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Verfahren zur Herstellung von Prunin Prunin gehört wie Hesperidin
und Rutin zur Klasse der Flavonoide, die auf Grund ihrer vitaminartigen Wirkung
die Widerstandsfähigkeit der Blutgefäße erhöhen. Während das Naringin, ein Rhamnosid-Glucosid-Oxyflavon,
sehr leicht aus Naturprodukten erhalten werden kann, war es bis jetzt verhältnismäßig
schwierig, das von Rhamnose freie, entsprechende Flavonoid-Glucosid »Prunin« als
natürlich vorkommendes Glucosid oder aus Naringin, dem entsprechenden Rhamnosid-Glucosid-Oxyflavon,
zu gewinnen. Die bisherigen Versuche, durch enzymatische Spaltung den im Naringinmolekül
enthaltenen Rhamnoseanteil zu entfernen, führten zur Abtrennung von Glucosid-Rhamnose,
d. h. zur Abspaltung der gesamten Biose. Hydrolyseverfahren unter Verwendung von
Säuren, wie Schwefelsäure, Essigsäure, Phosphorsäure und Zitronensäure, verursachten
eine vollständige Aufspaltung in Rhamnose, Glucose und das Aglykon Naringenin (vgl.
Chemistry and Industry, 57 [1938], S. 473). Es wurde auch schon vorgeschlagen, für
die Hydrolyse einen cycloaliphatischen Alkohol und Ameisensäure zu verwenden. Dieses
Verfahren verläuft aber sehr langsam und erfordert 10 bis 30 Stunden zur Erzielung
brauchbarer Ergebnisse.
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Es wurde nun gefunden, daß man Prunin in guter Ausbeute dadurch erhält,
daß man eine naringinhaltige Lösung in Gegenwart von 40 bis 200 Gewichtsteilen Glukose
oder von 1 bis 5 Gewichtsteilen Glukonlakton je Gewichtsteil Naringin bei einem
pH-Wert von 3 bis 7 und einer Temperatur von 5 bis 60°C mit 0,01 bis 0,501,
eines naringinasehaltigen Enzympräparates behandelt und anschließend das aus der
Lösung ausfallende Prunin abtrennt.
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Als naringinasehaltiges Enzympräparat kann ein solches verwendet werden,
das aus Pflanzenbestandteilen, z. B. aus Blättern, Albedo und Flavedo von Citrusfrüchten,
Sellerie und Rharbarber, extrahiert worden ist. Es eignet sich auch ein solches,
das von Bakterien oder Pilzen stammt. Geeignete Enzyme werden z. B. von verschiedenen
Pilzen, wie Aspergilli, z. B. A. niger, A. alliaceus, A. venti, und Penicilliumarten
erzeugt.
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Zum Nachweis des gewünschten katalytischen Systems im rohen Enzympräparat
kann p-Nitrophenyl-ß-d-glucosid als Substrat verwendet werden. Aus diesem wird durch
die Naringinase p-Nitrophenol abgespalten, das eine gelbe Farbe annimmt, wenn man
das Substrat alkalisch macht. Die Intensität der gelben Farbe gibt die Menge des
enzymatisch freigesetzten p-Nitrophenols an. Als Standard-Enzympräparat gilt ein
solches, das aus einer 1,69 # 10-3molaren Lösung in 20 Minuten bei einer Temperatur
von 28'C und einem pH-Wert von 5 mindestens 0,5 # 10-3 Mol p-Nitrophenol freisetzt.
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Die Naringinase im Enzympräparat kann ferner mit folgender Substratlösung
festgestellt werden:
| 25 ccm einer Lösung aus |
| kristallinem Naringin (technisch rein) 0,5 g |
| Zitronensäure .................... 15 g |
| NaOH, um den pH-Wert einzu- |
| stellen auf ..................... 4,0 |
| Wasser zum Auffüllen auf ......... 1000 ccm |
werden mit 0,2 ccm der zu untersuchenden Enzymextraktlösung gemischt. Das Gemisch
wird 2 Stunden bei 50°C inkubiert. Dann wird die behandelte Lösung 15 Minuten auf
100°C erhitzt. Das gekühlte Substrat wird auf die Anwesenheit von Rhamnose oder
Glukose untersucht, entweder nach dem Somogyi-Verfahren (Journ. of Biol. Chem.,
195 [1952], S. 19 bis 23) oder papierchromatographisch.
