分画精製を行なうことができる。また、分子量 分画膜を用いた膜分離法等を用いることもできる。
[0048] 各種抽出分画方法は特定重合度のプロアントシァ-ジンのみを得る目的で、あるい は、医薬や食品として用いる場合に安全性、物性、風味等の点で好ましくない成分あ るいは溶媒を除去する目的でも使用することができる。
[0049] 本発明によれば、 Thlサイト力イン産生抑制活性を有する画分の製造法であって、
(a)プロアントシァ-ジンを含有する植物原料を抽出操作に付す工程;および
(b)工程 (a)で得られた抽出画分を限外濾過操作に付して、ケーキ (濾滓)を得るェ を含んでなる、製造法が提供される。
[0050] 工程 (a)の抽出操作および植物原料は前記の通りである。工程 (a)の抽出操作に おいては好ましくは極性溶媒を用いることができ、特に、エタノール、水、含水ァセト ンが好ま 、。植物原料としては好ましくはプロアントシァ-ジンを含有する植物を用 いることがでさる。
[0051] 工程 (a)においては、抽出液を溶媒留去して抽出画分を得、次いで、この抽出画分 を非極性有機溶媒 (例えば、酢酸ェチル) Z水を用いた抽出操作に付すことにより、 水溶性画分とすることができる。あるいは、工程 (a)で得られた抽出画分をそのままェ 程 (b)の限外濾過操作に付してもよ!ヽ。
[0052] 工程 (b)の限外濾過操作においては、 Thlサイト力イン産生抑制活性を有する画 分が限外濾過膜に残存するように (すなわち、限外濾過膜を透過しないように）、カツ トオフ値を設定することができる。 Thlサイト力イン産生抑制活性とプロアントシァ-ジ ンの重合度の関係は上記した通りであり、限外濾過膜を透過する物質の分子量と力 ットオフ値との関係は当業者に周知であることから、当業者であれば製造すべきプロ アントシァ-ジンの種類に応じて限外濾過膜のカットオフ値を適宜設定することがで きる。例えば、少なくとも 5以上の重合度のプロシア-ジンが高い Thlサイト力イン産 生抑制活性を有し、重合度 5のプロシア-ジンの分子量は約 1442であることから、例 えば、カットオフ値を 1400と設定することができる。
[0053] 工程 (b)の後、必要に応じてケーキに含まれるプロアントシァ-ジンの重合度を測 定してもよい。重合度は質量分析法 (Jan F. Stevens et al, J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 3435-3443)により測定することができる。またチオール開裂分析法（ Sylvain uuyot, Nathalie Marnet, ana Jean-Francois Drilleau, J. Agric. Foodし hem. 2001, 49, 14-20)により平均重合度を測定してもよい。プロアントシァ-ジンの重合度 を測定することにより、 Thlサイト力イン産生抑制活性を有する画分の製造を確認す ることがでさる。
[0054] 本発明による有効成分であるプロアントシァ-ジンは、重合度が 4以上、好ましくは 5以上である。従って、植物力もプロアントシァ-ジンを調製する場合、元来重合度が 4以上あるいは 5以上のプロアントシァ-ジンを含有する抽出物の場合はそのまま有 効成分として、あるいは後述実施例に示した活性測定法により活性を指標にするか、 あるいは重合度を指標にして更に有効成分を分画 '精製して使用することができる。 また、平均重合度が 3以下の抽出物についても、後述実施例に示した活性測定法に より活性を指標にする力あるいは重合度を指標にして重合度力 以上の有効成分を 多く含むものを分画 '精製し使用することができる。医薬組成物あるいは食品中にお いて、複数の重合度のプロアントシァ-ジンを含む場合は、平均重合度として 4以下 のものであっても、 4以上の重合度のものを有効量含有している限り本発明の範囲内 であるが、平均重合度が約 4以上のプロアントシァ-ジンをより好ましくは用いることが できる。
[0055] プロアントシァ-ジンは植物からの抽出以外に、有機化学合成により調製してもよ い（例えば、 Swain et al" 1954. Chem Ind, 1144、 Eastmond., 1974. J Inst Brew 80, 188. Kozikowski AP et al, 2003、 J Org Chem 68, 1641-1658、および特表 2002— 542240号公報参照)。
[0056] 纖
本発明にお 、て用いられるプロアントシァ-ジンおよびジャトバ等の特定植物の抽 出物は、 Thl偏向させた脾臓細胞において Thlサイト力イン (具体的には、 IFN— γ )産生を抑制し、細胞性免疫過多の状況を改善'抑制する。従って、本発明による医 薬糸且成物は、 Thlサイト力イン産生の抑制が治療に有効である疾患の治療に有効で める。
[0057] Thlサイト力インの産生抑制が治療に有効である疾患としては、例えば、 Thlサイト 力イン依存型自己免疫疾患が挙げられる。本発明において「Thlサイト力イン依存型 自己免疫疾患」とは、細胞性免疫依存型自己免疫疾患を含む意味で用いられるもの とする。
[0058] Thl依存型自己免疫疾患としては、多発性硬化症 (MS)、慢性関節リウマチ (RA) 、若年性糖尿病や I型糖尿病等のインスリン依存型糖尿病 (IDDM)、自己免疫性甲 状腺炎 (AT)、自己免疫性ブドウ膜網膜炎 (AUR)、橋本病、乾癬症、クローン病、 および円形脱毛症が挙げられる。
[0059] Thl依存型自己免疫疾患では、炎症局所へのリンパ球 (Thl細胞）の浸潤や血中 での Thlサイト力イン（例えば、 IFN— γや TNF—ひ）の濃度亢進が認められている（ Skurkovich B & Skurkovich S, Curr Opin Mol Ther. 2003 Feb;5(l):52— 7; Fuss, I.J., et al, J. Immunol. 157: 1261(1996); Gherardo M., et al, European Journal of Endocrinology(2003) 148 383-388)。更に、抗 IFN— γ抗体ゃ抗 TNF— α抗体を使 用することにより自己免疫疾患の症状が実際に改善することが報告されている（ Skurkovich B & Skurkovich S, Curr Opin Mol Ther. 2003 Feb;5(l):52- 7)。従って、 これらの疾患の原因因子である Thlサイト力イン（例えば、 IFN- γや TNF— a )を抑 制することは、これらの疾患の治療に有効である。
[0060] 本発明にお 、て用いられる高重合度プロアントシァ-ジンは、自己抗体が誘導され たマウスにおいて自己抗体の産生を抑制する（実施例 30)。本発明において用いら れる高重合度プロアントシァニジンを含有する抽出物は、自己抗体産生と密接な関 連性を有する B細胞の活性化を抑制する（実施例 25)。従って、本発明による医薬組 成物は、自己抗体の産生抑制や B細胞の活性化の抑制が治療に有効である疾患の 治療に有効である。
[0061] 自己抗体の産生抑制や B細胞の活性ィヒの抑制が治療に有効である疾患としては、 自己抗体媒介型自己免疫疾患 (例えば、全身性エリテマトーデス、グッドパスチヤ一 症候群、自己免疫性溶血性貧血、シエーダレン症候群、急性リウマチ熱、尋常性天 疱瘡、自己免疫性血小板減少性紫斑病、および混合型本態性クリオグロブリン血症 )が挙げられる。
[0062] 自己抗体媒介型自己免疫疾患では、自己抗体の産生ある!/、は産生亢進や、 B細 胞の活性化が認められている（Clin.Exp.Immunol., 1985:62:639-46;
N.Engl.J.Med.,338:1359)。更に、 B細胞の活性化の抑制が自己抗体産生に起因す る自己免疫疾患の治療に有効であること（Int. Immunol.,2001:13(7):921-31) ,自己反 応性 B細胞の増殖阻害と全身性エリテマトーデスの改善が一致すること（
J.Clin.Invest.,2000:106(l):91-101)が報告されている。従って、これらの疾患の原因 因子である自己抗体の産生を抑制することや自己抗体の産生に密接に関連する B 細胞の活性ィ匕を抑制することは、これらの疾患の治療に有効である。本発明におい て「自己抗体の産生抑制」とは、自己抗体の産生と密接に関連する B細胞の活性ィ匕 の抑制を含む意味で用いられるものとする。
[0063] 本発明にお!/、て用いられるプロアントシァ-ジンは Thlサイト力インの産生を抑制 することができる。従って本発明は、 Thlサイト力インの産生が本質的な原因である 疾患を根治でき、あるいはその疾患の進行を阻害できる点で、対症療法的に用いら れる治療剤よりも有利である。特に慢性関節リウマチについては、炎症の抑制や痛み の軽減と 、つた対症療法的に用いられる従来の治療剤とは異なり、根治治療すること あるいは疾患の進行を阻害することが可能となる点で、本発明は有利であると言える 。プロアントシァ-ジンによる慢性関節リウマチの根治治療は、実施例 28および 29に おいて慢性関節リウマチモデルマウスにおいて臨床スコアが改善されたとともに、実 施例 30においてリウマチ抗体（自己抗体)の産生が抑制されたことからも裏付けられ ている。また、プロアントシァ-ジンによる慢性関節リウマチの病状の進行阻害は、実 施例 28および 29において慢性関節リウマチモデルマウスにおいて一次免疫成立後 においても臨床スコアが改善されたとともに、実施例 30においてリウマチ抗体（自己 抗体)の産生が抑制されたことからも裏付けられて 、る。
[0064] 慢性関節リウマチにおいては、疾患の初期において T細胞 (具体的には Thl細胞） が活性化され、それに伴って症状が発現しはじめること、疾患の中期あるいは慢性期 において、活性ィ匕した T細胞により B細胞の自己抗体産生が促され、異常に産生され た自己抗体により症状の慢性化、重篤化に至ることが報告されている（Cin Exp Immunol 1998; 111:521—526; Springer Semin Immunopathol. 2003 Aug;25(l):3— 18; Immunol Rev. 1990 Dec;118:193- 232)。またマウスにおいて IgGレベルを低下させる ことによりリウマチが抑制されたことが報告されている（Ann Rheum
Dis. ,2003, 62:707-14) o上記のようにプロアントシァ-ジンは Thlサイト力インを抑制し 、 Thl細胞の活性ィ匕を抑制するとともに、 Thl細胞活性ィ匕により刺激された自己抗体 であるリウマチ抗体の産生を実際に抑制した。また本発明による有効成分は、自己抗 体産生と密接な関連性を有する B細胞の活性化を抑制した。従って、本発明におい て用いられるプロアントシァ-ジンは、慢性関節リウマチの初期の病状のみならず、 慢性化、重篤化した病状の治療に用いることができる点でも有利である。
[0065] 従って本発明によれば、（i)重合度が 4以上のプロアントシァ-ジン (好ましくは、重 合度が 5以上のプロシア-ジンおよび Zまたはプロデルフィ-ジン）、または（ii)プロ アントシァ-ジン (好ましくは、重合度が 5以上のプロシア-ジンおよび Zまたはプロ デルフィ-ジン)を含有する植物素材の抽出物を有効成分として含んでなる、慢性関 節リウマチの根治治療剤およびその進行阻害剤が提供される。
[0066] 本発明によればまた、治療上の有効量の (i)重合度力 以上のプロアントシァ-ジ ン（好ましくは、重合度が 5以上のプロシア-ジンおよび Zまたはプロデルフィ-ジン） 、または（ii)プロアントシァ-ジン (好ましくは、重合度が 5以上のプロシア-ジンおよ び Zまたはプロデルフィ-ジン）を含有する植物素材の抽出物を、必要であれば薬 学上許容される担体とともに哺乳類に投与することを含んでなる、慢性関節リウマチ を根治治療する方法およびその進行を阻害する方法が提供される。
[0067] 本発明によればまた、慢性関節リウマチの根治治療剤およびその進行阻害剤の製 造のための、（i)重合度が 4以上のプロアントシァ-ジン (好ましくは、重合度が 5以上 のプロシア-ジンおよび Zまたはプロデルフィ-ジン）、または（ii)プロアントシァ-ジ ン（好ましくは、重合度が 5以上のプロシア-ジンおよび Zまたはプロデルフィ-ジン） を含有する植物素材の抽出物の使用が提供される。
[0068] 本発明において「治療」とは、疾患の改善、調節、遅延、予防 (特に、発症の予防お よび再発予防)を含む意味で用いられる。
[0069] 医 糸且) ^ ぉよび食。 糸且
本発明による治療剤は、前述した本発明による有効成分であるプロアントシァ-ジ ン、あるいは、それを含有した植物エキスゃ該エキスからの部分精製物を、有効成分 として用い、生理学的に許容されうる担体、賦形剤、結合剤、希釈剤などと混合する ことにより製造できる。本発明による治療剤は、経口または非経口的に投与すること ができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤 (糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤 、シロップ剤、乳剤、懸濁剤が挙げられる。非経口剤としては、注射剤（例えば、皮下 注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤)、点滴剤、外用剤 (例えば、 経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤)、坐剤 (例えば、直腸坐剤、膣坐剤)が挙げられ る。これらの製剤は、当分野で通常行われている手法により、薬学的に許容される担 体 (例えば、賦形剤、添加剤）とともに製剤化することができる。薬学的に許容される 賦形剤や添加剤としては、担体、結合剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、 乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられる。薬学的に許容される担体とし ては、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラタトース 、ぺクチン、デキストリン、澱粉、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリウム力 ルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、カカオバター等が挙げられる。
[0070] 製剤は、例えば下記のようにして製造できる。
[0071] 経口剤は、有効成分として、例えば賦形剤（例えば、乳糖、白糖、デンプン、マンニ トール）、崩壊剤（例えば、炭酸カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム） 、結合剤（例えば、 α化デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリビ ニールピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース）または滑沢剤（例えば、タルク、ステ アリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール 6000)を添カ卩して圧縮成形し、次いで 必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性の目的のため自体公知の方法 でコーティングすることにより製造することができる。コーティング剤としては、例えば ェチノレセノレロース、ヒドロキシメチノレセノレロース、ポリオキシエチレングリコーノレ、セノレ ロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートおよびオイ ドラギット（ローム社製、ドイツ、メタアクリル酸 ·アクリル酸共重合物）などを用いること ができる。
[0072] 注射剤は、有効成分を分散剤（例えば、ツイーン (Tween) 80 (アトラスパウダー社 製、米国）、 HCO 60 (日光ケミカルズ製）、ポリエチレングリコール、カルボキシメチ ルセルロース、アルギン酸ナトリウムなど）、保存剤（例えば、メチルパラベン、プロピ ルパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フエノール）、等張化剤（例えば 、塩ィ匕ナトリウム、グリセリン、ソルビトール、ブドウ糖、転化糖)などと共に水性溶剤（ 例えば、蒸留水、生理的食塩水、リンゲル液等)あるいは油性溶剤（例えば、ォリーブ 油、ゴマ油、綿実油、コーン油などの植物油、プロピレングリコール)などに溶解、懸 濁あるいは乳化することにより製造することができる。この際、所望により溶解補助剤（ 例えば、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン） 、無痛化剤（例えば、塩ィ匕ベンザルコ-ゥム、塩酸プロ力イン)等の添加物を添加して ちょい。
[0073] 外用剤は、有効成分を固状、半固状または液状の組成物とすることにより製造する ことができる。例えば、上記固状の組成物は、有効成分をそのまま、あるいは賦形剤（ 例えば、ラタトース、マン-トール、デンプン、微結晶セルロース、白糖)、増粘剤（例 えば、天然ガム類、セルロース誘導体、アクリル酸重合体)などを添加、混合して粉状 とすること〖こより製造できる。上記液状の組成物は、注射剤の場合とほとんど同様にし て製造できる。半固状の組成物は、水性または油性のゲル剤、あるいは軟骨状のも のがよい。また、これらの組成物は、いずれも pH調節剤（例えば、炭酸、リン酸、タエ ン酸、塩酸、水酸ィ匕ナトリウム）、防腐剤 (例えば、ノ ラオキシ安息香酸エステル類、ク ロロブタノール、塩化ベンザルコ-ゥム）などを含んでいてもよい。坐剤は、有効成分 を油性または水性の固状、半固状あるいは液状の組成物とすることにより製造できる 。該組成物に用いる油性基剤としては、高級脂肪酸のグリセリド〔例えば、カカオ脂、 ウイテプゾル類 (ダイナマイトノーベル社製)〕、中級脂肪酸〔例えば、ミグリオール類（ ダイナマイトノーベル社製)〕、あるいは植物油（例えば、ゴマ油、大豆油、綿実油）が 挙げられる。水性基剤としては、ポリエチレングリコール類、プロピレングリコールが挙 げられる。また、水性ゲル基剤としては、天然ガム類、セルロース誘導体、ビニール重 合体、アクリル酸重合体が挙げられる。
製剤化に当たっては、本発明による有効成分以外の 1種またはそれ以上の医療上 有効な有効成分を更に添加 ·配合してもよ!ヽ。また本発明による有効成分の投与に 当たっては、本発明による有効成分以外の 1種またはそれ以上の医療上有効な有効 成分を組み合わせて投与してもよい。このような他の有効成分としては、抗炎症剤、 消炎鎮痛剤、免疫抑制剤、その他の自己免疫疾患治療剤が挙げられるが、これらに 限定されるものではない。抗炎症剤としては、ステロイド抗炎症剤、非ステロイド抗炎 症剤が挙げられる。ステロイド抗炎症剤としては、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、 酢酸パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾロン、メチルプレドニン、デキサメタゾン、 トリアムシノロン、ベタメタゾンが挙げられる。非ステロイド抗炎症剤としては、ァスピリ ン、ジフル-サル、アスピリン'ァスコルビン酸、アスピリンダイアルミネートなどのサリ チル酸系非ステロイド抗炎症剤；ジクロフェナクナトリウム、スリンダク、フェンブフェン 、インドメタシン、インドメタシンフアルネシル、ァセメタシン、マレイン酸プログルメタシ ン、アンフエナクナトリウム、ナブメトン、モェゾラク、エトドラグなどのァリール酸系非ス テロイド抗炎症剤;メフエナム酸、フルフエナム酸アルミニウム、トルフエナム酸、フロク タフェニンなどのフエナム酸系非ステロイド抗炎症剤；イブプロフェン、フルルビプロフ ェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、プラノプロフェン、フエノプロフェンカルシウム、チ ァプロフェン、ォキサプロジン、ロキソプロフェン、ナトリウム、アルミノプロフェン、ザル トプロフェンなどのプロピオン酸系非ステロイド抗炎症剤；ピロキシカム、アンピロキシ カム、テノキシカム、ロルノキシカム、メロキシカムなどのォキシカム系非ステロイド抗 炎症剤;塩酸チアラミド、ェピリゾール、ェモルファゾンなどの塩基性非ステロイド抗炎 症剤が挙げられる。免疫抑制剤としては、サイクロスポリン、 FK506が挙げられる。そ の他の自己免疫疾患治療剤としては、インターフ ロン βなどの多発性硬化症治療 剤が挙げられる。 [0075] 本発明による有効成分を、抗炎症剤、消炎鎮痛剤、免疫抑制剤などの他の有効成 分と組み合わせることにより、治療活性がより強化された多機能性治療剤を提供する ことができる。特に、本発明による有効成分を、抗炎症剤や消炎鎮痛剤などの自己免 疫疾患の対症療法に用いられる薬剤と併用することにより、自己免疫疾患の根本治 療と対症治療が期待できる治療剤を提供することができる。また、本発明による有効 成分を、免疫抑制剤などの根本治療が期待される薬剤と組み合わせることにより、自 己免疫疾患の根本治療効果が強化された治療剤を提供することができる。慢性関節 リウマチの治療に当たっては、本発明による有効性成分をコンドロイチンやムコ多糖 を主成分とするダルコサミンと組み合わせてて投与してもよい。
