CN104543983A - 保健食品组合物 - Google Patents

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CN104543983A CN201310483401.2A CN201310483401A CN104543983A CN 104543983 A CN104543983 A CN 104543983A CN 201310483401 A CN201310483401 A CN 201310483401A CN 104543983 A CN104543983 A CN 104543983A
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骆俊光
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Taiyun Biotech Co Ltd
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Taiyun Biotech Co Ltd
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    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23VINDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

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Abstract

本发明涉及一种营养保健补给品,提供了一种保健食品组合物。该保健食品组合物包含20~50wt%的综合维生素组份、5~30wt%的葡萄籽萃取物组份、0.5~12wt%的绿藻萃取物组份、5~30wt%的凤梨酵素组份、15~50wt%的柑橘类黄酮素组份、1~15wt%的姜黄素萃取物组份、0.1~5wt%的叶黄素萃取物组份、0.1~1wt%的沉香组份、0.1~1wt%的矿物质组份,及5~15wt%的蓝莓萃取物组份。借此,使该保健食品组合物对于改善生理机能与日常保健能产生较佳的效用。

Description

保健食品组合物
技术领域
本发明涉及一种营养保健补给品,特别是涉及一种以天然食品中的营养成分为主要来源的保健食品组合物。
背景技术
随着产业的高度工业化与科技化,虽然带来了便利的生活,但也衍生了许多污染问题,经年累月下来,使现代人生活在一个充斥着各种污染源的环境里,例如,土地与地下水的重金属污染、河川的化学废料污染、水果蔬菜的农药残留、动物注射抗生素的残留与污染、野生鸟兽的病毒感染、空气中的病毒传染,及各种未知原因的文明病…等,可以说我们是生活在充斥着各种病毒与致病源的环境里,加上现代人快速的生活节奏、繁忙的工作、紧张的生活压力、运动量不足、及营养摄取不均衡,如此经年累月的煎熬,导致体质虚耗失调而百病丛生。
因应各种文明病陆续爆发所引起的健康问题,除了消极地对症治疗外,也应积极地强化个人的生理机能,才能使患病的机率降到最低,“留得青山在,不怕没柴烧”,近年来,国人的健康意识逐渐抬头,并体会到要享受幸福的生活必须拥有没有病痛的健康身体,因应这一趋势,市场上也出现了多种可预防各种文明病及帮助均衡营养的营养保健补给品,为了避免化学合成成分可能产生其他副作用反而造成二次伤害,目前在制造这些营养保健补给品时,是倾向以天然食材作为这些保健品的主要来源,并将这些天然食材内的有效成分、维生素、矿物质等以浓缩提炼的方式提取出来制成方便口服与可快速吸收的产品,以即时地补充个人所需养份。
近年来,以天然食材作为预防疾病的饮食备受瞩目,已知存在于日常饮食蔬果、药草等食物中的微量化学物质具有相当多样的药理活性,有益于预防癌症的发生,或是在术后搭配以调养体质并控制病情恶化。虽然目前市面上已出现各种琳琅满目,各具不同成效的营养保健补给品,但由于各种文明病的成因不明及人体结构复杂,所以仍有持续开发具各种有效成分营养品的需求,以供营养显著不均衡或免疫功能不足的现代人可针对自己本身的需求进行选择。
发明内容
本发明的目的在于提供一种由多种维生素与特定植物的根、茎、叶、花、果实与种籽等特定部位的萃取物组成的保健食品组合物。
于是,本发明保健食品组合物,包含20~50wt%的综合维生素(multivitamin)组份、5~30wt%的葡萄籽萃取物(grape seed extract)组份、0.5~12wt%的绿藻萃取物(chlorella extract)组份、5~30wt%的凤梨酵素(bromelin)组份、15~50wt%的柑橘类黄酮素(citrus bioflavonid)组份、1~15wt%的姜黄素萃取物(curcumin extract)组份、0.1~5wt%的叶黄素萃取物(xanthophylls extract)组份、0.1~1wt%的沉香(Aquilaria)组份、0.1~1wt%的矿物质(mineral)组份,及5~15wt%的蓝莓萃取物(blueberry extract)组份。
其中,为了获得较佳的保健效果,该保健食品组合物在人体上的建议用量为1g/Kg/日。
