DE60037838T2

DE60037838T2 - Verfahren zur Reinigung von Proanthocyanidin-Oligomeren

Info

Publication number: DE60037838T2
Application number: DE60037838T
Authority: DE
Inventors: Shinkichi Honda; Tomoya c/o Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd Takahashi; Ayako c/o Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Kamimura; Takako Matsuoka; Tomomasa c/o Asahi Breweries Kanda; Akio Yanagida; Kazuo Hieda
Original assignee: Asahi Breweries Ltd; Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: Asahi Breweries Ltd; Kyowa Kirin Co Ltd
Priority date: 1999-04-23
Filing date: 2000-03-03
Publication date: 2008-12-11
Anticipated expiration: 2020-03-04
Also published as: JP2010241840A; CA2370238A1; WO2000064883A1; HK1043361A1; CN1495260A; US6800433B1; EP1632486A2; JP4582917B2; DE60037838D1; CN1495178A; EP1666476B1; NZ515078A; CN1356994A; DE60030276D1; EP1632486B1; DE60030276T2; ATE396983T1; EP1632486A3; DE60039080D1; CN1151143C

Description

VERFAHREN ZUR REINIGUNG VON PROANTHOCYANIDIN-OLIGOMEREN
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum effizienten Reinigen von Proanthocyanidin-Oligomeren mit hoher Reinheit, welche eine Vielzahl biologischer Aktivitäten, einschließlich antitumorale, entzündungshemmende, Antialterungs-, antioxidative, antiallergische, antibakterielle sowie Haarwuchs-Aktivitäten, aufweisen und nützlich in Nahrungsmitteln, Kosmetika, Arzneimitteln oder dergleichen angewandt werden können.
Proanthocyanidin, welches als eine biologische Schutzsubstanz höherer Pflanzen bekannt ist, ist generell ein Oberbegriff für Polymere in der Form eines Dimers oder von höherem Grad, welche über Bindungsformate, wie 4β→6, 4β→8, 4β→8·2βO→7, mit Flavan-7-ol als einer konstituierenden Einheit polymerisiert sind. Diese werden auch als kondensierte Tannine bezeichnet (E. Steinegger/R. Hänsel, "Pharmacognosy [1^st Vol.], Approach to Chemistry and Pharmacology" (übersetzt von Shuji Itokawa et al., Hirnkawa Publishing Co.) (1977) 204–208; Porter L. J., Flavans and proanthocyanidins, in: Harborne J. B. (Ed.), "The Flavonoids, Advances in Research Science 1986", Chapman & Hall (1994) 23–55). Diese werden allgemein Proanthocyanidin genannt, weil sie Anthocyanidin erzeugen und bei saurer Behandlung rot werden. Von Proanthocyanidinen ist bekannt, dass sie eine Vielzahl von biologischen Aktivitäten zeigen. Zu den Aktivitäten, über die berichtet wurde, gehören antitumorale, entzündungshemmende, Antialterungs-, antioxidative, antiallergische, antibakterielle und Haarwuchs-Aktivitäten [Bart Schwitters/Jack Masquelier, "21^st century Biophylaxis Substance OPC", übersetzt von Akira Sasaki, Fragrance Journal (1997) 50–135; Tomoya Takahashi et al., Journal of Investigative Dermatology, 112 (1999) 310–316]. Noch nicht alle Beziehungen zwischen Struktur und Aktivität, die zwischen diesen biologischen Aktivitäten und dem Grad der Polymerisation von Proanthocyanidinen bestehen, sind geklärt worden. Was beispielsweise die Haarwuchsaktivität betrifft, wurde von dimeren bis pentameren Proanthocyanidin-Oligomeren (insbesondere dimeren und trimeren) in Proanthocyanidinen berichtet, dass sie die höchste Aktivität haben ( WO96/00561 ).
Hinsichtlich der Trennung und Reinigung von Proanthocyanidinen aus Pflanzenteilen wurden Versuche unternommen, Proanthocyanidine aus verschiedenen Pflanzenteilen, einschließlich Traubenkerne, Kiefernrinden, Gingkoblätter, Erdnüsse und Kakaobohnen, zu separieren und zu reinigen. Zu Beispielen für eine industrielle Extraktion aus Rohmaterialien wie diesen gehören die Extraktion aus Traubenkernen (Japanische veröffentlichte ungeprüfte Anmeldung Nr. 3-200781 , WO97/39632 , US5484594 ), Kiefernrinde ( US4698360 , WO97/44407 ) oder dergleichen. In dem Verfahren gemäß der japanischen veröffentlichten ungeprüften Anmeldung Nr. 3-200781 wird eine Vorbehandlung durchgeführt, indem man Kerne weißer Trauben bei weniger als 70°C in Kontakt mit Wasser kommen lässt, gefolgt von einer Extraktion mit heißem Wasser. Der so erhaltene Extrakt wird auf eine Sephadex LH-20^TM-Säule aufgebracht und dann mit 70% Ethanol eluiert, wodurch ein Proanthocyanidine enthaltendes Pulver mit einer Reinheit von ungefähr 90% erhalten wird. In dem Verfahren gemäß US4698360 wird 1 Tonne Pinasterrinde einer Heißwasserextraktion unter Druck unterzogen, und dann werden eine Elution mit Ethylacetat sowie Fällung durch Zugabe von Chloroform wiederholt, so dass ein Proanthocyanidine enthaltendes Pulver erhalten wird. Allerdings enthält keines der aus den vorstehenden Verfahren resultierenden gereinigten Produkte 90% oder mehr an dimeren bis pentameren Proanthocyanidin-Oligomeren allein. Alle diese gereinigten Produkte enthalten auch Monomere, hexamere oder höhergradige Polymere oder andere organische Säuren.
Als ein Verfahren zum Reinigen von Proanthocyanidinen unter Verwendung des Verfahrens der Gegenstrom-Flüssig-Flüssig-Verteilung wird zum Beispiel ein Verfahren, bei dem Wasser und Ethylacetat verwendet werden, in Andrew G. H. Lea, J. Sci. Fd. Agric. 29 (1978) 471–477, in der japanischen veröffentlichten ungeprüften Patentanmeldung Nr. 61-16982 und dergleichen beschrieben.
Als ein Verfahren zum Reinigen von Proanthocyanidinen unter Verwendung der Fest-Flüssig-Extraktion wird zum Beispiel ein Verfahren, bei dem Ethylacetat verwendet wird, in der Japanischen veröffentlichten ungeprüften Patentanmeldung Nr. 8-176137 und in EP0707005 beschrieben. Es werden beispielsweise 100 kg zerkleinerte Trauben mit einem gemischten Lösungsmittel aus Wasser (1650 l), Natriumchlorid (300 kg) und Aceton (550 l) extrahiert. Danach wird das Aceton mittels Destillation entfernt, um den Rückstand zu erhalten. Der Rückstand wird dann einer Fest-Flüssig-Extraktion unter Verwendung von Ethylacetat unterzogen, und dann wird Dichlorethan (45 l) dazu gegeben, wodurch 1,5 kg bis 2,5 kg einer Proanthocyanidin-Abscheidung erhalten werden ( EP0707005 ).
Weiterhin gehören zu bekannten Verfahren zum Reinigen von Proanthocyanidinen unter Anwendung von Chromatographie ein Verfahren, bei dem die vorstehende Sephadex LH-20^TM-Säule verwendet wird (ein Verfahren zur Extraktion aus Traubenkernen, japanische veröffentlichte ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 3-200781 ), sowie ein Verfahren, bei dem Adsorptionsharz auf der Basis von Polystyrol verwendet wird (ein Verfahren zur Extraktion aus roten Bohnen, japanische veröffentlichte geprüfte Patentanmeldung Nr. 7-62014 ). Zum Beispiel wird das Adsorptionsharz auf Basis von Polystyrol "Sepabeads SP-850^TM" (MITSUBISHI CHEMICAL CORPORATION) zu Wasser gegeben, welches durch Eintauchen getrockneter roter Bohnen in selbiges erhalten wurde, und das Gemisch wird gerührt, wodurch Proanthocyanidine am Harz adsorbieren können. Danach wird das Harz bei weniger als 70°C getrocknet und dann mit 80% (Vol./Vol.) Ethanol bei 70°C eluiert, so dass Proanthocyanidine enthaltendes Rohpulver mit einer Reinheit von ungefähr 60% erhalten werden kann.
Alle diese Verfahren dienen jedoch zum Reinigen von Proanthocyanidin-Gemischen unabhängig vom Polymerisationsgrad. Das heißt, diese Verfahren dienen nicht der effizienten und selektiven Gewinnung von dimeren bis pentameren Proanthocyanidin-Oligomeren. Ihre Rückgewinnungsquote für dimere bis pentamere Proanthocyanidin-Oligomere ist niedrig.
Hinsichtlich der Trennung von Proanthocyanidinen gemäß ihrem Polymerisationsgrad ist ein Verfahren unter Verwendung der Normalphasen-Kieselgel-Flüssigchromatographie bekannt (ein Verfahren zur Extraktion aus Kakaobohnen: J. Rigaud et al., J. Chromatogr. A, 654 (1993) 255–260; ein Verfahren zur Extraktion aus Traubenkernen: Corine Prieur et al., Phytochemistry 36 (1994) 781–784). Das erstere Verfahren umfasst das Aufbringen einer Proanthocyanidine enthaltenden Probelösung, welche durch Methanolextraktion aus Kakaobohnen erhalten wurde, auf eine Kieselgel-Säule, gefolgt von Gradientenelution unter Verwendung eines gemischten Lösungsmittels aus Dichlormethan:Methanol:Ameisensäure:Wasser [(41→5):(7→43):1:1] als mobile Phase. Das letztere Verfahren umfasst das Aufbringen einer Proanthocyanidine enthaltenden Probelösung, welche durch Methanolextraktion aus Traubenkernen erhalten wurde, auf eine Kieselgel-Säule, gefolgt von Gradientenelution unter Verwendung eines gemischten Lösungsmittels aus Dichlormethan:Methanol:Wasser:Trifluoressigsäure [(82→10):(18→86):2:0,05] als mobile Phase.
Gariboldi E. et al., Pharmaceutical Research, Bd. 15, Nr. 6, 1998, Seiten 936–943 untersuchten analytische Methoden zur schnellen Charakterisierung von Verbindungen in komplexen Gemischen, wobei die vorherige zeitaufwändige Isolierung vermieden wurde. Das Ziel dieser Untersuchung war, die Verbindungen mit Anti-Xanthinoxidase-Eigenschaften zu identifizieren. Zu diesem Zweck wurde Elektrospray-Tandem-Massenspektrometrie (ESI-MS-MS), gekoppelt mit UV- und Diodenarray-LC-Methoden, angewendet.
Eine Untersuchung von Hammerstone, J. F. et al., J. Agric. Food Chem., Bd. 47, 1999, Seiten 490–496, betrifft die Trennung und Identifizierung von monomeren und oligomeren Procyanidinen in Kakao und Schokolade unter Verwendung eines modifizierten Normalphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographieverfahrens (HPLC), gekoppelt mit einer Online-Massenspektrometrieanalyse (MS) unter Verwendung einer Elektrospray-Kammer mit Atmosphärendruck-Ionisierung. Die chromatographische Trennung wurde unter Verwendung einer stationären Siliciumdioxidphase in Kombination mit einem Gradienten mit steigender Polarität, erreicht.
Allerdings sind diese Verfahren mit derartigen Problemen verbunden, dass Rückgewinnung und Wiederverwendung von Lösungsmitteln wegen der Verwendung eines chlorhaltigen Lösungsmittels und der Komplikation einer Lösungsmittelzusammensetzung schwierig sind. Ferner ist eine Gradientenelution zum Anwenden von Konzentrationsgradienten auf eine mobile Phase erforderlich. Deshalb sind diese Verfahren im Hinblick auf Sicherheit und Wirtschaftlichkeit nicht geeignet für eine auf Massenreinigung orientierte industrielle Trennung.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum effektiven Reinigen dimerer bis pentamerer Proanthocyanidin-Oligomere mit hoher Reinheit aus Rohmaterialien, die Proanthocyanidine oder rohe Reinigungsprodukte davon enthalten, bereitzustellen.
