KR100478296B1

KR100478296B1 - 프로안토시아니딘 올리고머의 정제 방법

Info

Publication number: KR100478296B1
Application number: KR10-2001-7013444A
Authority: KR
Inventors: 혼다신키치; 다카하시도모야; 가미무라아야코; 마츠오카다카코; 간다도모마사; 야나기다아키오; 히에다가즈오
Original assignee: 닛카우위스키가부시키가이샤; 교와 학꼬 고교 가부시키가이샤
Priority date: 1999-04-23
Filing date: 2000-03-03
Publication date: 2005-03-25
Also published as: CN1495178A; HK1043361A1; ATE396983T1; EP1666476B1; JP4582917B2; ATE337310T1; EP1180516B1; EP1632486A2; DE60037838T2; ES2296046T3; AU2828700A; CN1356994A; US6800433B1; EP1632486A3; AU774390B2; EP1180516A4; EP1666476A1; EP1632486B1; ATE384056T1; CN1238350C

Abstract

본 발명은 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머를 정제하는 방법으로서, A) 상기 올리고머를 함유하는 원료 또는 그의 조정제물에서, 아세트산 메틸을 액상으로 하는 고액 추출법에 의한 방법; B) 상기 올리고머를 함유하는 원료 또는 그의 조정제물, 또는 그들을 함유하는 용액을, 미리 가수분해 효소로 처리하는 방법; 및 , C) 상기 올리고머를 함유하는 원료 또는 그의 조정제물에서, 에스테르계 용매, 케톤계 용매, 탄화수소계 용매, 에테르계 용매 및 알콜계 용매로 되는 군으로부터 선택되는 단일 용매 또는 2종 이상의 혼합 용매를 이동상으로 하는 정상 실리카 겔 액상 크로마토그래피에 의해, 중합도별로 균일한 각 올리고머로 분리 정제하는 방법에 관한 것이다.

Description

프로안토시아니딘 올리고머의 정제 방법{METHODS FOR PURIFYING PROANTHOCYANIDIN OLIGOMERS}

본 발명은 항종양, 항염증, 항노화, 항산화, 항알러지, 항균, 육모 등의 다양한 생리 활성을 가지며, 식품이나 화장품 혹은 의약품 등의 용도에 유용한 프로안토시아니딘 올리고머를 고순도로 또한 효율 좋게 정제하는 방법에 관한 것이다.

고등 식물의 생체 방어 물질로 알려진 프로안토시아니딘은 일반적으로, 플라벤-7-올을 구성 유니트로 하여 4β→6, 4β→8, 4β→8·2βO→7 등의 결합 양식으로 중합한 2량체 이상의 중합체의 총칭이고, 축합형 타닌으로도 불려진다[E.Steinegger·R.Hansel, Pharmacognosy[1^stvol.], "Approach to Chemistry and Pharmacology"(Shuji Itokawa et al. 번역, Hirokawa Publishing Co.), 204∼208(1977); Porter L.J., Flavans and proanthocyanidins, In:Harborne J.B. (ed.), "The Flavonoids. Advances in Research Science 1986". Chapman & Hall, 23-55(1994)]. 이들은 산처리에 의해 안토시아니딘을 생성하여 홍색으로 되기 때문에 프로안토시아니딘으로 총칭된다. 프로안토시아니딘은 다양한 생리 활성을 나타내는 것으로 알려져 있고, 그 활성으로는 항종양, 항염증, 항노화, 항산화, 항알러지, 항균, 육모 등의 활성이 보고되어 있다[Bart Schwitters/Jack Masquelier, "21^st century Biophylaxis Substance OPC", Akira Sasaki 번역, Fragrance Journal, 55~135(1997); Tomoya Takahashi, et al., Journal of Investigative Dermato1ogy, 112, 310-316(1999)]. 이들의 생리 활성과 프로안토시아니딘의 중합도수 간의 구조 활성 상관 관계에 관해서는, 전혀 명확히 되어 있지는 않지만, 예를 들면, 육모 활성에 대해서는, 프로안토시아니딘 중 2∼5량체(특히 2량체와 3량체)의 프로안토시아니딘 올리고머가 가장 높은 활성을 갖는 것으로 보고되어 있다(W096/00561).

식물에서의 프로안토시아니딘의 분리 정제에 관해서는, 종래부터, 포도종자, 소나무껍질, 은행나무잎, 땅콩, 카카오콩 등의 각종 식물체에서의 분리가 시도되었다. 이 중, 원료로부터의 공업적 추출 예로는, 포도종자(일본특개평3-200781, W097/39632, US5484594) 혹은 소나무껍질(US4698360, W097/44407)에서의 추출 등을 들 수 있다. 일본특개평3-200781의 기재 방법에서는, 백포도 종자와 70℃ 미만의 물을 접촉시켜 전처리를 행한 후, 열수 추출을 행하고, 얻어진 추출액을 세파덱스 LH-20 컬럼에 주입한 뒤, 70% 에탄올로 용출하여, 순도 약90%의 프로안토시아니딘 함유 분말을 얻는다. US4698360 기재의 방법에서는 해안 소나무껍질 1t를 가압 상태에서 온수 추출한 다음, 아세트산 에틸에 의한 용출 및 클로로포름 첨가에 의한 침전을 반복하여, 프로안토시아니딘 함유 분말을 얻는다. 그러나, 상기의 각 방법으로 정제한 정제물 중에, 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머만을 90% 이상 함유하는 것은 없고, 모든 정제물은 단량체나, 6량체 이상의 중합체, 혹은 다른 유기산을 함유한 것이다.

향류 액액 분배법(countercurrent liquid-liquid distribution method)을 이용한 프로안토시아니딘의 정제 방법으로는, 예를 들면, 물과 아세트산 에틸을 사용하는 방법이, Andrew G.H. Lea 저, J. Sci. Fd. Agric., 29, 471-477(1978), 일본특개소61-16982 등에 기재되어 있다.

또한, 고액 추출법을 이용한 프로안토시아니딘의 정제 방법으로, 아세트산 에틸을 사용하는 방법이, 일본특개평8-176l37 및 EP0707005에 기재되어 있다. 예를 들면, 파쇄한 포도종자 100kg을 물(1650ℓ), 염화나트륨(300kg), 아세톤(550ℓ)의 혼합 용액으로 추출하고, 증류에 의해 아세톤을 제거하여 얻은 잔류물을, 아세트산에틸을 사용한 고액 추출을 행한 다음, 디클로로에탄(45ℓ)을 첨가함으로써, 프로안토시아니딘의 침전물 1.5kg∼2.5kg을 얻었다(EP0707005).