本发明的有益效果在于:利用该综合维生素组份提供人体中所需且能维持细胞正常运作的营养成分,再辅以萃取自不同植物中能够抗自由基、抗氧化、抗发炎与提升人体免疫力的有效成分,以及有镇静抗菌效能的沉香组份与可辅助生理机能正常运作的矿物质组份,因此,本发明通过结合能提供人体生理活动所需营养成分、能强化细胞活力的成分以及能对抗对体内细胞造成损害的物质的成分的设计,使该保健食品组合物除了能用于补给营养外,还能够改善生理机能,故可降低细胞病变的机率,并有助于维持人体健康机能。
附图说明
无。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明:
本发明保健食品组合物的较佳实施例包含20~50wt%的综合维生素(multivitamin)组份、5~30wt%的葡萄籽萃取物(grape seed extract)组份、0.5~12wt%的绿藻萃取物(chlorella extract)组份、5~30wt%的凤梨酵素(bromelin)组份、15~50wt%的柑橘类黄酮素(citrusbioflavonid)组份、1~15wt%的姜黄素萃取物(curcumin extract)组份、0.1~5wt%的叶黄素萃取物(xanthophylls extract)组份、0.1~1wt%的沉香(Aquilaria)组份、0.1~1wt%的矿物质(mineral)组份,及5~15wt%的蓝莓萃取物(blueberry extract)组份。
该综合维生素组份可提供每日所需的最佳剂量的维生素B群、维生素C与矿物质,并能补充一般体内无法合成的成分,以提供均衡的营养及维持细胞的活力。借此,能够维持身体的正常运作与健康的生活型态。
该葡萄籽萃取物组份为超强的抗氧化剂,可保护体内细胞不被破坏,进而发挥较佳的免疫功能,并能避免身体受到自由基损害,自由基是一种可自由存在于体内的不稳定物质,它会随机地攻击体内细胞与组织,并引起连锁性的反应,引发人体产生退化性症候群,如血管脆化、脑细胞老化、退化性关节炎、免疫系统衰退及白内障等,是引起人体生病的一个主因,而要克服或消除自由基,最佳的应对之道就是抗氧化剂,葡萄籽萃取物中丰富的前花青素(Oligomeric proanthocyanidins,简称为OPC,又称为低聚原花色素或原花色素低聚物)是一种水溶性的多酚类,具有很强的抗自由基作用,而且由于OPC分子小而能通透血脑障碍,提供脑内抗氧化的功能,也能立即在人体内达到等渗压而在5分钟内被人体吸收达近90%,是目前已知清除自由基最强而有效的抗氧化剂,其清除自由基的能力比维生素E强50倍,比维生素C强30倍,不但能增强免疫力,并可以有效预防多种慢性病,如抗老化、抗糖尿病、视网膜病变、循环不良、组织发炎、动脉硬化、气喘、水肿、静脉曲张及抗癌等。
该绿藻萃取物组份具有抗氧化、降血压、降血脂、抗发炎与抗肿瘤等功能,因而可用于提升人体内抗氧化防御系统的能力及减少细胞受到损害的情形,进而能搭配其他药理活性的成分调养体质。
该凤梨酵素组份则萃取自凤梨根部,具有强力的抗发炎及消化蛋白质的特性,能帮助身体吸收食物及补充品中的养分,通过添加凤梨酵素,有助于本保健食品中的其他成分能顺利被身体吸收进而产生更有效的作用效果。
该柑橘类黄酮素组份包括多种广泛分布于植物体内的多酚类物质,许多抗氧化剂、降血脂与治疗心血管疾病的药物都含有柑橘类黄酮素化合物,与其他植物黄酮类相比,柑橘类黄酮素所特有的聚甲氧化黄酮类的生理活性使其比一般类黄酮有更强的抑制肿瘤效果。
该姜黄素萃取物组份主要是一种从姜黄根茎中提取到的多酚类化合物,具有降血脂、抗氧化、抗发炎、保护心血管等药理作用,且有动物实验证实其具有抑制肿瘤的作用。
该叶黄素萃取物组份也是一种抗氧化物,由于人体无法自行制造叶黄素,通常从食物摄入补充。
该沉香组份则有抗菌效能,并有止痛、镇静、止喘作用。
该矿物质组份是调节生理机能不可或缺的物质,并有促进代谢的功能,通常矿物质组份含有例如锌(zinc)、硒(selenium)、铁(iron)以及硫辛酸(lipoic acid)等成分,所述成分也多具有抗氧化作用。
该蓝莓萃取物组份吸收自由基的能力很高,可以减少自由基对细胞膜、DNA和其他细胞的损害,进而预防体内功能紊乱及许多老年疾病的发生,蓝莓抗氧化的能力在40余种蔬果中也是最高的,其萃取物中的花青素是很强的抗氧化剂,可以帮助预防动脉内斑块的形成和多种癌症,因而能减低患癌机率,减少心脏疾病与延迟老化。
本发明利用该综合维生素组份提供人体中所需且能维持细胞正常运作的营养成分,以增强正常细胞的活力,并配合矿物质组份调节生理机能,再辅以萃取自不同植物的根、茎、叶、花、果实中的多种有助于清除自由基、提升人体免疫力与抑制肿瘤的有效成分,使该保健食品组合物除了能作为饮食普遍不均衡的现代人的一种日常营养补给剂外,还能够通过其中所含的多种具有抗氧化活性的成分强化人体免疫系统、保护细胞,进而可降低细胞病变的机率,故有助于维持人体健康机能,并可应用于调养体质。
本发明将就下面的实施例来做进一步说明,但应了解的是,所述实施例仅是供例示说明用,而不应被解释为本发明的实施上的限制。
<实施例一-免疫调节功能评估试验>
依据本发明的组合物包含有综合维生素组份、葡萄籽萃取物组份、绿藻萃取物组份、凤梨酵素组份、柑橘类黄酮素组份、姜黄素萃取物组份、叶黄素萃取物组份、沉香组份、矿物质组份以及蓝莓萃取物组份,有关各个组份的来源被汇整在下面的表-1中。
表-1组合物中各组份的来源
组份 来源
综合维生素组份 克补(辉瑞大药厂股份有限公司)a
葡萄籽萃取物组份 DSM Nutritional Productsb
绿藻萃取物组份 DSM Nutritional Productsb