Eine Kombination herkömmlicher Verfahren ist nicht gut genug, um andere Substanzen als die Zielkomponenten, bei welchen es sich um dimere bis pentamere Proanthocyanidin-Oligomere handelt, zu entfernen, zum Beispiel die Proanthocyanidine konstituierenden Monomere, wie Flavonoide, Catechin oder Epicatechin, hexamere oder höhergradige hochpolymere Proanthocyanidin-Polymere oder andere Verunreinigungen. Das heißt, es ist schwierig, effizient in hoher Reinheit dimere bis pentamere Proanthocyanidin-Oligomere zu erhalten, welche Zielkomponenten dieser Erfindung sind. Außerdem sind die meisten der bekannten Verfahren im Hinblick auf die Komplikation einer verwendeten Lösungsmittelzusammensetzung, auf Wirtschaftlichkeit, Sicherheit oder dergleichen nicht geeignet für industrielle Abläufe.
Als Ergebnis eingehender Untersuchungen zur Lösung dieser Probleme haben wir ein Verfahren zur effizienten Reinigung dimerer bis pentamerer Proanthocyanidin-Oligomere in hoher Reinheit vollendet.
In einem ersten Aspekt wird ein Verfahren zum Reinigen dimerer bis pentamerer Proanthocyanidin-Oligomere offenbart, welches das Extrahieren der Proanthocyanidin-Oligomere durch ein Fest-Flüssig-Extraktionsverfahren, unter Verwendung von Methylacetat als einer Flüssigphase, aus Rohmaterialien, die die Proanthocyanidin-Oligomere oder rohe Reinigungsprodukte davon enthalten, umfasst.
Als die vorstehende Flüssigphase kann Methylacetat als ein einziges Lösungsmittel verwendet werden, oder als ein gemischtes Lösungsmittel, bei dem es sich um eine Kombination von Methylacetat und einem mit Methylacetat mischbaren organischen Lösungsmittel handelt, und welches durch Zufügen eines solchen organischen Lösungsmittels zu Methylacetat hergestellt wird.
In einem zweiten Aspekt wird ein Verfahren zum Reinigen dimerer bis pentamerer Proanthocyanidin-Oligomere offenbart, welches die Vorbehandlung von Rohmaterialien, in denen die Proanthocyanidin-Oligomere, rohe Reinigungsprodukte davon oder eine Lösung, die eines von diesen enthält, enthalten sind, mit einem Enzym zur Hydrolyse umfasst.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Reinigung dimerer bis pentamerer Proanthocyanidin-Oligomere mit einem einheitlichen Polymerisationsgrad bereit, in welchem die Proanthocyanidin-Oligomere gemäß ihrem Polymerisationsgrad aus Rohmaterialien, welche die Proanthocyanidin-Oligomere oder rohe Reinigungsprodukte davon enthalten, mittels Normalphasen-Kieselgel-Flüssigchromatographie gemäß isokratischer Elution getrennt und gereinigt werden, wobei als mobile Phase ein einzelnes Lösungsmittel oder ein gemischtes Lösungsmittel aus zwei oder mehreren Lösungsmitteln, ausgewählt aus einem Esterlösungsmittel, einem Ketonlösungsmittel, einem Kohlenwasserstofflösungsmittel, einem Etherlösungsmittel und einem Alkohollösungsmittel, verwendet wird. Vorzugsweise wird ein gemischtes Lösungsmittel aus zwei oder mehreren Lösungsmitteln als die vorstehende mobile Phase verwendet.
Ferner kann die vorliegende Erfindung gereinigte dimere bis pentamere Proanthocyanidin-Oligomere mit einer Reinheit von 90% (Gew./Gew.) oder mehr, dimere Proanthocyanidine mit einer Reinheit von 90% (Gew./Gew.) oder mehr, und trimere Proanthocyanidine mit einer Reinheit von 90% (Gew./Gew.) oder mehr, welche durch die vorstehenden Reinigungsverfahren erhältlich sind, bereitstellen.
Proanthocyanidine sind kondensierte Tannine, die in verschiedenen Pflanzenteilen vorkommen und eine Grundstruktur besitzen, in welcher Flavan-7-ol durch Bindung über 4β→6, 4β→8, 4β→8·2βO→7 oder dergleichen sequentiell kondensiert oder polymerisiert ist. In dieser Beschreibung sind Dimere bis Pentamere von Proanthocyanidinen und Hexamere oder höhergradige Polymere von Proanthocyanidinen als Proanthocyanidin-Oligomere beziehungsweise Proanthocyanidin-Polymere definiert. Darüber hinaus ist ein Flavan-7-ol-Monomer als ein Proanthocyanidine konstituierendes Monomer definiert. Zu Beispielen für Proanthocyanidin-Oligomere gehören Proanthocyanidine, wie Procyanidin, Prodelphinidin und Propelargonidin, sowie alle Stereoisomere davon. Ein Proanthocyanidine konstituierendes Monomer wird mit der nachstehenden Formel (I) gezeigt:
(worin R¹, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ gleich oder verschieden sind und für ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe oder eine Galloylgruppe stehen).
Zu Beispielen für Rohmaterialien oder rohe Reinigungsprodukte davon, die in dieser Erfindung verwendet werden, gehören alle, die Proanthocyanidin-Oligomere enthalten, und zu besonders bevorzugten Beispielen von diesen gehören pflanzliche Rohmaterialien, wie Früchte, Samenhüllen, Samen und Rinden von Pflanzen, Extrakte davon sowie rohe Reinigungsprodukte davon. Es sind beispielsweise jene bevorzugt, die reich im Gehalt an Proanthocyanidin-Oligomeren sind, einschließlich Saft von Früchten oder Extrakte von Samenhüllen oder Samen von Trauben, Persimonen, Äpfeln, Blaubeeren, Preiselbeeren oder dergleichen; oder Extrakte aus der Epidermis von Erdnüssen, Kastanien oder dergleichen, aus Schalen von Gerstenkleie oder Buchweizen, Blättern der Persimone, aus Kiefernrinde, Palme oder dergleichen.
Des Weiteren können Rohprodukte oder rohe Reinigungsprodukte davon, die durch nichtenzymatische oder enzymatische Verfahren erhalten wurden, ebenfalls als Rohmaterialien verwendet werden. Zu Beispielen für ein Syntheseverfahren zur Synthese von Proanthocyanidin-Oligomeren gehören ein Herstellungsverfahren für ein Dimer von Epicatechin oder Catechin, welches in Journal of Chemical Society Perkin Transaction I (1983) 1535–1543 beschrieben ist, und ein Herstellungsverfahren für ein Trimer von Epicatechin oder Catechin, welches in Phytochemistry 25 (1986) 1209–1215 beschrieben ist. Rohprodukte oder rohe Reinigungsprodukte davon, die gemäß diesen Verfahren oder in einer ähnlichen Weise erhalten wurden, können auch als Rohmaterialien für das Verfahren dieser Erfindung verwendet werden.
Ein flüchtiges organisches Lösungsmittel ist bevorzugt als das mit Methylacetat mischbare organische Lösungsmittel, welches für den ersten hier offenbarten Aspekt verwendet wird. Zu Beispielen für solche organische Lösungsmittel gehören Alkohollösungsmittel, wie Methanol, Ethanol, Propanol und Butanol; Esterlösungsmittel, wie Methylformiat, Ethylformiat und Ethylacetat; Ketonlösungsmittel, wie Aceton; Nitrillösungsmittel, wie Acetonitril; Etherlösungsmittel, wie Tetrahydrofuran und 1,2-Dimethoxyethan; Kohlenwasserstofflösungsmittel, wie Hexan; und Carbonsäurelösungsmittel, wie Essigsäure. Wenn ein mit Methylacetat mischbares organisches Lösungsmittel verwendet wird, enthält das gesamte Extraktionslösungsmittel vorzugsweise Methylacetat zu 50% (Volumen) oder mehr, stärker bevorzugt zu 70% (Volumen) oder mehr, und noch stärker bevorzugt zu 90% (Volumen) oder mehr.
Beispiele für das Enzym zur Hydrolyse, das im zweiten hier offenbarten Aspekt verwendet wird, schließen Glycosidase und Esterase ein.
Beispiele für Glycosidase umfassen eine einzige Substanz oder ein Gemisch aus zwei oder mehreren Substanzen, ausgewählt aus Amylase, Cellulase, Glucanase, Xylanase, Glucosidase, Dextranase, Chitinase, Galacturonase, Lysozym, Galactosidase, Mannosidase, Fructofuranosidase, Trehalase, Glucosaminidase, Pullulanase, Ceramidase, Fucosidase und Agarase. Beispiele für Esterase umfassen eine einzige Substanz oder ein Gemisch aus zwei oder mehreren Substanzen, ausgewählt aus Carboxyesterase, Arylesterase, Lipase, Acetylesterase, Cholinesterase, Pectinesterase, Cholesterolesterase, Chlorophyllase, Lactonase, Tannase und Hydrolase.
Im zweiten hier offenbarten Aspekt umfassen Beispiele für die Lösung, die Rohmaterialien, welche dimere bis pentamere Proanthocyanidin-Oligomere enthalten, oder rohe Reinigungsprodukte davon enthält, im Allgemeinen eine wässrige Lösung oder eine wässrige Lösung, die 10% oder weniger eines organischen Lösungsmittels, etwa Alkohol, Ester oder Keton, enthält.
Gemäß der vorliegenden Erfindung gehören zu Beispielen für das als mobile Phase verwendete Esterlösungsmittel Methylformiat, Ethylformiat, Propylformiat, Isopropylformiat, Butylformiat, Isobutylformiat, Methylacetat, Ethylacetat, Propylacetat, Isopropylacetat, Butylacetat, Isobutylacetat, Methylpropionat, Ethylpropionat, Propylpropionat, Isopropylpropionat, Butylpropionat, Isobutylpropionat, Methylbutyrat, Ethylbutyrat, Propylbutyrat, Isopropylbutyrat, Butylbutyrat und Isobutylbutyrat. Zu Beispielen für das Ketonlösungsmittel gehören Aceton, Methylethylketon, Methylpropylketon, Methylisopropylketon, Methylbutylketon, Methylisobutylketon, Methyl-t-butylketon, Diethylketon, Diisopropylketon, Methylvinylketon, Cyclobutanon, Cyclopentanon und Cyclohexanon. Zu Beispielen für das Kohlenwasserstofflösungsmittel gehören Pentan, Hexan, Heptan, Octan, Nonan, Decan, Nonadecan, Cyclohexan, Xylol und Toluol. Zu Beispielen für das Etherlösungsmittel gehören Tetrahydrofuran und 1,2-Dimethoxyethan. Zu Beispielen für das Alkohollösungsmittel gehören Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, s-Butanol, t-Butanol und dergleichen.
Eine Extraktion und grobe Reinigung aus pflanzlichen Rohmaterialien kann zum Beispiel mit bekannten Verfahren wie nachstehend beschrieben durchgeführt werden.
Pflanzliche Rohmaterialien, einschließlich Pflanzenfrüchte, Samenhüllen, Samen, Umhüllungen, Schalen, Blätter und Rinden, werden als Materialien für die Extraktion nach einem Trocknungsvorgang, wie allgemein Lufttrocknung, verwendet. Die intakten pflanzlichen Rohmaterialien können ebenfalls als Materialien zur Extraktion verwendet werden.
Eine Grobextraktion von Proanthocyanidinen aus den vorstehenden Materialien zur Extraktion kann unter Bezug auf bekannte Verfahren vorgenommen werden [Chem. Pharm. Bull. 38 (1990) 3218; Chem. Pharm. Bull. 40 (1992) 889–898]. Es werden beispielsweise zerquetschte oder zerhackte pflanzliche Rohmaterialien einer Extraktion unter Verwendung eines Lösungsmittels unterzogen. Als Lösungsmittel für die Extraktion kann ein einzelnes oder ein gemischtes Lösungsmittel aus zwei oder mehreren Lösungsmitteln, ausgewählt aus einem hydrophilen Lösungsmittel und einem lipophilen Lösungsmittel, verwendet werden. Zu solchen Lösungsmitteln gehören Wasser, Alkohollösungsmittel, wie Methanol, Ethanol und Isopropanol, Ketonlösungsmittel, wie Aceton und Methylethylketon, sowie Esterlösungsmittel, wie Methylacetat und Ethylacetat. Eine Temperatur für die Extraktion reicht im Allgemeinen von 0 bis 100°C, vorzugsweise von 5 bis 50°C. Ein Material, etwa Samen, das Öl enthält, kann als solches ohne Zerquetschen der Extraktion unterzogen werden. Die Extraktion kann, falls erforderlich, zwei bis drei Mal wiederholt werden. Der unlösliche Rückstand wird durch Filtration oder Zentrifugieren aus der mit dem vorstehenden Schritt erhaltenen Grobextraktlösung entfernt, wobei eine Grobextraktlösung anfällt. Pflanzliche Rohmaterialien, etwa Pflanzensaft, Mark oder dergleichen, können direkt als Materialien für die Extraktion verwendet werden, oder es kann eine konzentrierte Grobextraktlösung aus kondensierten Tanninen unter Bezug auf Agric. Biol. Chem. 45 (1981) 1885–1887 hergestellt werden.