또한, 크로마토그래피를 이용한 프로안토시아니딘의 정제 방법으로는 상술한 세파덱스 LH-20 컬럼을 사용한 방법(포도종자에서의 추출법, 일본특개평3-200781)이나, 폴리스티렌계 흡착 수지를 사용한 방법(빨간콩(red beans)에서의 추출법, 일본특공평7-62014)등이 알려져 있다. 예를 들면, 건조된 빨간콩으로부터 얻은 침지수에 폴리스티렌계 흡착수지「세파비즈 SP-850」(MITSUBISHI CHEMICAL CORPORATION)를 첨가하고 교반하여 프로안토시아니딘을 흡착시킨 뒤, 70℃이하에서 수지를 건조시키고, 70℃의 80%(v/v) 에탄올로 용출함으로써, 순도 약 60%의 조(粗)프로안토시아니딘 함유 분말을 얻었다.

그러나, 이들 방법은 모두 중합도수에 관계 없는 프로안토시아니딘 혼합물의 정제 방법이고, 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머를 선택적으로 효율 좋게 얻기 위한 수법은 아니며, 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머의 회수율이 낮다.

프로안토시아니딘의 중합도수별 분리에 관해서는, 정상(normal phase) 실리카 겔 액체 크로마토그래피를 사용한 방법[카카오콩에서의 추출법: J. Rigaud et al., J. Chromatogr. A, 654. 255-260 (1993), 포도종자로부터의 추출법: Corine Prieur et al., Phytochemistry. 36. 781-784(1994)]이 알려져 있다. 전자의 경우, 카카오콩을 메탄올로 추출하여 얻어진 프로안토시아니딘 함유 시료액을 실리카 겔 충전 컬럼에 주입하고, 이동상으로 디클로로메탄:메탄올:포름산:물[(41→5):(7→43):1:1]의 혼합 용매를 사용하여 기울기 용출(gradient elution)을 행한다. 후자의 경우, 포도종자를 메탄올로 추출하여 얻어진 프로안토시아니딘 함유 시료액을 실리카 겔 충전 컬럼에 주입하고, 이동상으로 디클로로메탄:메탄올:물:트리플루오로 아세트산[(82→10):(18→86):2:0.05]의 혼합 용매를 사용하여 기울기 용출을 행한다.

그러나, 이들 방법에는, 사용 용매에 염소계의 용매가 포함되어 있고, 또한 용매 조성이 복잡하기 때문에 용매의 회수 재사용이 어렵고, 또한 이동상에 농도 구배를 적용하는 기울기 용출법이 필수로 되는 등의 문제가 있으므로, 이들 방법은 안전성이나 경제성의 면에서 대량 정제를 목적으로 하는 공업적 분리 방법으로는 적합하지 않다.

도 1은 역상 액체 크로마토그래피의 결과를 나타내는 도면.

<도 1 중의 부호의 설명>

1 PB1

2 (+)-카테킨

3 PB2

4 클로로겐산

5 카페인산

6 PC1

7 (-)-에피카테킨

8 p-쿠말산에스테르

9 p-쿠말산

10 플로리진

11 플로레틴

도 2는 정상 액체 크로마토그래피의 결과를 나타내는 도면.

도 3은 정상 액체 크로마토그래피의 결과를 나타내는 도면.

도 4는 역상 액체 크로마토그래피의 결과를 나타내는 도면.

<도 4 중의 부호의 설명>

1 PB1

2 (+)-카테킨

3 PB2

4 PC1

5 (-)-에피카테킨

[5], [6] 단량체 획분, 도 3의 분획번호에 대응.

[7]∼[11] 2량체 획분, 도 3의 분획 번호에 대응.

[12]∼[20] 3량체 획분, 도 3의 분획 번호에 대응.

도 5는 정상 액체 크로마토그래피의 결과를 나타내는 도면.

도 6은 역상 액체 크로마토그래피의 결과를 나타내는 도면.

<도 6 중의 부호의 설명>

1 PB1

2 (+)-카테킨

3 PB2

4 PC1

5 (-)-에피카테킨

[2]∼[4] 단량체 획분, 도 5의 분획 번호에 대응.

[5]∼[9] 2량체 획분, 도 5의 분획 번호에 대응.

[10]∼[15] 3량체 획분, 도 5의 분획 번호에 대응.

도 7은 프로안토시아니딘 올리고머의 중합도수 분포의 해석 결과를 나타내는 도면.

<발명을 실시하기 위한 최량의 형태>

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예 등에 한정되는 것은 아니다.

(실시예 1) 고액 추출법에 의한 정제(A)

참고예 1에서 얻어진 프로안토시아니딘 획분 30g에, 아세트산 메틸 300㎖를 첨가하고, 실온에서 1시간 고액 추출을 행하였다. 추출은 합계 2회를 행하고, 2회분의 추출액을 혼합해서 여과한 뒤, 소량의 아세트산 메틸로 추출 잔사를 세정하였다. 아세트산 메틸 추출액과 세정액을 합해서 감압 농축한 뒤, 소량의 증류수를 첨가하고 한번더 감압 농축하고, 추출 성분을 수용액으로 용해하였다. 얻어진 수용액을 동결 건조하여, 아세트산 메틸 추출 분말품 17.5g을 얻었다. 또한, 추출 잔사를 건조하여, 아세트산 메틸 비추출물의 분말품 12.5g을 얻었다. 또한, 양 분말중에 함유되는 2량체 프로안토시아니딘 성분인 프로시아니딘 B1(에피카테킨-(4β→8)-카테킨; 이하 PB1이라 함) 및 프로시아니딘 B2(에피카테킨-(4β→8)-에피카테킨: 이하 PB2라 함) 및 3량체 성분인 프로시아니딘 C1(에피카테킨(4β→8)-에피카테킨-(4β→8)-에피카테킨: 이하 PC1이라 함)의 함유량을, 참고예 2 기재의 역상 액체 크로마토그래피법으로 정량하였다. 아세트산 메틸 추출시의 고형분 회수율과 함께 표 1에 그 결과를 나타낸다.

<표 1>

표 1에서 명백한 바와 같이, 아세트산 메틸에 의한 고액 추출에 의해, PB1, PB2 및 PC1로 대표되는 프로안토시아니딘 올리고머 성분의 선택적 추출과 순도 향상이 효과적으로 달성되었다.

