DD225711A1

DD225711A1 - Verfahren zur herstellung von thermitase mit alpha-amylolytischer aktivitaet

Info

Publication number: DD225711A1
Application number: DD26198584A
Authority: DD
Inventors: Manfred Richter; Peter Klingenberg; Dieter Koerner; Heinz Ruttloff; Friedrich Schierbaum
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1984-04-16
Filing date: 1984-04-16
Publication date: 1985-08-07

Abstract

Das erfindungsgemaesse Verfahren fuehrt zu einer Thermitase, die neben der proteolytischen Aktivitaet auch eine zur Anwendung geeignete alpha-amylolytische Aktivitaet aufweist. Ein derartiges Enzympraeparat ist als Hilfsmittel bei der Naehrmittel-, Waffel- und Backwarenherstellung erwuenscht. Erfindungsgemaess wird die Kultivation eines Stammes von Thermoactinomyces vulgaris und/oder seiner Mutanten - hinterlegt in der zentralen Stammsammlung der DDR im Zentralinstitut fuer Mikrobiologie und experimentelle Therapie in Jena unter IMET 5912 und die Mutante IMET 9515 - durchgefuehrt und fuer die alpha-amylolytische Aktivitaet bei einer Fermentationsdauer von 16 bis 20 Stunden abgebrochen.

Description

Erfinder: Dr. Manfred Richter

Dr. Peter Klingenberg Dipl.-Ing. Dieter Körner Prof. Dr. Heinz Ruttloff Dr. !Friedrich Schierbaum

Verfahren zur Herstellung von Thermitase mit alpha-amylolytischer Aktivität

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung kann überall dort angewendet werden, wo neben der proteolytischen zusätzlich auch eine alpha-amylolytische Aktivität des einzusetzenden Enzyms notwendig ist. Das betrifft bestimmte Einsatzgebiete bei der Verarbeitung bzw. der Herstellung protein- und stärkereicher Rohstoffe bzw. Lebensmittel. So ist z. B. die Verwendung von Proteasen und alpha-Ainylasen als Hilfsmittel bei der Nährmittel-, Waffel- und Backwarenherstellung bekannt. Selbstverständlich kann das erfindungsgemäß hergestellte Enzympräparat auch wie reine alpha-Amylase herkömmlich zur. Herstellung von Stärkesyrupen, Stärkevorhydrolysaten, Glucose und anderen Hydrolysenprodukten verwendet v/erden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Herstellung von Thermitase aus Therraoactinomyces vulgaris ist im WP 156 714 beschrieben. Hierbei handelt es sich um ein Enzympräparat das nur eine, nämlich eine proteolytische Hauptaktivität auf v/eist.

λ Γ- Λ W Cl Π

Für das Enzym liegt die diesbezügliche optimale wirkung bei pH = 8 und das Temperaturoptimum bei 70 ⁰G. Wenn eine zweite., nämlich alpha-amylolytische Hauptaktivität gebraucht wird, dann muß der Anwender herkömmliche alpha-Amylasepräparate zur Verfugung haben und mit der Thermitase mischen. Stellt der Anwender die obige Thermitase selbst her, benötigt er eine zweite Produktionslinie zur mikrobiellen Gewinnung von alpha-Amylase. Nachteilig wirkt sich hierbei aus, daß die Kulturführung zur Erzeugung der alpha-Amylase störanfällig ist, wenn mit den herkömmlichen alpha-Amylasebildnern, wie z. B. Bacillus subtilis oder Aspergillus orezae gearbeitet wird. Diese mesophilen MikrοOrganismen unterliegen bekanntlich der normalen Infektionsgefahr bei der. Fermentation.

Demgegenüber weisen thermophile Mikroorganismen wozu auch Thermoactinomyces vulgaris gehört, diese Störanfälligkeit nicht.auf. Es ist lange bekannt, daß diese Species auch alphä-Ämylase produzieren. So beschreiben M.J. ICJO und P.A. HARTMAipr ( Journal of Bacteriology, 32, (1966) 723-726) die Herstellung thermophiler Actinomyces-alpha-Amylase unter Verwendung von Maltose und Stärke als Kohlenstoffquelle bei der Kulturführung. Nachteilig bei diesem Verfahren ist die lange Inkubationszeit von mehr als 36 Stunden und die Verwendung von teurer Maltose als Substrat. Dieses Disaccharid muß, wenn man es nicht zur Verfügung hat, -erst durch einen enzymatischen Abbau mit beta-Amylase aus Stärke hergestellt werden. Aus der genannten Arbeit kann nicht entnommen werden, ob das betreffende Enzympräparat neben der alpha-amylolytischen Hauptaktivität auch noch eine zweite, d. h. proteolytische Hauptaktivität besitzt.