[0076] 本発明による治療剤は、医薬品への適用のみならず、食品への適用も意図されて いる。従って、本発明による治療剤の食品への適用に当たっては、後述するような食 品に関する記述を参照することができる。
[0077] 本発明による食品は、本発明による有効成分であるプロアントシァ-ジンを有効量 含有した食品である。ここで「有効成分を有効量含有した」とは、個々の飲食品にお V、て通常喫食される量を摂取した場合に、後述するような範囲で有効成分が摂取さ れるような含有量を!、う。本発明による食品には本発明による有効成分をそのままあ るいは上記のような組成物の形態で、食品に配合することができる。より具体的には、 本発明による食品は、前述した本発明による有効成分であるプロアントシァ-ジン、 あるいはそれを含有した植物抽出物ゃ該抽出物力もの部分精製物をそのまま、飲食 品として調製したもの、各種タンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類等を更に 配合したもの、液状、半液体状若しくは固体状にしたもの、ペースト状のもの、一般の 飲食品へ添加したものであってもよい。本発明において「食品」は、医薬以外のもの であって、哺乳動物が摂取可能なものであればその形態に特に制限はな 、。
[0078] 本発明において「食品」とは、健康食品 (例えば、特定保健用食品、栄養機能食品 、栄養補助食品）、機能性食品、病者用食品を含む意味で用いられる。
[0079] また「食品」の形態は特に限定されるものではなぐ例えば、飲料の形態であっても よい。
[0080] 本発明によれば、重合度が少なくとも 4のプロアントシァ-ジンを、成人 1人 1日当た り 50— 2000mg (好ましくは、 400— 2000mg)の摂取量となるように含んでなる、健 康食品が提供される。
[0081] 本発明によればまた、重合度が少なくとも 5のプロアントシァ-ジンを、成人 1人 1日 当たり 50— 2000mg (好ましくは、 400— 2000mg)の摂取量となるように含んでなる 、健康食品が提供される。
[0082] 上記健康食品に含有されるプロアントシァ-ジンは、ジャトバ抽出物、葡萄種子抽 出物、クランベリー抽出物、シナモン抽出物、松榭皮抽出物、およびカカオ抽出物か らなる群力も選択される抽出物であって、重合度が少なくとも 4あるいは少なくとも 5の プロアントシァ-ジンを含む抽出物の形態で提供されてもよい。
[0083] 上記健康食品はまた、通常の食品の形状であっても、栄養補助食品の形状 (例え ば、サプリメント）であってもよい。
[0084] 本発明による有効成分は、 Thl偏向させた脾臓細胞において Thlサイト力イン (具 体的には、 IFN— γ )の産生を抑制し、細胞性免疫過多の状況を改善'抑制作用を 有する。本発明による有効成分はまた、自己抗体が誘導されたマウスにおいて自己 抗体の産生を抑制する。このため、日常摂取する食品やサプリメントとして摂取する 健康食品や機能性食品に本発明の有効成分あるいはジャトバ等の抽出物を添加' 配合することにより、 Thlサイト力イン産生抑制機能、自己抗体産生抑制機能、また は Thlサイト力イン産生増大に関連する状態や自己抗体産生に関連する状態の改 善または緩和機能、特に自己免疫疾患の治療機能を併せ持つ食品を提供すること ができる。
[0085] 従って、本発明によれば、（i)重合度が少なくとも 4のプロアントシァ-ジン (好ましく は、重合度が少なくとも 5のプロシア-ジンおよび Zまたはプロデルフィ-ジン）、また は (ii)プロアントシァ-ジンを含有する植物素材の抽出物 (好ましくは、重合度が少な くとも 5のプロシア-ジンおよび Zまたはプロデルフィ-ジンを含有する植物素材の抽 出物）を有効成分として含む、 Thlサイト力イン産生抑制機能、自己抗体産生抑制機 能、または Thlサイト力イン産生増大に関連する状態や自己抗体産生に関連する状 態 (例えば、 Thlサイト力イン依存型自己免疫疾患や自己抗体媒介型自己免疫疾患 に特徴的な全身の強張りや関節の違和感)の改善または緩和機能が表示された食 品が提供される。このような表示は、食品の本体、容器、包装、説明書、添付文書、ま たは宣伝物の 、ずれかに付すことができる。
[0086] 本発明によれば、（i)重合度が少なくとも 4のプロアントシァ-ジン (好ましくは、重合 度が少なくとも 5のプロシア-ジンおよび Zまたはプロデルフィ-ジン）、または（ii)プ 口アントシァ-ジンを含有する植物素材の抽出物 (好ましくは、重合度が少なくとも 5 のプロシア-ジンおよび Zまたはプロデルフィ-ジンを含有する植物素材の抽出物） を有効量含んでなる食品であって、 Thlサイト力インの産生抑制が治療に有効である 疾患および Zまたは自己抗体の産生抑制が治療に有効である疾患の治療、それら の疾患の根治治療、および Zまたはそれらの疾患の進行阻害に用いられる食品が 提供される。
[0087] 本発明によればまた、（i)重合度が少なくとも 4のプロアントシァ-ジン (好ましくは、 重合度が少なくとも 5のプロシア-ジンおよび Zまたはプロデルフィ-ジン）、または（ii )プロアントシァニジンを含有する植物素材の抽出物 (好ましくは、重合度が少なくと も 5のプロシア-ジンおよび Zまたはプロデルフィ-ジンを含有する植物素材の抽出 物）を有効量含んでなる食品であって、 Thlサイト力イン産生抑制機能、 Thlサイト力 イン産生増大に関連する状態の改善または緩和機能、自己抗体産生抑制機能、ま たは自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和機能を有する食品が提供され る。
[0088] 本発明によれば更に、（ii)プロアントシァニジンを含有する植物素材の抽出物であ つて、 Thlサイト力イン産生抑制機能、 Thlサイト力イン産生増大に関連する状態の 改善または緩和機能、 自己抗体産生抑制機能、または自己抗体産生に関連する状 態の改善または緩和機能を有する抽出物を含んでなる食品が提供される。
[0089] 本発明による食品は、 Thlサイト力イン産生抑制機能、自己抗体産生抑制機能、ま たは Thlサイト力イン産生増大に関連する状態や自己抗体産生に関連する状態の 改善または緩和機能等の機能を期待する消費者に適した食品、すなわち、特定保 健用食品、として提供することができる。ここでいう特定保健用食品とは、 Thlサイト力 イン産生抑制、 自己抗体産生抑制、または Thlサイト力イン産生増大に関連する状 態や自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和等を目的として食品の製造ま たは販売等を行う場合に、保健上の観点から、各国において法上の何らかの制限を 受けることがある食品をいう。
[0090] 本発明の有効成分あるいはジャトバ等の抽出物の添加'配合の対象である日常摂 取する食品としては、飯類、麵類、パン類およびパスタ類等炭水化物含有飲食品;ク ツキ一やケーキなどの洋菓子類、饅頭や羊羹等の和菓子類、キャンディ一類、ガム 類、ヨーグルト、プリン、ゼリーなどの冷菓や氷菓などの各種菓子類;ジュースや清涼 飲料水、乳飲料等の各種飲料;卵を用いた加工品、魚介類 (イカ、タコ、貝、ゥナギな ど)ゃ畜肉（レバー等の臓物を含む)の加工品（珍味を含む)などを例示することがで きるが、これらに特に制限されない。
[0091] 本発明のより好ましい態様によれば、添加'配合の対象である食品としては、飲料（ 例えば、茶飲料、乳飲料)、ヨーグルトが挙げられる。
[0092] ここで茶飲料とは、ツバキ科の常緑樹である茶榭の葉 (茶葉）、または茶榭以外の 植物の葉もしくは穀類等を煎じて飲むための飲料をいい、発酵茶、半発酵茶および 不発酵茶のいずれも包含される。茶飲料の具体例としては、 日本茶（例えば、緑茶、 麦茶）、紅茶、ハーブ茶 (例えば、ジャスミン茶）、中国茶 (例えば、中国緑茶、烏龍茶 )、ほうじ茶等が挙げられる。
[0093] ここで乳飲料とは、生乳、牛乳等またはこれらを原料として製造した食品を主原料と した飲料をいい、牛乳等そのもの材料とするものの他に、例えば、栄養素強化乳、フ レーバー添加乳、加糖分解乳等の加工乳を原料とするものも包含される。
[0094] またヨーグルトには、ハードタイプ、ソフトタイプ、ドリンクタイプのいずれのものも包 含され、さらにヨーグルトを原料とする加工ヨーグルト製品も包含される。
[0095] 本発明の有効成分あるいはジャトバ等の抽出物の添加'配合の対象である日常摂 取する食品としてはまた、プロアントシァ-ジンを元来含有する食品が挙げられる。本 発明の有効成分あるいはジャトバ等の抽出物を、プロアントシァ-ジンを元来含有す る食品に添加'配合することにより、 Thlサイト力イン産生抑制機能、自己抗体産生 抑制機能、または Thlサイト力イン産生増大に関連する状態や自己抗体産生に関連 する状態の改善または緩和機能を強化することができる。ここで「強化」とは、食品に 当初力 含まれている有効成分の量が、期待される機能の発現に必要とされる量以 上となるように本発明による有効成分あるいは抽出物を添加 ·配合することを 、う。ま た、「プロアントシァ-ジンを元来含有する食品」としては、例えば、クランべリージュ ースゃクランベリージャムなどのクランベリー製品；チョコレート菓子、ココアなどの力力 ォ製品；シナモンスティック、シナモンシュガー、シナモンガム、シナモンティーなどの シナモン製品が挙げられる力 これらに限定されるものではない。
本発明の有効成分あるいはジャトバ等の抽出物の添加'配合の対象であるサブリメ ントとして摂取する健康食品や機能性食品の形態としては、例えば、ジュースや茶の ような飲料、ゼリー、カプセル、顆粒剤、粒剤、ペーストが挙げられる。本発明の有効 成分あるいはジャトバ等の抽出物を、単独で、あるいは他の成分 (例えば、植物素材 )と組み合わせて、飲料、ゼリー、カプセル、顆粒剤、粒剤、ペーストなどの形態にカロ ェすることによりで、 Thlサイト力イン産生抑制機能、自己抗体産生抑制機能、また は Thlサイト力イン産生増大に関連する状態や自己抗体産生に関連する状態の改 善または緩和機能を有するサプリメントなどの健康食品や機能性食品として提供する ことができる。特に、本発明による有効成分以外の成分であって、抗炎症作用、消炎 鎮痛作用、または免疫抑制作用があるとされる他の成分と組み合わせることによって 、 Thlサイト力イン産生増大に関連する状態や自己抗体産生に関連する状態の改善 または緩和機能をより強化することができる。抗炎症作用、消炎鎮痛作用、または免 疫抑制作用があるとされる他の成分は公知の成分から選択することができる。抗炎症 作用を有する成分としては、ァリシン、カブサイシン、ブロメリン、硫ィ匕ァリルが挙げら れる。これらの成分は植物素材に含まれており、例えば、ァリシンを含む植物素材と しては、玉ねぎ、にら、にんにく、ユラ、葉ねぎが、カプサイシンを含む植物素材として は、唐辛子が、ブロメリンを含む植物素材としては、パイナップルが、硫化ァリルを含 む植物素材としては、あさつき、にんにぐエシャロット、ねぎ、葉ねぎ、ユラ、らつきよう 力 それぞれ挙げられる。また、免疫抑制作用を有する成分としてはグリチルレチン 酸が挙げられ、グリチルレチン酸を含む植物素材としては、カンゾゥが挙げられる。ま た、リウマチに効果があるとされる雷公藤; I型糖尿病に効果があるとされる人参湯;多 発性硬化症に効果があるとされるカンラン:乾癬症に効果があるとされる Polvpodium Leucotomos等の植物素材を組み合わせることができる。また、本発明による機能以 外の機能を発揮する他の成分あるいは他の機能性食品と組み合わせることによって 、多機能性の食品を提供することができる。
[0097] 本発明にお 、て提供される飲料 (飲料形態の健康食品や機能性食品を含む)の製 造に当たっては、通常の飲料の処方設計に用いられている糖類、香料、果汁、食品 添加剤などを適宜添加することができる。飲料の製造に当たってはまた、当業界に公 知の製造技術を参照することができ、例えば、「改訂新版ソフトドリンクス」（株式会社 光琳)を参考とすることができる。
[0098] 本発明の好ま 、態様によれば、重合度が少なくとも 5のプロアントシァ-ジン (好ま しくは、重合度が少なくとも 5のプロシア-ジンおよび Zまたはプロデルフィ-ジン）を 、 Thlサイト力イン産生抑制機能、自己抗体産生抑制機能、または Thlサイト力イン 産生増大に関連する状態や自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和機能 の強化等を目的として、プロアントシァ-ジンを元来含有する食品へ添加'配合する ことができる。
[0099] 本発明による有効成分または抽出物を、そのまま食用に供する場合や、あるいは一 般食品の原料に添加'配合して食品とする場合は、有効成分の苦みが食品の味に 影響しない範囲で用いるか、または苦味がマスクされるような工夫をすることが好まし い。例えば、有効成分または抽出物を、カプセルに注入する力、あるいは適当なコー ティング剤でコーティングすることにより、苦味をマスクすることができる。カプセル化さ れた形態としてはゼラチンカプセル、プルランカプセルが挙げられる。コーティングさ れた形態としては糖衣錠が挙げられる。
[0100] 本発明による食品は様々な形態を取ることができ、公知の医薬品の製造技術に準 じて本発明による食品を製造してもよい。その場合には、本発明による治療剤の製造 の項目において述べたような担体や製剤用添加剤を用いて製造することができ、具 体的には、経口剤の欄に記載された担体や製造用添加剤を用いて製造することが できる。
[0101] 本発明による有効成分であるプロアントシァ-ジンは、人類が食品として長年摂取 してきたカカオゃブドウ類に多く含まれていることから、毒性も低ぐ哺乳動物 (例えば 、ヒト、マウス、ラット、ゥサギ、ィヌ、ネコ、ゥシ、ゥマ、ブタ、サル等）に対し安全に用い ることがでさる。
[0102] 本発明による治療剤および食品を投与あるいは摂取する場合、本発明による有効 成分の投与量または摂取量は、受容者、受容者の年齢および体重、症状、投与時 間、剤形、投与方法、薬剤の組み合わせ等に依存して決定できる。例えば、本発明 による有効成分を医薬として経口投与する場合、プロアントシァ-ジン量として成人 1 人 1日当たり 50— 5000mg、好ましくは 50— 2000mg、非経口的に投与する場合は 5— 500mg、好ましくは 5— 200mgの範囲で投与することができる。本発明による有 効成分と組み合わせて用いる他の作用機序を有する薬剤も、それぞれ臨床上用いら れる用量を基準として適宜決定できる。また、食品として摂取する場合には、成人 1 人 1曰当たり 50— 5000mgの範囲、好ましくは 50— 2000mgの範囲の摂取量となる よう本発明による有効成分を食品に配合することができる。
[0103] 本発明による治療剤の好ましい態様によれば、（i)重合度が少なくとも 5のプロシア 二ジンおよび Zまたはプロデルフィ-ジン、または（ii)重合度が少なくとも 5のプロシア 二ジンおよび Zまたはプロデルフィ-ジンを含有する植物素材の抽出物を有効成分 として含んでなる、 Thlサイト力インの産生抑制が治療に有効である疾患 (特に、 Thl サイト力イン依存型自己免疫疾患)の治療剤、それらの疾患の根治治療剤、およびそ れらの疾患の進行阻害剤が提供される。
[0104] 本発明の好ましい態様によればまた、 Thlサイト力インの産生抑制が治療に有効で ある疾患 (特に、 Thlサイト力イン依存型自己免疫疾患）の治療剤、それらの疾患の 根治治療剤、およびそれらの疾患の進行阻害剤の製造のための、（i)重合度が少な くとも 5のプロシア-ジンおよび Zまたはプロデルフィ-ジン、または（ii)重合度が少な くとも 5のプロシア-ジンおよび Zまたはプロデルフィ-ジンを含有する植物素材の抽 出物の使用が提供される。
[0105] 本発明の好ましい態様によればまた、治療上の有効量の (i)重合度が少なくとも 5 のプロシア-ジンおよび Zまたはプロデルフィ-ジン、または（ii)重合度が少なくとも 5 のプロシア-ジンおよび Zまたはプロデルフィ-ジンを含有する植物素材の抽出物 を、必要であれば薬学上許容される担体とともに哺乳類に投与することを含んでなる 、 Thlサイト力インの産生抑制が治療に有効である疾患 (特に、 Thlサイト力イン依存 型自己免疫疾患)の治療方法、その疾患の根治治療方法、およびその疾患の進行 阻害方法が提供される。
[0106] Thlサイト力インの産牛.抑制剤および自己抗体産牛.抑制剤
本発明によれば、（i)重合度が少なくとも 4のプロアントシァ-ジン (好ましくは、重合 度が少なくとも 5のプロシア-ジンおよび Zまたはプロデルフィ-ジン）、または（ii)プ 口アントシァ-ジンを含有する植物素材の抽出物 (好ましくは、重合度が少なくとも 5 のプロシア-ジンおよび Zまたはプロデルフィ-ジンを含有する植物素材の抽出物） を有効成分として含んでなる、 Thlサイト力インの産生抑制剤が提供される。
[0107] 本発明によればまた、 Thlサイト力インの産生抑制剤の製造のための（i)重合度が 少なくとも 4のプロアントシァ-ジン (好ましくは、重合度が少なくとも 5のプロシア-ジ ンおよび/またはプロデルフィ-ジン）、または（ii)プロアントシァ-ジンを含有する植 物素材の抽出物 (好ましくは、重合度が少なくとも 5のプロシア-ジンおよび Zまたは プロデルフィ-ジンを含有する植物素材の抽出物）の使用が提供される。
[0108] 本発明によればまた、有効量の（i)重合度が少なくとも 4のプロアントシァ-ジン (好 ましくは、重合度が少なくとも 5のプロシア-ジンおよび Zまたはプロデルフィ-ジン） 、または (ii)プロアントシァ-ジンを含有する植物素材の抽出物 (好ましくは、重合度 が少なくとも 5のプロシア-ジンおよび Zまたはプロデルフィ-ジンを含有する植物素 材の抽出物）を哺乳類に投与することを含んでなる、 Thlサイト力インの産生抑制方 法が提供される。
[0109] Thlサイト力インは、好ましくは、 IFN— γである。
[0110] Thlサイト力インの産生抑制剤は、 Thlサイト力インの産生抑制を目的とした医薬 品への適用のみならず、 Thlサイト力インの産生抑制を目的とした食品への適用も意 図されている。従って、本発明による Thlサイト力インの産生抑制剤の実施に当たつ ては、前記のような治療剤に関する記述および食品に関する記述を参照することが できる。