(실시예 2) 고액 추출법에 의한 정제(B)

아세트산 메틸과 각종 용매를 9:1(아세트산메틸:헥산=95:5)의 용량비로 혼합하여, 고액 추출 용매를 준비하였다. 상기 각종 용매로는 아세트산 메틸과 혼합 가능한 유기용매로서, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 포름산 에틸, 아세트산 에틸, 아세톤, 아세토니트릴, 테트라하이드로푸란, 헥산 또는 아세트산을 사용하였다. 참고예 1에서 얻어진 프로안토시아니딘 획분 1g에, 각 추출 용매 1O㎖를 첨가하고, 실온에서 1시간 고액 추출(1회 추출)을 행하였다. 추출액을 원심분리하여 고형 성분을 제거한 뒤, 일정량을 증류수로 100배 희석(0.01→1㎖)하여, 추출액 중의 PB1, PB2 및 PC1의 함유량을, 참고예 2 기재의 역상 액체 크로마토그래피법으로 정량하였다. 동시에, 각 추출액을 1㎖씩 분취하여 용매를 제거한 뒤, 동결 건조해서 추출 고형분량을 구하였다. 각 추출 용매에 의한 고액 추출시의 PB1, PB2 및 PC1의 추출 효율과 고형분 회수율을 함께 표 2에 나타낸다. 또한, 비교예로서, 상기와 동일하게 하여 아세트산 에틸 단독으로 고액 추출을 행했다(단, 프로안토시아니딘 획분 2g에 아세트산 에틸 20㎖를 사용함). 그 결과도 표 2에 나타낸다.

<표 2>

(실시예 3) 고액 추출법에 의한 정제(C)

아세트산 메틸과 아세트산 에틸을 표 3에 나타내는 용량비로 혼합하여, 고액추출을 행하였다. 참고예 1에서 얻어진 프로안토시아니딘 획분 1g에, 각 용량비의 추출 용매 1O㎖를 첨가하고, 30℃에서 1.5시간 고액 추출을 행하고, 이것을 3회 반복하였다. 이들 추출액을 합해서 감압 농축한 후, 추출 성분을 동결 건조하여 추출 분말품을 얻었다. 분말품 중에 함유되는 PB1, PB2 및 PC1의 함유량을, 참고예 2 기재의 역상 액체 크로마토그래피법으로 정량하였다. 각 용량비의 용매로 추출했을 때의 고형분 회수율, PB1, PB2 및 PC1 각각의 추출량 및 회수율, 및 PB1, PB2 및 PC1의 합계 추출량, 회수율 및 순도를 표 3에 나타낸다.

<표 3>

표 3에서 명백한 바와 같이, 아세트산 메틸을 함유하는 추출 용매를 사용한 고액 추출에 의해, PB1, PB2 및 PC1으로 대표되는 프로안토시아니딘 올리고머 성분의 선택적 추출과, 회수율의 향상이 효과적으로 달성되었다.

(실시예 4) 효소 분해 처리를 병용한 정제

참고예 1에서 얻어진 폴리페놀 추출액을 식품 가공용의 시판 효소제제로 효소 처리하였다. 효소제제로는 아스페르길러스(Aspergillus)속 유래의 리파아제 제제(리파아제 산교(상표명), SANKYO CO., LTD) 및 하이드로라제 제제(하이드록시계피산에스테르 하이드로라제, Seishin Co., Ltd)을 사용하였다. 미리 폴리페놀 추출액 1OO㎖를 5mol/ℓ의 NaOH로 pH 5로 조정하고, 증류수로 10배 더 희석한 시료액 1ℓ에 대해, 상기 리파아제 제제 및 상기 하이드로라제 제제을 각자 1g(최종 농도:0.1%)씩 첨가하여, 45℃에서 16시간 효소 반응을 행하였다. 반응전과 반응 후의 시료액에 대해서 참고예 2 기재의 역상 액체 크로마토그래피 분석을 행한 결과를 각각 도 1-a와 도 1-b에 나타낸다. 도면에서도 알수있는 바와 같이, 상기 효소 반응을 행함에 의해, 주요한 이물 성분인 클로로겐산이나 플로리진은 거의 소실하고, 대신에 유리 카페인산, p-쿠말산 및 플로레틴이 증가하였다. 다음에, 반응 종료후의 용액을 농축, 스프레이 드라이하여 분말체 20g를 얻었다. 또한, 아세트산 메틸을 200㎖ 첨가하고 고액 추출을 행하여 얻어진 아세트산 메틸 추출액의 크로마토그램을 도 1-c에 나타내었다. 도 1-a나 도 1-b에서 베이스 라인 상의 융기로 나타나는 프로안토시아니딘 중합체류가 고액 추출 처리로 제거되었다.

또한, 본 추출액에 소량의 증류수를 첨가한 뒤, 감압 농축에 의해 아세트산 메틸을 제거함으로써 추출 성분을 물에 용해하였다. 얻어진 수용액 50㎖에 대해 등량의 아세트산에틸/n-헥산(8/2)을 첨가하여, 액액 추출을 행했다. 그 결과 얻어진 유기용매층(상층)과 물층(하층)의 크로마토그램을 각각 도 1-d와 도 1-e에 나타내었다. 결과로서, 아세트산에틸/n-헥산(8/2)에 의한 액액 추출 처리에 의해, 프로안토시아니딘 구성 단량체(카테킨, 에피카테킨)의 일부와 앞선 효소 처리시의 반응 주생성물인 유리 카페인산, p-쿠말산, 플로레틴의 대부분이 유기 용매층으로 제거되었다(도 1-d). PB1, PB2 및 PC1로 대표되는 2∼5량체의 프로시아니딘 올리고머는 대부분 액액 추출 후 물층에 잔류하였다(도 1-e). 최종적으로 얻어진 물층을 농축한 뒤, 동결 건조하여, 5.7g의 분말체를 얻었다. 일련의 처리 결과, PB1 + PB2 + PC1의 총고형분 중 순도는 11.5%에서 40.3%로 약 4배 향상되었다. 이와 같이, 원료 추출액에 대하여 효소 분해 처리를 행하고, 또한 복수의 정제 방법을 조합함으로써, 목적 성분인 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머의 효과적인 순도 향상이 달성되었다.

(실시예 5) 정상 액체 크로마토그래피에 의한 정제(A)

참고예 1에서 얻어진 프로안토시아니딘 획분 1Og에 아세트산 메틸 1OO㎖를 첨가하여 고액 추출을 행하였다. 추출액을 감압 농축하여 20㎖ 농축액으로 하여, 실리카 겔을 충전제로 하는 정상 액체 크로마토그래피법에 의한 성분 분리를 행하였다. 크로마토그래피의 조건은, 이하와 같다.

컬럼 : Inertsil SIL(4.6mmI.D.×150mm, GL 사이언스)

이소크락틱 분리용 이동상 : 헥산/메탄올/아세트산 에틸(70/30/10)

시료 부하량: O.O1㎖

유속 : 1.8㎖/분

검출 : UV280nm

얻어진 크로마토그램을 도 2에 나타낸다. 본 조건하에서는, 프로안토시아니딘 올리고머 성분은, 2량체부터 순서대로 중합도수별로 분리하여 컬럼으로부터 용출하였다. 즉, 실리카 겔을 충전제로 하는 정상 액체 크로마토그래피 분리로, 2량체, 3량체 등의 목적에 따른 중합도수가 균일한 올리고머 성분의 선택적인 분리가 달성됨을 확인할 수 있었다.