凤梨酵素组份 DSM Nutritional Productsb
柑橘类黄酮素组份 DSM Nutritional Productsb
姜黄素萃取物组份 DSM Nutritional Productsb
叶黄素萃取物组份 DSM Nutritional Productsb
沉香组份 DSM Nutritional Productsb
矿物质组份 克补(辉瑞大药厂股份有限公司)a
蓝莓萃取物组份 DSM Nutritional Productsb
a:是直接将克补锭剂磨成粉状后与其他组份进行调配。
b:原料取得非仅DSM独家,包含与DSM公司相同等级产品,且原料进货已为粉状。
接着,参照下面表-2中所示的组份含量比例直接混合成该组合物。所得到的该组合物被拿来做为下列提升免疫系统试验、肿瘤细胞抑制试验、动物体内抗肿瘤等试验的试验物质。
表-2组合物中各组份的含量比例
组份 含量比例(%)(w/w)
综合维生素组份 25
葡萄籽萃取物组份 10
绿藻萃取物组份 5
凤梨酵素组份 15
柑橘类黄酮素组份 20
姜黄素萃取物组份 10
叶黄素萃取物组份 4
沉香组份 0.5
矿物质组份 0.5
蓝莓萃取物组份 10
实验动物及饲养环境:
1.试验动物:12只6周龄大的雄性SPF级BALB/c小鼠。
2.动物来源:乐斯科生物科技股份有限公司。
3.饲养地点:国立阳明大学实验动物中心(SPF级)。
4.饲养条件:a.温度:22±4℃;b.相对湿度:40~70%;c.换气频率:10~15次小时;d.光照:12小时的光暗周期;e.饲养状况:每笼饲养4只试验小鼠;f.饲料:LabDiet5010 Rodent Diet(Purina MillsLLC, St. Louis, MO, USA);g.饮水:充份提供饮水。
分组与剂量:
将所述雄性SPF级BALB/c小鼠经驯养一星期后开始进行试验,动物随机分成3组,并根据给予物质种类或剂量分组为(A)对照组、(B)低剂量组和(C)高剂量组。所述小鼠投予剂量的换算公式=每位成人每日服用剂量÷60Kg(成人平均体重)×12.3(小鼠相对于人体的代谢系数,参考FDA),以每人每天服用1~30g为例,单位体重剂量为0.02~0.5g/Kg,换算成所述小鼠投予剂量为0.21~6.15g/Kg,其中对照组为提供无菌水,(C)高剂量组试验物质的投予剂量为(B)低剂量组投予剂量的5倍剂量。在本实施例中,(C)高剂量组的投予剂量为4.15g/kg,(B)低剂量组的投予剂量为0.83g/kg。
试验项目:
1.动物体重:以电子天平称重。
2.摄食量:以电子天平称重。
3.脾脏中辅助型T细胞数量分析:以流式细胞仪检测。
4.血清中抗体IgG分泌情形测定:酵素免疫连结吸附(Enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)法检测。
试验流程:
1.试验物质:以管喂该组合物方式每日分别投予所述小鼠。
2.采血:分别于试验前、试验第4周与试验第8周进行第一次、第二次与第三次采血。
临床症状观察、体重与摄食:
试验期间,每日观察所述小鼠两次,并记录动物死亡或明显临床症状的情形。试验前、试验期间每周一次及牺牲前对所述小鼠进行称重。此外,测量各组试验前和试验期间每周的饲料消耗量,以计算所述小鼠的每天饲料摄食量。
脾脏中辅助型T细胞数量分析:
在喂食所述小鼠试验物质连续8周后,牺牲所述小鼠并取其脾脏,收集脾脏细胞,以抗体标定其CD3及CD4细胞表面标记,再以流式细胞仪分析样品中细胞的荧光强度百分比,并以Cell QuestTM软件进行数据分析,其中标定CD3及CD4细胞表面标记的抗体分别为PE conjugated hamster anti-mouse CD3e(clone:145-2C11,eBioscience)及FITC conjugated rat anti-mouse CD4(L3T4,clone:GK1.5,eBioscience)。
血清中抗体IgG分泌情形测定:
分别在第0、4周进行所述小鼠眼窝采血,在第8周牺牲所述小鼠前以心脏采血方式取得血液,将全血静置1小时,待血清与凝血分离后,4℃下以900xg离心20分钟,取其上清液即为血清,并保存于-20℃,待日后分析抗体。以酵素免疫连结吸附法测定血清中Total IgG抗体:在96孔盘(Biofill)中分别加入磷酸盐缓冲液做为空白对照组(100μL/well)、标准品(100μL/well;Sigma)及稀释血清(100μL/well),每个样品都进行三次重复,在4℃隔夜静置。隔天加入200μL/well以磷酸盐缓冲液配制的blocking buffer(含1%bovineserum albumin,BAS;Sigma)静置于37℃下作用30分钟,以填满无抗原附着部分。作用完后将液体丢弃,加入100μL/well以磷酸盐缓冲液稀释的HRP conjugate goat anti-mouse IgG(H+L chain;invitrogen),静置37℃下作用30分钟。随后加入100μL/well ABTSsubstrate(invitrogen),在室温下缓缓摇动呈色30分钟,在波长405nm条件下以盘式光谱分析仪(Epoch;BioTek,USA)测定吸光值,最后将试验样品及标准品的吸光值减去空白对照组后,最后IgG以标准品浓度曲线计算样品中抗体的含量。
统计分析方法:
上述试验数据都取其平均数(Mean)及标准误差(S.E.M)表示。统计分析方法依SPSS生物统计检定软件中one-way ANOVA变异数分析的Duncan检定法进行试验组与对照组的差异性比较。若p值小于0.05则表示组间具有显著差异。
试验结果:
1.动物体重与饲料摄取量
此次试验共使用12只BALB/c小鼠,在8周的试验期间内每日观察动物两次,所有动物生长状况正常且无临床病变等异常现象状况,试验期间亦无动物异常死亡。在动物体重结果显示,饲养期间各组体重经统计后组间无明显差异(p>0.05)。同时比较各组饲料摄食量的差异,结果显示组间差异不大。
2.脾脏中辅助型T细胞数量分析
喂食所述小鼠试验物质8周后,(B)低剂量组和(C)高剂量组的辅助型T细胞数量与(A)对照组比较后分别增加3.00%和4.29%。参阅表-3结果显示,各组的CD3CD4辅助型T细胞数目与对照组比较后都显著增加(p<0.05)。
表-3喂食试验物质8周后脾脏中辅助型T细胞数量的影响
单位:百分比
1.所有数值都以Mean±S.E.M表示,n=4。
2.数据统计使用Duncan检定法。
3.血清中抗体IgG分泌情形测定
由上述结果得知(C)高剂量组的辅助型T细胞数量与对照组比较有显著增加,故进一步取(A)对照组与(C)高剂量组分别在喂食试验物质前(第0周)、喂食4及8周试验物质后的所述小鼠血液样本,进行血清中抗体IgG分析。参阅表-4,在第0周时,(C)高剂量组其血清中的抗体IgG分泌情形与(A)对照组比较后不具有显著差异(p>0.05)。在第4周时,(C)高剂量组其血清中的抗体IgG分泌情形与(A)对照组比较后增加7.77%。在第8周时,(C)高剂量组其血清中的抗体IgG分泌情形与对照组比较后增加17.90%,且与(A)对照组比较后有显著差异(p<0.05)。
表-4喂食试验物质8周后血清中抗体IgG分泌情形的影响
单位:百分比
1.所有数值都以Mean±S.E.M表示,n=4。
2.数据统计使用Duncan检定法。
综合以上的实验结果,发明人认为:含有25wt%的综合维生素组份、10wt%的葡萄籽萃取物组份、5wt%的绿藻萃取物组份、15wt%的凤梨酵素组份、20wt%的柑橘类黄酮素组份、10wt%的姜黄素萃取物组份、4wt%的叶黄素萃取物组份、0.5wt%的沉香组份、0.5wt%的矿物质组份,及10wt%的蓝莓萃取物组份的本发明的组合物,在连续食用8周后,可增加脾脏中辅助型T细胞数量,对于增强免疫反应的效用明显,且每日食用高剂量连续8周后,可提升血清中抗体IgG的分泌情形。
<实施例二-肿瘤细胞生长抑制试验(肺癌、乳癌)>
本实施例所用组合物(试验物质)的来源与比例同<实施例一>的表-1与表-2所述。
细胞来源与培养环境:
1.细胞株:肺癌细胞LL2及乳癌细胞BT-474,均购自财团法人食品工业发展研究所。其中,肺癌细胞为小鼠肺癌细胞(murine lewislung carcinoma cell line),LL/2(LLC1)(BCRC60050),乳癌细胞为人类乳癌细胞(breast ductal carcinoma cell line),BT-474(BCRC60359)。
2.培养环境:含5%CO2(v/v)的37±2℃培养箱。
分组与剂量:
实验包括对照组与不同剂量的试验组,每组实验均进行三次重复:
对照组1:肺癌细胞LL2对照组:含有4mM的L-glutamine(Gibco,Lot:482577)的90%DMEM及10%FBS。
对照组2:乳癌细胞BT-474对照组:含有30ng/ml的EGF(Sigma,Lot:086K6132)的90%Hybri-Care Medium(Modified Dulbecco’smedium)pux10%FBS。
试验组溶液制备:分别进行最佳化剂量筛选试验与有效剂量评估试验,前述试验都以细胞培养液为溶剂将<实施例一>表-2所示的组合物配制成试验物质溶液进行实验,其中,针对最佳化剂量筛选试验配制1、10、100及1000μg/mL的不同浓度的试验物质溶液,针对有效剂量评估试验则配制25、50、100、150及200μg/mL的不同浓度的试验物质溶液。
实验流程
1.在24孔盘中植入约2.0×106cells/well后,在含5%CO2(v/v)的37±2℃培养箱中培养2小时。
2.去除培养基后,依细胞种类分别在24孔盘中加入2mL的对照组1、对照组2中的培养液及不同浓度的试验用物质溶液,在含5%CO2(v/v)的37±2℃培养箱中培养24小时或48±1小时。
3.在4℃,1800r.p.m.离心5分钟,倒去上清液后,加入1mL细胞培养液移到96孔盘中,依据细胞种类分别与各自的培养液进行培养(5.0×104cells/100μL per well),再加入10μL Cell Countingkit-8(CCK-8,Sigma,Lot:BCBC3885)试剂,在37℃下静置作用1小时后,在450nm波长下检测吸光值,并计算细胞的存活率。
4.数据分析:定量测试的吸光值都以平均值±标准差(mean±SD)表示。试验组所得数据以统计软件中Student’s t-test检定法分析与对照组的组间差异,并以p<0.05为显著差异水准。
试验结果:
1.最佳化剂量筛选试验
表-5不同剂量(等比差异剂量)试验物质配制成的试验物质溶液与不同细胞共同培养24与48小时后的生长抑制比例
单位:百分比a
a.细胞生长抑制比例(%)=100[对照组的细胞存活率(%)-实验组的细胞存活率(%)]/对照组的细胞存活率(%)。
b.-:表示抑制比例小于0。