[0111] 本発明によれば、（i)重合度が少なくとも 4のプロアントシァ-ジン (好ましくは、重合 度が少なくとも 5のプロシア-ジンおよび Zまたはプロデルフィ-ジン）、または（ii)プ 口アントシァ-ジンを含有する植物素材の抽出物 (好ましくは、重合度が少なくとも 5 のプロシア-ジンおよび Zまたはプロデルフィ-ジンを含有する植物素材の抽出物） を有効成分として含んでなる、 自己抗体の産生抑制剤が提供される。
[0112] 本発明によればまた、自己抗体の産生抑制剤の製造のための、（i)重合度が少なく とも 4のプロアントシァ-ジン（好ましくは、重合度が少なくとも 5のプロシア-ジンおよ び Zまたはプロデルフィ-ジン）、または（ii)プロアントシァ-ジンを含有する植物素 材の抽出物 (好ましくは、重合度が少なくとも 5のプロシア-ジンおよび Zまたはプロ デルフィ-ジンを含有する植物素材の抽出物）の使用が提供される。
[0113] 本発明によればまた、有効量の（i)重合度が少なくとも 4のプロアントシァ-ジン (好 ましくは、重合度が少なくとも 5のプロシア-ジンおよび Zまたはプロデルフィ-ジン） 、または (ii)プロアントシァ-ジンを含有する植物素材の抽出物 (好ましくは、重合度 が少なくとも 5のプロシア-ジンおよび Zまたはプロデルフィ-ジンを含有する植物素 材の抽出物)を哺乳類に投与することを含んでなる、自己抗体の産生抑制方法が提 供される。
[0114] 自己抗体の産生抑制剤は、自己抗体の産生抑制を目的とした医薬品への適用の みならず、自己抗体の産生抑制を目的とした食品への適用も意図されている。従つ て、本発明による自己抗体の産生抑制剤の実施に当たっては、前記のような治療剤 に関する記述および食品に関する記述を参照することができる。
[0115] 檢定方法
本発明によれば、試料中のプロアントシァ-ジンの重合度を測定する工程を含んで なる、 Thlサイト力イン産生抑制活性の検定方法であって、 4以上の重合度のブロア ントシァ-ジンの検出が Thlサイト力イン産生抑制活性を示すことを特徴とする方法 が提供される。
[0116] 検定の対象である試料としては、例えば、植物原料由来の抽出物や乾燥粉末が挙 げられる。植物原料としては、プロアントシァ-ジンを含む植物原料のみならず、プロ アントシァ-ジンの含有が不明な植物原料も含まれる。抽出物としては、例えば、水 や有機溶媒による抽出物が挙げられる。
[0117] 検定の対象である試料としてはまた、合成されたプロアントシァ-ジンやプロアント シァ-ジンが含有されているか不明な試料が挙げられる。 [0118] プロアントシァ-ジンの重合度は、例えば、電子スプレーイオン化質量分析法 (ESI -MS)やマトリックス支援レーザー脱離イオン化 -飛行時間型質量分析法 (MALDI -TOF-MS)により測定することができる。
[0119] 本発明による検定方法では、試料中に 5以上の重合度のプロアントシァ-ジンが含 まれているか否かを指標にすることができる。実施例 31および図 50に示されたように 、重合度が 5以上のプロアントシァ-ジンは EAEモデルマウスにお!ヽて高 、治療活 性を示す。従って、このような指標を採用することにより、試料が強い Thlサイト力イン 産生抑制活性を有する力否かを検定することができる。
[0120] 本発明による検定方法ではまた、 Thlサイト力インの産生抑制が治療に有効である 疾患の治療活性の検定に用いることができる。
実施例
[0121] 以下実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によりそ の技術的範囲が限定されるものではな 、。
[0122] 実施例 l :Thl偏向マウス脾臓細胞を用いた各糠アマゾンハーブ抽出物の IFN— /
牛. 制能の枪討
一連のアマゾンハーブについて Thl偏向させたマウスの脾臓細胞を用いて、インビ トロにおける IFN- γ産生抑制能を検討した。
[0123] 1.実験方法
(1)試料
サマンノ ィゾ Poiypodium lepidopteris)、ンャトノ (Hvmenaea courbarn)、 = ャッック ロー (Uncaria tomentosa 、シジゥム (Psidium guaiava)、ヘルコンサッテャ (
Dracontium loretense Krause)の巿販乾燥粉末（有限会社エジソン ·エス ·アール ·ェ ル日本事務所） 10gにエタノールを 200mL加え、一晩攪拌した。ろ過後、溶媒を留 去し、エタノール抽出物を得た (表 2)。抽出物をそれぞれ 1%エタノールに溶解し、 投与試料とした。
[0124] 表 2 :本発明の実施例において、サマンバイァ、ジャトバ、キヤッックロー、シジゥム、 そしてへルゴンサッチヤのエタノール抽出物重量を示す。
[表 2]
Figure imgf000040_0001
(2)実験動物
6—8週齢、雄性、 C57BL/6マウス (チャールズリバ一社）に第 0日目と第 7日目に 卵白アルブミン（OVA、生化学工業 (株)） lmgを complete freund' s adjuvant (シグマ 社）に Mycobacterium tuberculosis H37 Ra(Difco社）を 0. 8mg添カ卩したもの（以下、 CFAと表記する。 )に混合し、ェマルジヨンィ匕したものを腹腔内投与した。第 14日目 に解剖し、常法に従い、脾細胞を調製した。
[0126] (3)脾細胞 IFN— γの測定
IFN— γの測定は OptEIA ELISA Set (ベタトン 'デイツキンソン社）を用いて測 疋した。
[0127] (4)実験条件
実験動物の方法で調製した脾細胞を RPMI 1640 (シグマ社） + 10% FCS (ロシ ュ社） + lmg OVA培地で 5 X 106細胞 Zmlになるように懸濁し、 200 μ lZゥエルで 96穴プレートに分注した。さらに試験する各ハーブ抽出物を 100あるいは 500 gZ mlで添加した。 1週間後に培養上清を回収し、 Thlサイト力インとして IFN— γを測定 した。
[0128] 2.実験結果
結果を表 3に示す。サマンバイァには IFN— γ産生抑制能は見られず、むしろ上昇 した。他のハーブ抽出物でも同様な IFN— γ産生の上昇が見られた。ジャトバでのみ
、顕著な IFN— γ産生抑制が見出された。
[0129] 表 3 :Thl偏向させたマウスの脾臓細胞を用いて、抗原特異的に産生された Thlサイ トカインである IFN— γに対する各種アマゾンノヽーブの抑制、または亢進活性を示す
[表 3]
00 (Ji 3 ID CD
L
Q
〇 LO 〇 LO
ω 00 rvi
CD
i O
\
a
寸 O 寸
〇
D 寸
O
1
1
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D ヽ Λ
- λ "π
Λ ヽ Λ
Π ,ヽ (
実施例 2：インビトロにおけるジャトバ抽出物 IFN- y抑制活性の濃度依存件枱討 実験 1によって IFN— y抑制活性をインビトロで示したジャトバ抽出物にっ 、て濃度 依存性を検討した。 [0131] 1.実験方法
(1)投与試料
ジャトバ乾燥粉末 lOOgに 500mLのエタノールを加え、ー晚、室温で攪拌した。ろ 過後、残渣を再度同量エタノールで抽出した。ろ液を濃縮乾固し、 27. 2gのエタノー ル抽出物を得た。抽出物を 1%エタノールに溶解し、投与試料とした。
[0132] (2)実験動物
実施例 1と同様に OVAを CF Aでェマルジヨン化したものを C 57BLZ6に 2回免疫 し、 Thl偏向マウスを作製した。
[0133] (3)脾細胞 IFN— γの測定
IFN— γの測定は OptEIA ELISA Set (ベタトン 'デイツキンソン社）を用いて測 疋した。
[0134] (4)実験条件
脾細胞は RPMI1640 (シグマ社） + 10% FCS (ロシュ社） + 100 μ g/ml OVA 培地で 37°C、 5%COの条件で 1週間培養し、培養上清を回収し、 IFN - γ濃度測
2
定を行った。ジャトバ抽出物の添加濃度は 0 (コントロール）、 15. 5, 31, 62. 5, 125 , 250, 500 μ gZmlとした。
[0135] 2.実験結果
7日後の培養上清中 IFN- γ濃度を表 4に示す。コントロール (ジャトバ無添加）で O VA添カ卩によって強い IFN— γ産生が見られた。ジャトバ濃度依存的に IFN— γ産生 は抑制され、 125 gZml以上で殆ど産生は見られなくなった。以上の結果、ジャト バはインビト口において Thlサイト力インを抑制する活性があることが示された。これ は細胞性免疫過多によって起こる自己免疫疾患の予防 '治療に有効である可能性を 示す。
[0136] 表 4 :Thl偏向させたマウスの脾臓細胞を用いて、抗原特異的に産生された Thlサイ トカインである IFN— γに対するジャトバの抑制活性の容量依存性を示す。
[表 4]
Figure imgf000044_0001
[0137] 実施例 3： 験 § ^m ^ (EAE)モデルを用いたジャトバ ¾ίΒ·のイン ビボでの効果 I
ジャトバ抽出物のインビボでの効果を明らかにするために、実験的自己免疫性脳脊 髄炎（ΕΑΕ)モデルマウスで検討した。 ΕΑΕモデルマウスは、ヒト多発性硬化症のモ デルとして用いられている（Antel JP., 1999. J Neuroimmunol 100, 181-189)。
[0138] 1.実験方法
(1)投与試料
実施例 2で調製したものを用いた。
[0139] (2)実験動物
C57BL/6,雄性、 6—8週齢のマウスに対して、第 0日目に Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide (以下「MOGペプチド」と表記する：キアゲン社） 200 μ gを CF A 800 /z gと混合して、ェマルジヨンィ匕したものを皮下投与し、第 1日目と第 3日目に 百日咳毒素（PTX: Calbiochem社) 200ngを腹腔内投与することにより実験的自己免 疫性脳脊髄炎を誘導した。試験期間を通じてマウスは標準固形飼料 CE— 2 (アメリカ 国立栄養研究所による標準組成)を供与された。飲用水は水道水を用いた。
[0140] (3)実験条件
C57BL/6,雄性、 6— 8週齢を 1群 10匹でコントロール群、 20mgZkg群、 50mg Zkg群、および 50mgZkg前投与群に分けた。コントロール群は第 0日目に MOG 抗原投与後、第 30日目まで週 3回 1%エタノールを腹腔内投与した。 20mgZkg群 、 50mg/kg群は第 0日目に MOG抗原投与後、第 30日目まで週 3回ジャトバを所 定量投与した。 50mgZkg前投与群は MOG抗原投与 2週間前力も合計 7回ジャトバ を 50mgZkgで投与し、抗原感作後は 1%エタノールに切り替えた。実験スケジユー ルを図 2に示す。
[0141] (4)臨床スコアのつけ方
スコア 0 :正常、スコア 1 :尾の麻痺、スコア 2 :正向不全、スコア 3 :後肢片方麻痺、ス コア 4：両後肢麻痺、スコア 5：前後肢麻痺、スコア 6：死亡で、第 55日目まで毎日各 個体の臨床スコア（clinical score)を記録した。
[0142] (5) Ex vivo IFN— γ , TNF— α産生能測定 第 12日目で各群 5匹を解剖し、脾細胞を調製した。脾細胞は RPMI1640 (シグマ 社） + 10% FCS (ロシュ社）士 MOG2 μ Μで培養し、 1週間培養後の上清につ!ヽ て IFN- y濃度を、 10日後培養上清にっ ヽて TNF- a濃度を測定した。 IFN- y、 TNF— αの測定は OptEIA ELISA Set (ベタトン'ディッキンソン社）を用いた。
[0143] (6)脊髄病理切片の作製と脱髄の観察
脊髄の脱髄がジャトバによって抑制されるかを検討するために、組織切片の作製と 観察を行った。第 15日目のコントロール群およびジャトバ群のマウスから脊髄を摘出 し、 20%のホルマリン溶液中で固定後、パラフィン包埋して 5 μ m切片をミクロトーム RM2145 (ライカ社）にて作製した。切片を脱パラフィン後、ルクソールファストブルー 溶液 (武藤化学薬品社)で髄鞘染色し、水洗い後、コールドシッフ試薬で細胞質を染 色した。最後にへマトキシリンで核を染色し、顕微鏡下で観察した。
[0144] 2.実験結果
臨床スコアの平均値の経時変化グラフを図 3に示す。コントロール群では第 9日目 で発症が始まり、第 16日目で平均スコアが 3. 5を上回った。 20mgZkg群では第 15 日目近辺で発症が始まり、第 21日目前後でピークの平均スコア 1. 5になったが、そ の後症状は回復した。 50mgZkgでは発症しな力つた。また、 50mgZkg前投与群 では第 30日目前後で発症し、第 41日目にピークの平均スコアが 2程度になったが、 その後回復した。以上の結果、ジャトバは明確な EAE発症抑制効果を持つ事が明ら 力になった。また EAE誘導前に投与しておくと、発症が 3週間遅延するという予防効 果もあることが明らかになった。
[0145] Ex vivoサイト力イン産生量を図 4に示す。 IFN— γについてはコントロール群で 6 0, 000pg/mlと高濃度の産生力見られて!/ヽる力 20mg/kg群で ίま 30, OOOpg/ ml前後と半減し、 50mgZkg群では 5000pgZml前後と激減した。 TNF- αについ ても、コントロール群で 180pgZml前後であつたの力 20mgZkg群で l lOpgZml 前後と減り、 50mgZkg群で 20pgZml前後と激減した。さらに、脊髄切片のルクソ一 ルファストブルー染色による観察結果を図 5に示した。コントロール群脊髄切片写真 を見ると、脱髄による青く染色されない個所 (切片写真中の組織右側個所)が観察さ れるのに対し、ジャトバ群ではそのような脱髄が抑制されていることが明らかである。 以上の結果はジャトバが Thlサイト力イン産生を強く抑制し、 EAEの症状を抑制した ことを示している。
[0146] 実施例 4： EAEモデルを用いたジャトバ柚出物のインビボでの効果 II
実施例 3の効果がマウス種によらな 、ことを示す為、実施例 3とは異なったマウス種 を用いて、実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE)モデルによる検討を行った。
[0147] 1.実験方法
(1)投与試料
実施例 2で調製したものを用いた。
[0148] (2)実験動物
SJL/J,雄性、 8— 10週齢のマウス (購入先:チヤ一ルスリバ一社）に対して、 Proteolipid protein peptide (以下「PLPペプチド」と表記する：キアゲン社） 100 μ gを CFA 800 gにェマルジヨン化したものを皮下投与し、第 1日目と第 3日目に PTX2 OOngを腹腔内投与することにより実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導した。飼料およ び飲用水は実施例 3と同様のものを用いた。
[0149] (3)実験条件
SJL/J,雄性、 8— 10週齢を 1群 10匹でコントロール群、 50mgZkg群を設定した。 抗原およびジャトバ抽出物の投与法 ·時期は実施例 3の実験に準じた。
[0150] (4) Ex vivo IFN— γ , TNF— α産生能測定
実施例 3と同様に実施した。但し、培養時に添加する抗原は 2 MPLPペプチドと した。
[0151] 2.実験結果
前記実施例 3とは異なったマウス種である SJLZJにおいても、図 6に示すように ex vivoでの IFN— γ産生はジャトバ投与によって殆ど見られなくなっており、ジャトバの ΕΑΕ抑制効果はマウス種によらないことが明らかになった。
[0152] 実施例 5 : ΕΑΕモデルを用いたジャトバ抽出物単回前投与によるインビボでの効果
ジャトバ投与による ΕΑΕ発症予防について単回前投与による検討を行なった。
[0153] 1.実験方法
(1)投与試料 実施例 2のジャトバエタノール抽出物を用いた。
[0154] (2)実験動物
実施例 3で示した C57BLZ6マウスを MOG抗原で免疫する方法で EAEを誘導し た。一群は 10匹で、第 12日目に半数を解剖した。
[0155] (3)実験条件
ジャトバ 50mg/kgを、第 0日目に MOG抗原を投与する前である第一 1日目に、一 回腹腔内投与する。
[0156] (4) Ex vivo IFN— γ産生能測定
第 12日目で 5匹を解剖し、脾細胞を調製した。脾細胞は RPMI1640 (シグマ社） + 10% FCS (ロシュ社）士 MOG2 μ Μで培養し、 1週間培養後の上清について IFN — 0濃度を測定した。 IFN— γの測定は OptEIA ELISA Set (ベタトン'ディツキン ソン社)を用いた。
[0157] 2.実験結果
EAEの臨床スコア平均値の経時変化では、コントロール群が第 9日目に発症した のに対して、 1回前投与した場合 2日の遅れが観察された（図 7A)。以上の結果、前 記実施例 3の複数回前投与よりは効果が劣るものの 1回投与のみでも効果が認めら れた。本実施例および前記実施例 3の前投与の結果を踏まえると、回数の増加と共 に予防効果は増大することが示唆された。脾細胞の IFN— γ産生能は 1回予防投与 でも、著しく減少することが示された (図 7Β)。
[0158] 実施例 6 :ジャトバ柚出物の成分枪討 (I)
ジャトバ抽出物の活性成分の特性を明らかにするために、ジャトバ抽出物をポリビ 二ルポリピロリドン (PVPP)で吸着処理し、非吸着画分の活性を実験的自己免疫性 脳脊髄炎 (ΕΑΕ)モデルで検証した。
[0159] 1.実験方法
(1)投与試料
実施例 2のジャトバエタノール抽出物 3. 49gを水 500mLに溶解し、ポリビニルポリ ピロリドン (PVPP シグマ社) 50gをカ卩えて一晩攪拌した。その後吸引濾過し、凍結 乾燥を行ない、 420. 3mgの PVPP処理物、すなわち PVPP非吸着画分を得た。 [0160] (2)実験動物
実施例 3で示した C57BLZ6マウスを MOG抗原で免疫する方法で EAEを誘導し た。一群は 10匹で、第 12日目に半数を解剖した。
[0161] (3)実験条件
コントロール群は第 30日目まで週 3回 1 %エタノールを腹腔内に注射した。ジャトバ 群はジャトバエタノール抽出物を、ジャトバ PVPP処理群は PVPP処理したジャトバエ タノール抽出物をそれぞれ週 3回、 50mg/kgで投与した。
[0162] (4) Ex vivo IFN— γ , TNF— α産生能測定
第 12日目で各群 5匹を解剖し、脾細胞を調製した。脾細胞は RPMI1640 (SIGM A) + 10% FCS (ロシュ）士 MOG2 μ Μで培養し、 1週間培養後の上清について IF N— y濃度を、 10日後培養上清にっ ヽて TNF— a濃度を測定した。 IFN— y、 TNF — αの測定は OptEIA ELISA Set (ベタトン'ディッキンソン）を用いた。
[0163] 2.実験結果
結果を図 8に示す。コントロール群は第 13日目に発症し、ジャトバ群は第 21日目ま で発症しなかった。ジャトバ PVPP処理群は第 15日目に発症した。脾細胞の IFN— y , TNF— α産生能はジャトバ群では顕著に抑制された力 ジャトバ PVPP処理群で は殆どコントロール群と変わらな力つた（図 9)。以上の結果、 PVPP処理によってジャ トバの活性は著しく減弱しており、従って、ジャトバの活性成分は PVPPに吸着するこ とが明らかになった。 PVPPはポリフエノールを強力に吸着する性質を有し、ポリフエ ノールの除去剤として知られている（Loomis, W.D., Battaile, J., 1966. Phytochem. 5, 423-438., Loomis, W.D. , 1969. In: Lowenstein, J.M. , (Ed.), Methods in
enzymology Vol. 13. Academic Press, New York, pp. 555—563. Loomis, W.D., 1974. In: Fleischer, S., Packer, L., (Eds.), Methods in enzymology Vol. 31. Academic Press, New York, pp. 528-544.)。ジャトバエタノール抽出物の 88%が PVPPに吸着 したことから、ジャトバ抽出物の 88%はポリフエノールであり、そして活性成分もポリフ ェノールである可能性が示唆された。