Eine Extraktion und Grobreinigung aus Grobprodukten, die mit einem chemischen Verfahren, wie nicht-enzymatische oder enzymatische Verfahren, erhalten wurden, kann ebenfalls in einer ähnlichen Weise wie die vorstehend beschriebenen vorgenommen werden.
Als Nächstes wird eine detaillierte Beschreibung des erfindungsgemäßen Reinigungsverfahrens mit Beispielen gegeben.
In dem ersten hier offenbarten Aspekt werden dimere bis pentamere Proanthocyanidin-Oligomere gereinigt, indem Rohmaterialien, die die Proanthocyanidin-Oligomere oder rohe Reinigungsprodukte davon enthalten, einer Fest-Flüssig-Extraktion unterzogen werden, wobei entweder ein einzelnes Lösungsmittel aus Methylacetat oder ein gemischtes Lösungsmittel aus Methylacetat und einem organischen Lösungsmittel, das mit Methylacetat mischbar ist, als Flüssigphase verwendet wird. Wenn die Rohmaterialien oder rohen Reinigungsprodukte davon flüssig sind, wird bevorzugt eine vorausgehende Verfestigung durch Sprühtrocknen oder Gefriertrocknen vorgenommen. Im Allgemeinen liegt das Mischungsverhältnis (Gew./Vol.) eines Feststoffes und Methylacetat oder eines Feststoffes und eines gemischten Lösungsmittels aus Methylacetat und einem organischen Lösungsmittel, das mit Methylacetat mischbar ist, bei ungefähr 1:1 bis 1:1000. Die Extraktion wird bei Raumtemperatur oder mit Erwärmen unter Rühren während einer kurzen Zeitspanne durchgeführt. Vorzugsweise liegt das Mischungsverhältnis (Gew./Vol.) eines Feststoffes und Methylacetat oder eines Feststoffes und eines gemischten Lösungsmittels aus Methylacetat und einem organischen Lösungsmittel, das mit Methylacetat mischbar ist, bei 1:5 bis 1:100. Eine Extraktion bei Raumtemperatur während etwa 1 Stunde und die anschließende wiederholte Extraktion (mehrmals) des Rückstandes unter den gleichen Bedingungen sind stärker bevorzugt. Eine feinere Teilchengröße des Pulvers ist für eine effiziente Fest-Flüssig-Extraktion bevorzugt. Wenn die Extraktion unter Verwendung eines gemischten Lösungsmittels durchgeführt wird, ist es bevorzugt, dass durch Mischen der Lösungsmittel das gemischte Lösungsmittel eine Lösungsmittelpolarität analog zu derjenigen von Methylacetat aufweist. Die Fest-Flüssig-Extraktion unter Verwendung dieser Lösungsmittel unterdrückt die Elution von Proanthocyanidin-Polymeren und anderen Verunreinigungen und ermöglicht eine effiziente Reinigung von dimeren bis pentameren Proanthocyanidin-Oligomeren. Im ersten hier offenbarten Aspekt können dimere bis pentamere Proanthocyanidin-Oligomere durch Gefriertrocknung oder Sprühtrocknung gewonnen werden, nachdem der erhaltene Methylacetatextrakt konzentriert und der konzentrierte Rückstand erneut in Wasser oder in einem wässrigen Lösungsmittel, etwa einem Puffer, aufgelöst wurde.
Im zweiten hier offenbarten Aspekt werden dimere bis pentamere Proanthocyanidin-Oligomere gereinigt, indem Rohmaterialien, welche die Proanthocyanidin-Oligomere, rohe Reinigungsprodukte davon oder eine Lösung, die eines davon enthält, enthalten, mit einem Enzym zur Hydrolyse vorbehandelt werden. Die Rohmaterialien oder rohen Reinigungsprodukte davon enthalten im Allgemeinen viele von Proanthocyanidin-Oligomeren verschiedene Verunreinigungen. Insbesondere wenn die Rohmaterialien oder rohen Reinigungsprodukte davon von Pflanzen stammen, sind Polyphenolglycoside, -ester oder dergleichen neben Proanthocyanidin-Oligomeren in einem hohen Anteil vorhanden. Eine Vorbehandlung solcher Glycoside oder Ester, welche Verunreinigungen darstellen, mit der vorstehenden Hydrolase, um Aglycon zu bekommen, ermöglicht eine effiziente Entfernung der Verunreinigungen im nächsten Reinigungsschritt sowie Verbesserungen in der Reinheit der Proanthocyanidin-Oligomere. Durch die Behandlung mit β-Glycosidase führt zum Beispiel Rutin, bei dem es sich um ein Flavonoidglucosid handelt, das in der gesamten Pflanze von Fagopyrum esculentum aus der Familie der Polygonaceae reichlich vorhanden ist, zu Quercetin, welches ein Aglykon ist. Wenn Chlorogensäure und p-Coumaroylchinasäure, welche Hydroxycinnamate sind und in Früchten oder Blättern von Dicotyledonen reichlich enthalten sind, mit Hydroxycinnamat-Hydrolase behandelt werden, werden ihre Depsidbindungen, bei denen es sich um intramolekulare Esterbindungen handelt, hydrolysiert, woraus Kaffeesäure und Chinasäure beziehungsweise p-Coumarinsäure und Chinasäure resultieren. Die Reaktionsbedingungen für die Behandlung mit dem Enzym zur Hydrolyse differieren in Abhängigkeit von der Art der Enzyme oder dergleichen. Die Bedingungen sind im Allgemeinen pH 3 bis pH 8, 25 bis 55°C und 1 bis 24 Stunden. Die vorstehenden Aglykonkomponenten, freien Zucker oder Carbonsäuren, die aus der Behandlung mit dem Enzym zur Hydrolyse resultieren, können mit herkömmlichen Verfahren, etwa Kühlung, Flüssig-Flüssig- oder Fest-Flüssig-Extraktion oder Säulenadsorption, oder mit einer Kombination dieser Verfahren mit Normalphasenchromatographie leicht entfernt werden. Diese Schritte ermöglichen ein effizientes Entfernen von Verunreinigungen in Rohmaterialien, welche dimere bis pentamere Proanthocyanidin-Oligomere oder rohe Reinigungsprodukte davon enthalten, sowie eine Verbesserung in der Reinheit der Zielkomponenten, das heißt der dinieren bis pentameren Proanthocyanidin-Oligomere.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können dimere bis pentamere Proanthocyanidin-Oligomere mit einem einheitlichen Polymerisationsgrad erhalten werden durch Trennung und Reinigung gemäß dem Polymerisationsgrad aus Rohmaterialien, welche die Proanthocyanidin-Oligomere oder rohe Reinigungsprodukte davon enthalten, mittels Normalphasen-Kieselgel-Flüssigchromatographie gemäß isokratischer Elution, wobei als mobile Phase ein einzelnes Lösungsmittel oder ein gemischtes Lösungsmittel aus zwei oder mehreren Lösungsmitteln, ausgewählt aus einem Esterlösungsmittel, einem Ketonlösungsmittel, einem Kohlenwasserstofflösungsmittel, einem Etherlösungsmittel und einem Alkohollösungsmittel, verwendet wird. Bei der vorstehenden Normalphasen-Kieselgel-Flüssigchromatographie kann entweder ein Verfahren unter Verwendung der Chromatographie mit offener Säule oder dasjenige unter Verwendung der Hochleistungsflüssigchromatographie angewandt werden. Ein Lösungsmittel oder Wasser wird aus der Lösung, die dimere bis pentamere Proanthocyanidin-Oligomere enthält, entfernt, und danach wird der Rückstand in einer mobilen Phase oder in einem organischen Lösungsmittel, das in einer mobilen Phase löslich ist, gelöst. Wenn Rohmaterialien oder rohe Reinigungsprodukte davon fest sind, werden sie direkt in einer mobilen Phase oder in einem organischen Lösungsmittel, das in einer mobilen Phase löslich ist, gelöst. Falls nötig, werden sie durch ein Membranfilter oder dergleichen filtriert und dann auf eine Säule aufgebracht. Bei der Elution einer Zielkomponente wird das isokratische Eluieren, bei dem kein Konzentrationsgradient auf eine mobile Phase angewandt wird, hinsichtlich einer Vereinfachung des Vorganges angewandt. Zu Beispielen für eine bevorzugte mobile Phase bei isokratischem Eluieren gehören gemischte Lösungsmittel, wie Hexan/Methanol/Ethylacetat, Hexan/Aceton, Hexan/Methanol/Tetrahydrofuran/Essigsäure, Hexan/Methanol/Tetrahydrouran/Ameisensäure, Hexan/Methanol/Methylacetat/Essigsäure, Hexan/Methanol/Methylacetat und Hexan/Methylacetat/Aceton.
Das Reinigungsverfahren der Erfindung ermöglicht ein effizientes Entfernen von Verunreinigungen, das heißt Monomeren, welche die Proanthocyanidine aufbauen, etwa (+)-Catechin, (+)-Gallocatechin, (–)-Epicatechin und (–)-Epigallocatechin, sowie hexameren oder höhergradigen Proanthocyanidin-Polymeren; und es ermöglicht eine Trennung und Reinigung gemäß dem Polymerisationsgrad von Zielkomponenten, das heißt dimeren bis pentameren Proanthocyanidin-Oligomeren.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit anderen bekannten Verfahren kombiniert werden. Wenn die Reinigungsverfahren kombiniert werden, können die zu verwendenden Schritte und deren Reihenfolge frei gewählt werden.
Mit diesen Verfahren können dimere bis pentamere Proanthocyanidin-Oligomere, dimere Proanthocyanidine und trimere Proanthocyanidine mit hoher Reinheit (Reinheit von 90% (Gew./Gew.) oder mehr) effizient erhalten werden.
Dimere bis pentamere Proanthocyanidin-Oligomere, dimere Proanthocyanidine und trimere Proanthocyanidine, die mit dem Reinigungsverfahren dieser Erfindung gereinigt wurden, können als Rohmaterialien zur Herstellung von Nahrungsmitteln, Kosmetika, Arzneimitteln oder dergleichen verwendet werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 (Referenz) zeigt das Ergebnis einer Umkehrphasen-Flüssigchromatographie. Die Symbole in 1 bezeichnen das Folgende.
1. PB1
2. (+)-Catechin
3. PB2
4. Chlorogensäure
5. Kaffeesäure
6. PC1
7. (–)-Epicatechin
8. p-Cumarinsäureester
9. p-Cumarinsäure
10. Phlorizin
11. Phloretin
2 zeigt das Ergebnis einer Normalphasen-Flüssigchromatographie.
3 zeigt das Ergebnis einer Normalphasen-Flüssigchromatographie.
4 zeigt das Ergebnis einer Umkehrphasen-Flüssigchromatographie. Die Symbole in 4 bezeichnen das Folgende.
1. PB1
2. (+)-Catechin
3. PB2
4. PC1
5. (–)-Epicatechin
[5], [6] Monomer-Fraktionen entsprechend den Fraktionsnummern in 3.
[7]–[11] Dimer-Fraktionen entsprechend den Fraktionsnummern in 3.
[12]–[20] Trimer-Fraktionen entsprechend den Fraktionsnummern in 3.
5 zeigt das Ergebnis einer Normalphasen-Flüssigchromatographie.
6 zeigt das Ergebnis einer Umkehrphasen-Fltissigchromatographie. Die Symbole in 6 bezeichnen das Folgende.
1. PB1
2. (+)-Catechin
3. PB2
4. PC1
5. (–)-Epicatechin
[2]–[4] Monomer-Fraktionen entsprechend den Fraktionsnummern in 5.
[5]–[9]Dimer-Fraktionen entsprechend den Fraktionsnummern in 5.
[10]–[15] Trimer-Fraktionen entsprechend den Fraktionsnummern in 5.
7 zeigt das Ergebnis einer Analyse der Verteilung der Polymerisationsgrade von Proanthocyanidin-Oligomeren.
Als Nächstes wird die vorliegende Erfindung mit Beispielen weiter beschrieben, sie ist aber nicht durch irgendeines dieser Beispiele oder dergleichen eingeschränkt.
Beispiel 1 (Referenz) Reinigung durch Fest-Flüssig-Extraktion (A)
300 ml Methylacetat wurden zu 30 g der in Referenzbeispiel 1 erhaltenen Proanthocyanidin-Fraktion gegeben, und dann wurde eine Fest-Flüssig-Extraktion 1 Stunde lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Extraktion wurde insgesamt zweimal durchgeführt, die zwei aus der Extraktion erhaltenen Extrakte wurden vermischt und dann einer Filtration unterzogen.