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Als Standardenzympräparat gilt ein solches, das bei 50°C in einem
pH-Bereich von 4,0 bis 5,0 eine mindestens 25°/jge Hydrolyse der ursprünglich 0,05°/oigen
Naringinlösung unter Bildung von mindestens 0,0008 g Rhamnose und 0,0009 g Glukose
bewirkt.
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Für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Naringinkonzentration nicht
entscheidend. Liegt das Naringin
z. B. in einer übersättigten Lösung
zum Teil in Kristallen vor, so geht dieses im Laufe der enzymatischen Hydrolvse
allmählich in Lösung. Die Umwandhing zu Prunin erfolgt sehr rasch und beträgt im
allgemeinen mehr als 90°71o der Theorie. Das Prunin kristallisiert gewöhnlich aus
der wäßrigen Lösung aus. Es wird durch Umkristallisieren gereinigt.
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Das Fortschreiten der Umwandlung von Naringin in Prunin kann in folgender
Weise ermittelt werden: Eine Probe wird zur Inaktivierung des Enzyms erhitzt und
darauf nach dem Davis-Test (W. B. D a v i s, Anal. Chem., 19 [1947], S.476) ihr
Naringin- und Pruningehalt ermittelt.
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Nach diesem Test wird eine Lösung aus 950 ccm Diäthylenglykol, 13,3
ccm 6 n-Natriumhydroxyd und 36,7 ccm Wasser hergestellt. 10 ccm dieser Lösung werden
zu 0,2 ccm der zu untersuchenden Substratlösung gegeben. Es entsteht eine gelbe
Farbe. Nach Ablauf von. 20 Minuten wird die Farbintensität spektrographisch bestimmt.
Die Intensität der gelben Farbe ist dem Naringin-plus-Pruningehalt proportional.
Die Naringin-plus-Prunin-Konzentration des Substrates kann durch Vergleich mit einer
Standardkurve ermittelt werden, die die Farbintensität bekannter Naringinkonzentrationen
angibt.
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Anschließend wird die Probe mit Emulsin behandelt, um das gesamte
Prunin zu Naringenin zu hydrolysieren. Emulsin ist ein im Handel erhältliches, aus
Pflanzen extrahiertes Präparat mit ß-Glucosidase-Enzymwirksamkeit. Es beeinträchtigt
das Naringin nicht. Die Hydrolyse des Prunins wird zweckmäßig mit einem Überschuß
an vorzugsweise kristallinem Emulsin, z. B. 0,2 bis 0,80/" bei einem pH-Wert von
etwa 4,5 bis 5,0 und einer Temperatur von etwa 30 bis 35°C, durchgeführt. Nach Beendigung
der Hydrolyse wird der Naringingehalt erneut nach dem Davis-Test bestimmt. Die Abnahme
an Naringin entspricht der vor der Emulsinbehandlung vorhandenen, d. h. der durch
enzymatischen Abbau von Naringin gebildeten Menge Prunin.
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Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.
Beispiel 1 Das für das erfindungsgemäße Verfahren angewandte Enzympräparat ist dadurch
hergestellt worden, daß man aus
| Weizenkleie ...................... 5 g |
| Sojamehl......................... 3 g |
| Steffens-Abfall ................... 0,5 g |
| Ammoniumphosphat .............. 2,5 g |
| Naringin ........................ 0,25 g |
| Wasser zum Auffüllen auf ......... 190 ccm |
ein Nährmedium herstellte, dieses mit 0,2 bis 0,5 ccm Ammoniumhydroxyd auf pH 6
einstellte, sterilisierte und die gekühlte sterile Flüssigkeit aseptisch mit Sporen
eines Aspergillus-niger-Stammes impfte. Die beimpften, mit Watte verschlossenen
Flaschen wurden 48 Stunden bei 28'C geschüttelt. 10 ccm dieser Kultur wurden aseptisch
in sterilisierte Kolben gebracht,die 140 ccm des oben beschriebenen Nährmediums
enthielten. Nach 96stündiger Bebrütung bei 28°C auf dem Schüttler wurde filtriert
und eine Probe des Filtrats auf die gewünschte Enzymwirksamkeit untersucht.