[0164] 実施例 7：ジャトバ柚出物の成分枪討 (II)
実施例 6より、ジャトバの活性成分はポリフエノールである可能性が示唆された。活 性本体をさらに追求する目的で、ジャトバエタノール抽出物について以下の実験を 実施した。
[0165] 1.実験方法
(1)塩酸ーブタノール法
ジャトバエタノール抽出物を文献（J. Agric. Food Chem.1998, 46, 1698-1705)の 方法に従い、塩酸ーブタノール法に供した。すなわちジャトバエタノール抽出物の 4m g/mLメタノール溶液を調製し、その 250 Lに、 5%塩酸を含む 1ーブタノール 1.5 mLと、 2%硫酸アンモ-ゥムを含む 2N塩酸 50 μ Lを添カ卩し、 95°Cで 50分反応させ た。反応液を室温に戻し、 550nmにおける吸光度を測定した。測定の対照には、ジ ャトバエタノール抽出物 4mgZmL (メタノール溶液）を用いた。
[0166] (2)順相カラムクロマトグラフィ (NP-HPLC)
ジャトバエタノール抽出物を文献（journal of Chromatography A.1993.255-260) の方法に従い、 NP— HPLCに供した。ポンプおよび制御装置は Shimazu
LC-10Advp、 UV検出器は Shimazu SPD- 10Aを用いた。カラム条件を以下に示す。
[0167] カラム： Finepak SIL— 5 φ 4.6 X 250mm (日本分光）
移動相：
(A) MeOH:CH C1： HCOOH:H 0 = 7:41:1:13
2 2 2
(B) MeOH:CH CI： HCOOH:H 0 = 43:7:1:1
2 2 2
移動相グラジ ント条件：
時間 (分） A溶媒 (％) B:
0 95 5
10 85 15
35 80 20
37 77 23
40 77 23
42 70 30
45 50 50
46 0 100 移動相流速： lmLZ分
検出波長： 280nm
(3)電子スプレーイオン化質量分析 (ESI— MS)
ジャトバエタノール抽出物を ESI— MSに供した。装置はサーモクエスト社 LCQを用 いた。測定条件は、インフュージョン法、陰イオンモード、流速 6 μ 1Ζ分， Sheath gas flow rate 60 arb, bpray voltage 4.5 kV, Capillary temp 200。しとした。
[0168] (4)マトリックス支援レーザー脱離イオン化—飛行時間型質量分析 (MALDI-TOF- MS)
ジャトバエタノール抽出物を MALDI— TOF— MSに供した。装置は PerSeptive Biosystems, voyagerを用い、マトリックスとして 2, 5—ジヒドロキシ安息香酸（DHB)を 用いた。
[0169] 2.実験結果
(1)プロアントシァ-ジンは酸性条件下における加熱処理により、フラバン間の結合 が切断され、エクステンションユニットに由来するカルべ-ゥムイオンと、ターミナルュ ニットに由来する力テキン類を与える。前者はさらに酸ィ匕されて赤色のアントシァ-ジ ンになる。この原理を利用した呈色法が塩酸ーブタノール法であり、 550nmにおける 吸光度の上昇をして試料中のプロアントシァ-ジンを鋭敏に検出できる。本法によつ てジャトバエタノール抽出物は赤色化し、 550nmにおける吸光度は 2. 72となった。 このこと力ら、ジャトバに含有されるポリフエノールはプロアントシァ-ジンであることが 明らかとなった。
[0170] (2) NP— HPLCは、プロアントシァ-ジンのオリゴマー成分を溶出ピークとして検出 することができる。しかし、より高重合度の成分はカラムに強く吸着されるために、溶 出後半に特徴的なブロード型のクロマトグラムを与える。ジャトバエタノール抽出物の クロマトグラムは 8本の溶出ピークと、それに続く特徴的なブロード形状を示したので 、プロアントシァ-ジンのオリゴマーのみならず、より高重合度成分の存在を示唆した
[0171] (3) ESI— MSでは装置の測定限界として分子量 2000までの成分しか観測できなか つたが、図 10Aに示すように、 288ずつ増加していく分子イオンピークが 5本観測さ れた。すなわちジャトバのプロアントシァ-ジンは、分子量 288の繰り返し構造を有し ていた。この分子量はカテキンまたはェピカテキンに相当し、かつガレートの付加が ないことを示す。以上のことから、ジャトバエタノール抽出物の主成分はプロアントシ ァニジンのうち、プロシア二ジンであることが明ら力となった。
[0172] (4) MALDI— TOF— MSでは、 ESI— MSでは観測することができなかった、さらなる 高分子領域に属する高重合度プロシア-ジンの存在が確認された。すなわち図 10B に示したように、プロシア-ジン 20量体以上にまで及ぶ分子イオンピークが観測され た。
[0173] ¾ 列 8 :ジャトバ抽出物の成分檢^ KTTT)
実施例 7により、ジャトバのエタノール抽出物の主成分がプロシア-ジンであること が示された。構成単位の同定、結合様式、重合度の算出、および定量分析を精密に 行なう目的で、 Guyotらの方法 (Sylvain Guyot, Nathalie Marnet, and Jean-Francois Drilleau, J. Agric. Food Chem. 2001 , 49, 14-20)に基づき、チオール開裂分析を行 なった。
[0174] 1.実験方法
( 1)チオール開裂、逆相液体クロマトグラフィー (RP— HPLC)分析
ジャトバエタノール抽出物を 4mgZmLのメタノール溶液に調製し、その 25 Lに 3 . 3%塩酸含有メタノールを 25 μ L、 5%トルエン aーチオール（シグマ社） 50 μ Lを 添加し、 40°Cで 30分反応させた後、反応液をそのまま RP— HPLCに供し、分析した 。ポンプは HITACHI L-7100、 UV検出器は Shimazu SPD- 10Aを用いた。カラム条件 を以下に示す。
[0175] カラム：ディスカバリー 018 φ 4. 6 X 250 mm (スペルコ社）
移動相：（A) 2. 5%酢酸 Z水 (vZv)、 （B)ァセトニトリル
移動相グラジ ント条件：
時間 (分） A溶媒 (％) B溶媒 (％)
0 97 3
5 91 9 15 84 16
45 50 50
55 0 100
移動相流速: 0. 6mLZ分
検出波長： 280nm
(2)液体クロマトグラフ質量分析 (LC-MS)による反応物の同定
チオール開裂反応液中にはトルエン aーチオールが残存するために、反応液を そのまま LC— MSに供することができな 、。そこでまず ( 1)の RP— HPLCにお!/ヽてそ れぞれのピークを分取し、 LC MSに供した。 LC部分のポンプは Waters 2690 allianceを使用し、検出は多波長検出器 (Waters 996)で行なった。カラム条件を以下 に示す。
[0176] カラム： YMC Pack 018 4. 6 X 250 mm
移動相：（A) l %HCOOHZ水（vZv)、 (B) MeOH
移動相グラジ ント条件：
時間 (分） A溶媒 (％) B溶媒 (％)
0 90 10
5 84 16
45 50 50
50 0 100
移動相流速： lmLZ分
検出波長： 200— 400nm
MSのイオン化モードは ESIとし、装置は Waters micromass ZQ2000を用いた。
[0177] (3)トルエン aーチオール付カ卩に伴うモル吸光係数（ ε )値の補正
ェピカテキンにトルエン α—チオールが付カ卩することに伴う 280 nmにおける ε値 の変化を、ェピカテキンニ量体であるプロシア-ジン Β2を用いて算出した。すなわち プロシア-ジン Β2を（1)の条件でチオール開裂し、 RP— HPLC分析に供した。
[0178] (4)平均重合度の算出と定量分析
( 1)、 （2)、および（3)の結果に基づき、ジャトバエタノール抽出物に含まれるブロア ントシァ-ジンの平均重合度と含量を算出した。
[0179] 2.実験結果
( 1)図 1 1に示すように、プロアントシァ-ジンはチオール開裂によって、ターミナルュ ニットに由来する単量体成分と、エクステンションユニットに由来するべンジルチオェ 一テル付加体を与えるので、これらを RP— HPLCで分離、同定、定量することができ る。ジャトバエタノール抽出物のチオール開裂を行なった結果、図 12に示すように、 2 1. 6分と 42. 8分に 2本のピークが認められた。前者はェピカテキン (EC)と溶出位置 がー致した。これら 2本以外には、いかなるピークをも与えな力つた。
[0180] Aタイプ結合はチオール開裂反応で開裂せず、残存する。そのため、もし Aタイプ 結合があれば、チオール開裂により、 Aタイプで結合した二量体のベンジルチオエー テル付加体が生成され、 RP - HPLCで検出される。チオール開裂分析の結果より、 ジャトバのプロシア-ジンには Aタイプ結合は存在せず、従って Bタイプ結合のみで 構成されていることが明らかとなった。
[0181] (2) ( 1)で検出されたピークを LC MSによって同定した。すなわちこれら 2本のピー クは、プロシア-ジン B2のチオール開裂産物である EC、および ECのべンジルチオ エーテル付加体 (EC— BTE)と LC溶出位置および分子量がそれぞれ一致した。 ( 1) と（2)の結果から、ジャトバのプロシア-ジンは ECのみを構成単位とすることが明らか となった。
[0182] (3)プロシア-ジン B2をチオール開裂に供すると、ターミナルユニットに由来する EC と、エクステンションユニットに由来する EC— BTEを等モル比で生成する。 RP-HPL Cで検出される両成分の 280nmにおける吸光度すなわちピーク面積値を比較するこ とにより、 ECにトルエン α—チオールが付カ卩することに伴う 280nmにおける ε値の 変化を算出した。その結果、 ECの ε： EC BTEの ε = 1 : 1. 2であった。
[0183] (4) (3)の結果に基づき、ジャトバエタノール抽出物に含まれるプロシア-ジンの平均 重合度を、以下のように計算した。
[0184] 平均重合度 = (T+EZl . 2) ΖΤ
Τ=ターミナルユニットのピーク面積
Ε =エクステンションユニットトルエン a—チオール付カ卩体のピーク面積 その結果、ジャトバエタノール抽出物中に含まれるプロシア-ジンの平均重合度は
、 6. 8と算出された。
[0185] チオール開裂反応生成物である ECと EC— BTEを定量分析することによって、ジャ トバエタノール抽出物中のプロシア-ジン含量を求めることができる。定量分析に必 要なチオール開裂の反応率は、プロシア-ジン B2を外部標準として用い、生成した ECを定量することで求めた。反応率は概して 83%であった。その結果、ジャトバエタ ノール抽出物中のプロシア-ジン含量を 76. 0% (w/w)と算出した。
[0186] 実施例 9：ジャトバのプロシア二ジンの分画 ·分析
実験方法および結果
(1)抽出および分画
ジャトバ巿販乾燥粉末 20gにエタノール (EtOH) 500mLを加え、ー晚、室温で攪 拌した。ろ過後、残渣を再度同量 EtOHで抽出した。ろ液を濃縮乾固し、抽出物 6. 9 7gを得た。この抽出物を lOOmLの水に再溶し、等量の酢酸ェチルで 3回抽出した。 それぞれを溶媒留去し、水画分 5. 93g、酢酸ェチル画分 894mgを得た。水画分を メタノール（MeOH)に再溶し、 Saucierらの方法（J. Agric. Food Chem., 2001. 49: 5732- 5735)に基づき、クロ口ホルム（CHC1 )を順次カ卩え、生じた沈殿を分別した。
3
本法により、プロシア-ジンを重合度別に分画することができる。酢酸ェチル画分は C18カラムによる固相抽出を行ない、さらに 2つの画分に分別した。すなわち最初に ジェチルエーテル（DEE)で溶出して Fr. 7を、次いで MeOHで溶出して Fr. 6を得 た。それぞれの画分の重量を図 13に示した。
[0187] (2)ジャトバ抽出物ならびに各画分の分析
得られた分画物につ!、て、プロシア-ジンの平均重合度と含量をチオール開裂分 析により算出した (方法は実施例 8を参照)。図 13に示した通り、本法によって平均重 合度を異にするプロシア-ジン画分を容易に調製することができた。
[0188] 実施例 10： EAEモデルを用いたジャトバ由来分画サンプルの IFN— y抑制活性
実施例 9で分画されたサンプルを EAEモデルマウスに腹腔内投与し、脾細胞の IF N— γ抑制活性を検討した。
[0189] 1.実験方法 (1)投与試料
実施例 2のジャトバエタノール抽出物および実施例 9で分画された分画物 Fr. 1-7 を使用した。
[0190] (2)実験条件
C57BL/6,雄性、 6週齢を 1群 3匹でコントロール群、ジャトバ群（未分画）、 Frl - Fr 7群に分けた。コントロール群は第 0日目に MOG抗原投与後、第 0, 2, 4, 7, 9日 目の合計 5回、 1%エタノールを腹腔内投与した。ジャトバ群は同じスケジュールで 5 Omg/kg投与した。各フラクションは同じスケジュールで 50mg/kgで投与した。第 11日目に剖検し、脾細胞を MOGと共培養し、培養上清中の IFN— γ産生量を ELI SAにて測定した。
[0191] 2.実験結果
結果を図 14に示す。コントロール群では約 20000pgZmlの IFN— γ産生が見られ た力 ジャトバ群では殆ど産生が見られなかった。 Fr5— 7ではコントロールに比べ、 若干の IFN γ産生が見られた。 Frl— 4においては殆ど IFN γの産生がなかった 。以上の結果、自己免疫疾患の増悪因子である IFN- γ産生を抑制する活性は、平 均重合度 6. 5以上で顕著に強い活性を有し、重合度が高い程同活性は高くなること が示唆された。
[0192] ¾ 列 ί ί：ジャトバ抽出物の成分檢^ KTV)
実施例 8ではジャトバに含まれるプロシア-ジンの構成単位の同定、結合様式の決 定、重合度の算出、および定量分析を精密に行なう目的でチオール開裂分析を行 なった。プロシア-ジンの平均重合度および定量分析をさらに厳密に行なう目的で、 ェピカテキン (EC)のトルエン aーチオール付加誘導体 (EC— BTE)を精製'単離し 、高分解能質量分析 (HR-MS)と核磁気共鳴スペクトル (NMR)に供し、構造の同 定を行なった後、これを標品として HPLC分析を行なった。精製'単離された標品を 用いて分析を行うことにより、より精密に、プロシア-ジンの構成単位の同定、結合様 式の決定、重合度の算出を行うことができた。
[0193] 1.実験方法
(1) EC—BTEの単離·精製 実施例 9で調製した Fr. 1を実施例 8の手法でチオール開裂を行ない、反応物を H PLCに供し、 EC— BTEのピークを分取した。カラム条件を以下に示す。
[0194] カラム Cadenza CD— C18 C18 φ 10 X 250 mm (インタタト社）
移動相 メタノール：水：ギ酸（50 : 49. 8 : 0. 2, v/v/v)
移動相流速 2mLZ分
検出波長 280nm
(2) EC— BTEの構造同定
前項で得た EC— BTEを、まず精密分子量を得る目的で HR— MSに供した。装置は JeoUMS-700 (日本電子株式会社)を用い、イオン化モードは高速原子衝撃 (FAB )とし、イオンィ匕電圧は 70eVとした。また、文献値とシグナルを比較するためにプロト ン NMRスペクトルを測定した。装置は Varian社製 UNITY INOVA— 500 (500M Hz)を用いた。
[0195] (3)プロシア-ジンの HPLC分析
得られた EC— BTEを標品とし、実施例 8に示した条件で HPLC分析を行ない、プロ シァ-ジンの平均重合度と含量を算出した。平均重合度は以下のように計算した。
[0196] 平均重合度 = (T+E) ZT
Τ=ターミナルユニット（EC)のモル量
E =エクステンションユニット（EC— BTE)のモル量
含量は試料中のプロシア-ジン量を EC換算した重量％で求めた。
[0197] 2.実験結果
(l) 66mgの Fr. 1より 10. 8mgの EC—BTEを得た。
[0198] (2) HR— MSの結果、 MH+として 413. 1061のイオンピークが観測され、分子式が C22H2106Sと定まり、 EC— BTEと一致した。またプロトン NMRスペクトル（図 15) も文献値（Chem. Pharm. Bull., 40, 889-898, 1992)と一致し、さらに1 H— Detected Multiple— bond Heteronuclear Multiple Quantum Coherrence (HMBC )スペクトルにおいて、ベンジルチオールの SCH部位のプロトンからフラバン環 4位
2
カーボンへの遠隔相関シグナルが観測されたので（図 16)、ベンジルチオールはフラ バン環 4位に付カ卩して ヽることが証明され、以上の事実カゝら EC— BTE構造が完全に 同定された。
[0199] (3) EC— BTEを標品として用いて HPLC分析を行なった結果得られたプロシア-ジ ンの平均重合度と含量を図 17に示した。
[0200] 実施例 12：プロシア二ジン含有試料の調製 分析 (I)
実施例 10より、ジャトバの活性本体が特定重合度以上のプロシア-ジンであること が明らかになつたので、更にプロシア-ジンを含有する他素材の探索を行った。
[0201] 1.試料
市販の素材である、グラビノール SL (キッコーマン株式会社)、ポリフエノン (東京テ タノフード株式会社)、アップルフエノン (ニツカゥヰスキー株式会社)、クランベリーパ ウダ一 (キッコーマン株式会社)、カカオポリフエノール (明治製菓株式会社)、松榭皮 エキス (有限会社素材機能研究所)、シナモン粉末 (エスビー食品株式会社)を試料 として用いた。
[0202] 2.実験方法
(1)シナモン試料の調製
シナモン粉末 30. 5gをエタノール 300 mLで抽出し、得られたエタノール抽出物 を濃縮乾固した後、 50%メタノール Z水に再溶し、等量のクロ口ホルムで 4回抽出し た。含水メタノール画分を溶媒留去後、 1%エタノール Z水による抽出を行なった。
[0203] (2)クランベリー試料の調製
クランベリーパウダーより、高重合度プロシア-ジンを含有する試料を調製した。す なわちクランベリーパウダー 9gを水 600mLに溶解し、セフアデックス LH— 20榭脂を 充填したカラム（ φ 2. 6cm X 72cm)に供した。 5mLZ分の流速で 1Lずつの水、メタ ノールで溶出した後、最後に 1Lの 70%アセトン Z水で溶出した。このカラムクロマト グラフィを 3回実施した。
[0204] (3)プロシア-ジン分析
実施例 8のチオール開裂分析法により、各試料および（1)で調製したシナモン試料 、（2)で調製したクランベリー試料に含有されるプロシア-ジンを定量し、平均重合度 、構成成分、結合様式を決定した。また試料によってはフラバン環 3位水酸基へのガ レート付カ卩があったので、それに伴う 280nmにおけるモル吸光係数（ ε Μ直の変化を 、ェピカテキン (EC)とェピカテキンガレート (ECG)を用いて算出した。
[0205] 3.実験結果
(1)シナモンエタノール抽出物を 3. 91g得た。分配後の含水メタノール画分 1. 45g より、 1%エタノール Z水可溶画分 635mgが得られ、これをシナモン試料とした。
[0206] (2)合計 27gのクランベリーパウダーより、水画分 20. 8g、メタノール画分 303mg、 含水アセトン画分 217mgを得た。チオール開裂分析法により、含水アセトン溶出画 分を高重合度プロシア-ジン画分とした。
[0207] (3)各試料に含まれるプロシア-ジンの分析結果は表 5のようになった。ジャトバにつ いては実施例 8を参照。ガレート付加体とその修飾体のピーク同定は、実施例 8の 1.