Dann wurde der Rückstand aus der Extraktion mit einer kleinen Menge Methylacetat gewaschen. Die Methylacetatextrakte und die Waschflüssigkeit wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt. Eine kleine Menge destilliertes Wasser wurde dazu gegeben und das Einengen unter vermindertem Druck wurde erneut vorgenommen, und die extrahierte Komponente wurde in einer wässrigen Lösung gelöst. Die so erhaltene wässrige Lösung wurde gefriergetrocknet, wobei 17,5 g eines Methylacetat-Extrakts als Pulver anfielen. Im Weiteren wurde der Rückstand aus der Extraktion getrocknet, wobei 12,5 g eines Nicht-Extrakts aus Methylacetat-Extraktion als Pulver anfielen. Die Gehalte der in beiden Pulverprodukten enthaltenen dimeren und trimeren Proanthocyanidin-Komponenten wurden durch Umkehrphasen-Fltissigchromatographie ermittelt, wie in Referenzbeispiel 2 beschrieben. Die ermittelten dimeren Proanthocyanidin-Komponenten waren Procyanidin B1 (Epicatechin- (4β→8)-Catechin; nachstehend mit PB1 abgekürzt) und Procyanidin B2 (Epicatechin-(4β→8)-Epicatechin; nachstehend mit PB2 abgekürzt). Die ermittelte trimere Komponente war Procyanidin C1 (Epicatechin-(4β→8)-Epicatechin-(4β→8)-Epicatechin; nachstehend mit PC abgekürzt). Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse einer Extraktion mit Methylacetat sowie die Ausbeuten (%) eines Feststoffanteils. Tabelle 1