또한, 동일한 농축액 시료를 사용하여, 분취 스케일로 정상 액체 크로마토그래피 분획을 행하였다. 분획 조건은 이하와 같다.

실리카 겔 충전제: 구상 다공 실리카 겔(75㎛, 120A)

컬럼 사이즈: 6mmI.D.×500mm×2개

이소크락틱 분리용 이동상: 헥산/메탄올/아세트산에틸(70/30/10)

시료 부하량: 0.5㎖

유속: 3㎖/분

분획: 15㎖/5분/1획분

검출: UV280nm

이 때, 도 3에 나타내는 바와 같이, 분취 스케일에서도, 시료 중의 프로안토시아니딘 올리고머는 중합도수별로 분리되었다.

그 다음에, 크로마토그램상의 단량체, 2량체, 3량체에 상당하는 용출 획분을 분취하여, 참고예 2 기재의 역상 액체 크로마토그래피로 각 용출 획분 중의 올리고머 성분의 구성을 조사하였다. 그 결과, 도4a([5] 및 [6])에 나타내는 바와 같이, 단량체 획분은 주로 카테킨과 에피카테킨이고, 도4b([7]∼[l1])에 나타내는 바와 같이, 2량체 획분은 주로 PB1와 PB2이고, 도4c 및 도4d([12]∼[20])에 나타내는 바와 같이, 3량체 획분은 주로 PC1로 구성되며, 분리한 각 획분은 각각 중합도수가 균일한 올리고머 성분으로 구성되어 있다.

이상과 같이 하여 얻어진 2량체 프로안토시아니딘 정제물 및 3량체 프로안토시아니딘 정제물의 순도는, 각각 93 및 92(w/w)% 였다.

(실시예 6) 정상 액체 크로마토그래피에 의한 정제(B)

실시예 5에서 얻어진 농축액 시료를 사용하여, 정상 액체 크로마토그래피 분획을 행하였다. 분획 조건은 이하와 같다.

실리카 겔 충전제: 구상 다공 실리카 겔(75㎛, 120A)

컬럼 사이즈: 6mmI.D.×500mm×2개

이소크라틱 분리용 이동상: 헥산/아세톤(40/60)

시료 부하량: 0.05㎖

유속: 3㎖/분

분획: 15㎖/5분/1획분

검출: UV280nm

얻어진 크로마토그램을 도 5에 나타낸다. 또한, 크로마토그램상의 단량체, 2량체, 3량체에 상당하는 용출 획분을 분취하여, 참고예 2 기재의 역상 액체 크로마토그래피로 각 용출 획분 중의 올리고머 성분의 구성을 조사하였다. 그 결과, 도6a([2]∼[4])에 나타내는 바와 같이, 단량체 획분은 주로 카테킨과 에피카테킨으로 구성되어 있고, 도6b([5]∼[9])에 나타내는 바와 같이, 2량체 획분은 주로 PB1와 PB2로 구성되어 있고, 도6c([10]∼[15])에 나타내는 바와 같이, 3량체 획분은 주로 PC1로 구성되어 있고, 실시예 5와 같이, 분리한 각 획분은 각각 중합도수가 균일한 올리고머 성분으로 구성되어 있었다.

이상과 같이 하여 얻어진 2량체 프로안토시아니딘 정제물 및 3량체 프로안토시아니딘 정제물의 순도는 각각 95 및 93(w/w)% 였다.

(참고예 1) 사과 과실로부터의 프로안토시아니딘 획분의 제조

Rapid Communication of Mass Spectrometry, 11, 31-36 (1997)에 기재된 방법에 따라, 사과 과실로부터의 폴리페놀 추출액 및 프로안토시아니딘 획분을 제조하였다. 주요 재배 품종인「후지」의 미숙 과실 3kg을 원료로 하고, 메타중아황산 칼륨 3g를 첨가하면서 과실을 파쇄, 착즙하였다. 착즙액을 원심분리 및 여과하여 청징화 처리를 행하여, 1.8ℓ의 청징 과즙액을 얻었다. 다음에, 상기 과즙액을 Sepabeads SP-850(Nippon Rensui) 충전 컬럼(25mmI.D.×285mm)에 주가하여 과즙 중의 폴리페놀 성분을 흡착시키고, 300㎖의 증류수로 세정하여 과즙 중에 혼재하는 당류나 유기산류를 제거한 뒤, 200㎖의 80% 에탄올 수용액으로 폴리페놀 성분을 용출하였다. 또한, 회수 용출액을 65㎖까지 감압 농축하여, 폴리페놀 추출액으로 하였다. 얻어진 폴리페놀 추출액 중 25㎖를 TSK-GEL toyopearl HW-40EC(TOSOH) 충전 컬럼(25mnlI.D.×285mm)에 주가하고, 200㎖의 증류수로 세정함으로써 이물 성분인 페놀카복실산류의 대부분을 제거한 다음, 250㎖의 40% 에탄올 수용액을 주가하여 다른 저분자 폴리페놀류를 용출한 뒤, 10O㎖의 6O% 아세톤 수용액을 칼럼에 주가하여 프로안토시아니딘류의 대부분을 용출, 회수하였다. 또한, 40% 에탄올 수용액 용출액중에는 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머의 일부가 혼재해 있기 때문에, 감압 농축에 의해 탈에탄올화한 용출액을 다시 Sep-pak C18ENV 컬럼(Waters)에 주가하고, 혼재한 프로안토시아니딘 성분만을 재정제, 회수하였다. 이 회수 용액과 상술한 60% 아세톤 수용액 용출액을 혼합하여, 감압 농축한 뒤, 동결 건조하여 프로안토시아니딘 획분을 얻었다(청징 과즙 1.8ℓ→8g). 별도의 질량 분석 결과, 본 획분은 단량체∼15량체의 프로안토시아니딘류로 구성되어 있었다. 또한, 필요에 따라, 본 공정을 스케일을 크게 하여, 개개의 실시예에서의 필요량의 폴리페놀 추출액 또는 프로안토시아니딘 획분을 제조하였다.

(참고예 2) 폴리페놀 분석

실시예에 기재한 각종 시료 중의 폴리페놀 성분 조성에 대해서는, 필요에 따라서, 이하의 조건에서 역상 액체 크로마토그래프피법으로 분석하였다.

컬럼: Inertsil ODS-3 (4.6×15mm, GL사이언스)

용리액: A)0.1mol/ℓ 인산완충액(pH 2)/메탄올(8/2) B) 0.1mol/ℓ 인산 완충액(pH 2)/메탄올(5/5)

기울기 용출조건: 0→10분(100%A), 10→50분(100%A→100%B),

50분→65분(l00%B)

시료 부하량: 1O㎕, 유속: 1㎖/분

검출: 280nm

(참고예 3) 프로안토시아니딘 올리고머의 중합도수 분포의 해석

실시예 1에서 얻어진 아세트산 메틸 추출물과 아세트산 메틸 비추출물의 분말품에 함유되는 프로안토시아니딘 올리고머의 중합도수 분포를, 겔 침투 크로마토그래피에 의해 해석하였다. 해석 조건은 이하와 같다.