(2)と同様に液体クロマトグラフ質量分析 (LC MS)によって行なった。 ECと ECGの 280nmにおける ε値の比は 1 : 3. 1であったので、ガレート付加体を定量する際に はピーク面積を 3. 1で除算し、補正した。
[0208] 表 5 :本発明の実施例において、ジャトバ、グラビノール SL、ポリフエノン、アップルフ ェノン、クランベリー高重合度画分精製物、カカオポリフエノール、松榭皮エキス、そし てシナモン粗分画物に含有されるプロシア-ジンについて、平均重合度、含量、そし て構成成分の分析結果を示す。
[表 5]
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Ζ CSJ CO CO oo ポリフエノンは緑茶由来のポリフエノール粗精製物である力 プロシア二ジンのオリ ゴマ一は検出されず、主成分はェピガロカテキンガレート（EGCG)、 EC ECG、力 テキン（CA)の単量体のみであった。グラビノール SLはブドウ種子由来、アップルフ ェノン (登録商標）はリンゴ由来のプロシア二ジン粗精製物であり、構成成分は CA E C、 ECGであった。また、松榭皮エキス、カカオポリフエノール、シナモンのプロシア- ジンは CA、 EC力 構成されていた。試料の平均重合度は 1から 6. 8の範囲にあり、 ジャトバの平均重合度が最も高力つた。
[0210] アップルフエノンの平均重合度は 2. 7であった力 チオール開裂を経ない試料を実 施例 8の 1. (2)の条件で LC MSに供した結果、観測されたのはプロシア-ジン二 量体、三量体、四量体の分子イオンピークのみであった。さらに実施例 8の 1. (1)の 条件で逆相液体クロマトグラフィー (RP— HPLC)による定量分析を行なった結果、主 成分は三量体（38. 1%, wZw)であった（図 18)。
[0211] クランベリーのプロシア-ジン高重合度画分をチオール開裂し、実施例 8の 1. (2) の条件で LC MSに供した結果、 Aタイプ結合の存在が確認された。 Aタイプ結合は クランベリー以外の試料では認められな力つた。
[0212] ¾施例 ί 3：プロシア二ジン含有試料の調 ^分析 (Π)
1.実験方法
実施例 12で得られた知見をさらに精査する目的で、市販の素材であるシナモン（ 株式会社岡田薬局）、ピクノジェノール (株式会社バレンタイン）、グラビノール (キッコ 一マン株式会社）について、実施例 9と同様のクロ口ホルム添カ卩による沈殿分別分画 法を行なった。
[0213]
200gのシナモン粉末に 2Lのエタノールをカ卩え、 1晚室温で抽出した。ろ過してシ ナモン抽出液を得て、溶媒留去し、粗抽出物 22. 58gを得た。これをメタノール:水（ 50 : 50、 vZv) 400mL〖こ溶解し、濃度を 40gZLに調整した。これを等容のクロロホ ルムで 3回洗浄し、夾雑物を除去した。含水メタノール画分を減圧溶媒留去し、 11. 97gの試料を得た。これを 300mLのメタノールに再溶し、等容のクロ口ホルムをカロえ 、クロ口ホルム:メタノール (50： 50、 v/v)溶液とした。得られた沈殿 (Fr. 1)をガラス 漏斗（ポアサイズ P16)でろ過して分別後、ろ液に 150mLのクロ口ホルムを添カ卩して クロ口ホルム:メタノール（60 :40、 vZv)溶液とした。生じた沈殿 (Fr. 2)を同様に分 別し、ろ液に 250mLのクロ口ホルムをカ卩えてクロ口ホルム：メタノール（70 : 30、 v/v) 溶液とした。生じた沈殿 (Fr. 3)を分別後、ろ液に 200mLのクロ口ホルムをカロえてク ロロホルム:メタノール（75 : 25、 vZv)溶液とした。生じた沈殿 (Fr. 4)を分別し、ろ液 を溶媒留去して Fr. 5とした。
[0214] (2)ピクノジェノール
10gのピクノジェノールを水 200mLに溶解し、等容の酢酸ェチルで 4回分配を行な い、水層を乾固して 6. 54gの試料を得た。これを 164mLのメタノールに溶解し、濃 度を 40gZLに調整した。これに（1)と同様にクロ口ホルムを順次添加し、沈殿分別を 行ない、 Fr. 1力ら Fr. 5を調製した。
[0215] (3)グラビノール
10gのグラビノールを水 200mLに溶解し、 (2)と同様の手法で Fr.l力 Fr.5を調 製した。
[0216] 2.実験結果
(1)各画分の調製結果
シナモン、ピクノジェノール、グラビノールのプロシア二ジンをクロ口ホルム沈殿分別 法で分画した結果、得られた各画分の重量と重量比を表 6に示す。
[0217] 表 6 : (1)から (3)で得られた分画物の重量を示す。
[表 6]
Figure imgf000062_0001
[0218] m \A：プロシア二ジン含有試料の調 ^分析 (m)
プロシア-ジンの平均重合度および定量分析を精密に行なう目的で、実施例 12で 得られた各調製物をチオール開裂反応に供し、実施例 11と同様の方針で計算した 。すなわちェピカテキンガレート（ECG)のトルエン αーチオール付加誘導体 (ECG — BTE)およびカテキン（CA)のトルエン aーチオール付加誘導体（CA— BTE)を 精製'単離し、高分解能質量分析 (HR - MS)と核磁気共鳴 (NMR)に供し、構造の 同定を行なった後、それぞれを標品として当該成分の HPLC分析を行なった。
[0219] 1.実験方法
(1) ECG - BTEの単離 .精製
グラビノールを実施例 8の方法でチオール開裂を行な、、反応物を HPLCに供し、 ECG— BTEのピークを分取した。カラム条件を以下に示す。
[0220] カラム XTerra MS C18 19 X 100 mm (Waters社）
移動相 0. 2% (vZv)ギ酸水：メタノール (47 : 53)
移動相速度 3mLZ分
検出波長 280nm
(2) ECG— BTEの構造同定
前項で得た ECG— BTEにつ!/、て、 ECGのフラバン環 4位へのベンジルチオール付 加を立証するために、 NMRスペクトルを測定した。装置は Varian社製 UNITY IN OVA— 600 (600MHz)を用いた。シグナルの比較のため、巿販標品 ECG (フナコ シ株式会社)のプロトン ( ) NMRを測定した。
[0221] (3) CA— BTEの単離 ·精製
ニュージーランド産の松榭皮エキスであるェンゾジノール (株式会社バレンタイン） を実施例 8の方法でチオール開裂を行ない、反応物を HPLCに供し、 CA— BTEのピ 一クを分取した。カラム条件を以下に示す。また CA— BTEのピークを同定する目的 で、 Procyanidin B3 (CAの 2量体）をチオール開裂に供した。
[0222] カラム Discovery (登録商標） C18 10 X 250 mm (シグマ アルドリッチ社 スペルコ事業部）
移動相 0. 2% (vZv)ギ酸水：メタノール（50 : 50)
移動相速度 2mLZ分
検出波長 280nm
(4) C A— BTEの構造同定
前項で得た CA— BTEにつ!/、て、 CAのフラバン環 4位へのベンジルチオール付カロ を立証するために、 NMRスペクトルを測定した。装置は Varian社製 UNITY INO
VA— 600 (600MHz)を用いた。シグナルの比較のため、巿販標品 CA (フナコシ株 式会社)のプロトン ( ) NMRを測定した。
[0223] (5)プロシア-ジンの HPLC分析
実施例 11で得られたェピカテキン ベンジルチオールエーテル（EC— BTE)と、今 回得られた ECG— BTE、 CA— BTEをそれぞれを標品とし、実施例 8に示した条件で
HPLC分析を行ない、プロシア-ジンの平均重合度と含有量を算出した。平均重合 度は以下のように計算した。
[0224] 平均重合度 = (T+E) ZT
Τ=ターミナルユニット（EC、 ECG、 CA)のモル量
E =エクステンションユニット（EC— BTE、 ECG— BTE、 CA— BTE)のモル量
2.実験結果
(1) 326mgのグラビノーノレより 32. Omgの ECG— BTEを得た。
[0225] (2) ECG— BTEのプロトン NMRを ECGのそれと比較した結果（図 19)、 ECGでは 2 . 85ppm、 3. OOppmに観測されたフラバン環 4位メチレンのシグナルが ECG— BTE では消失し、代わりにベンジルチオール付カ卩に伴い、 4. 17ppmに低磁場シフトした 4位メチンのシグナルと、 7. 2ppm— 7. 5ppmの領域にベンジルチオールのァロマ ティックプロトンのシグナルが観測された。また、丄!! Detected Multiple-bond Heteronuclear Multiple Quantum Coherrence (HMBC)スぺクトノレにおいて、ベンジ ルチオールの SCH部位のプロトンから 4位カーボンへの遠隔相関シグナル、および
2
4位プロトンから SCH部位のカーボンへの遠隔相関シグナルが観測されたので（図
2
20)、ベンジルチオ一ルはフラバン環 4位に付カ卩していることが証明された。なお、 4 位カーボン、 SCH部位のカーボンのシグナルは、 Heteronuclear Single Quantum
2
Coherence (HSQC)スペクトル（図 21)により帰属した。以上の事実から、 ECG— BT E構造が同定された。
[0226] (3) Procyanidin B3のチオール開裂反応物より CA— BTEのカラム溶出位置を 18
. 6分と定めた。 90mgのェンゾジノールより 11. 3mgの CA— BTEを得た。
[0227] (4) CA— BTEのプロトン NMRを CAのそれと比較した結果（図 22)、 CAでは 2. 50p pm、 2. 85ppmに観測されたフラバン環 4位メチレンのシグナルが CA— BTEでは消 失し、代わりにベンジルチオール付カ卩に伴い、 4. 36ppmに低磁場シフトした 4位メチ ンのシグナルと、 7. 2ppm— 7. 4ppmの領域にベンジルチオールのァロマティックプ 口トンのシグナルが観測された。また、ェ！！ー Detected Multiple-bond Heteronuclear Multiple Quantum Coherrence (HMBC)スペクトルにおいて、ベンジルチオールの S CH部位のプロトンから 4位カーボンへの遠隔相関シグナル、および 4位プロトンから
2
SCH部位のカーボンへの遠隔相関シグナルが観測されたので（図 23)、ベンジル
2
チオールはフラバン環 4位に付カ卩していることが証明された。なお、 4位カーボン、 S CH部位のカーボンのシグナノレは、 Heteronuclear Single Quantum Coherence (HS
2
QC)スペクトル（図 24)によりアサインした。以上の事実から、 CA— BTE構造が同定 された。
[0228] (5)チオール開裂で生成する EC、 CA、 ECG、 EC— BTE、 CA— BTE、そして ECG
BTEをそれぞれ標品として用いて HPLC分析を行なった結果得られた各調製物の プロシア-ジンの平均重合度と含有量％ (w/w)を表 7に示した。
[0229] 表 7 :ジャトバ、グラビノール SL、ポリフエノン、アップルフエノン、クランベリー高重合 度画分精製物、カカオポリフエノール、松榭皮エキス、そしてシナモン粗分画物に含 有されるプロシア-ジンについて、平均重合度、含量、そして構成成分の分析結果を 示す。
[表 7]
Figure imgf000066_0001
o
si CO 寸 O 施例 1 5：プロシア二ジン含有試料の調製 分析 (IV)
実施例 13で得られたシナモン、ピクノジヱノール、グラビノール由来のそれぞれの 画分について、実施例 8と同様にチオール開裂反応後、実施例 14と同様の方針で プロシア二ジンの構成単位の同定、重合度の算出、および含有量の定量分析を行な つた o
[0231] 1.実験方法
実施例 11で得られたェピカテキン ベンジルチオールエーテル (EC— BTE)と、実 施例 14で得られた ECG— BTE、 CA— BTEをそれぞれ標品とし、実施例 8に示した 条件で HPLC分析を行ない、プロシア-ジンの平均重合度と含有量を算出した。平 均重合度は以下のように計算した。
[0232] 平均重合度 = (T+E) ZT
Τ=ターミナルユニット（EC、 ECG、 CA)のモル量
E =エクステンションユニット（EC— BTE、 ECG— BTE、 CA— BTE)のモル量
2.実験結果
チオール開裂で生成する EC、 CA、 ECG、 EC— BTE、 CA— BTE、そして ECG— B TEをそれぞれ標品として用いて HPLC分析を行な ヽ、得られた各画分のプロシア- ジンの平均重合度と含有量％ (w/w)を表 8に示した。
[0233] 表 8 :シナモン、ピクノジェノール、グラビノールをクロ口ホルム沈殿分別法で分画した 結果得られた各画分のプロシア-ジン (PC)の平均重合度と含有量％ (w/w)を示 す表である。参考としてジャトバの数値を附記してある。
[表 8]
Figure imgf000068_0001
[0234] 実施例 16：ジャトバプロシア二ジン 3量体一 6量体の精製
1.実験方法
実施例 9で調製した Fr. 5より、プロシア-ジンの 3量体から 6量体までをカラム精製 した。まず LC MSで各オリゴマーの溶出位置を決め、次いで日立製の HPLCで大 量精製を行なった。各々の条件を以下に示す。
[0235] (l) LC-MS
カラム： Discovery (登録商標） HS PEG 10 X 250 mm, 5 m (シグマ アル ドリツチ社スペルコ事業部）
ポンプ： Waters社 alliance (商標名 ) 2690
移動相：0. 1 % (v/v)ギ酸入りメタノール：0. 1% (v/v)ギ酸水（60： 40、 v/v) 移動相流速： 2mLZ分
検出波長： 280nm (Waters社 2996多波長検出器）
MS装置： Waters社 micromassZQ2000
Fr. 5は 100 ju g u Lの濃度のメタノール溶液 10 μ Lにメタノール 60 μ Lを加え、 水で 120 Lに希釈した溶液を 100 Lインジェタトした。 UV検出器の出口流路を 1
Ζ6にスプリットし、 MSに導入した。イオン化モードは ESIのネガティブイオンモードと し、分子量 2000以上のプロシア-ジンについては 2価イオンで検出を行なった。コー ン電圧は 40Vとした。
[0236] (2)大量精製
カラム、移動相、移動相流速、検出波長は（1)と同様とし、ポンプを日立 L-7100、 検出器を日立 L— 7455 (多波長検出器）とした。サンプルループ容量は lmLとし、 Fr
.5の 150mgをメタノール：水（50 : 50、 vZv)溶媒 lmLに溶解した試料を 1回のイン ジ タト量とした。
[0237] 2.実験結果
(l) LC-MS
280nmでモニターしたクロマトグラムと、 MSクロマトグラムを図 25に示した。各オリ ゴマーにおいて複数のピークが検出されているのは 4→8結合と 4→6結合力 構成 される異性体があるためであると考えられる。 Fr. 5より、 7量体までの重合体が検出さ れ、 8量体、 9量体のピークは検出されな力つた。なお、 MS装置の性能として検出上 限が 2000なので、分子量 1730の 6量体までを 1価イオンで検出し、 7量体は 2価ィ オン（1009)で検出した。
[0238] PEGカラムにより、各オリゴマーは重合度順に溶出されていることが明ら力となった
[0239] (2)大量精製
(1)でアサインした溶出ピークパターンに基づき、 3量体から 6量体までの精製を行 なった。 7量体は Fr. 5中の含量が少なかったため、分取しなかった。 2. 31gの Fr. 5 より、 132. Imgの 3量体、 173. Imgの 4量体、 187. Omgの 5量体、 111. Omgの 6 量体を得た。精製物の一部を同 HPLC条件に供し、純度検定を行なった結果、隣接 する各オリゴマーの相互混入は微量であり、それぞれの純度は、 3量体が 95. 7%、 4量体が 92. 1%、 5量体が 97. 4%、 6量体が 95. 9%であった。
[0240] 実施例 17：ジャトバプロシア二ジン 6量体一 9量体の精製
1.実験方法
実施例 9と同様にして調製した Fr. 4より、プロシア-ジンの 6量体から 9量体までを カラム精製した。まず LC MSで各オリゴマーの溶出位置を決め、次いで日立製の H PLCで大量精製を行なった。各々の条件を以下に示す。
[0241] (l) LC-MS
カラム： Discovery (登録商標） HS PEG φ 10 X 250 mm, 5 ^ m (シグマ—アルド リッチ社スペルコ事業部）
ポンプ： Waters社 alliance (商標名 ) 2690
移動相：0. 1 % (v/v)ギ酸入りメタノール：0. 1% (v/v)ギ酸水（80： 20、 v/v) 移動相流速： 2mLZ分
検出波長： 280nm (Waters社 2996多波長検出器）
MS装置： Waters社 micromassZQ2000
Fr. 4につ!/、ては、 100 μ g/ μ Lの濃度のメタノーノレ溶液 80 μ Lを水で 120 μ に 希釈した溶液を 100 Lインジェタトした。 UV検出器の出口流路を 1/6にスプリット し、 MSに導入した。イオン化モードは ESIのネガティブイオンモードとし、分子量 200 0以上のプロシア-ジンについては 2価イオンで検出を行なった。コーン電圧は 40V とした。
[0242] (2)大量精製
カラム、移動相流速、検出波長は（1)と同様とし、移動相を 0. 1% (νΖν)ギ酸入り メタノール： 0. 1% 7 ）ギ酸水（80 : 20、 vZv)ポンプを日立 L—7100、検出器を 日立 L— 7455 (多波長検出器）とした。サンプルループ容量は lmLとし、 Fr.4の 150 mgをメタノール：水（70： 30、 v/v)溶媒 900 μ Lに溶解した試料を 1回のインジヱタト 量とした。
[0243] 2.実験結果
(l) LC-MS
280nmでモニターしたクロマトグラムと、 MSクロマトグラムを図 26に示した。各オリ ゴマーにおいて複数のピークが検出されているのは 4→8結合と 4→6結合力 構成 される異性体があるためであると考えられる。 Fr. 4より、 12量体までの重合体が検出 された。なお、 MS装置の性能として検出上限が 2000なので、分子量 1730の 6量体 までを 1価イオンで検出し、 7量体以上は 2価イオンで検出した。
[0244] PEGカラムにより、各オリゴマーは重合度順に溶出されていることが明ら力となった
[0245] (2)大量精製
(1)の結果、 10量体以上のオリゴマーは量が少な力つたので、帰属した溶出ピーク パターンに基づき、 6量体から 9量体までの精製を行なった。 2. 66gの Fr. 4より、 15 6. 2mgの 6量体、 222. 9mgの 7量体、 236. lmgの 8量体、 176. 4mgの 9量体を 得た。精製物の一部を同 HPLC条件に供し、純度検定を行なった結果、隣接する各 オリゴマーの相互混入は微量であり、それぞれの純度は、 6量体が 95. 9%、 7量体 力 8%、 8量体が 90. 3%、 9量体が 97· 0%であった。
[0246] 実施例 18：プロシア二ジン 3量体一 9量体のチオール開裂分析
1.実験方法
実施例 16と実施例 17で得た画分中のプロシア-ジン含有量％ (w/w)を算出す るために、実施例 8の方法でチオール開裂分析を行な、、実施例 11の方法で結果 を解析した。チオール開裂分析ではプロシア-ジン含有量％(wZw)以外に、その 平均重合度をも算出できる。なお、 6量体については実施例 17で得られたものを用 いた。