	Ausbeute (g)	Ausbeute Feststoffanteil (%)	PB1		PB2		PC1		PB1 + PB2 + PC1
	Ausbeute (g)	Ausbeute Feststoffanteil (%)	Gehalt (g)	Ausbeute (%)	Gehalt (g)	Ausbeute (%)	Gehalt (g)	Ausbeute (%)	Gehalt (g)	Ausbeute (%)	Reinheit (%)
Probe vor Extraktion	(30,0)		(1,22)		(4,34)		(1,96)		(7,52)		(25,1)
Methylacetat-Extrakt	17,5	58,3	1,16	95,1	4,03	92,8	1,65	84,2	6,84	91,0	39,1
Nicht-Extrakt aus Methylacetat-Extraktion	12,5	41,7	0,06	4,9	0,31	7,2	0,31	15,8	0,68	9,0	5,4

Wie in Tabelle 1 gezeigt, wurden eine selektive Extraktion und Verbesserung der Reinheit der durch PB1, PB2 und PC1 dargestellten Proanthocyanidin-Oligomerkomponenten durch Fest-Flüssig-Extraktion mit Methylacetat effizient erreicht.
Beispiel 2 (Referenz) Reinigung durch Fest-Flüssig-Extraktion (B)

Methylacetat und verschiedene Lösungsmittel wurden in einem Volumenverhältnis von 9:1 gemischt (im Fall von Methylacetat:Hexan ist das Verhältnis 95:5), und somit wurden Lösungsmittel für die Fest-Flüssig-Extraktion hergestellt. Das in diesen verschiedenen Lösungsmitteln verwendete organische Lösungsmittel, das mit Methylacetat mischbar ist, war Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, Ethylformiat, Ethylacetat, Aceton, Acetonitril, Tetrahydrofuran, Hexan oder Essigsäure. 10 ml des Lösungsmittels zur Extraktion wurden zu jeweils 1 g der in Referenzbeispiel 1 erhaltenen Proanthocyanidin-Fraktion gegeben und das Gemisch wurde 1 Stunde lang einer Fest-Flüssig-Extraktion bei Raumtemperatur unterzogen (einfache Extraktion). Nach der Entfernung fester Komponenten aus dem Extrakt mittels Zentrifugieren wurde eine bestimmte Menge des Extrakts 100-fach mit destilliertem Wasser verdünnt (0,01 → 1 ml). Dann wurden die Gehalte an PB1, PB2 und PC1 mittels der in Referenzbeispiel 2 beschriebenen Umkehrphasen-Flüssigchromatographie ermittelt. Gleichzeitig wurde 1 ml von jedem der Extrakte abgenommen, um die Lösungsmittel zu entfernen, und dann gefriergetrocknet, wodurch die Menge eines festen Extrakts bestimmt wurde. Tabelle 2 zeigt die Extraktionseffizienzen und Ausbeuten (%) eines Feststoffanteils für PB1, PB2 und PC1 in dem Extrakt aus der Fest-Flüssig-Extraktion mit jedem Extraktionslösungsmittel. Und es wurde auch als Vergleichsbeispiel eine Fest-Flüssig-Extraktion mit Ethylacetat allein in einer ähnlichen Weise wie der vorstehend beschriebenen durchgeführt (mit der Ausnahme, dass 20 ml Ethylacetat für 2 g der Proanthocyanidin-Fraktion verwendet wurden). Tabelle 2 zeigt auch die Ergebnisse aus dem Vergleichsexperiment. Tabelle 2