컬럼: TSK-GEL toyopearl HW-40F(2.5×95cm, TOSHO)

용리액: 아세톤/ 8mol/ℓ의 우레아 (6/4)

유속: 1.O㎖/분

분획: 3㎖/3분/1획분(최초의 80㎖는 폐기)

검출: 페놀 시약 첨가에 의한 비색법(VIS760nm 검출)

또한, 카테킨류 표준품 혼합물(에피카테킨, PB2, PC1/각 2mg), 프로안토시아니딘 혼합물(1Omg), 동일 혼합물의 아세트산 메틸 추출 분말품(5.83mg), 아세트산 메틸 비추출 분말품(4.17mg)을, 각각 용리액 0.5㎖에 용해하여 분석하였다. 결과를 도 7에 나타낸다

본 분석 조건하에서는, 도 7에 나타내는 바와 같이, 시료 중의 구성 프로안토시아니딘 올리고머가 충전제의 분자체 효과에 의하여 중합도수가 큰 것부터 차례로 용출하고, 특히 3량체, 2량체, 단량체 성분에 대해서는, 독립한 피크로서 크로마토그램상에 나타난다. 도 7에 나타내는 바와 같이, 아세트산 메틸 추출 분말품은 주로 단량체, 및 2,3량체로 되는 프로안토시아니딘 올리고머 성분으로 구성되어 있었다. 한편, 아세트산 메틸 비추출물 분말품은 주로 분자량이 큰 프로안토시아니딘 중합체 성분으로 구성되어 있었다.

본 발명의 목적은 프로안토시아니딘을 함유하는 원료 또는 그의 조정제물에서, 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머를 고순도로 효율 좋게 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

종래 방법의 조합으로는, 목적 성분인 2∼5량체 프로안토시아니딘 올리고머 이외의 플라보노이드류, 카테킨, 에피카테킨 등의 프로안토시아니딘 구성 단량체, 6량체 이상의 고중합 프로안토시아니딘 중합체, 혹은 다른 이물질을 제거하는 것이 어려워, 본 발명의 목적 성분인 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머를 고순도로 효율 좋게 얻음은 곤란하다. 또한, 종래 공지의 방법은 사용하는 용매의 조성이 복잡하거나, 경제성이나, 안전성의 면에서 공업화 프로세스로는 부적당한 예가 대부분이다.

본 발명자들은 이들 문제점을 해결하고자 여러가지 검토를 거듭한 결과, 고순도의 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머를 효율 좋게 정제하는 방법을 완성하기에 이르렀다.

본원 제1 발명은, 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 원료 또는 그의 조정제물에서, 아세트산메틸을 액상으로 사용한 고액 추출법으로 상기 프로안토시아니딘 올리고머를 추출함을 특징으로 하는 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머의 정제 방법이다.

상기 액상으로는, 아세트산 메틸의 단일 용매를 사용해도 좋지만, 아세트산 메틸에 아세트산 메틸과 혼합 가능한 유기용매를 부가하여, 아세트산 메틸 및 아세트산 메틸과 혼합 가능한 유기용매의 조합으로 되는 혼합 용매를 사용해도 좋다.

본원 제２ 발명은 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 원료 또는 그의 조정제물, 또는 그들을 함유하는 용액을, 미리 가수분해 효소로 처리함을 특징으로 하는 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머의 정제 방법이다.

본원 제３ 발명은 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 원료 또는 그의 조정제물에서, 에스테르계 용매, 케톤계 용매, 탄화수소계 용매, 에테르계 용매 및 알콜계 용매로 되는 군으로부터 선택되는 단일 용매 또는 2종 이상의 혼합 용매를 이동상으로 사용한 정상 실리카 겔 액체 크로마토그래피에 의해, 상기 프로안토시아니딘 올리고머를 중합도별로 분리 정제함을 특징으로 하는 중합도수가 균일한 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머의 정제 방법이다. 상기 이동상으로는, 2종 이상의 혼합 용매를 사용함이 바람직하다.

또한, 본 발명에 의해, 상기 각 정제 방법으로 얻을 수 있는 순도 90(w/w)% 이상의 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머 정제물, 순도 90(w/w)% 이상의 2량체 프로안토시아니딘 정제물 및 순도 90(w/w)% 이상의 3량체 프로안토시아니딘 정제물이 제공된다.

프로안토시아니딘은 각종 식물체내에 존재하는 축합형 탄닌으로, 플라벤-7-올이 4β→6, 4β→8, 4β→8·2βO→7 등의 결합에 의해 순차적으로 축합 또는 중합하여 결합한 기본 구조를 갖는다. 본 명세서 중에서는, 이들 중, 2∼5량체인 것을 프로안토시아니딘 올리고머, 6량체 이상인 것을 프로안토시아니딘 중합체로 정의한다. 또한, 플라벤-7-올의 단량체를 프로안토시아니딘 구성 단량체로 정의한다. 프로안토시아니딘 올리고머로는 프로시아니딘, 프로델피니딘, 프로펠랄고니딘 등의 프로안토시아니딘 및 이들의 입체 이성체가 전부 포함된다. 프로안토시아니딘 구성 단량체는 다음 식(I):

(식 중, R¹, R², R³, R⁴, R⁵ 및 R⁶은 동일하거나 다르고, 수소, 수산기 또는 갈로일기를 나타냄)으로 표시된다.

본 발명에서 사용하는 원료 또는 그의 조정제물은 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 것이면 어떠한 것이라도 좋지만, 특히 식물의 과실, 과피, 종자, 나무 껍질 등의 식물 원료, 그들의 추출물, 또는 그들의 조정제물이 적합하다. 예를 들면, 포도, 감, 사과, 월귤 등의 과실의 착즙액 또는 과피 또는 종자의 추출액, 혹은 땅콩이나 밤의 표피, 보리나 메밀의 껍질, 감 잎, 소나무 껍질, 야자 등의 추출액 등, 프로안토시아니딘 올리고머를 많이 함유하는 것이 바람직하다.

또한, 원료로는, 비효소적 방법 또는 효소적 방법에 의해 얻어지는 조생성물 또는 그의 조정제물을 사용할 수 있다. 프로안토시아니딘 올리고머의 합성법으로는, 에피카테킨 또는 카테킨의 2량체의 제조 방법이, Journal Of Chemical Society Perkin Trasaction I, 1535∼1543(1983)에 기재되어 있고, 에피카테킨 또는 카테킨의 3량체의 제조 방법이, Phytochemistry, 25, 1209∼1215(1986)에 기재되어 있으며, 이들 방법 혹은 이들과 유사한 방법으로 얻어지는 조생성물 또는 그의 조정제물을 본 발명 방법의 원료로 사용할 수도 있다.