Die Isolierung einer alpha-Amylase aus dem Kulturfiltrat von Thermoactinomyces vulgaris, Stamm R-47 beschreiben M. SHMIZU, H. KAlCTO, M. TAMURA und IE. SUEKAiIE (Agric. Biol. Chem.,· £2, (1978) 1681 - 1688). Das durch Salzfällung

und Säulenchromatographie gereinigte 3nzym kann Pullulanan unter Bildung von Pannose und Stärke unter Bildung von 74,1 % LIaItöse und 11,8 % Glucose als Hauptreaktidnsprodukte spalten. Sine solche saccharogene alpha-Amylase ist aber für viele Anwendungszwecke nicht geeignet. Bei Erhitzungsvorgängen reagiert insbesonders die durch den Stärkeabbau gebildete Glucose mit den in Lebensmittelbestandteilen wie z. B. Mehlen immer vorhandenen Aminosäuren. Dabei kommt es zur unerwünschten Bildung von Färb- und Geschmacksstoffen. Deshalb setzt der Fachmann als Backhilfsmittel z. B. bei der V/affelherstellung dextrinogene alpha-Amylasen ein, die keine oder nur geringe Mengen an Glucose bilden.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel das Anwendungsspektrum von Thermitase zu verbreitem.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die speziellen Verfahrensbedingungen zur Herstellung von Thermitase mit alpha-ainylolytischer Aktivität aufzuzeigen. Die Aufgabe wird gelöst, indem in einem für Proteasen üblichen Medium Mikroorganismen des Stammes Thermoactinomyces vulgaris und/oder seiner Mutanten - hinterlegt in der zentralen StammesSammlung der DDR im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie in Jena unter IiIST 9512 und für die Mutante ILiET 9515 - kultiviert werden. Dabei wird in der Weise vorgegangen, daß man in Abständen die alpha-amylolytische Aktivität bestimmt und die Fermentation bei vorgegebener Zeit im Bereich von 16-bis 20 Stunden beendet, wenn diese das Maximum erreicht hat. !lach dieser Zeit fällt die alpha-amylolytische Aktivität rasch ab, während die proteolytische Aktivität erst nach 20 bis 24 Stunden das Maximum erreicht. Zur Zeit des

Haxiraum.;der alpha-amylolytischen Aktivität hat die proteolytische Aktivität bei vorgegebenen Fermentationsbedingungen etwa die Hälfte des Höchstwertes erreicht, Nach Abtrennung der Biomasse kann das Kulturfiltrat in bekannter Weise in ein Trockenpräparat aufgearbeitet v/erden.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen "Verfahrens hat es sich als zweckmäßig erwiesen, eine Fütterung mit einer Kohlenstoffquelle und mit einer Stickstoffquelle im Bereich von 2 bis 14 Stunden gemäß WP 156 714 vorzunehmen. Als -Kohlenstoffquelle sind vorzugsweise Stärke, gelbildende Maltodextrine entsprechend WP 126 992 und Maltodextrine geeignet.

Überraschend hat sich ergeben, daß die Temperatur- und pH-Bedingungen bei denen sich die proteolytisch.e oder amy-,.Iqlytische Aktivität zeigt, verschieden sind. Die "Protease "-Wirkung der Thermitase liegt bekannter Weise bei pH 3 und bei 70 ⁰G. !Pur die "alpha-Amylase"-Wirkung der Thermitase wurde ein pH-Optimum bei pH 5 bis 6 und ein Temperaturoptimum bei 50 bis 60 ⁰C gefunden. Damit läßt sich in dem für Lebensmittel typischen schwach sauren pH-Bereich und bei Temperaturen kleiner als 70 ⁰C vorwiegend'die. alpha-amylolytische Aktivität der Thermitase ausnutzen. Der Fachmann kann aber durch Variation des pH-Wertes zwischen 5 und 3 das Verhältnis der beiden Enzymaktivitäten •entsprechend dem Anwendungszweck einstellen.