Lösungsmittel zur Extraktion	Ausbeute Feststoffanteil (%)	PB1 (mg)	PB2 (mg)	PC1 (mg)	PB1 + PB2 + PC1
Lösungsmittel zur Extraktion	Ausbeute Feststoffanteil (%)	PB1 (mg)	PB2 (mg)	PC1 (mg)	Menge an Extrakt (mg)	Ausbeute (%)	Reinheit (%)
Unbehandelt mit Lösungsmittel zur Extraktion	(100)	36,4	136,1	63,0	235,5	(100)	23,6
Ethylacetat (Vergleichsbeispiel)	9,8	6,2	24,3	7,0	37,5	15,1	38,3
100% Methylacetat	39,9	25,9	87,7	31,1	144,7	61,5	36,3
Methylacetat/Methanol (9/1)	82,8	39,5	137,1	62,7	239,3	101,6	28,9
Methylacetat/Ethanol (9/1)	80,5	39,8	140,1	64,6	244,4	103,8	30,4
Methylacetat/Propanol (9/1)	77,2	38,9	134,0	62,4	235,3	99,9	30,5
Methylacetat/Butanol (9/1)	79,0	38,4	136,6	62,7	237,7	100,9	30,1
Methylacetat/Ethylformiat (9/1)	40,0	26,3	89,9	31,1	147,3	62,5	36,8
Methylacetat/Ethylaceta(9/1)	39,6	25,4	86,6	30,1	142,1	60,3	35,9
Methylacetat/Aceton (9/1)	56,1	33,5	120,7	50,2	204,4	86,8	36,5
Methylacetat/Acetonitril (9/1)	59,3	35,8	123,2	51,3	210,4	89,3	35,5
Methylacetat/Tetrahydrofuran (9/1)	83,7	34,4	120,1	51,3	205,8	87,4	24,6
Methylacetat/Essigsäure (9/1)	70,5	38,3	131,1	56,5	225,9	95,9	32,1
Methylacetat/Hexan (95/5)	15,7	10,7	41,0	9,9	61,6	24,8	39,2

Beispiel 3 (Referenz) Reinigung durch Fest-Flüssig-Extraktion (C)

Methylacetat und Ethylacetat wurden in einem Volumenverhältnis, wie in Tabelle 3 gezeigt, gemischt und dann wurde eine Fest-Flüssig-Extraktion durchgeführt. Jeweils 10 ml der Lösungsmittel zur Extraktion bei einem betreffenden Volumenverhältnis wurden zu 1 g der in Referenzbeispiel 1 erhaltenen Proanthocyanidin-Fraktion gegeben, gefolgt von einer Fest-Flüssig-Extraktion bei 30°C während 1,5 Stunden. Dieser Schritt wurde dreimal wiederholt. Diese Extrakte wurden vereinigt, unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet, wodurch Pulverprodukte (Extrakte) erhalten wurden. Die Gehalte an PB1, PB2 und PC1 in den Pulverprodukten wurden mittels der in Referenzeispiel 2 beschriebenen Umkehrphasen-Fltissigchromatographie ermittelt. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse der Extraktion mit einem Lösungsmittel bei einem betreffenden Volumenverhältnis, einschließlich der Ausbeuten (%) eines Feststoffanteils, der Mengen des Extrakts und jeweiligen Ausbeuten von PB1, PB2 und PC1, sowie der Mengen des Extrakts, Ausbeuten (%) und Reinheit der Gesamtheit von PBl, PB2 und PC1. Tabelle 3

Lösungsmittel zur Extraktion	Ausbeute Feststoffanteil (%)	PB1 (mg) (%)	PC2 (mg) (%)	PC1 (mg) (%)	PB1 + PB2 + PC1
Lösungsmittel zur Extraktion	Ausbeute Feststoffanteil (%)	PB1 (mg) (%)	PC2 (mg) (%)	PC1 (mg) (%)	Menge an Extrakt (mg)	Ausbeute (%)	Reinheit (%)
Unbehandelt mit Lösungsmittel zur Extraktion	100	39,9 (100)	153,4 (100)	66,9 (100)	260,2	100	26
Ethylacetat (Vergleichsbeispiel)	34,9	23,0 (57,6)	90,4 (58,9)	28,7 (42,9)	142,1	54,6	40,7
Ethylacetat/Methylacetat (9/1)	39,2	25,8 (64,7)	100,9 (65,8)	32,3 (48,3)	159	61,1	40,6
Ethylacetat/Methylacetat (7/3)	42,5	28,6 (71,7)	110,2 (71,8)	35,5 (53,1)	174,3	67	41
Ethylacetat/Methylacetat (5/5)	46,5	31,0 (77,7)	121,0 (78,9)	39,9 (59,6)	191,9	73,8	41,3
Ethylacetat/Methylacetat (3/7)	51	33,8 (84,7)	130,1 (84,8)	44,5 (66,5)	208,4	80,1	40,9
Ethylacetat/Methylacetat (1/9)	51,6	33,0 (82,7)	127,7 (83,2)	45,4 (67,9)	206,1	79,2	39,9
Ethylacetat/Methylacetat (1/10)	52,4	33,3 (83,5)	128,9 (84,0)	47,1 (70,4)	209,3	80,4	39,9

Wie in Tabelle 3 gezeigt wurden durch Fest-Flüssig-Extraktion mit einem Methylacetat enthaltenden Lösungsmittel zur Extraktion eine selektive Extraktion und Verbesserung der Ausbeuten an Proanthocyanidin-Oligomerkomponenten, dargestellt durch PB1, PB2 und PC1, effizient erreicht.
Beispiel 4 (Referenz) Reinigung kombiniert mit Enzymolyse-Behandlung
Der in Referenzbeispiel 1 erhaltene Polyphenol-Extrakt wurde mit einer kommerziell erhältlichen Enzymzubereitung für die Nahrungsmittelverarbeitung behandelt. Die hier verwendeten Enzymzubereitungen waren eine Lipasezubereitung, abgeleitet vom Genus Aspergillus (Lipase Sankyo^TM, SANKYO CO., LTD.), und eine Hydrolasezubereitung (Hydroxycinnamat-Hydrolase (Seishin Co., Ltd.)). 100 ml des Polyphenol-Extrakts wurden vorausgehend mit 5 mol/l NaOH auf den pH-Wert 5 eingestellt und 10-fach mit destilliertem Wasser verdünnt, wodurch eine Probelösung erhalten wurde. Jeweils 1 g der vorstehenden Lipasezubereitung und der vorstehenden Hydrolasezubereitung wurden zu 1 lder Probelösung gegeben (Endkonzentration: 0,1%), und man ließ 16 Stunden lang bei 45°C eine enzymatische Reaktion ablaufen. Die Ergebnisse einer in Referenzbeispiel 2 beschriebenen Analyse mit Umkehrphasen-Flüssigchromatographie, die an der Probelösung vor der Reaktion und nach der Reaktion vorgenommen wurde, sind in 1-a beziehungsweise 1-b gezeigt. Wie in der Abbildung gezeigt, verschwand das meiste der Hauptverunreinigungen, Chlorogensäure und Phlorizin, und statt dessen nahmen freie Kaffeesäure, p-Coumarinsäure und Phloretin auf Grund der vorstehenden enzymatischen Reaktion zu. Als Nächstes wurde die Lösung nach der Reaktion konzentriert und dann einer Sprühtrocknung unterzogen, wodurch 20 g Pulver erhalten wurden. Dann wurden 200 ml Methylacetat dazu gegeben und es wurde eine Fest-Flüssig-Extraktion durchgeführt. Ein Chromatogramm des Methylacetat-Extrakts ist in 1-c gezeigt. Proanthocyanidin-Polymere, die als eine Erhebung auf den Basislinien in 1-a und 1-b auftraten, wurden durch die Fest-Flüssig-Extraktion entfernt. Weiterhin wurde eine kleine Menge destilliertes Wasser zu diesem Extrakt gegeben, und dann wurde Methylacetat durch Einengen unter vermindertem Druck entfernt, wodurch extrahierte Komponenten in Wasser gelöst wurden. Ethylacetat/n-Hexan (8/2) (in einer zu der wässrigen Lösung äquivalenten Menge) wurde zu der erhaltenen wässrigen Lösung (50 ml) gegeben, um eine Flüssig-Flüssig-Extraktion vorzunehmen. Chromatogramme der so erhaltenen organischen Lösungsmittelschicht (obere Schicht) und der wässrigen Schicht (untere Schicht) sind in 1-d beziehungsweise 1-e gezeigt. Demnach wurden ein Teil der die Proanthocyanidin konstituierenden Monomere (Catechin, Epicatechin) sowie das meiste der Hauptprodukte aus der vorausgegangenen Enzymbehandlung, freie Kaffeesäure, p-Coumarinsäure und Phloretin, in die organische Lösungsmittelschicht entfernt (1-d). Das meiste der durch PB1, PB2 und PC1 dargestellten dimeren bis pentameren Proanthocyanidin-Oligomere verblieb nach der Flüssig-Flüssig-Extraktion in der wässrigen Schicht (1-e). Die abschließend erhaltene wässrige Schicht wurde konzentriert und gefriergetrocknet, wodurch 5,7 g Pulver erhalten wurden. Als Ergebnis einer Reihe von Schritten wurde die Reinheit von PB1 + PB2 + PC1 im Gesamtfeststoffgehalt etwa 4-fach verbessert, von 11,5% auf 40,3%. Wie vorstehend beschrieben, kann die Reinheit der Zielkomponenten, dimere bis pentamere Proanthocyanidin-Oligomere, durch eine Enzymolyse-Behandlung an Extrakten aus Rohmaterialien, gefolgt von einer Kombination aus mehrfachen Reinigungsvorgängen, effizient verbessert werden.
Beispiel 5 Reinigung durch Normalphasen-Flüssigchromatographie (A)
100 ml Methylacetat wurden zu 10 g der in Referenzbeispiel 1 erhaltenen Proanthocyanidin-Fraktion gegeben, um eine Fest-Flüssig-Extraktion vorzunehmen. Der Extrakt wurde unter vermindertem Druck auf ein konstantes Volumen von 20 ml konzentrierter Flüssigkeit eingeengt. Dann wurde eine Normalphasen-Flüssigchromatographie unter Verwendung von Kieselgel als Füllmittel durchgeführt, um Komponenten zu trennen. Die Bedingungen für die Chromatographie sind wie folgt:

Säule: Inertsil SIL^TM (4,6 mm I. D. × 150 mm, GL Science)
Mobile Phase für isokratische Trennung: Hexan/Methanol/Ethylacetat (70/30/10)
Beschickungsdosis einer Probe: 0,01 ml
Fließgeschwindigkeit: 1,8 ml/Min.
Detektion: UV 280 nm

Das erhaltene Chromatogramm ist in 2 gezeigt. Unter diesen Bedingungen wurden Proanthocyanidin-Oligomerkomponenten gemäß ihrem Polymerisationsgrad von dimer bis zu höherem Grad getrennt und dann aus der Säule eluiert. Das heißt, es wurde bestätigt, dass eine selektive Trennung von Oligomerkomponenten mit einem einheitlichen Polymerisationsgrad, Dimere, Trimere und dergleichen, abhängig vom jeweiligen Zweck, durch Normalphasen-Flüssigchromatographie unter Verwendung von Kieselgel als Füllmittel erreicht wurde.
Darüber hinaus wurde unter Verwendung der gleichen konzentrierten Flüssigproben eine Fraktionierung durch Normalphasen-Flüssigchromatographie im präparativen Maßstab durchgeführt. Die Bedingungen für die Fraktionierung sind wie folgt:

Kieselgel-Füllmittel: sphärisches multiporöses Kieselgel (75 μm, 120 Å)
Säulengröße: 6 mm I. D. × 500 mm × 2 Säulen
Mobile Phase für isokratische Trennung: Hexan/Methanol/Ethylacetat (70/30/10)
Beschickungsdosis einer Probe: 0,5 ml
Fließgeschwindigkeit: 3 ml/Min.
Fraktionierung 15 ml/5 Min./1 Fraktion
Detektion: UV 280 nm

Wie in 3 gezeigt, wurden Proanthocyanidin-Oligomere in den Proben ebenfalls gemäß ihrem Polymerisationsgrad getrennt, selbst im präparativen Maßstab.
Anschließend wurden eluierte Fraktionen, entsprechend Monomeren, Dimeren und Trimeren auf dem Chromatogramm, gesammelt. Dann wurde der Aufbau von Oligomerkomponenten in jeder eluierten Fraktion untersucht, wobei die in Referenzbeispiel 2 beschriebene Umkehrphasen-Flüssigchromatographie verwendet wurde. Wie in 4 – [5] und 4 – [6] gezeigt, bestanden die Monomerfraktionen hauptsächlich aus Catechin und Epicatechin; wie in 4 – [7] bis [11] gezeigt, bestanden die Dimerfraktionen hauptsächlich aus PB1 und PB2; und wie in 4 – [12] bis [20] gezeigt, bestanden die Trimerfraktionen hauptsächlich aus PC1. Die getrennten Fraktionen bestanden jeweils aus Oligomerkomponenten mit einem einheitlichen Polymerisationsgrad.
Die Reinheit der vorstehend erhaltenen gereinigten dimeren und trimeren Proanthocyanidin-Produkte betrug 93 beziehungsweise 92% (Gew./Gew.).
Beispiel 6 Reinigung durch Normalphasen-Flüssigchromatographie (B)
Unter Verwendung der in Beispiel 5 erhaltenen konzentrierten Flüssigprobe wurde eine Fraktionierung durch Normalphasen-Flüssigchromatographie durchgeführt. Bedingungen für die Fraktionierung sind wie folgt:

Kieselgel-Füllmittel: sphärisches multiporöses Kieselgel (75 μm, 120 Å)
Säulengröße: 6 mm I. D. × 500 mm × 2 Säulen
Mobile Phase für isokratische Trennung: Hexan/Aceton (40/60)
Beschickungsdosis einer Probe: 0,05 ml
Fließgeschwindigkeit: 3 ml/Min.
Fraktionierung: 15 ml/5 Min./1 Fraktion
Detektion: UV 280 nm

5 zeigt das erhaltene Chromatogramm. Im Weiteren wurden eluierte Fraktionen entsprechend Monomeren, Dimeren und Trimeren im Chromatogramm gesammelt. Dann wurde der Aufbau von Oligomerkomponenten in jeder eluierten Fraktion untersucht, wobei die in Referenzbeispiel 2 beschriebene Umkehrphasen-Flüssigchromatographie verwendet wurde. Wie in 6 – [2] bis [4] gezeigt, bestanden die Monomerfraktionen hauptsächlich aus Catechin und Epicatechin; wie in 6 – [5] bis [9] gezeigt, bestanden die Dimerfraktionen hauptsächlich aus PB1 und PB2; und wie in 6 – [10] bis [15] gezeigt, bestanden die Trimerfraktionen hauptsächlich aus PC1. Ähnlich wie in Beispiel 5 bestanden die getrennten Fraktionen jeweils aus Oligomerkomponenten mit einem einheitlichen Polymerisationsgrad.
Die Reinheit der vorstehend erhaltenen gereinigten dimeren und trimeren Proanthocyanidin-Produkte betrug 95 beziehungsweise 93% (Gew./Gew.).
(Referenzbeispiel 1) Herstellung einer Proanthocyanidin-Fraktion aus einer Apfelfrucht
Ein Polyphenol-Extrakt und eine Proanthocyanidin-Fraktion wurden aus Apfelfrüchten gemäß dem Verfahren hergestellt, das in Rapid Communication of Mass Spectrometry 11 (1997) 31–36 beschrieben ist. Unreife Apfelfrüchte (3 kg) einer bedeutenden Sorte „Fuji" wurden als Rohmaterialien verwendet. Die Früchte wurden unter Zufügen von 3 g Kaliummetabisulfit zerkleinert und ausgepresst, um den Saft zu erhalten. Der Saft wurde zentrifugiert und zur Klärung filtriert, wodurch 1,8 l klarer Saft erhalten wurden. Als Nächstes wurde der Saft auf eine mit Sepabeads SP-850^TM (Nippon Rensui) gefüllte Säule (25 mm I. D. × 285 mm) gegeben, um die Polyphenolkomponenten in dem Saft daran adsorbieren zu lassen. Nachdem in dem Saft vorhandene Zucker und organische Säuren durch Waschen mit 300 ml destilliertem Wasser entfernt worden waren, wurden die Polyphenolkomponenten mit 200 ml einer 80%-igen wässrigen Ethanollösung eluiert. Weiterhin wurde das gesammelte Eluat unter vermindertem Druck auf 65 ml eingeengt, so dass der Polyphenol-Extrakt erhalten wurde. Der Polyphenol-Extrakt (25 ml) wurde im Weiteren auf eine mit TSK-GEL toyopearl HW-40EC^TM (TOSOH) gefüllte Säule (25 mm I. D. × 285 mm) gegeben und die Säule wurde mit 200 ml destilliertem Wasser gewaschen, so dass die meisten der Verunreinigungen, Phenolcarbonsäuren, entfernt wurden. Dann wurden 250 ml einer 40%-igen wässrigen Ethanollösung auf die Säule gegeben, so dass andere niedermolekulare Polyphenole eluiert wurden. Anschließend wurden 100 ml einer 60%-igen wässrigen Acetonlösung auf die Säule gegeben, wodurch das meiste der Proanthocyanidine eluiert und zurückgewonnen wurde. An dieser Stelle wurde ein Teil der dimeren bis pentameren Proanthocyanidin-Oligomere dem Eluat aus der Elution mit einer 40%-igen Ethanollösung zugemischt. So wurde das Eluat einer De-Ethanolisierung durch Einengen unter vermindertem Druck unterzogen, das Konzentrat wurde im Weiteren auf eine Säule Seppak C18ENV^TM (Waters) gegeben, wodurch lediglich die zugemischten Proanthocyanidin-Komponenten nachgereinigt und zurückgewonnen wurden. Die zurückgewonnene Lösung und das Eluat aus der Elution mit einer 60%-igen wässrigen Acetonlösung wurden gemischt, unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet, wodurch eine Proanthocyanidin-Fraktion erhalten wurde (klarer Saft 1,8 → 8 g). Eine massenspektrometrische Analyse enthüllte, dass diese Fraktion aus monomeren bis 15-meren Proanthocyanidinen bestand. Gemäß dem Bedarf wurde dieser Schritt in einem größeren Maßstab durchgeführt, so dass ein Polyphenol-Extrakt oder eine Proanthocyanidin-Fraktion in einer Menge hergestellt wurde, wie sie in jedem Beispiel erforderlich war.
(Referenzbeispiel 2) Polyphenol-Analyse
Die Zusammensetzung von Polyphenolkomponenten in verschiedenen, in den Beispielen beschriebenen Proben wurde mittels Umkehrphasen-Flüssigchromatographie unter den nachstehenden Bedingungen gemäß dem Bedarf analysiert.