c.LL2为小鼠肺癌细胞,BT-474为人类乳癌细胞。
为能有效评估试验物质溶液对肿瘤细胞的毒杀作用,需先确定剂量范围与试验最佳条件,以找出一合理评估剂量。因此,首先进行本发明组合物配制的不同浓度试验物质溶液作用的最佳化剂量筛选试验,表-5的结果显示,经试验物质溶液作用24小时与48小时,对肺癌细胞LL2的毒杀抑制范围为4~64%,对乳癌细胞BT-474的抑制范围则为9~59%,其中,对乳癌细胞的毒杀效果最好,且在lμg/mL试验物质溶液作用24小时即有显著差异(p<0.01)。然而增加作用时间并未加乘试验物质溶液的毒杀效果,反而影响对肿瘤细胞的抑制作用。整体来说,较高剂量的100μg/mL及1000μg/mL的试验物质溶液作用为有效的作用剂量,都能显著影响两种肿瘤细胞的存活率(p<0.05)。然而实验结果也显示,当加入的试验物质溶液作用剂量达到1000μg/mL的浓度时,会影响到肿瘤细胞的培养,试验物质溶液中的试验物质剂量呈现过量而无法被有效吸收的情形,因而导致测试结果的误差,特别是生长速度较慢的乳癌细胞BT-474。因此,后续实验以100μg/mL作为有效剂量范围,以进行进一步的检测。
2.对肿瘤细胞毒性之有效剂量评估
表-6不同剂量(等差差异剂量)试验物质配制成的试验物质溶
液与不同细胞共同培养24与48小时后的生长抑制比例
单位:百分比a
a.细生长抑制比例(%)=100[对照组的细胞存活率(%)-实验组的细胞存活率(%)]/对照组的细胞存活率(%)。
b.-:表示抑制比例小于0。
c.LL2为小鼠肺癌细胞,BT-474为人类乳癌细胞。
在此进一步实验中,分别评估25、50、100、150及200μg/mL的试验物质溶液作用24及48小时后,引发细胞伤害的抑制效果。结果显示2种肿瘤细胞经作用后存活率有不同的变化,而以50~200μg/Ml之试验物质溶液共同培养24小时后,肺癌细胞LL2与乳癌细胞BT-474的细胞存活率下降比例较明显(p<0.05)。在本实验的设计条件下,作用48小时后,肺癌细胞LL2与乳癌细胞BT-474的细胞存活率都有显著下降,有效剂量范围分别为100~200μg/mL及50~200μg/mL(p<0.05)。其中,肺癌细胞LL2与乳癌细胞BT-474分别以200μg/mL的试验组达51%的抑制率,及150μg/mL之试验组达52%的抑制率为最佳。
结论:
在最佳化剂量筛选试验中,以等比差异剂量的试验物质溶液分别与肿瘤细胞共同培养,实验结果显示当试验物质(即本发明的组合物)的浓度为100μg/mL的试验物质溶液与肿瘤细胞共同培养后,确实能有效提升对肿瘤细胞的抑制效果,而当该试验物质的剂量浓度高达1000μg/mL时,则因为过量沉淀在培养基的影响,干扰到该试验物质溶液中的试验物质对肿瘤细胞造成的效应,因而无法有效观察到抑制效果,因此,评估试验物质溶液抑制效应的浓度范围应在100μg/mL左右。
在进一步的细胞抑制试验中,则发现以100~200μg/mL浓度范围的试验物质溶液与上述2种肿瘤细胞共同培养24与48小时后,对上述2种肿瘤细胞均有伤害的效果,且抑制其生长的幅度约为10~50%。而试验物质溶作用时间长短是抑制效应的影响,则可由试验物质溶液与肺癌细胞LL2作用48小时,对抑制细胞生长无加乘效用的结果可得到证实,而且剂量在100~200μg/Ml之间的细胞生长抑制比例显示,随着试验物质溶液作用时间增加其抑制效果愈趋减缓。同样地,试验物质溶液处理48小时后的抑制结果,除了乳癌细胞BT-474外,其余效果均较24小时来得差,此现象亦可进一步解释细胞增生效率较佳的肿瘤细胞受试验物质溶液影响的抑制效果与作用时间有成反比的结果。
综上所述,显示本发明的保健食品组合物,其抑制肿瘤细胞生长的有效浓度范围为100~200μg/mL,且有效抑制作用时间为24小时。
<实施例三-动物移植性肿瘤抑制试验(肺癌)>
本实施例所用组合物(试验物质)的来源与比例同<实施例一>的表-1与表-2所述。
细胞来源与细胞培养环境:
1.细胞株:小鼠肺癌细胞(BCRC 60050,Lewis lung carcinoma,LLC),购自财团法人食品工业发展研究所。
2.培养环境:含5%CO2(v/v)的37±2℃培养箱。
3.培养方式:以含10%胎牛血清的DMEM进行培养。培养足够量的细胞数后,以PBS清洗去除血清,并以trypsin-EDTA作用使细胞脱落,离心收集细胞备用。
实验动物及饲养环境:
1.试验动物:12只6周龄大,平均体重18±2公克的雌性C57BL/6品系的小鼠。
2.动物来源:乐斯科生物科技股份有限公司。
3.饲养地点及动物饲养管理:国立台湾大学医学院实验动物中心。
试验设计:
1.肿瘤移植:预养两周后,每只小鼠后腿植入0.1mL含1×106的LLC细胞。
2.实验动物分组:本试验参考已建立的Lewis肺癌荷瘤动物模式(Ho BY & Pan TM,The Monascus metabolite monacolin K reducestumor progression and metastasis of Lewis lung carcinoma cells,JAgric Food Chem 57:8258-8265,2009),将小鼠随机分配成7组,分别为正常健康鼠对照组(喂食无菌水)、肿瘤模型对照组(喂食无菌水)、标准建议剂量试验组(试验物质)、10倍剂量试验组(10倍标准建议剂量的试验物质)、化疗药物对照组(Doxorubicin)、化疗药物+标准建议剂量试验组(Doxorubicin+试验物质),及化疗药物+10倍剂量试验组(Doxorubicin+10倍标准建议剂量的试验物质)。试验期间连续4周,将肿瘤细胞植入实验动物体内后,有施加化疗药物的组别以每周施打两次Doxorubincin(5mg/kg Dox)的方式给予化疗药物,其余则依实验设计,给予管喂无菌水或试验物质。详细分组方式参照下表-7。