Die erfindungsgemäß hergestellte Thermitase mit alpha-amylolytischer Aktivität bildet beim Abbau verschiedener Stärkepolysaccharide, wie Hydrozyaethylamylose, Glykogen, Wachsmaisstärke, Kartoffelstärke, u. a. keine Glucose. Als Hauptreaktionsprodukte wurden mittels DünnschichtChromatographie Maltose, Maltotriose und Maltotetraose nachgewiesen. Pullulanan wird bei pH 5 und 50 ⁰G durch die erfindungsgemäß hergestellte Thermitase nicht gespalten.

Bei der Beschreibung der Merkmale der Erfindung wurde auf die proteolytischen und alpha-amylolytischen Aktivitäten

hingewiesen. Unter Aktivitäten werden hierbei die Wirkungen in der Zeiteinheit verstanden, die eine "bestimmte Snzymmenge auf einen abzubauenden Stoff, daß ist das Substrat, unter definierten Bedingungen (pH, Temperatur) ausübt. Es ist üblich diese Wirkung in Einheiten auszudrücken, die man dann auf bestimmte Mengen wie ein ml Kulturfiltrat oder ein Gramm Enzymtrockensubstanz bezieht. Gewöhnlich werden als Substrat für Proteasen und für alpha-Ämylasen Stärkepolysaccharide eingesetzt und die Wirkung durch Abbau dieser Substrate bestimmt. Die Bestimmung der proteolytischen Aktivität ist im WP 156 714 beschrieben«.

Zur Bestimmung der alpha-amylolytischen Aktivität werden 2,5 al einer durch Aufkochen erhaltenen 1 %igen wäßrigen Hydroxyaethylamyloselösung mit 2,4 ml Acetat-Puffer von pH 5,0 vermischt und auf 50 C temperiert. Der Abbau wird begonnen durch Zugabe von 0,1 ml Bnzyrnlösung. Diese kann aus einem Seil Kulturfiltrat und vier Teilen des oben genannten Puffers bestehen oder aber eine Aufschlämmung bzw. Lösung von 0,1 g Thermitase in 100 ml dieses Puffers.sein. Nach einer Zeit von t Minuten wird vom Ansatz eine Probe von 0,1 ml entnommen und zu 5 ml einer 0,05 normalen Salzsäurelösung gegeben. Dadurch wird der enzymatische Abbau gestoppte Von dieser .salzsauren Probenlösung werden 0,5 ml. mit 7,5 ml 7/asser, 1,0 ml einer 1 normalen Salzsäure und 1,o ml einer auf das Zehnfache verdünnten Kaliumjodid-Kaliumjodat-Stammlösung zur Entwicklung des Jod-Polysaccharidkompleses vermischt. Die Kaliumjodid-Kaliumgodat-Stammlösung ist in bezug auf Kaliumiodid ο,11665 molar,

in bezug auf Kaliuirgodat 8,33· 10*"^ molar und in bezug auf

—2 —

Kaliumhydrogencarbonat 10 molar, m einem Spektralphotometer (ζ'. B. "Specord UY VIS" des VEB Carl Zeiß Jena, DDR) wird die Absorptionskurve der jodhaltigen Meßprobe aufgeschrieben» Dazu verwendet man übliche Glasküvetten mit einer Schichtdicke von 5 cm und führt die Messung gegen einen Leerwert aus, der an Stelle von 0,5 ml salzsaurer Probenlösung 0,5 ml Wasser enthält. Aus dieser Messung

wird die Extinktion E₊ im Absorptionsmaximum erhalten. Gleichzeitig mit dem Meßansatz .wird ein Blindansatz hergestellt indem an Stelle der 0,1 ml Enzymlösung 0,1 ml Acetat-Puffer von pH 5,0 verwendet und in gleicher V/eise wie beschrieben verfahren wird. Aus dieser Messung des Blindansatzes wird die Extinktion S im Absorptionsmazimum erhalten. Die Reaktionszeit t wird so variiert, daß E. nicht kleiner als die Hälfte des Wertes von Ξ wird. Eine geeignete Zeit stellt t = 5 Minuten dar. Die alpha-Amylase-Einheiten werden wie folgt berechnet:

AE = (log Ξ,' - log Ej t . V

und beziehen sich auf ein ml Kulturfiltrat (Y = 0,2) bzw. auf ein Gramm Enzymtrockenpräparat (V = 0,0001).