[0247] 2.実験結果
3量体一 9量体の各画分中のプロシア-ジン含有量％ (w/w)を表 9に示した。プ ロシア-ジン（PC)含有量は低いものでも 71. 3% (6量体）、高いものでは 83. 0% ( 3量体)であった。また各々について算出した平均重合度についても表 8に示した通 り、いずれも目的重合度と符合し、チオール開裂分析法自体の精度が極めて良好で あることち示された。
[0248] 表 9 : 3量体一 9量体のプロシア-ジンを実施例 8の方法でチオール開裂分析し、平 均重合度とプロシア-ジン (PC)含有量0 /0 (w/w)を実施例 11の方法で解析した結 果である。オリゴマー純度％ (w/w)は実施例 16と実施例 17の HPLCでの定量結 果であり、総純度とは PC含有量にオリゴマー純度を乗算した値である。
[表 9]
3mers Amsrs omers 6mers 了 msrs 8mers 9mers 平均重合度 2.9 3.8 4.9 6.0 6.6 7.7 9.2
PC含有璗 (％>) 83.0 81.8 73.7 71.3 73.5 75.2 79.6 オリゴマー純度 (％) 95.7 92.1 97.4 95.9 95.8 90.3 97.0 総純度 (％) 79.4 75.3 71.8 68.4 70.4 67.9 77.2
[0249] 実施例 19：プロシア二ジンオリゴマーの HPLC分析
プロシア-ジンは実施例 8および実施例 11のチオール開裂分析により平均重合度 と含有量％(wZw)を、実施例 7、実施例 16、実施例 17の質量分析法により重合体 の分布を分析することができる力 実施例 16、実施例 17の HPLC条件を以下のよう に設定することにより、プロシア-ジンオリゴマーの分布をより高い重合度まで検出す ることが可能となる。
[0250] 1.実験方法
LC MSの条件を以下のように設定した。
[0251] カラム： Discovery (登録商標） HS PEG 10 X 250 mm, 5 m (シグマ アルド リッチ社スペルコ事業部）
ポンプ： Waters社 alliance (商標名 ) 2690
移動相：0. 1 % (v/v)ギ酸入りメタノール：0. 1% (v/v)ギ酸水（95 : 5、 v/v) 移動相流速： 2mLZ分
検出波長： 280nm (Waters社 2996多波長検出器）
MS装置： Waters社 micromassZQ2000
実施例 9と同様にして調製した Fr. 5、Fr. 4、 Fr. 3については、 100 gZ の 濃度のメタノール溶液 80 μ Lを水で 120 μ Lに希釈した溶液を 100 μ Lインジェタトし た。 UV検出器の出口流路を 1Z6にスプリットし、 MSに導入した。イオン化モードは ESIのネガティブイオンモードとし、分子量 2000以上のプロシア-ジンにつ!/、ては 2 価イオンで検出を行なった。コーン電圧は 40Vとした。
[0252] 2.実験結果
280nmでモニターした Fr. 5、 Fr. 4、 Fr. 3のクロマトグラムをそれぞれ図 27、図 2 8、図 29に示した。 MSによって Fr. 4、 Fr. 3から 13量体までのピークを確認した。 M S装置の性能として検出上限が 2000なので、分子量 1730の 6量体までを 1価イオン で検出し、 7量体以上は 2価イオンで検出した。 13量体は 2価イオンで検出できる限 界であり（イオンピーク 1873)、 Fr. 4、 Fr. 3には、より高重合度のプロシア-ジンを 含んでいる可能性がある。
[0253] 実施例 20： EAEモデルを 、た各種植物由来試料のインビボでの効果 '二ジン類の自己免疫疾患改善作用につ 、て検討するために、実施 例 8の各種植物素材由来の試料を EAEモデルマウスで検討した。
[0254] 1.実験方法
(1)投与試料
実施例 2のジャトバエタノール抽出物および、実施例 12の各試料を使用した。各試 料はそのプロシア-ジン含量がジャトバエタノール抽出物と同一になるように 1%エタ ノール溶液を調製した。
[0255] (2)実験条件
C57BL/6,雄性、 6週齢を 1群 10匹でコントロール群、および各試料群に分けた oコントローノレ群 ίま第 0曰目に MOG抗原投与後、第 0, 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18 , 21日目の合計 10回、 1%エタノールを投与した。各試料群は同じスケジュールで プロシア-ジン換算で 50mgZkgジャトバ相当量を投与した。第 11日目に 5匹を剖 検し、脾細胞を MOGと共培養し、培養上清中の IFN— γ産生量を ELISAにて測定 した。また、残り 5匹は第 25日目まで臨床スコアを観察した。
[0256] 2.実験結果
臨床スコアの結果を図 30に示す。コントロールは第 11日目で発症し、最大臨床ス コアは 2. 5前後となった。ジャトバと同様な ΕΑΕ発症抑制が見られたのは松榭皮ェ キス、クランベリー高重合度画分およびシナモン抽出物であり、これらの素材では第 2 5日目まで明確な発症が認められな力つた。グラビノール SLでは発症が 4日遅れ、臨 床スコアではコントロールの半分程度の抑制が見られた。その他の試料では ΕΑΕ抑 制はコントロールと同程度であり、効果が認められな力つた。脾細胞による IFN— γ産 生能についてもグラビノール、クランベリー、松榭皮エキス、シナモン、ジャトバでは完 全に抑制された力 その他の試料では明確な抑制は見られなかった（図 31)。
[0257] 以上の結果、実施例 12で示したように主成分が三量体であるアップルフエノンに効 果が無いことから少なくとも重合度 3以下のプロアントシァ-ジンには自己免疫疾患 抑制効果は無 、ことが示唆された。
[0258] なお、平均重合度でアップルフエノン（2. 72)と大差な!/ヽグラビノール（3. 18)に、 部分的な抑制活性が認められた点にっ 、ては、アップルフエノンが前述したように三 量体が主成分であってそれより高い重合度の物の含有量が乏しいのに対し、予備的 試験であるがグラビノールは重合度分布が広く 4以上の高重合度のものを十分量含 有していることを確認しており、これが両者の差となったと考えられる。
[0259] 効果が認められた試料に含まれるプロシア-ジンの種類は一義に限定されず、例 えば Aタイプ， Bタイプの結合様式、構成成分、ガレート付加の有無は活性と相関し ないことが明ら力となった。これらのことから、フラバン基本骨格の水酸基の数も活性 には関係しないことが容易に演繹される。すなわち活性に関わるのは重合度のみで あり、重合度 4以上のプロアントシァ-ジンが自己免疫疾患改善作用を有することが 明らかになった。
[0260] m2i：高重合度プロシア二ジン含有素材に: ける活件の 扁件
高重合度プロシア-ジンを含む他素材活性比較のために、松の榭皮（ピクノジエノ ール）、シナモン、ぶどう種子（グラビノール）からジャトバの Fr3相当（平均重合度 10 )のものを抽出し、自己免疫疾患改善活性を検討した。
[0261] 1.実験方法
(1)投与試料
コントロール群には、 l。/0 EtOH、ジャトバ由来高重合度プロシア-ジンとしてジャ トバ Fr3 (15. 7) (実施例 9)を、グラビノール由来高重合度プロシア-ジンとしてダラ ピノール Fr2 (8. 8) (実施例 13)を、松の榭皮由来高重合度プロシア-ジンとしてピ クノジェノール Fr2 (8. 6) (実施例 13)を、シナモン由来高重合度プロシア-ジンとし てシナモン Frl (10. 2) (実施例 13)を、それぞれ 5mgZmlになるように 1% EtOH に溶解した。 0内は、平均重合度を示す。
[0262] (2)実験動物
C57BL/6,雄， 7週齢を用い、一群 16匹で開始。 MOG (200 g)と 800 gの H 37Raを含む CFAをェマルジヨンィ匕したものを第 0日目に皮内投与、第 1日目と第 3 日目に腹腔内に 1 μ gZmlの ΡΤΧを 200 1 (実質 200ng)投与して疾患を惹起した
[0263] (3)脾細胞の IFN— yの測定
IFN— γの測定は OptEIA ELISA Set (ベタトン'デッキンソン社）を用いて実施 した。
[0264] (4)実験条件
各サンプルは lmgZmouseとなるように週 3回腹腔内投与した。第 11日目にて剖 検し、脾細胞を調製した。脾臓細胞は RPMI1640 (シグマ社） + 10% FCS (ロシュ 社） ± 2 /z M MOG培地で 37°C、 5%COの条件で 7日間培養し、培養上清を回収
2
し、 IFN— γ濃度測定を実施した。
[0265] 2.実験結果
いずれのプロシア-ジン含有素材も高重合度プロシア-ジンを濃縮する事により、 同様に強い抗自己免疫疾患活性を示す事が分力つた (図 32)。また後述する実施例 31において示されているように、抗自己免疫疾患活性は重合度 5以上のプロアントシ ァ-ジンにより担われている。このことから、当該活性はジャトバに限定されるもので はなぐ高重合度プロシア-ジンを含む他の素材にも適用可能であることが明らかと なった。
[0266] ¾施例 22 :TvOen コラーゲン謙導閗節炎モデル 用いたジャトバのインビボでの ジャトバの慢性関節リウマチにおける効能を調べるために、 Typell コラーゲン誘 導関節炎モデルで検討した。
[0267] 1.実験方法
(1)投与試料
実施例 2のジャトバエタノール抽出物を用いた。
[0268] (2)実験動物およびその飼育
DBAZUマウス (雄)、 8週齢 (購入先：チヤ一ルスリバ一社）に対して、第 0日目お よび第 21日目に II型コラーゲン（コスモバイオ） 150 gを CFA400 μ gと混合してェ マルジヨンィ匕したものを皮内投与して誘導した。
[0269] (3)実験条件
1群 10匹でコントロール群、ジャトバ群に分けた。コントロール群は第 0日目から第 3 0日目まで週 3回、 1%エタノールを腹腔内投与した。ジャトバ群は同じスケジュール で 50mgZkgでジャトバエタノール抽出物を腹腔内投与した。 [0270] 実験スケジュールを図 33に示す。
[0271] (4)臨床スコアのつけ方
スコア 0 :正常、スコア 1 :四肢の指など小関節が一本のみ膨張発赤、スコア 2 :小関 節 2本以上、あるいは手首 ·足首など大きな関節が膨張発赤、スコア 3 :—本の手や 足全体が発赤膨張、スコア 4 :さらに 1本の手や足の膨張が最大限に達している 臨床スコアは 4本の足全てに対して、上記基準で観察し、 4本の合計をスコアとして 記録した。
[0272] 2.実験結果
臨床スコアの経時変化グラフを図 34に示す。コントロール群では第 21日目に 2次 免疫を行い（0日目とする）、二次免疫後 2日経過した 2日目で発症が始まり、それか ら 2週間でほぼ完全発症 (スコア 16)した。ジャトバ群では 2次免疫後、 1週間経過し た 6日目近辺で発症が始まった力 スコア 8までし力病状が進行しな力つた。以上の 結果、ジャトバ抽出物は慢性関節リウマチにも効果があることが示された。
[0273] ¾施例 23 :卵糖尿病モデル 用いたジャトバのインビボでの効菜
ジャトバの I型糖尿病における効能を調べるために、 I型糖尿病が誘導された NOD ZLtjマウスで検討した。
[0274] 1.実験方法
(1)投与試料
実施例 2のジャトバエタノール抽出物を用いた。
[0275] (2)実験動物、飼育
NODZLtjマウス (雌）、 4週齢 (購入先:チヤ一ルスリバ一社）に対して 10週齢時に シクロホスフアミド（Cy)を 300mgZkg腹腔内投与した。
[0276] (3)実験条件
1群 20匹でコントロール群、ジャトバ群に分けた。コントロール群は 4週齢時から週 2 回、 1%エタノールを腹腔内投与した。ジャトバ群は同じスケジュールで 50mgZkgで ジャトバエタノール抽出物を腹腔内投与した。 9週齢時に 5匹を剖検し、脾細胞を抗 原のひとつであるインスリンと共培養し、培養上清中の IFN— γ産生量を ELISAにて 測定した。また、残り 15匹は 10週齢時に Cyを投与し、 Cy投与後第 35日目まで臨床 スコアを観察した。実験スケジュールを図 35に示す。
[0277] (4)発症の判定
糖尿病の発症率はダルテストエース（三和化学研究所 (株)）で尾から微量採血した ものを測定し、 250mg/dl以上の値を示した場合、陽性とした。
[0278] 2.実験結果
糖尿病発症率を図 36に示す。コントロール群では Cy投与後第 28日目で 39%が 発症した力 ジャトバ群では 13%し力発症しな力つた。
[0279] さらに、 9週齢時点の脾細胞のインスリンに対する IFN— γ産生量を測定したところ
、コントロール群では 6000pgZmlの産生が見られたにも関わらず、ジャトバ群では 1
OOOpgZml程度に抑制されていた。以上の結果、ジャトバ抽出物は I型糖尿病にも 効果があることが示された（図 37)。
[0280] ¾施例 24 :T 着尿 に: ける効亩 討
実施例 23ではシクロホスフアミドをマウスに投与して I型糖尿病を誘導し、そのマウ スを実験に用いた。本実施例では、長期的な I型糖尿病自然発症モデルマウスを実 験に用いることによって、本発明による有効成分の効果をより正確に検証する。
[0281] 1.実験方法
(1)投与試料
コントロール群として 1。/0 EtOHを、またジャトバ投与群としてジャトバ EtOH抽出 物（実施例 2)を 5mgZmlになるように 1% EtOHに溶解したもの
(2)実験動物
NODZLtjマウス (雌）、 4週齢 (購入先：チヤ一ルスリバ一社)。
[0282] (3)実験条件
1群 20匹で I型糖尿病自然発症モデルマウス NODZLtjを 4週齢で購入と同時に ジャトバ EtOH抽出物を lmgZmouse、コントロール群には 1% EtOHを 200 ΐ腹 腔内へ週 2回投与を開始。 9週目以降、週 1回に切り替え、発症率の検討終了の 33 週目まで投与を継続した。また一部 (η= 3) 9週目で剖検し、脾細胞の抗原特異的な 反応を検討した。脾細胞は RPMI1640 (シグマ社） + 10% FCS (ロシュ社）士 300 μ g/ml インスリン（シグマ社)で培養し、 3日間培養後の上清につ!、て IFN— yの 濃度を測定した。更に 11週目で一部 (n= 5)剖検し、脾臓細胞の各種免疫細胞存在 比率を調べた。残りの個体は 33週目まで週一回血糖値を測定し、発症率を検討した (図 38)。
[0283] (4)脾細胞の IFN— γの測定
IFN— γの測定は OptEIA ELISA Set (ベタトン'デッキンソン社）を用いて実施 した。
[0284] (5) ex vivo 脾細胞における各種免疫担当細胞比率への影響
11週目で剖検した各群 5匹力 脾細胞を調製した。免疫担当細胞の表面マーカー の発現はフローサイトメトリーを用いて実施例 25と同様の条件で調べた。
[0285] (6)発症の判定
糖尿病の発症率はダルテストエース（三和化学研究所 (株)）で尾から微量採血した ものを測定し、 250mg/dl以上の値を示した場合、陽性とした。
[0286] 2.実験結果
9週目における抗原依存的な反応を調べた結果、抗原の一つであるインスリン依存 的な IFN— γ産生が検出された。更にジャトバ投与によりこの IFN— γ産生が抑制さ れた（図 39)。また 11週目で調べた脾臓細胞の各種免疫細胞存在比率に関しては ジャトバ投与群でマクロファージの顕著な増加 (約 6%→20%)を観察した一方、 CD 4+T細胞、 CD8+T細胞の減少傾向がみられた（図 40)。また増加したマクロファージ の表面抗原を調べたところ、 MHC classllや共刺激分子である CD40, CD86に関 してはそれぞれ発現低下傾向を示し（図 41)、ジャトバ投与群では T細胞活性化能の 低い未熟なマクロファージが増加していると考えられる。これは実施例 25における E AEモデルにおけるジャトバ投与の効果と同様の傾向である。
[0287] また 33週目における最終的な発症率は対照群の 54%に比較してジャトバ投与群 では 22%に抑制されていた（図 42)。以上の結果から、高重合度プロシア-ジンを豊 富に含むジャトバ抽出物は I型糖尿病に対して抑制効果を持つ事が明らかとなった。
[0288] 実窗列 25 :ジャトバ EtOH柚出物の！!車細胞における各免疫担当細朐比率への影響 鐘
ジャトバ抽出物の特性を明らかにするために、 ex vivoにおける脾細胞の免疫担 当細胞の割合を実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE)モデルで検証した。
[0289] 1.実験方法
(1)投与試料
ジャトバ EtOH抽出物（実施例 2)を 5mgZmlになるように 1% EtOH溶液に溶解 させた。対照群には l%EtOH溶液を用いた。
[0290] (2)実験動物
C57BLZ6マウスを MOG抗原で免疫する方法で EAEを誘導した一群 3匹で第 0 , 2, 4, 8, 15日目と経時的に剖検を行った。
[0291] (3)実験条件
対照群では週 3回 l%EtOHを 200 1、ジャトバ投与群は 5mgZml (l% EtOH 溶媒)を 200 μ 1腹腔内投与した。
[0292] (4) ex vivo 脾細胞ポピュレーション解析
第 0, 2, 4, 8, 15日目で各群、 3匹解剖し、脾細胞とリンパ節細胞を調製した。免 疫担当細胞の細胞表面マーカーの発現はフローサイトメトリーにて解析を行った (ベ タトンデッキンソン)。解析する免疫担当細胞は、 T細胞 (CD3) {CD4陽性 (CD4)T 細胞、 CD8陽性（CD8)T細胞、制御性（CD4ZCD25)T細胞 }、 B細胞（B220)、 NK細胞（DX5)、マクロファージ (CD1 lb)、榭状細胞（CD1 lc)であり括弧内の細 胞表面マーカーを指標とした。マクロファージの成熟度を示す細胞表面マーカーとし ては CD40、 CD80、 CD86、 MHC class IIの抗体を用いた。
[0293] 細胞は Fc受容体をブロックするために CD16ZCD32 (Rat IgG2b, clone, 93) でプレインキュベーションし洗浄後、 5xl05cellsを 5%FBS、 0. 1%のアジ化ナトリウ ムを含む PBS中で目的とする抗原に特異的なマウスの抗体 30分間、 4°Cでインキュ へ' ~~トした。染色に ίま fluorescein isothiocyanate (FITC)—ま 7こ ίま phycoerythrin (PE )一で標識されたモノクローナル抗体を用いた。各々用いた抗体は、 CD3e (Armeni an hamster IgG, 145-2C11) , CD4 (Rat IgG2b, GK1. 5) , CD8a (Rat
IgG2a, 53-6. 7) , CDl lb (Rat TgG2b, Ml/70) , CDl lc (Armenian Hamster IgG, N418) , CD40 (Rat IgG2a, 1C10) , CD80 (B7— 1) (Armen ian hamster IgG, 16— 10A1) , CD86 (B7— 2) (Rat IgG 2b, GL1) , MHC c lassll (Rat IgG2b, M5/114. 15. 2) .ネガティブコントロールとして FITC—ま たは PE-標識したマウス IgG、ラット IgG、あるいはアルメニアハムスター IgGを用いた 。これらの抗体は全て eBioscience Inc. (San Diego, C A)から購入した。