본원 제1 발명에서 사용하는 아세트산 메틸과 혼합 가능한 유기용매로는 휘발성인 것이 바람직하고, 그 구체적인 예로는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올계 용매; 포름산 메틸, 포름산 에틸, 아세트산 에틸 등의 에스테르계 용매: 아세톤 등의 케톤계 용매: 아세토니트릴 등의 니트릴계 용매; 테트라하이드로푸란, 1,2-디메톡시에탄 등의 에테르계 용매: 헥산 등의 탄화수소계 용매; 아세트산 등의 카복실산계 용매 등을 들 수 있다. 아세트산 메틸과 혼합 가능한 유기용매를 사용하는 경우, 추출 용매 전체 중에 아세트산 메틸이 50%(용량)이상 함유됨이 바람직하고, 70%(용량)이상 함유됨이 보다 바람직하고, 90%(용량)이상 포함됨이 더욱더 바람직하다.

본원 제２ 발명에서 사용하는 가수분해 효소로는 글리코시다제, 에스테라제 등을 들 수 있다.

글리코시다제로는 아밀라제, 셀룰라아제, 글루카나제, 크실라나제, 글루코시다제, 덱스트라나제, 키티나제, 갈락트로나제, 라이소자임, 갈락토시다제, 만노시다제, 프락토푸라노시다제, 트레할라제, 글루코사미니다제, 풀루라나제, 세라미다제, 푸코시다제, 아가라제 등으로부터 선택되는 단독물 또는 2종 이상의 혼합물을 들 수 있고, 에스테라제로는 카복시에스테라제, 아릴에스테라제, 리파제, 아세틸에스테라제, 콜린에스테라제, 펙틴에스테라제, 콜레스테롤에스테라제, 클로로필라제, 락토나제, 탄나제, 하이드로라제 등으로부터 선택되는 단독물 또는 2종 이상의 혼합물을 들 수 있다.

본원 제2 발명에서, 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 원료 또는 그의 조정제물을 함유하는 용액으로는, 통상, 수용액, 또는 l0% 이하의 알콜, 에스테르, 케톤계 등의 유기용매를 함유하는 수성 용액이 사용된다.

본원 제３ 발명에서 이동상으로 사용하는 에스테르계 용매로는 포름산 메틸, 포름산 에틸, 포름산 프로필, 포름산 이소프로필, 포름산 부틸, 포름산 이소부틸, 아세트산 메틸, 아세트산 에틸, 아세트산 프로필, 아세트산 이소프로필, 아세트산 부틸, 아세트산 이소부틸, 프로피온산 메틸, 프로피온산 에틸, 프로피온산 프로필, 프로피온산 이소프로필, 프로피온산 부틸, 프로피온산 이소부틸, 부틸산 메틸, 부틸산 에틸, 부틸산 프로필, 부틸산 이소프로필, 부틸산 부틸, 부틸산 이소부틸 등을 들 수 있고, 케톤계 용매로는 아세톤, 메틸에틸케톤, 메틸프로필케톤, 메틸이소프로필케톤, 메틸부틸케톤, 메틸이소부틸케톤, 메틸tert-부틸케톤, 디에틸케톤, 디이소프로필케톤, 메틸비닐케톤, 시클로부타논, 시클로펜타논, 시클로헥사논 등을 들 수 있고, 탄화수소계 용매로는 펜탄, 헥산, 헵탄, 옥탄, 노난, 데칸, 노나데칸, 시클로헥산, 크실렌, 톨루엔 등을 들 수 있고, 에테르계 용매로는 테트라하이드로푸란, 1,2-디메톡시에탄 등을 들 수 있고, 알코올계 용매로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, sec-부탄올, tert-부탄올 등을 들 수 있다.

식물 원료에서의 추출·조정제는 예를 들면 다음과 같은 공지 방법으로 행할 수 있다.

식물의 과실, 과피, 종자, 표피, 껍질, 잎, 나무껍질 등의 식물 원료는, 통상 공기 건조 등의 건조 공정을 행한 뒤, 추출 원료로 사용하지만, 그대로 추출 원료로 사용할 수도 있다.

상기 추출 원료에서의 프로안토시아니딘의 조추출은 공지의 방법[Chem. Pharm. Bull., 38. 3218(199O), Chem. Pharm. Bull., 40, 889-898(1992)]을 참고하여 행할 할 수 있다. 예를 들면, 식물 원료를 파쇄 또는 세편으로 자른 다음, 용매를 사용하여 추출한다. 추출 용매로는 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 등의 알코올계 용매, 아세톤, 메틸에틸케톤 등의 케톤계 용매, 아세트산 메틸, 아세트산 에틸 등의 에스테르계 용매 등의 친수성 또는 친유성의 용매를 단독으로 또는 혼합 용매로서 사용할 수 있다. 추출 온도는 통상 0∼100℃, 바람직하게는 5∼50℃이다. 내부에 유분을 함유하고 있는 종자 등은 파쇄하지 않고 그대로 추출 처리하여 제공할 수 있다. 추출 조작은, 필요에 따라서, 2∼3회 반복해도 좋다. 상기의 조작으로 얻어지는 조추출액에서, 불용성 잔사를 여과 또는 원심분리로 제거하여, 조추출액으로 한다. 식물 원료가 식물의 착즙액, 수액 등인 경우는, 그대로 추출 원료로서 사용해도 좋고, Agric. Biol. Chem., 45, 1885-1887(1981)를 참고하여 축합형 탄닌의 농축 조추출액을 제조해도 좋다.

비효소적 방법, 효소적 방법 등의 화학적 방법으로 얻어지는 조생성물에서의 추출·조정제도 상기와 같이 행할 수 있다.

다음에, 본 발명의 정제 방법에 대해서, 예를 들어 더욱 상세하게 설명한다.