表-7本试验的分组资料
*剂量换算:依小鼠与人体代谢比率(12.3)换算。以每人每日服用1克为例,小鼠剂量为0.205g/kg(1g/60kg×12.3=0.205g/kg)。
试验项目:
1.动物体重:试验期间,每周测量记录各组体重一次。
2.血清生化检测:试验结束后,以血清进行AST(aspartateaminotransferase)、ALT(Alanine amino-transferase)、TNF-α(Tumornecrosis factor-alpha)及VEGF(Vascular endothelial growth factor)四项检测。
3.肿瘤大小测定:试验期间,每周以游标卡尺量测肿瘤的长×宽×高,以计算肿瘤体积(mm3)。
统计分析:
1.本试验的资料以平均值±标准差(mean±S.D.)表示。采用SPSS(v.17)统计软件进行数据分析,实验数据经统计分析变异数分析(Analysis of variance ANOVA)测试各实验组间是否有差异,若有差异再以邓肯氏多变试验(Duncan’s multiple range test)作进一步分析,以决定各实验组在95%可信度内是否有差异,同列平均值间无相同上标者表示具显著差异(p<0.05)。
试验结果:
1.体重变化:肿瘤细胞植入后第一周与第二周,各组间平均体重无显著差异。第三周起,施加抗癌药物Doxorubicin的组别体重比未施加组别轻。第四周各组间体重差距拉大,详如表-8。
表-8各组间动物平均体重(g)变化
所有数据均以Mean±S.D.表示,n=8。以One-way ANOVA及Duncan’s multiple range test比较各组间的差异,以英文字母a、b及c表示统计的结果,同列平均值间无相同上标者表示显著差异(p<0.05)。
2.肿瘤大小:第一周至第四周间,每周以游标卡尺量测肿瘤的长×宽×高,以计算肿瘤体积(mm3)。各组肿瘤大小分析如下表-9所示。
表-9各组间肿瘤平均大小(mm3)变化
所有数据均以Mean±S.D.表示,n=8。以One-way ANOVA及Duncan’s multiple range test比较各组间的差异,以英文字母a、b及c表示统计之结果,同列平均值间无相同上标者表示显著差异(p<0.05)。
3.血清生化值:分析结果如表-10所示。
表-10各组间血清生化值分析
ND:低于可检测数值。
所有数据均以Mean±S.D.表示,n=8。以One-way ANOVA及Duncan’s multiple range test比较各组间的差异,以英文字母a、b及c表示统计的结果,同列平均值间无相同上标者表示显著差异(p<0.05)。
4.肿瘤抑制率:在第四周试验终止时,牺牲小鼠并取出肿瘤称重,计算肿瘤抑制率,如表-11所示。其中,计算公式如下:
表-11各组间肿瘤抑制率
综合以上的实验结果显示,当喂食10倍剂量的试验物质(本发明组合物)时,可达25%的肿瘤抑制率,同时降低血清中发炎因子TNR-α含量,显示本发明的组合物(试验物质)确实具有抑制肿瘤与发炎的效果,故未来可针对试验物质的含量浓度进行调整以提供做进一步评估,也可再针对其他肿瘤模型进行再评估。
<实施例四-动物体内抗肿瘤实验1(Lewis肺癌)>
本实施例所用组合物(试验物质)的来源与比例同<实施例一>的表-1与表-2所述。
实验材料:
1.实验动物:C57BL/6小鼠,50只,雌性,体重16.0~20.0公克,由已取得动物实验相关认证的四川大学实验动物中心提供,动物使用许可证号:SCXK(川)-09-2006,动物级别:三级。实验动物使用设施许可证号:SYXK(川)2008-113(IVC屏障系统)。
2.细胞株:Lewis小鼠肺癌细胞,由四川大学华西医院卫生部移植工程和移植免疫重点实验室提供。
3.实验药物:
试验物质:如表-2所示的组合物制成。
多西他赛注射液:淡黄色澄明粘稠液,规格:0.5ml(每瓶),20mg,批号:11081211,江苏恒瑞医药股份有限公司生产。
多西他赛专用溶剂:透明液体,规格:1.5ml/瓶,批号:11081131,江苏恒瑞医药股份有限公司生产。
生理食盐水:500mL/瓶,批号:11051050,由西南药业股份有限公司生产。
4.药物配制:每天要使用前配制,配制方式为将试验物质加入生理食盐水溶解,分别配制浓度为20%(200mg/ml)的高剂量试验物质溶液,及浓度为10%(100mg/ml)的低剂量试验物质溶液。
取多西他赛注射液一瓶(0.5ml),先用1.5ml专用溶剂进行稀释,然后再加入8.0ml的生理食盐水,配制成浓度为0.2%(2mg/ml)的药液。每次要使用前,吸取一定量的0.2%浓度的多西他赛药液,按照多西他赛:生理食盐水为1:7的比例加入生理食盐水稀释,配制成0.025%(0.25mg/ml)的药液供试验用。
5.仪器:
分析天平:北京赛多利斯天平有限公司,型号:BS210S。
电子天平:常熟双杰测试仪器厂生产,型号:T1000。
净化工作台:吴江市华兆净化设备有限公司生产,级别:100。