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Sowohl die Untersuchung mit p-Nitrophenylß-d-glykosid als auch mit
einer Naringinlösung zeigte eine zufriedenstellende Wirksamkeit des Enzympräparates
an.
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2 g umkristallisiertes Naringin wurden in 800 ccm Wasser von 60°C
gelost. Zu dieser Lösung wurden 10 g Glukonlakton und 6 g Zitronensäure gegeben,
der pH-Wert durch Zugabe von Natriumhxdroxyd auf 4 eingestellt und die Lösung dann
auf 1 1 aufgefüllt. Anschließend wurden 5 ccm des obigen Naringinase-Enzympräparates
zugegeben, und die Temperatur des Gemisches wurde 2 Stunden auf 50°C gehalten. Aus
der 50'C warmen Mischung fiel das gebildete Prunin als Rohprodukt aus. Es
wurde zweimal aus einem Gemisch von 20 ccm Methanol und 10 ccm Wasser umkristallisiert.
Ausbeute 378 mg; F. 220°C. Beispiel 2 5 g Naringin wurden mit 450 ccm Wasser von
50°C versetzt, wobei 2 g Naringin ungelöst blieben. Zu dieser Lösung wurden 120
g Glukose und 3 g Zitronensäure gegeben, und der pH-Wert wurde mit Kaliumhydroxyd
auf 3,5 eingestellt. Anschließend wurden zu der Lösung 3 ccm des gleichen Naringinase-Enzympräparates
wie im Beispiel 1 gegeben. Das Ganze wurde 6 Stunden unter gelegentlichem Schütteln
bei 40°C stehengelassen, wobei sich das restliche Naringin löste. Nach dieser Zeit
war praktisch das gesamte Naringin in Prunin übergeführt. Es fiel aus der heißen
Lösung aus und wurde aus Methanol umkristallisiert. Ausbeute 750 mg; F. 220°C. Beispiel
3 11 ungesüßter Grapefruitsaft aus Texas Pinkmeat Grapefruits mit einem Naringingehalt
von 0,0580/, wurde auf etwa 50°C erwärmt. Dann wurden dem Saft 120 g Glukose zugesetzt
sowie Naringinase-Enzympräparat nach Beispiel 1 in solcher Menge, daß die Enzymkonzentration
0,15 °/o betrug. Das Ganze wurde 1 Stunde auf 50°C gehalten. Das Prunin fiel aus
der heißen Lösung aus und wurde aus einem Gemisch von 20 ccm Methanol und 10 ccm
Wasser umkristallisiert. Ausbeute 23 mg Prunin vom Schmelzpunkt 220°C aus 1000 ccm
Grapefruitsaft. Beispiel 4 Nach der im Beispiel 3 beschriebenen Methode wurden 31
Grapefruitsaft, der aus Grapefruitrückständen extrahiert worden war und einen Naringingehalt
von 0,076 % pro Liter hatte, unter Zugabe von 10 g Glukonlakton und 0,5 g
Naringinase enthaltendes Enzympräparat nach Beispiel 1 behandelt und aufgearbeitet.
Aus 1000 ccm Saft wurden 30 mg Prunin vom Schmelzpunkt 220°C erhalten. Beispiel
s Einer Lösung von 2 g Naringin in 800 ccm Wasser wurden 2 g Glukonlakton und 6
g Zitronensäure zugesetzt, dann wurde der pH-Wert der Lösung durch Zugabe von Natriumhydroxyd
auf 4 eingestellt und hierauf das Ganze mit Wasser auf 1 1 aufgefüllt. Anschließend
wurde die Lösung mit 5 ccm Naringinase-Enzympräparat nach Beispiel 1 versetzt und
das Ganze 2 Stunden auf 50°C gehalten. Das Prunin fiel aus der heißen Lösung aus.
Ausbeute 345 mg; F. 220°C.