본원 제1 발명에서, 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머는 그 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 원료 또는 그의 조정제물을, 아세트산 메틸의 단일 용매, 또는 아세트산 메틸 및 아세트산 메틸과 혼합 가능한 유기용매의 조합으로 되는 혼합 용매 중 어느 하나를 액상으로 사용한 고액 추출을 행함으로써 정제할 수 있다. 원료 또는 그의 조정제물이 액체인 경우는, 미리 스프레이 드라이나 동결 건조하여 분말화 해 둠이 바람직하다. 통상, 고체와, 아세트산 메틸, 또는 아세트산 메틸 및 아세트산 메틸과 혼합 가능한 유기용매의 조합으로 되는 혼합 용매와의 혼합비는(w/v)는 1:1∼1:1000정도이고, 추출은 실온하 또는 가열하면서, 교반을 병용하여 단시간에 행한다. 고체와, 아세트산 메틸, 또는 아세트산 메틸 및 아세트산 메틸과 혼합 가능한 유기용매의 조합으로 되는 혼합 용매와의 혼합비(w/v)는, 1:5∼1:100이 바람직하고, 실온에서 약 1시간 정도 추출을 행하고, 동일 조건에서 추출 잔사를 수회 더 재추출하면 보다 바람직하다. 또한, 효율 좋게 고액 추출을 행하기 위해서는 분말체의 입경은 작은 편이 바람직하다. 혼합 용매를 사용하여 추출하는 경우, 그 혼합 용매는 용매의 혼합에 의해 아세트산 메틸과 유사한 용매 극성을 갖는 것이 바람직하다. 이들 용매를 사용한 고액 추출법에 의해, 프로안토시아니딘 중합체나 다른 이물질의 용출을 억제하여, 효율 좋게 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머를 정제할 수 있다. 본원 제1 발명에서는, 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머는 얻어진 아세트산 메틸 추출액을 농축한 뒤, 농축 잔사를 물, 또는 완충액 등의 수성 용매 등에 재용해시켜, 동결 건조하여 회수해도 좋고, 스프레이 드라이를 행하여 회수해도 좋다.

본원 제２ 발명에서, 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머는 그 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 원료 또는 그의 조정제물, 또는 그들을 함유하는 용액을, 미리 가수분해 효소로 처리함으로써 정제한다. 통상, 그 원료 또는 그의 조정제물에는 프로안토시아니딘 올리고머 이외의 이물질이 많이 함유되어 있고, 특히 원료 또는 그의 조정제물이 식물 유래인 경우, 프로안토시아니딘 올리고머 이외의 폴리페놀 배당체나 에스테르체가 높은 비율로 존재한다. 이물 성분인 상기 배당체나 에스테르체를 상기의 가수분해 효소로 처리하여 미리 아글리콘화함으로써, 다음 정제 공정에서의 이물 성분의 제거를 효율 좋게 행할 수 있고, 프로안토시아니딘 올리고머의 순도 향상을 도모할 수 있다. 예를 들면, 여뀌(Polygonaceae)과의 메밀의 전체 식물에 많이 함유되어 있는 플라보노이드 배당체인 루틴은, β-글루코시다제로 처리함으로써 케르세틴으로 아글리콘화된다. 쌍자엽 식물의 과실이나 잎에 많이 함유되어 있는 하이드록시계피산 에스테르체인 클로로겐산 및 p-쿠마로일퀴닌산은 히드록시계피산 에스테르 하이드로라제로 처리함으로써 분자내 에스테르 결합인 뎁시드 결합이 가수분해되어, 카페인산(caffeic acid)과 퀴닌산(quinic acid) 및 p-쿠말산과 퀴닌산으로 된다. 가수분해 효소 처리의 반응 조건은 효소의 종류 등에 따라 다르지만, 통상, pH3∼8, 25∼55℃, 1∼24시간이다. 가수분해 효소 처리에 의해서 생성한 상술의 아글리콘 성분, 유리 당류 또는 카복실산류는 냉각 처리, 액액 또는 고액 추출 처리 또는 컬럼 흡착 처리 등의 기존 방법, 혹은 이들과 정상 크로마토그래피의 조합에 의해, 용이하게 제거할 수 있다. 이상의 조작을 행함으로써, 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 원료 또는 그의 조정제물 중의 이물 성분의 제거가 효과적에 행해져서, 목적 성분인 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머의 순도를 향상시킬 수 있다.

본원 제３ 발명에서, 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 원료 또는 그의 조정제물에서, 에스테르계 용매, 케톤계 용매, 탄화수소계 용매, 에테르계 용매 및 알콜계 용매로 되는 군으로부터 선택되는 단일 용매 또는 2종 이상의 혼합 용매를 이동상으로서 사용한 정상 실리카 겔 액체 크로마토그래피에 의해, 상기 프로안토시아니딘 올리고머를 중합도별로 분리 정제하여, 중합도수가 균일한 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머를 얻을 수 있다. 상기 정상 실리카 겔 액체 크로마토그래피로는, 오픈 컬럼 크로마토그래피에 의한 방법 및 고속 액체 크로마토그래피에 의한 방법 둘다를 적용할 수 있다. 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머는 그 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 용액에서 용매 또는 물을 제거한 뒤, 혹은 그 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 원료 또는 그의 조정제물이 고체인 경우는 그대로, 이동상 또는 이동상에 가용인 유기용매에 직접 용해시킨다. 필요에 따라, 멤브레인 필터(membrane filter)등으로 여과한 뒤, 컬럼에 충전(charge)한다. 목적 성분을 용출할 때에는, 이동상에 농도 구배를 적용하지 않는 이소크라틱 용출법으로 행하는 것이, 작업 간소화면에서 바람직하다. 이소크라틱 용출법에서의 이동상으로는 헥산/메탄올/아세트산에틸, 헥산/아세톤, 헥산/메탄올/테트라하이드로푸란/아세트산, 헥산/메탄올/테트라하이드로푸란/포름산, 헥산/메탄올/아세트산메틸/아세트산, 헥산/메탄올/아세트산메틸, 헥산/아세트산메틸/아세톤 등의 혼합 용매가 바람직하다.

본원 제３ 발명의 정제 방법을 사용함으로써, 이물 성분인 (+)-카테킨, (+)-갈로카테킨, (-)-에피카테킨, (-)-에피갈로카테킨 등의 프로안토시아니딘 구성 단량체나 6량체 이상의 프로안토시아니딘 중합체의 효과적인 제거가 가능하게 됨과 동시에, 목적 성분인 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머 성분을 중합도별로 분리 정제할 수 있다.

본원 제1∼제３ 발명에 의한 정제 방법은, 추출원으로 되는 원료 및 목적으로 하는 정제도 등에 따라, 자유롭게 선택하고, 반복하거나 조합해도 좋다.

2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머의 정제는 본원 제1∼제３ 발명에 의한 정제 방법 중 2종 이상을 조합함이 바람직하고, 중합도수가 균일한 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머의 정제는 본원 제1 발명에 의한 정제 방법 및/또는 본원 제２ 발명에 의한 정제 방법과, 본원 제３ 발명에 의한 정제 방법을 조합함이 바람직하다. 또한, 다른 공지 방법과 조합해도 좋다. 정제 방법을 조합한 경우, 각 정제 방법의 사용 단계 및 사용 순서에는 제한이 없다.

이들의 방법에 의해, 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머, 2량체 프로안토시아니딘 및 3량체 프로안토시아니딘의 고순도체[순도 90(w/w)% 이상]을 효율 좋게 얻을 수 있다.