Säule: Inertsil ODS-3^TM (4,6 × 15 mm, GL Science)
Elutionsmittel: A) 0,1 mol/l Phosphatpuffer (pH 2)/Methanol (8/2) B) 0,1 mol/l
Phosphatpuffer (pH 2)/Methanol (5/5)
Gradientenelutionsbedingungen: 0 → 10 Min. (100% A), 10 Min. → 50 Min. (100% A → 100% B), 50 Min. → 65 Min. (100% B)
Beschickungsdosis einer Probe: 10 μl
Fließgeschwindigkeit: 1 ml/Min.
Detektion: 280 nm

(Referenzbeispiel 3) Analyse der Verteilung im Polymerisationsgrad von Proanthocyanidin-Oligomeren
Die Verteilung im Polymerisationsgrad der Proanthocyanidin-Oligomere in den Pulverprodukten, die in Beispiel 1 aus dem Extrakt oder dem Nicht-Extrakt aus der Extraktion mit Methylacetat erhalten wurden, wurde mittels Gelpermeationschromatographie analysiert. Die Bedingungen für die Analyse waren wie folgt:

Säule: TSK-GEL toyopearl HW-40F^TM (2,5 × 95 cm, TOSOH)
Elutionsmittel: Aceton/8 mol/l Harnstoff (6/4)
Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/Mm.
Fraktionierung: 3 ml/3 Mm./1 Fraktion (die anfänglichen 80 ml wurden verworfen)
Detektion: Kolorimetrie durch Zugabe eines Phenolreagens (detektiert bei VIS 760 nm)

Es wurden ferner ein Gemisch von Standard-Catechinen (jeweils 2 mg Epicatechin, PB2 und PC1), ein Proanthocyanidin-Gemisch (10 mg), ein Pulverprodukt, das mit Methylacetat aus dem Proanthocyanidin-Gemisch extrahiert war (5,83 mg), sowie ein nicht mit Methylacetat extrahiertes Pulverprodukt aus dem gleichen Gemisch (4,17 mg) separat in 0,5 ml eines Elutionsmittels gelöst und einer Analyse unterzogen. 7 zeigt die Ergebnisse.
Wie in 7 gezeigt, wurden unter den vorstehenden Analysebedingungen Proanthocyanidin-Oligomere in einer Probe in der Abfolge von größeren zu kleineren Polymerisationsgraden, basierend auf dem Molekularsiebeffekt des Füllmittels, eluiert. Insbesondere Trimer-, Dimer- und Monomerkomponenten tauchten als individuelle Peaks in einem Chromatogramm auf. Wie in 7 gezeigt, bestand das mit Methylacetat extrahierte Pulverprodukt hauptsächlich aus monomeren, dimeren und trimeren Proanthocyanidin-Oligomerkomponenten. Andererseits bestand das nicht mit Methylacetat extrahierte Pulverprodukt hauptsächlich aus Proanthocyanidin-Polymerkomponenten mit hohem Molekulargewicht.
Gemäß dieser Erfindung wurden dimere bis pentamere Proanthocyanidin-Oligomere sowie dimere und trimere Proanthocyanidine mit einem einheitlichen Polymerisationsgrad mit hoher Reinheit aus Rohmaterialien, welche die Proanthocyanidine oder rohe Reinigungsprodukte davon enthielten, effizient gereinigt. Mit der vorliegenden Erfindung erhaltene Proanthocyanidin-Oligomere besitzen eine Vielzahl von biologischen Aktivitäten, einschließlich antitumorale, entzündungshemmende, Antialterungs-, antioxidative, antiallergische, antibakterielle sowie Haarwuchs-Aktivitäten und dergleichen, so dass sie in Anwendungen, die Nahrungsmittel, Kosmetika und Arzneimittel einschließen, nützlich sind.

Claims

Verfahren zur Reinigung von dimeren bis pentameren Proanthocyanidin-Oligomeren mit einem einheitlichen Polymerisationsgrad, umfassend: Trennen und Reinigen der Proanthocyanidin-Oligomere nach Polymerisationsgrad von Rohmaterialien, enthaltend dimere bis pentamere Proanthocyanidin-Oligomere oder rohe Reinigungsprodukte davon, durch Normalphasen-Kieselgel-Flüssig-Chromatographie gemäß isokratischer Elution unter Verwendung eines einzelnen Lösungsmittels oder eines gemischten Lösungsmittels von zwei oder mehr Lösungsmitteln, ausgewählt aus einem Esterlösungsmittel, einem Ketonlösungsmittel, einem Kohlenwasserstofflösungsmittel, einem Etherlösungsmittel und einem Alkohollösungsmittel, als mobile Phase.
Verfahren zur Reinigung nach Anspruch 1, wobei die Rohmaterialien, die die dimeren bis pentameren Proanthocyanidin-Oligomere oder rohe Reinigungsprodukte davon enthalten, von einer Pflanze abgeleitet sind.
Verfahren zur Reinigung nach Anspruch 1, wobei das Lösungsmittel, welches als mobile Phase verwendet wird, ein gemischtes Lösungsmittel von zwei oder mehreren Lösungsmitteln ist, ausgewählt aus einem Esterlösungsmittel, einem Ketonlösungsmittel, einem Kohlenwasserstofflösungsmittel, einem Etherlösungsmittel und einem Alkohollösungsmittel.
Verfahren zur Reinigung nach Anspruch 1, wobei das Esterlösungsmittel ein Lösungsmittel ist, ausgewählt aus Methylformiat, Ethylformiat, Propylformiat, Isopropylformiat, Butylformiat, Isobutylformiat, Methylacetat, Ethylacetat, Propylacetat, Isopropylacetat, Butylacetat, Isobutylacetat, Methylpropionat, Ethylpropionat, Propylpropionat, Isopropylpropionat, Butylpropionat, Isobutylpropionat, Methylbutyrat, Ethylbutyrat, Propylbutyrat, Isopropylbutyrat, Butylbutyrat und Isobutylbutyrat.
Verfahren zur Reinigung nach Anspruch 1, wobei das Ketonlösungsmittel ein Lösungsmittel ist, ausgewählt aus Aceton, Methylethylketon, Methylpropylketon, Methylisopropylketon, Methylbutylketon, Methylisobutylketon, Methyl-tert-Butylketon, Diethylketon, Diisopropylketon, Methylvinylketon, Cyclobutanon, Cyclopentanon und Cyclohexanon.
Verfahren zur Reinigung nach Anspruch 1, wobei das Kohlenwasserstofflösungsmittel ein Lösungsmittel ist, ausgewählt aus Pentan, Hexan, Heptan, Octan, Nonan, Decan, Nonadecan, Cyclohexan, Xylol und Toluol.
Verfahren zur Reinigung nach Anspruch 1, wobei das Etherlösungsmittel Tetrahydrofuran oder 1,2-Dimethoxyethan ist.
Verfahren zur Reinigung nach Anspruch 1, wobei das Alkohollösungsmittel ein Lösungsmittel ist, ausgewählt aus Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, sec-Butanol und tert-Butanol.