游标卡尺:川制01000101号。
手术剪、眼科镊、眼科剪、组织匀浆器。
试验流程:
1.以常规方式进行Lewis细胞的传代培养,收获处于对数生长期的Lewis细胞,分别在每只小鼠左前肢腋窝皮下接种细胞悬浮液0.2ml(约含细胞数2×106个),待肿瘤长大时作为种鼠供实验用。无菌剥离种鼠肿瘤,按比例加入生理食盐水(比例为1g:3ml),制成细胞悬浮液。
2.将制备好的细胞悬浮液依照0.2ml/只,接种在50只C57BL/6小鼠左前腋窝下,按照体重随机分为4组,分别为高剂量试验物质组(4g/kg)、低剂量试验物质组(2g/kg)、多西他赛对照组(5mg/kg)及不投药的模型组。其中,高剂量试验物质组、低剂量试验物质组分别分配13只小鼠,其余的每组12只。
3.在接种细胞悬浮液的第2天按组别开始给药,多西他赛对照组采腹腔注射(ip)给药,单次单药给药容量为0.2ml·10g-1,隔日一次。多西他赛共给药5次,在给药第8天开始测量肿瘤体积,共测量肿瘤体积4次(V=0.52×移植瘤长径L×移植瘤最短径W2)。在开始给药的第11天停止实验,牺牲小鼠并称重,整个试验过程中共记录小鼠体重5次。剥取肿瘤,计算抑瘤率%=[1-(给药组平均瘤重/阴性组平均瘤重)]×100%,解剖小鼠取出脾、胸腺、肺称重,计算脏器系数(脏器系数=脏器重量/去瘤重后的体重×100)。
4.统计分析:计量资料以Mean±S.D.(x±s)表示,采用SPSS11.5统计软件,进行组间t检验。
试验结果:
1.对肿瘤重量的影响:下表-12为给药第11天后,各组小鼠移植瘤的肿瘤生长重量与抑瘤率情形。
表-12Lewis肺癌的小鼠移植瘤的肿瘤检验结果((x±s)
*表示与模型组比较有显著差异(p<0.05)。
2.对脏器系数的影响:下表-13为给药第11天后,解剖小鼠取出脾、胸腺、肺称重,计算出的各组小鼠的脏器系数情形。
表-13Lewis肺癌的小鼠脏器系数检验结果
结论:
综合以上的实验结果显示,高剂量与低剂量试验物质组对Lewis肺癌C57BL/6小鼠移植瘤的瘤重均有一定的抑制作用,且高剂量试验物质组相较于模型组在抑瘤率上还具有显著差异。其中,由试验物质的剂量增加,其抑制效果也增强的情形来看,显示本发明的组合物(试验物质)确实能有效抑制肿瘤生长,而且也可以借由控制试验物质的剂量提供更有效的抑制肿瘤作用,由于多西他赛原来就是专门用来抑制癌症的用药,因此,其作用也会相对较强,虽然本次试验显示本发明的组合物的抑制作用尚无法达到与多西他赛相同的水准,但此结果仍可说明本发明的组合物作为保健食品时,应有助于强化免疫系统因而可产生抑制肿瘤的作用。
<实施例五-动物体内抗肿瘤实验2(Lewis肺癌)>
本实施例所用组合物(试验物质)的来源与比例同<实施例一>的表-1与表-2所述。
实验材料:
1.实验动物:与<实施例四>相同,在此不再赘述。
2.细胞株:与<实施例四>相同,在此不再赘述。
3.实验药物:与<实施例四>相同,在此不再赘述。
4.药物配制:每天要使用前配制,配制方式为将试验物质加入生理食盐水溶解,分别配制浓度为30%(300mg/ml)的高剂量试验物质溶液,及浓度为20%(200mg/ml)的低剂量试验物质溶液。
取多西他赛注射液一瓶(0.5ml),先用1.5ml专用溶剂进行稀释,然后再加入8.0ml的生理食盐水,配制成浓度为0.2%(2mg/ml)的药液。每次要使用前,吸取一定量的0.2%浓度的多西他赛药液,按照多西他赛:生理食盐水为1:7的比例加入生理食盐水稀释,配制成0.025%(0.25mg/ml)的药液供试验用。
5.仪器:与<实施例四>相同,在此不再赘述。
试验流程:
与<实施例四>大部分相同,差别只在于:(1)将高剂量试验物质组的剂量改为6g/kg,并将低剂量试验物质组的剂量改为4g/kg;(2)分组时,每组实验动物数量为10只;及(3)给药时,多西他赛给药总次数改为6次,且改为第12天停止实验及牺牲实验小鼠进行肿瘤重量与脏器系数的相关检测。
试验结果:
1.对肿瘤重量的影响:下表-14为给药第12天后,各组小鼠移植瘤的肿瘤生长重量与抑瘤率情形。
表-14Lewis肺癌的小鼠移植瘤的肿瘤检验结果(x±s)
*表示与模型组比较有显著差异(p<0.05)。
2.对脏器系数的影响:下表-15为给药第12天后,解剖小鼠取出脾、胸腺、肺称重,计算出的各组小鼠的脏器系数情形。
表-15Lewis肺癌的小鼠脏器系数检验结果(x±s)
3.肿瘤体积的变化情形:下表-16显示给药第8~11天每一天分别测得的小鼠肿瘤体积的情形。
表-16第8~11天的小鼠肿瘤体积变化(x±s,cm3)
*表示与模型组比较有显著差异(p<0.05)。n为实际测出肿瘤的只数。
4.小鼠体重的变化情形:下表-17显示给药前、给药第4天、第7天、第10天与第12天分别测得的小鼠体重的变化情形。
表-17Lewis肺癌的小鼠的体重变化情形(x±s,g)
*表示与模型组比较有显著差异(p<0.05)。n为实际测出肿瘤的只数。
结论:
综合以上的实验结果也显示,本发明组合物的高剂量与低剂量试验物质组对Lewis肺癌C57BL/6小鼠移植瘤的瘤重均有抑制作用,且高剂量试验物质组相较于模型组在抑瘤率上具有显著差异。且同样可由试验物质的剂量增加,其抑制效果也增强的情形,说明本发明的组合物(试验物质)确实能有效抑制肿瘤生长,因此仍可以通过控制试验物质的剂量提供更有效的抑制肿瘤作用,虽然本发明之组合物的抑制作用尚无法达到与专门抑癌药物多西他赛相同的水准,但此结果仍可说明本发明的组合物作为保健食品,应有助于强化免疫系统因而可产生抑制肿瘤作用。