본 발명의 정제 방법으로 정제한 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머, 2량체 프로안토시아니딘 및 3량체 프로안토시아니딘은 식품, 화장품, 의약품 등의 제조 원료로서 사용할 수 있다.

본 발명에 의해, 프로안토시아니딘을 함유하는 원료 또는 그의 조정제물에서, 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머 및 중합도수가 균일한 2량체, 3량체 프로안토시아니딘을 고순도로 또한 효율 좋게 정제할 수 있다. 본 발명에 의해 얻어지는 프로안토시아니딘 올리고머는 항종양, 항염증, 항노화, 항산화, 항알러지, 항균, 육모 등의 다양한 생리 활성을 가지며, 식품이나 화장품 혹은 의약품 등의 용도에 유용하다.

Claims

2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 원료 또는 그의 조정제물에서, 아세트산 메틸을 액상으로 사용한 고액 추출법에 의해 상기 프로안토시아니딘 올리고머를 추출함을 특징으로 하는 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머의 정제 방법.
제 1항에 있어서,

2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 원료 또는 그의 조정제물이 식물 유래인 프로안토시아니딘 올리고머의 정제 방법.
제 1항에 있어서,

상기 액상에 아세트산 메틸과 혼합 가능한 유기용매를 첨가하는 프로안토시아니딘 올리고머의 정제 방법.
제 3항에 있어서,

아세트산 메틸과 혼합 가능한 유기용매가 알코올계 용매,에스테르계 용매, 케톤계 용매, 니트릴계 용매, 에테르계 용매, 탄화수소계 용매 및 카복실산계 용매로 되는 군으로부터 선택되는 용매인 프로안토시아니딘 올리고머의 정제 방법.
제 3항에 있어서,

아세트산 메틸과 혼합 가능한 유기용매가 메탄올, 에탄올, 프로탄올, 부탄올, 포름산 메틸, 포름산 에틸, 아세트산 에틸, 아세톤, 아세토니트릴, 테트라하이드로푸란, 헥산 및 아세트산으로 되는 군으로부터 선택되는 용매인 프로안토시아니딘 올리고머의 정제 방법.
2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 원료 또는 그의 조정제물, 또는 그들을 함유하는 용액을, 미리 글리코시다제(glycosidase)로 처리함을 특징으로 하는 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머의 정제 방법.
제 6항에 있어서,

2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 원료 또는 그의 조정제물이 식물 유래인 프로안토시아니딘 올리고머의 정제 방법.
제 6항에 있어서,

2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 원료 또는 그의 조정제물을 함유하는 용액이, 10% 이하의 유기용매를 함유하는 수성 용액인 프로안토시아니딘 올리고머의 정제 방법.
제 8항에 있어서,

유기용매가 알코올계, 에스테르계 또는 케톤계의 유기용매인 프로안토시아니딘 올리고머의 정제 방법.
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제 10항에 있어서,

글리코시다제가 아밀라제, 셀룰라제, 글루카나제, 크실라나제, 글루코시다제, 덱스트라나제, 키티나제, 갈락트로나제, 라이소자임, 갈락토시다제, 만노시다제, 프락토푸라노시다제, 트레할라제, 글루코사미니다제, 풀루라나제, 세라미다제, 푸코시다제 및 아가라제로 되는 군으로부터 선택되는 단독물 또는 2종 이상의 혼합물인 프로안토시아니딘 올리고머의 정제 방법.
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2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 원료 또는 그의 조정제물에서, 에스테르계 용매, 케톤계 용매, 탄화수소계 용매, 에테르계 용매 및 알콜계 용매로 되는 군으로부터 선택되는 단일 용매 또는 2종 이상의 혼합 용매를 이동상으로 사용한 정상 실리카 겔 액체 크로마토그래피에 의해, 상기 프로안토시아니딘 올리고머를 중합도별로 분리 정제함을 특징으로 하는 중합도수가 균일한 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머의 정제 방법.
제 13항에 있어서,

2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 원료 또는 그의 조정제물이 식물 유래인 프로안토시아니딘 올리고머의 정제 방법.
제 13항에 있어서,

이동상으로 사용하는 용매가 에스테르계 용매, 케톤계 용매, 탄화수소계 용매, 에테르계 용매 및 알콜계 용매로 되는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 혼합 용매인 프로안토시아니딘 올리고머의 정제 방법.
제 13항에 있어서,

에스테르계 용매가 포름산 메틸, 포름산 에틸, 포름산 프로필, 포름산 이소프로필, 포름산 부틸, 포름산 이소부틸, 아세트산 메틸, 아세트산 에틸, 아세트산 프로필, 아세트산 이소프로필, 아세트산 부틸, 아세트산 이소부틸, 프로피온산 메틸, 프로피온산 에틸, 프로피온산 프로필, 프로피온산 이소프로필, 프로피온산 부틸, 프로피온산 이소부틸, 부틸산 메틸, 부틸산 에틸, 부틸산 프로필, 부틸산 이소프로필, 부틸산 부틸 및 부틸산 이소부틸로 되는 군으로부터 선택되는 용매인 프로안토시아니딘 올리고머의 정제 방법.
제 13항에 있어서,

케톤계 용매가 아세톤, 메틸에틸케톤, 메틸프로필케톤, 메틸이소프로필케톤, 메틸부틸케톤, 메틸이소부틸케톤, 메틸tert-부틸케톤, 디에틸케톤, 디이소프로필케톤, 메틸비닐케톤, 시클로부타논, 시클로펜타논 및 시클로헥사논으로 되는 군으로부터 선택되는 용매인 프로안토시아니딘 올리고머의 정제 방법.
제 13항에 있어서,

탄화수소계 용매가 펜탄, 헥산, 헵탄, 옥탄, 노난, 데칸, 노나데칸, 시클로헥산, 크실렌 및 톨루엔으로 되는 군으로부터 선택되는 용매인 프로안토시아니딘 올리고머의 정제 방법.
제 13항에 있어서,

에테르계 용매가 테트라하이드로푸란 또는 1,2-디메톡시에탄인 프로안토시아니딘 올리고머의 정제 방법.
제 13항에 있어서,

알콜계 용매가 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, sec-부탄올 및 tert-부탄올로 되는 군으로부터 선택되는 용매인 프로안토시아니딘 올리고머의 정제 방법.
제 1항 기재의 정제 방법, 제 6항 기재의 정제 방법 및 제 13항 기재의 정제 방법으로 되는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 정제 방법을 조합한 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머의 정제 방법.
제 1항 기재의 정제 방법 및/또는 제 6항 기재의 정제 방법과, 제 13항 기재의 정제 방법을 조합하는 중합도수가 균일한 2∼5량체의 프로안토시아니딘 올리고머의 정제 방법.
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