[0294] 2.実験結果
脾臓細胞では第 8日目力も第 15日目にかけてヘルパー T細胞である CD4+T細胞 の増加が対照群でみられるのに対し、ジャトバ投与群では抑制されていた。また、抗 原提示細胞である DCおよび Β細胞は実験開始から一貫して低下傾向にある一方で マクロファージは増加傾向にある（図 43)。 CD8+T細胞については特に両群間で差 異はな力つた。 Thl免疫亢進性の疾患では CD4+T細胞の減少や、抗原提示細胞（ DC)の減少はその症状抑制に寄与すると考えられ、ジャトバ投与により、これらの細 胞の割合が減少することは抑制活性をよく説明する結果となった。一方、これとは逆 にジャトバ投与群で増加して 、たマクロファージにつ!/、てその成熟度を検討するため に、第 10日目の脾臓細胞について更に解析した。細胞表面マーカーとして抗原提 示能を反映すると言われている共刺激分子である CD40, CD80, CD86, MHC c lass IIを用いた。その結果ジャトバ投与により増加しているマクロファージは調べた いずれの共刺激分子の発現も抑制傾向である事が分かり、特に Thl反応による炎症 増幅に関わる CD80や抗原提示に主要に関わる MHC class IIについては有意に 抑制していた。これらのことから、ジャトバ投与により脾細胞で増加しているマクロファ ージは対照群に比較して、抗原提示能が低!ヽ事が示唆された (図 44)。
[0295] 実施例 26 :TVOe II collagen誘導関節炎モデルにおけるジャトバ経口投与による 臨床スコアの 善
ジャトバの経口投与の効果を調べるために Type II collagen誘導関節炎モデル で検討した。
[0296] 1.実験方法
(1)投与試料
ジャトバ EtOH抽出物（実施例 2)、ジャトバ Fr3分画物（実施例 9)、力テキン類単量 体である緑茶ポリフエノール（ポリフエノン：三井農林）を各々 50mgZmlになるように 10%EtOH溶液に溶解させた。対照群には 10%EtOH溶液を用いた。 [0297] (2)実験動物
DBAZUマウス（雄）、 8週齢に対してゥシタイプ IIコラーゲン（コスモバイオ） 150 μ gを 400 μ gの結核死菌（H37Ra：ディフコ）含む CFAと混合し、ェマルジヨン化した ものを第 0日目に皮内投与（1次免疫）、 3週間後の第 21日目に腹腔内投与 (2次免 疫)することで疾患を誘導した。
実験は一群 13匹で実施した。
[0298] (3)実験条件
一次免疫開始日から第 40日目まで週 5回、対照群では 10%EtOHを 250 μ 1、ジ ャトバ EtOH抽出物投与群、ジャトバ Fr3分画物投与群、緑茶ポリフエノール (ポリフ ヱノン)投与群はそれぞれ 50mgZml (10%EtOH溶媒）に調製した試料を 250 μ 1 強制経口投与した。
[0299] (4)臨床スコアの付け方
2次免疫日を 0日目として、以降 31日目まで臨床症状を観察した。スコアの付け方 は実施例 22に従った。
[0300] 2.実験結果
臨床スコアの経時変化を図 45に示した。ジャトバ EtOH抽出物投与によって臨床ス コアの抑制がみられた。またジャトバの Rapid Fractionationによる分画物である Fr
3投与では抑制効果が顕著であり、 2次免疫後 10日目力 有意差をもって抑制する ことが分力つた。一方単量体ポリフエノールであるポリフエノン投与では臨床スコアの 増悪傾向が認められた。
[0301] 実施例 27 :TVOe II collagen誘導関節炎モデルにおけるジャトバ経口投与による
Thlサイト力イン産牛.能の抑制
ジャトバの経口投与の効果を ex vivoで評価するために Type II collagen誘導 関節炎モデルで検討した。
[0302] 1.実験方法
(1)投与試料
ジャトバ投与群にはジャトバ EtOH抽出物（実施例 2)を 50mgZmlになるように 10 %EtOH溶液に溶解したものを投与した。対照群には 10%EtOH溶液を用いた。 [0303] (2)実験動物
DBAZUマウス（雄）、 8週齢に対してゥシタイプ IIコラーゲン（コスモバイオ） 150 μ gを 400 /z g H37Ra含む CFAと混合し、ェマルジヨン化したものを皮内投与した。 実験は一群 20匹で実施した。
[0304] (3)脾細胞の IFN— γの測定
IFN— γの測定は OptEIA ELISA Set (ベタトン'デッキンソン社）を用いて実施 した。
[0305] (4)実験条件
免疫開始から 2週間、週 5回、対照群では 10%EtOHを 250 1、ジャトバ投与群は 50mgZml (l%EtOH溶媒)を 250 μ 1強制経口投与した。第 14日目に剖検し、脾 臓細胞を調製した。脾細胞は RPMI1640 (シグマ社） + 10%FCS (ロシュ社） ± 25 μ gZmlコラーゲン培地で 37°C、 5%COの条件で 3日間培養し、培養上清を回収
2
した。この上清中の IFN— γ濃度測定を実施した。
[0306] 2.実験結果
対照群における抗原依存的な IFN— γの上昇とジャトバ投与群における有意な抑 制が確認できた（図 46)。このことは経口投与によっても、腹腔内投与と同様に Thl 型サイト力インである IFN— γ産生の抑制を介して臨床スコアを改善して ヽる事を示し ている。
[0307] ¾施例 28 :TvOe Π collagen謙 閗節炎モデルにおけるジャトバ終ロ による 臨床スコアの B 善効 の容量依存件
ジャトバの経口投与の効果について容量依存性を調べるために Type II collage n誘導関節炎モデルで検討した。
[0308] 1.実験方法
(1)投与試料
ジャトバ抽出物の Rapid Fractionation分画物である Fr3 (実施例 9)を各々 50m g/ml, 37. 5mg/ml, 25mgZmlになるように 10%EtOH溶液に溶解させた。対 照群には 10%EtOH溶液を用 、た。
[0309] (2)実験動物 DBAZUマウス（雄）、 8週齢に対してゥシタイプ IIコラーゲン（コスモバイオ） 150 μ gを 400 μ gの結核死菌（H37Ra：ディフコ）含む CFAと混合し、ェマルジヨン化した ものを第 0日目に皮内投与（1次免疫）、 3週間後の第 21日目に腹腔内投与 (2次免 疫）することで疾患を誘導した。実験は一群 7匹で実施した。
[0310] (3)実験条件
一次免疫開始日から第 40日目まで週 5回、コントロール群では 10%EtOHを 250 μ 1、 50mg/ml, 37. 5mg/ml, 25mgZmlの Fr3を各々 250 μ 1投与した。一匹 あたりの投与量は Fr3換算でそれぞれ 12. 5、 9. 375、 6. 25mgZマウスとなる。
[0311] (4)臨床スコアの付け方
2次免疫日を 0日目として、以降 17日目まで臨床症状を観察した。スコアの付け方 は実施例 22に従った。
[0312] 2.実験結果
スコアの変化のグラフを図 47に示す。約 9. 375mgZマウスの Fr3投与より高い濃 度においては有意に病状が抑制された力 それより低い濃度においては有意なスコ ァの抑制はみられなかった。よってジャトバ抽出物の効果が期待できる濃度は約 9. 3 75mgZマウス以上と考えられた。
[0313] ¾ 列 29： ^ ^プロシアュジンの カ がネ晷られる き の 討
発症期、急性期、慢性期以降力もの高重合度プロシア-ジン経口投与を行い、有 効な投与時期につ!、て検討を行った。
[0314] 1.実験方法
(1)投与試料
コントロールとして 10% EtOHを、また高重合度プロシア-ジンサンプルとしてジ ャトバ Fr3 (実施例 9)を 50mgZmlになるように 10% EtOHに溶解したものを用い た。
[0315] (2)実験動物
DBAZUマウス（雄）、 8週齢に対してゥシタイプ IIコラーゲン（コスモバイオ） 150 μ gを 400 μ gの結核死菌（H37Ra：ディフコ）含む CFAと混合し、ェマルジヨン化した ものを第 0日目に皮内投与（1次免疫）、 3週間後の第 21日目に腹腔内投与 (2次免 疫）することで疾患を誘導した。実験は一群 12匹で実施した。
[0316] (3)実験条件
一次免疫開始日第 0日目から第 46日目まで週 5回、以下のような条件で経口投与 を実施した。（第 21日目開始を発症期、第 28日目開始を急性期、第 35日目開始を 慢性期投与とした。）なお、一回あたりのジャトバ Fr3の投与量は 12. 5mg/mouse である。
I.コントロール群：一次免疫開始から実験終了まで 250 1の 10% EtOH溶液を経 口投与。
II. ジャトバ投与群：一次免疫開始力も実験終了までジャトバ Fr3を経口投与。
III. 第 21日目開始群：一次免疫開始から第 20日目まで 250 1の 10% EtOHを 、 2次免疫日の第 21日目から実験終了までジャトバ Fr3を経口投与。
IV. 第 28日目開始群：一次免疫開始から第 27日目まで 250 1の 10% EtOHを 、 2次免疫日から 1週間後の第 28日目力も実験終了までジャトバ Fr3を経口投与。
V. 第 35日目開始群：一次免疫開始から第 34日目まで 250 1の 10% EtOHを、 2次免疫日から 2週間後の第 35日目力も実験終了までジャトバ Fr3を経口投与。
[0317] (4)臨床スコアの付け方
2次免疫日を 0日目として、以降 25日目まで臨床症状を観察した。スコアの付け方 は実施例 22と同じ。
[0318] 2.実験結果
発症期投与としての第 21日目投与開始群と、急性期投与としての第 28日目投与 開始群は、コントロール群と比較して発症率に影響はな力つた (表 10)。しかし、第 21 日目投与開始群では最大スコアが対照群のほぼ半分に、第 28日目投与開始群で はコントロール群の約 68%程度にまで抑制されていた（表 10)。
[表 10] 発症率 （％) 最大スコア ジャトノ F r 3 5 0 . 0 0 2 . 2 第 2 1日目開始 9 2 . 8 6 4 . 1 第 2 8日目開始 9 3 . 3 3 5 . 2 第 3 5日目開始 1 0 0 . 0 0 6 . 8 コントロール 9 2 . 8 6 7 . 6
[0319] 平均スコアの推移を図 48に示した。第 21日目及び第 28日目開始群は投与を開始 することで病状の悪化を抑制して ヽることが示された。高重合度プロシア-ジンの抗 自己免疫疾患効果は一次免疫成立後でも、有効であることが示された。
[0320] ¾施例 30：高重 度プロシア二ジンによる rfn.中杭体価の抑制活件
慢性関節炎リウマチモデルの臨床症状に加え、血中抗体価の抑制を確認する事を 目的として実施した。
[0321] 1.実験方法
(1)投与試料
コントロール群として 10% EtOHを、またジャトバ投与群としてジャトバ Fr3 (実施 例 9)を 50mgZmlになるように 10% EtOHに溶解したものを用いた。
[0322] (2)実験動物
DBAZ1Jマウス（雄）、 8週齢に対してゥシタイプ IIコラーゲン（コスモバイオ） 150 μ gを 400 μ gの結核死菌（H37Ra：ディフコ）含む CFAと混合し、ェマルジヨン化した ものを第 0日目に皮内投与（1次免疫)、 3週間後の第 21日目に腹腔内投与 (2次免 疫)することで疾患を誘導した。実験は一群 12匹で実施した。
[0323] (3)血中抗体価の測定
ゥシタイプ IIコラーゲン (コスモノィォ）をリン酸バッファーで 3 μ g/mlに調製したも のを 4°Cでー晚コーティングしたプレートに 500— 5000倍希釈した血清サンプルを 添カロして測定した。一次抗体には 500倍希釈した AP— conjugateの抗 total IgG抗 体， 抗 IgGl抗体， 抗 IgG2a抗体（コスモバイオ）を用い、その後 pNPP (フナコシ） にて発色させて 410nmにて検出した。
[0324] (4)実験条件 一次免疫開始日から第 40日目まで週 5回対照群には 10% EtOHを 250 /z l、ジ ャトバ群にはジャトバ Fr3を 250 1経口投与した。第 42日目に採血し、血清を調製し た。
[0325] 2.実験結果
抗原であるコラーゲンに特異的な血中抗体価について調べた。 IgGl, IgG2a,総 I gG量のいずれもジャトバ Fr3投与により抑制された。更に IgGl/lgG2a比について は上昇傾向を認めており、 Thl免疫の抑制傾向を示した（図 49)。この結果から高重 合度プロシア二ジン投与により自己抗体の産生が抑制されること、高重合度プロシア 二ジンによる慢性関節炎リウマチ抑制効果は抗原特異的な抗体産生の抑制効果を 介していることが明ら力となった。
[0326] ¾ 列 3ί :プロシア二ジンの重合)^ II活件檢討 (I)
ジャトバ抽出物から 3量体から 6量体までのプロシア-ジンを重合度ごとに調製した ものを、 EAEの ex vivoの系を用いて検討した。
[0327] 1.実験方法
(1)投与試料
3量体から 6量体までのプロシア-ジン分画（実施例 16)はプロシア-ジン換算で各 々5mgZmlになるように 1% EtOH溶液に溶解した。また単量体として、（一)ェピカ テキン（シグマ）を、二量体として、 Procyanidin B2 (フナコシ）を各々購入し、同様 の条件で溶解した。対照群には 1 % EtOH溶液を用 ヽた。
[0328] (2)実験動物
C57BLZ6マウスを実施例 3に記載の MOG抗原で免疫する方法で EAEを誘導し た。一群 12匹で第 11日目に剖検を行った。
[0329] (3)脾細胞の IFN— yの測定
IFN— γの測定は OptEIA ELISA Set (ベタトン'デッキンソン社）を用いて実施 した。
[0330] (4)実験条件
第 0日目力ら第 10日目までコントロール群では週 3回 l%EtOHを 200 1、（一)ェ ピカテキン、 Procvanidin B2と調製した各オリゴマーは 5mgZml(l% EtOH溶 媒)を 200 μ 1腹腔内投与した。第 11日目にて剖検し、脾臓細胞を調製した。脾細胞 は RPMI1640 (シグマ社） + 10% FCS (ロシュ社） 2 μ Μ MOG培地で 37°C、 5% COの条件で 7日間培養し、培養上清を条件回収し、 IFN— γ濃度測定を実施した。
2
[0331] 2.実験結果
IFN- γの測定結果を図 50に示す。単量体 (一)ェピカテキンから 6量体までの活性 比較により、 5量体以上のプロシア-ジンに IFN— γ抑制がみられた。このことからこ れまでみられていたジャトバ抽出物投与による Thlサイト力インの抑制効果は重合度
5以上のプロシア-ジンによることが示唆された。
[0332] 実施例 32：プロシア二ジンの重合度别活件枪討 (II)
ジャトバ抽出物から 3量体から 9量体までのプロシア-ジンを各重合度別に調製し たもの（実施例 16および実施例 17)を EAEの ex vivoの系を用いて検討した。今回
、 7量体乃至 9量体の効果を検討するため、投与量は実施例 31の半分の用量で実 験を実施した。
[0333] 1.実験方法
( 1)投与試料
3量体から 9量体までのプロシア-ジン精製物（実施例 16および 17)はプロシア- ジン換算で各々 2. 5mgZmlになるように 1% EtOH溶液に溶解した。また単量体 として（一)ェピカテキン（シグマ）を、二量体として Procyanidin B2 (フナコシ）を各 々購入し、同様の条件で溶解した。コントロール群には 1 % EtOH溶液を用いた。
[0334] (2)実験動物
C57BLZ6マウスを実施例 31に記載の MOG抗原で免疫する方法で EAEを誘導 した。一群 12匹で第 11日目に剖検を行った。
[0335] (3)脾細胞の IFN— yの測定
IFN— γの測定は OptEIA ELISA Set (ベタトン'デッキンソン社）を用いて実施 した。
[0336] (4)実験条件
第 0日目力ら第 10日目までコントロール群では週 3回 l %EtOHを 200 1、（一)ェ ピカテキン、 Procvanidin B2と調製した各オリゴマーはそれぞれ 500 g/mouse となるように腹腔内投与した。第 11日目にて剖検し、脾細胞を調製した。脾細胞は R PMI1640 (シグマ社） + 10% FCS (ロシュ社） 2 μ Μ MOG培地で 37°C、 5%CO の条件で 7日間培養し、培養上清を回収し、 IFN - γ濃度測定を実施した。
2
[0337] 2.実験結果
IFN- γの測定結果を図 51に示す。実施例 31で 5量体以上のプロシア-ジンに活 性があることを示した力 本実施例においては投与量を減少させて、更に 9量体まで 活性比較を実施した。投与量を減少させたため 5量体での活性は弱まったが、 5量体 以上のプロシア-ジンでは重合度が高くなると共に、活性が上昇し、 9量体まで重合 度と活性の相関関係を確認することができた。
[0338] ¾ 列 33 :ジャトバ^ の 全件 ,験 (ジャトバ^ の 冋 によるラット 用いた急件 験）
1.実験方法
(1)投与試料
ジャトバ EtOH抽出物（実施例 2)、緑茶ポリフエノール (単量体）としてのポリフエノ ン（三井農林)を 200mgZmlの容量になるように 10%EtOHに溶解した。対照群に は 10%EtOH溶液を用いた。
[0339] (2)実験動物
SD系ラット、雄、 6週齢
(3)実験条件
第 0日目に 200mgZmlのジャトバ EtOH抽出物または緑茶ポリフエノールを 2gZk gとなるように強制的に経口投与した。第 6日目まで毎日同時間に体重と、摂餌量を 計測した。
[0340] 2.実験結果
ジャトバ投与群では毒性は認められず、体重変化（図 52上）、摂餌量（図 52下）とも に、対照群と変わらなかった。一方、緑茶ポリフエノール投与群では第 1日目で 10g 以上の体重減少を 3個体で認めた力 翌日から回復し、死亡例はな力つた。以上の 結果カもジャトバ抽出物では急性毒性は認められないことが分力つた。

Claims

請求の範囲
[1] (i)重合度が少なくとも 4のプロアントシァ-ジン、または（ii)プロアントシァ-ジンを 含有する植物素材の抽出物を有効成分として含んでなる、 Thlサイト力インの産生抑 制が治療に有効である疾患および Zまたは自己抗体の産生抑制が治療に有効であ る疾患の治療剤、それらの疾患の根治治療剤、およびそれらの疾患の進行阻害剤。
[2] (i)および Zまたは（ii)のプロアントシァ-ジンの重合度が少なくとも 5である、請求 項 1に記載の治療剤および阻害剤。
[3] (i)および Zまたは（ii)のプロアントシァ-ジンの重合度が 4一 30である、請求項 1 に記載の治療剤および阻害剤。
[4] (i)および Zまたは（ii)のプロアントシァ-ジンの重合度が 5— 30である、請求項 1 に記載の治療剤および阻害剤。
[5] (i)および Zまたは（ii)のプロアントシァ-ジンが、カテキン、ェピカテキン、ェピカテ キンガレート、ェピガロカテキンガレート、およびこれらの組み合わせから選択される 構成単位を少なくとも含む、請求項 1一 4の 、ずれか一項に記載の治療剤および阻
[6] (i)および Zまたは（ii)のプロアントシァ-ジンが、プロペラルゴ-ジン、プロシア- ジン、プロデルフィ-ジン、プロガイボールチ-ジン（proguibourtinidin)、プロフイセチ 二ジン、プロロビネチニジン、プロテラカシジン、プロメラカシジン、プロアピゲニニジン 、およびプロルテオリ-ジン力もなる群力も選択される、請求項 1一 5のいずれか一項 に記載の治療剤および阻害剤。