<实施例六-动物体内抗肿瘤实验3(人源肺癌)>
本实施例所用组合物(试验物质)的来源与比例同<实施例一>的表-1与表-2所述。
实验材料:
1.实验动物:BABL/c裸小鼠,32只,雌性,体重19.0~24.0克,由上海斯莱克实验动物有限责任公司购买,动物级别:三级。实验动物使用设施许可证号:第113号(IVC屏障系统)。
2.细胞株:A549人肺癌细胞,由四川大学华西医院卫生部移植工程和移植免疫重点实验室提供。
3.实验药物:与<实施例四>相同,在此不再赘述。
4.药物配制:每天要使用前配制,配制方式为将试验物质加入生理食盐水溶解,分别配制浓度为30%(300mg/ml)的高剂量试验物质溶液,及浓度为20%(200mg/ml)的低剂量试验物质溶液。
取多西他赛注射液一瓶(0.5ml),先用1.5ml专用溶剂进行稀释,然后再加入8.0ml的生理食盐水,配制成浓度为0.2%(2mg/ml)的药液。每次要使用前,吸取一定量的0.2%浓度的多西他赛药液,按照多西他赛:生理食盐水为1:7的比例加入生理食盐水稀释,配制成0.025%(0.25mg/ml)的药液供试验用。
5.仪器:与<实施例四>相同,在此不再赘述。
试验流程:
1.以常规方式进行A549细胞的传代培养,收获处于对数生长期的A549细胞,分别在每只小鼠左前肢腋窝皮下接种细胞悬浮液0.2ml(约含细胞数2×106个),待肿瘤长大时作为种鼠供实验用。无菌剥离种鼠肿瘤,按比例加入生理食盐水(比例为1g:3ml),制成细胞悬浮液。
2.将制备好的细胞悬浮液依照0.2ml/只,接种在32只裸鼠左前腋窝下,按照体重随机分为4组,每组9只实验动物,分别为高剂量试验物质组(12g/kg)、低剂量试验物质组(8g/kg)、多西他赛对照组(5mg/kg)及不投药的模型组。
3.在接种细胞悬浮液的第2天按组别开始给药,多西他赛对照组采腹腔注射(ip)给药,单次单药给药容量为0.2ml·10g-1,隔日一次,视裸鼠状态适当添减。多西他赛共给药9天。高剂量、低剂量试验物质组则灌胃给药,单次给药容量为0.2ml·10g-1,每日二次(上、下午各一次),视裸鼠状态适当添减,共给药18天。在给药第12天开始量测肿瘤体积,共测量肿瘤体积5次(V=0.52×移植瘤长径L×移植瘤最短径W2)。在开始给药的第24天停止实验,牺牲小鼠,整个试验过程共记录小鼠体重8次。剥取肿瘤,计算抑瘤率%=[1-(给药组平均瘤重/阴性组平均瘤重)]×100%,解剖小鼠取出脾、胸腺、肺称重,计算脏器系数(脏器系数=脏器重量/去瘤重后的体重×100)。
4.统计分析:计量资料以Mean±S.D.(x±s)表示,采用SPSS11.5统计软件,进行组间t检验。
试验结果:
1.对肿瘤体积的影响:下表-18显示给药第12天、第16天、第19天、第21天与第23天分别测得的A549肺癌裸鼠肿瘤体积的变化情形。
表-18A549肺癌裸鼠的肿瘤体积变化情形(x±s,cm3)
n为实际测出肿瘤的只数
2.对肿瘤重、抑瘤率及脏器系数的影响:下表-19为给药第24天后,各组裸鼠移植瘤的肿瘤生长重量与抑瘤率情形,以及解剖小鼠取出脾、胸腺、肺称重,计算出的各组小鼠的脏器系数情形。
表-19A549肺癌裸鼠肿瘤瘤重、抑瘤率与脏器系数(x±s)
*表示与模型组比较有显著差异(p<0.05)。**表p<0.01的显著差异。
3.裸鼠体重的变化情形:下表-20显示给药前、给药第4天、第7天、第10天与第12天分别测得的小鼠体重的变化情形。
表-20A549肺癌裸鼠的体重变化情形(x±s,n=8,g)
*表示与模型组比较有显著差异(p<0.05)。
结论:
综合以上的实验结果也显示,本发明组合物的高剂量与低剂量试验物质组都可对A549人源肺癌的肿瘤产生显著的抑制效果,但12g/kg与8g/kg的给药剂量,其药效并无明显差异,显然给药剂量虽然给到12g/kg,应该到8g/kg即可产生显著的抑癌作用。据此说明本发明的组合物有助于强化免疫系统因而可产生有效的抑制肿瘤作用。
在本说明书中被引述的所有专利和文献以其整体被并入本案作为参考资料。若有所冲突时,本案详细说明(包含界定在内)将占上风。
虽然通过参照本发明的某些优选实施方式,已经对本发明进行了描述,但本领域的普通技术人员应该明白,可以在形式上和细节上对其作各种改变,而不偏离本发明的精神和范围。

Claims (2)

1.一种保健食品组合物;其特征在于:包含:
20~50wt%的综合维生素组份、5~30wt%的葡萄籽萃取物组份、0.5~12wt%的绿藻萃取物组份、5~30wt%的凤梨酵素组份、15~50wt%的柑橘类黄酮素组份、1~15wt%的姜黄素萃取物组份、0.1~5wt%的叶黄素萃取物组份、0.1~1wt%的沉香组份、0.1~1wt%的矿物质组份,及5~15wt%的蓝莓萃取物组份。
2.如权利要求1所述的保健食品组合物,其特征在于:所述保健食品组合物包含25wt%的综合维生素组份、10wt%的葡萄籽萃取物组份、5wt%的绿藻萃取物组份、15wt%的凤梨酵素组份、20wt%的柑橘类黄酮素组份、10wt%的姜黄素萃取物组份、4wt%的叶黄素萃取物组份、0.5wt%的沉香组份、0.5wt%的矿物质组份,及10wt%的蓝莓萃取物组份。
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