Die Erfindung wird anhand eines Beispieles näher erläuter, Ausführungsbeispiel

Ein 300 1-Rlihrfermentor wird mit 150 1 Medium der Zusammensetzung

Maisstärke 1,00 Masse-%

Maisquellwasser (5O.5»ig) 1,00 Masse-%

Trockenhefe 0,03 Masse-%

Magermilchpulver 0,05 Masse-%

0,5 Masse-%

CaCIp 0,05 Masse-%

befüllt und sterilisiert. Die Beimpfung erfolgt mit Inoculum des genannten Stammes, das gemäß "/P 156 714, Beispiel 1, vorkultiviert wird._; Die Fermentationstemperatur beträgt 50 ⁰C. Luftmenge und Rührerdrehzahl werden Schrittweise innerhalb von 6 Stunden von 20 l/min auf 140 l/min bzw. von 300 min"¹ auf 500"¹ erhöht·. Als Entschäumer werden, dem Medium vor der Beimpfung 0,5 1 Rapsöl zugesetzt, lach 2,4,6 und 14 Fermentationsstunden werden dem Ansatz je 5 1 Substrat der Zusammensetzung' Maisstärke 1,5 Masse-%

Liaisquellwasser 3,0 Masse-% zugeführt.

Der "Verlauf der Enzymbildung ist in Pig. 1 dargestellt. Die -\.-Amylase-Synthese beginnt zur 4« Stunde und erreicht nach 16 Stunden Permentationsdauer ein Maximum von 0,73 AE/ml Kulturlösung. Bis zur 20. Stunde geht der -..-Ämylasegehalt jedoch v/i e der auf 0,23 A3/ml Kulturlösung zurück. Die Proteasebildung setzt etwa zur 7. Stunde ein und wird zur 20. Stunde mit 18 TE/nil Kulturlösung beendet. Fach 16 Stunden beträgt die Konzentration 10 IS/ml Kulturlösung. Ein aus der nach 16 Stunden geernteten Kulturlösung nach bekannten Verfahren durch MapSO.-Fällung hergestelltes Trockenpräparat besitzt die Aktivität von 3"75 AS/g ArAmylase und 3350 TE/g Protease.

Claims

Erfindung; san sprue he

1. Verfahren zur Herstellung von Thermitase mit alpha-amylolytischer Aktivität dadurch gekennzeichnet, daß in einem für Proteasen üblichen Medium Mikroorganismen des Stammes Thermoactinomyces vulgaris und/oder seiner Mutanten - hinterlegt in der zentralen StammesSammlung der DDR im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie in Jena unter IMST 9512 und für die Mutante H¹IET 9515 - kultiviert werden, dabei gegebenenfalls Fütterungen mit Kohlenstoff- und Stickstoffquellen erfolgen, die fermentation bei vorgegebener Zeit im Bereich von 16 bis 20 Stunden beendet und das Kulturfiltrat nach Abtrennung der Biomasse in bekannter Weise in ein Trockenpräparat überführt wird·

2. Verfahren nach Punkt 1 dadurch gekennzeichnet, daß eine Fütterung mit einer Kohlenstoffquelle und mit einer Stickstoffquelle im Bereich von 2 bis 14 Stunden erfolgt.

3· Verfahren nach Punkt 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlenstoffquelle Stärke, gelbildende Stärkehydrolysenprodukte oder andere Maltodextrine eingesetzt werden.

4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, daß aufeinander abgestimmte Temperatur- und pH-Bedingungen entweder zur Erhöhung der proteolytischen oder zur Erhöhung der alpha-amylolytischen Aktivität ausgewählt werden.

5. Verfahren nach Punkt 1 bis 4 dadurch gekennzeichnet, daß für die alpha-amylolytische Aktivität ein pH-Wert im Bereich von 5 bis 6 und eine Temperatur im Bereich von 50 bis 60 ⁰G gewählt wird.

Hierzu JLieiten Zeichnungen