[7] (i)のプロアントシァ-ジンが、ジャトバ、葡萄種子、クランベリー、シナモン、松榭皮 、またはカカオ由来である、請求項 1一 6のいずれか一項に記載の治療剤および阻
[8] (ii)の植物素材の抽出物が、ジャトバ抽出物、葡萄種子抽出物、クランベリー抽出 物、シナモン抽出物、松榭皮抽出物、およびカカオ抽出物からなる群力 選択される 、請求項 1一 6のいずれか一項に記載の治療剤および阻害剤。
[9] (i)および Zまたは（ii)のプロアントシァ-ジンが式 (I)で表される、請求項 1に記載 の治療剤および阻害剤。 [化 1]
Figure imgf000092_0001
(上記式中、
Figure imgf000092_0002
R6、および R7は、同一または異なっていてもよぐ水素原子
、水酸基、または O— R11 ^11は炭素数 1一 4のアルキル基または糖残基を表す。 ) を表し、 R3および R4は、同一または異なっていてもよぐ水素原子、水酸基、または 基 (II) :
[化 2]
Figure imgf000092_0003
を表し、但し、 ITおよび R4の両方が水酸基を表すことはなぐ R3および R4の両方が基 (II)を表すことはなぐ nは 4一 30の整数を表し、各構成単位は、 4位と 6位または 4位 と 8位の一力所にお!、て互いに結合して!/、る力、あるいは 4位と 8位および 2位と 7位 の二力所において互いに結合している。 )
[10] 各構成単位において、 R1および R2が水酸基または O— R11を表し、 R6が水酸基ま たは O— R11を表し、 R5および R7が水素原子を表す、請求項 9に記載の治療剤およ び阻害剤。
[11] 各構成単位において、 R1および R2が水酸基を表し、 R6が水酸基を表し、 R5および
R7が水素原子を表す、請求項 10に記載の治療剤および阻害剤。
[12] 各構成単位にお 、て、 R3および R 、ずれか一方が水酸基を表し、他方が水素原 子を表す、請求項 10または 11に記載の治療剤および阻害剤。
[13] 各構成単位にお 、て、 R3および R 、ずれか一方が基 (Π)を表し、他方が水素原子 を表す、請求項 10または 11に記載の治療剤および阻害剤。
[14] 各構成単位にお 、て、 R1および R2が水酸基または O— R11を表し、 R5および が 水酸基または O— R11を表し、 R7が水素原子を表す、請求項 9に記載の治療剤およ び阻害剤。
[15] 各構成単位にお 、て、 R1および R2が水酸基を表し、 R5および R6が水酸基を表し、
R7が水素原子を表す、請求項 14に記載の治療剤および阻害剤。
[16] 各構成単位にお 、て、 R3および R4 、ずれか一方が水酸基を表し、他方が水素原 子を表す、請求項 14または 15に記載の治療剤および阻害剤。
[17] 各構成単位において、 R3および R4いずれか一方が基 (Π)を表し、他方が水素原子 を表す、請求項 14または 15に記載の治療剤および阻害剤。
[18] 各構成単位にお 、て、 R1および R2が水酸基または- O-R11を表し、 R5、 R6、および
R7が水酸基または O— R11を表す、請求項 9に記載の治療剤および阻害剤。
[19] 各構成単位にお 、て、 R1および R2が水酸基を表し、 R5、 R6、および R7が水酸基を 表す、請求項 18に記載の治療剤および阻害剤。
[20] 各構成単位にお 、て、 R3および R 、ずれか一方が水酸基を表し、他方が水素原 子を表す、請求項 18または 19に記載の治療剤および阻害剤。
[21] 各構成単位において、 R3および R4いずれか一方が基 (Π)を表し、他方が水素原子 を表す、請求項 18または 19に記載の治療剤および阻害剤。
[22] nが 5— 30の整数を表す、請求項 9一 21のいずれか一項に記載の治療剤および阻 害剤。
[23] 各構成単位が、 4位と 6位または 4位と 8位にぉ 、て互いに結合して 、る、請求項 9 一 22のいずれか一項に記載の治療剤および阻害剤。
[24] 各構成単位が、 4位と 8位および 2位と 7位にぉ 、て互いに結合して 、る、請求項 9 一 22のいずれか一項に記載の治療剤および阻害剤。
[25] Thlサイト力インの産生抑制が治療上有効である疾患力 Thlサイト力イン依存型 自己免疫疾患である、請求項 1一 24のいずれか一項に記載の治療剤および阻害剤
[26] Thlサイト力イン依存型自己免疫疾患が、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、イン スリン依存型糖尿病、自己免疫性甲状腺炎 (AT)、 自己免疫性ブドウ膜網膜炎 (AU R)、橋本病、乾癬症、クローン病、および円形脱毛症から選択される、請求項 25〖こ 記載の治療剤および阻害剤。
[27] 自己抗体の産生抑制が治療上有効である疾患が、自己抗体媒介型自己免疫疾患 である、請求項 1一 24の 、ずれか一項に記載の治療剤および阻害剤。
[28] 自己抗体媒介型自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、グッドパスチヤ一症候 群、 自己免疫性溶血性貧血、シエーダレン症候群、急性リウマチ熱、尋常性天疱瘡、 自己免疫性血小板減少性紫斑病、および混合型本態性クリオグロブリン血症力 選 択される、請求項 27に記載の治療剤および阻害剤。
[29] Thlサイト力インが IFN— γである、請求項 1一 26のいずれか一項に記載の治療剤 および阻害剤。
[30] 経口剤または外用剤の態様で提供される、請求項 1一 29に記載の治療剤および 阻害剤。
[31] Thlサイト力インの産生抑制が治療に有効である疾患および Ζまたは自己抗体の 産生抑制が治療に有効である疾患の治療剤、それら疾患の根治治療剤、およびそ れら疾患の進行阻害剤の製造のための、（i)重合度が少なくとも 4のプロアントシァ- ジン、または (ii)プロアントシァ-ジンを含有する植物素材の抽出物の使用。
[32] Thlサイト力インの産生抑制が治療に有効である疾患および Zまたは自己抗体の 産生抑制が治療に有効である疾患の治療剤、それら疾患の根治治療剤、およびそ れら疾患の進行阻害剤が、食品の形態で提供される、請求項 31に記載の使用。
[33] 治療上の有効量の（i)重合度が 4以上のプロアントシァ-ジン、または (ii)プロアント シァ-ジンを含有する植物素材の抽出物を、必要であれば薬学上許容される担体と ともに哺乳類に投与することを含んでなる、 Thlサイト力インの産生抑制が治療に有 効である疾患および Zまたは自己抗体の産生抑制が治療に有効である疾患の治療 方法、それら疾患の根治治療方法、およびそれら疾患の進行阻害方法。
[34] (i)重合度が少なくとも 4のプロアントシァ-ジン、または（ii)プロアントシァ-ジンを 含有する植物素材の抽出物を有効成分として含んでなる、 Thlサイト力インの産生抑 制剤。
[35] Thlサイト力インの産生抑制剤の製造のための、（i)重合度が少なくとも 4のブロア ントシァ-ジン、または（ii)プロアントシァ-ジンを含有する植物素材の抽出物の使用
[36] Thlサイト力インの産生抑制剤が、食品の形態で提供される、請求項 35に記載の 使用。
[37] 有効量の（i)重合度が少なくとも 4のプロアントシァ-ジン、または（ii)プロアントシァ 二ジンを含有する植物素材の抽出物を哺乳類に投与することを含んでなる、 Thlサ イト力インの産生抑制方法。
[38] (i)重合度が少なくとも 4のプロアントシァ-ジン、または（ii)プロアントシァ-ジンを 含有する植物素材の抽出物を有効成分として含んでなる、自己抗体の産生抑制剤。
[39] 自己抗体の産生抑制剤の製造のための、（i)重合度が少なくとも 4のプロアントシァ 二ジン、または (ii)プロアントシァ-ジンを含有する植物素材の抽出物の使用。
[40] 自己抗体の産生抑制剤が、食品の形態で提供される、請求項 39に記載の使用。
[41] 有効量の（i)重合度が少なくとも 4のプロアントシァ-ジン、または（ii)プロアントシァ 二ジンを含有する植物素材の抽出物を哺乳類に投与することを含んでなる、自己抗 体の産生抑制方法。
[42] (i)重合度が少なくとも 4のプロアントシァ-ジン、または（ii)プロアントシァ-ジンを 含有する植物素材の抽出物を有効量含んでなる食品であって、 Thlサイト力インの 産生抑制が治療に有効である疾患および Zまたは自己抗体の産生抑制が治療に有 効である疾患の治療、それらの疾患の根治治療、および Zまたはそれらの疾患の進 行阻害に用いられる食品。
[43] (i)重合度が少なくとも 4のプロアントシァ-ジン、または（ii)プロアントシァ-ジンを 含有する植物素材の抽出物を有効量含んでなる食品であって、 Thlサイト力イン産 生抑制機能、 Thlサイト力イン産生増大に関連する状態の改善または緩和機能、自 己抗体産生抑制機能、または自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和機能 を有する食品。
[44] (ii)プロアントシァ-ジンを含有する植物素材の抽出物であって、 Thlサイト力イン 産生抑制機能、 Thlサイト力イン産生増大に関連する状態の改善または緩和機能、 自己抗体産生抑制機能、または自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和機 能を有する抽出物を含んでなる食品。
[45] (i)重合度が少なくとも 4のプロアントシァ-ジン、または（ii)プロアントシァ-ジンを 含有する植物素材の抽出物を有効量含んでなる食品であって、 Thlサイト力イン産 生抑制機能、 Thlサイト力イン産生増大に関連する状態の改善または緩和機能、自 己抗体産生抑制機能、または自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和機能 が表示された食品。
[46] 本体、容器、包装、説明書、添付文書、または宣伝物のいずれかに Thlサイトカイ ン産生抑制機能、 Thlサイト力イン産生増大に関連する状態の改善または緩和機能 、 自己抗体産生抑制機能、または自己抗体に関連する状態の改善または緩和機能 が表示された、請求項 45に記載の食品。
[47] (i)および Zまたは（ii)のプロアントシァ-ジンの重合度が少なくとも 5である、請求 項 42— 46の!、ずれか一項に記載の食品。
[48] (i)および Zまたは（ii)のプロアントシァ-ジンの重合度が 4一 30である、請求項 42 一 46の!、ずれか一項に記載の食品
[49] (i)および Zまたは（ii)のプロアントシァ-ジンの重合度が 5— 30である、請求項 42 一 46の!、ずれか一項に記載の食品
[50] (i)および Zまたは（ii)のプロアントシァ-ジンが、カテキン、ェピカテキン、ェピカテ キンガレート、ェピガロカテキンガレート、およびこれらの組み合わせから選択される 構成単位を少なくとも含む、請求項 42— 49のいずれか一項に記載の食品。
[51] (i)および Zまたは（ii)のプロアントシァ-ジンが、プロペラルゴ-ジン、プロシア- ジン、プロデルフィ-ジン、プロガイボールチ-ジン（proguibourtinidin)、プロフイセチ 二ジン、プロロビネチニジン、プロテラカシジン、プロメラカシジン、プロアピゲニニジン 、およびプロルテオリ-ジン力もなる群力も選択される、請求項 42— 49のいずれか一 項に記載の治療剤および阻害剤。
[52] (i)のプロアントシァ-ジンが、ジャトバ、葡萄種子、クランベリー、シナモン、または 松榭皮由来である、請求項 42— 51のいずれか一項に記載の食品。
[53] (ii)の植物素材の抽出物が、ジャトバ抽出物、葡萄種子抽出物、クランベリー抽出 物、シナモン抽出物、松榭皮抽出物、およびカカオ抽出物からなる群力 選択される
、請求項 42— 46の!、ずれか一項に記載の食品。
[54] (i)および Zまたは（ii)のプロアントシァ-ジンが式 (I)で表される、請求項 42— 53 の！、ずれか一項に記載の食品。
[化 3]
Figure imgf000097_0001
(上記式中、
Figure imgf000097_0002
R6、および R7は、同一または異なっていてもよぐ水素原子
、水酸基、または O— R11 ^11は炭素数 1一 4のアルキル基または糖残基を表す。 ) を表し、 R3および R4は、同一または異なっていてもよぐ水素原子、水酸基、または 基 (II) :
[化 4]
Figure imgf000098_0001
を表し、但し、 R3および R4の両方が水酸基を表すことはなぐ R3および R4の両方が基
(II)を表すことはなぐ nは 4一 30の整数を表し、各構成単位は、 4位と 6位または 4位 と 8位の一力所にお!、て互いに結合して!/、る力、あるいは 4位と 8位および 2位と 7位 の二力所において互いに結合している。 )
[55] 各構成単位にお 、て、 R1および R2が水酸基または O— R11を表し、 R6が水酸基ま たは O— R11を表し、 R5および R7が水素原子を表す、請求項 54に記載の食品。
[56] 各構成単位にお 、て、 R1および R2が水酸基を表し、 R6が水酸基を表し、 R5および
R7が水素原子を表す、請求項 55に記載の食品。
[57] 各構成単位にお 、て、 R3および R4 、ずれか一方が水酸基を表し、他方が水素原 子を表す、請求項 55または 56に記載の食品。
[58] 各構成単位にお 、て、 R3および R4 、ずれか一方が基 (Π)を表し、他方が水素原子 を表す、請求項 55または 56に記載の食品。
[59] 各構成単位にお 、て、 R1および R2が水酸基または O— R11を表し、 R5および が 水酸基または O— R11を表し、 R7が水素原子を表す、請求項 54に記載の食品。
[60] 各構成単位にお 、て、 R1および R2が水酸基を表し、 R5および R6が水酸基を表し、
R7が水素原子を表す、請求項 59に記載の食品。
[61] 各構成単位にお 、て、 R3および R4 、ずれか一方が水酸基を表し、他方が水素原 子を表す、請求項 59または 60に記載の食品。
[62] 各構成単位にお 、て、 R3および R4 、ずれか一方が基 (Π)を表し、他方が水素原子 を表す、請求項 59または 60に記載の食品。
[63] 各構成単位にお 、て、 R1および R2が水酸基または O— R11を表し、 R5、 R6、および
R7が水酸基または O— R11を表す、請求項 54に記載の食品。
[64] 各構成単位にお 、て、 R1および R2が水酸基を表し、 R5、 R6、および R7が水酸基を 表す、請求項 63に記載の食品。
[65] 各構成単位にお 、て、 R3および R 、ずれか一方が水酸基を表し、他方が水素原 子を表す、請求項 63または 64に記載の食品。
[66] 各構成単位にお 、て、 R3および R 、ずれか一方が基 (Π)を表し、他方が水素原子 を表す、請求項 63または 64に記載の食品。
[67] nが 5— 30の整数を表す、請求項 54— 66のいずれか一項に記載の食品。
[68] 各構成単位が、 4位と 6位または 4位と 8位にぉ 、て互いに結合して 、る、請求項 54 一 67の!、ずれか一項に記載の食品。
[69] 各構成単位が、 4位と 8位および 2位と 7位にお!、て互いに結合して!/、る、請求項 5
4一 67のいずれか一項に記載の食品。
[70] Thlサイト力イン産生増大に関連する状態が、 Thlサイト力イン依存型自己免疫疾 患に特徴的な状態である、請求項 43— 46の 、ずれか一項に記載の食品。
[71] Thlサイト力イン依存型自己免疫疾患が、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、イン スリン依存型糖尿病、自己免疫性甲状腺炎 (AT)、自己免疫性ブドウ膜網膜炎 (AU
R)、橋本病、乾癬症、クローン病、および円形脱毛症から選択される、請求項 70〖こ 記載の食品。
[72] 自己抗体産生に関連する状態が、自己抗体媒介型自己免疫疾患に特徴的な状態 である、請求項 43— 46の 、ずれか一項に記載の食品。
[73] 自己抗体媒介型自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、グッドパスチヤ一症候 群、自己免疫性溶血性貧血、シエーダレン症候群、急性リウマチ熱、尋常性天疱瘡、 自己免疫性血小板減少性紫斑病、および混合型本態性クリオグロブリン血症力 選 択される、請求項 72に記載の食品。
[74] Thlサイト力インが IFN— γである、請求項 42— 46のいずれか一項に記載の食品
[75] Thlサイト力イン産生増大に関連する状態および Ζまたは自己抗体産生に関連す る状態が、全身の強張りや関節の違和感である、請求項 43— 46のいずれか一項に 記載の食品。
[76] 重合度が少なくとも 4のプロアントシァ-ジンを、成人 1人 1日当たり 50— 2000mg の摂取量となるように含んでなる、健康食品。
[77] プロアントシァ-ジンが、ジャトバ抽出物、葡萄種子抽出物、クランベリー抽出物、シ ナモン抽出物、松榭皮抽出物、およびカカオ抽出物力 なる群力 選択される抽出 物であって、重合度が少なくとも 4のプロアントシァ-ジンを含む抽出物の形態で提 供される、請求項 76に記載の健康食品。
[78] プロアントシァ-ジンの重合度が 4一 30である、請求項 76または 77に記載の健康
^ P
[79] プロアントシァ-ジンの重合度が少なくとも 5である、請求項 76または 77に記載の 健康食品。
[80] プロアントシァ-ジンの重合度が 5— 30である、請求項 76または 77に記載の健康
^ P
[81] 特定保健用食品、栄養機能食品、または栄養補助食品である、請求項 76— 80の
V、ずれか一項に記載の健康食品。
[82] 通常の食品の形状あるいは栄養補助食品の形状である、請求項 76— 81のいずれ か一項に記載の健康食品。
[83] Thlサイト力イン産生抑制活性を有する画分の製造法であって、
(a)プロアントシァ-ジンを含有する植物原料を抽出操作に付す工程;および
(b)工程 (a)で得られた抽出画分を限外濾過操作に付して、ケーキを得る工程 を含んでなる、製造法。
[84] 工程 (b)の後に、（c)工程 (b)で得られたケーキに含まれるプロアントシァ-ジンの 重合度を測定する工程を更に含んでなる、請求項 83に記載の製造法。
[85] 試料中のプロアントシァ-ジンの重合度を測定する工程を含んでなる、 Thlサイト 力イン産生抑制活性の検定方法であって、 4以上の重合度のプロアントシァ-ジンの 検出が Thlサイト力イン産生抑制活性を示すことを特徴とする方法。
[86] 5以上の重合度のプロアントシァ-ジンの検出が Thlサイト力イン産生抑制活性の 指標である、請求項 85に記載の方法。
[87] 試料中のプロアントシァ-ジンの重合度を測定する工程を含んでなる、 Thlサイト 力インの産生抑制が治療に有効である疾患の治療活性の検定方法であって、 4以上 の重合度のプロアントシァ-ジンの検出が Thlサイト力インの産生抑制が治療に有 効である疾患の治療活性を示すことを特徴とする方法。
[88] 5以上の重合度のプロアントシァ-ジンの検出が Thlサイト力インの産生抑制が治 療に有効である疾患の治療活性の指標である、請求項 87に記載の方法。
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