PL92400B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia inhibitora sacharazy.Opis patentowy RFN DOS nr 2064092 opiera sie na stwierdzeniu, ze szereg Actinomyceteis przede wszystkim Actinopilanaceae tworza inhibitory gli- kozydohydrolaz, korzystnie enizymów przewodu pokarmowego, rozszczepiajacych weglowodany.Grupa tych inhibitorów jest wzglednie odporna na wysokie temperatury i w temperaturze poko¬ jowej odporna, na kwasy i alkalia.Inhibitory te naleza pod wzgledem chemicznym do klasy oligo- lub polisacharydów lub ich po¬ chodnych. Wiekszosc inhibitorów z tej grupy jest wysokoaktywnymi inhibitorami amylazy, lecz tylko srednimi lub slabymi inhibitorami sacha¬ razy.Przedmiotem wynalazku jest sposób przeksztal¬ cenia wymienionych inhibitorów amylazy w silne inhibitory sacharazy.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze inhibitory amylazy, nalezace do klasy oligo- lub polisacharydów, które sa wytwarzane przez mi¬ kroorganizmy rzedu Actinomycetales, hydrolizuje sie kwasami lub hydrolizuflacymii enzymami, gliko- zydohydrolazami i otrzymany inhibitor sacharazy wyodrebnia sie znana metoda i ewentualnie oczysz¬ cza.Test amylazy. Jednostka inhibitora amylazy (1 AIE) jest ilosc inhibitora, która hamuje aktyw¬ nosc dwóch jednostek amylazy o 50%. Jednostka amylazy (AE) jest ilosc enzymu, która w ciagu 1 minuty w podanych warunkach doswiadczenia rozszczepia 1 ^równowaznik wiazan glikozydowych w skrobi, przy czym l^wal rozszczepionych wiazan oznacza sie kolorymetrycznie kwasem dwunitro- salicylowym jako ^y/al redukujacych cukrów i za pomoca krzywej wzorcowej maltozy podaje sde jako |jwal maltozy. Dla przeprowadzenia testu 0,1 ml roztworu amylazy (20—22 AE/ml) traktuje sie 0—10 jxg inhibitora lub 0—20 ni testowanego roztworu w 0,4 ml 0,02 m buforu: gliceroifosforan sodu (0,001 m CaCl2 o wartosci pH=6,9) i utrzy¬ muje sie na lazni wodnej w temperaturze 35°C przez okolo 10—20 minut. Nastepnie przez 5 minut 1(5 utrzymuje sie z 0,5 ml 1% roztworu skrobi, ogrza¬ nego' wstepnie do temperatury 35°C (skrobia, roz¬ puszczalna, Firmy Merck, Darmstadt Nr 1252) i nastepnie traktuje sie 1 ml reagenitu dwunitro- salicylowego (P. Bernfeld w Colowick-Kaplain, Meth. Enzymol, tom 1, strona 149).Dla wywolania zabarwienia wsad ogrzewa sie przez 5 minut na wrzacej lazni wodnej, nasttejpnie chlodzi sie i traktuje 10 ml wody destylowanej.Ekstynkcje przy 540 mm mierzy sie w stosunku do odpowiednio zalozonej wartosci slepej bez amylazy.Przy obliczaniu odczytuje sie z uprzednio' spo¬ rzadzonej krzywej wzorcowej' amylazy jeszcze istniejaca aktywnosc amylazy po dodaniu inhibi¬ tora i z tego oblicza sie hamowanie procentowe «. aktywnosci wprowadzonej amylazy. Procentowo 92 4003 -*¦: , 02 400 4 hamowanie aktywnosci nanosi sie jako funkcje ilorazu: jxg inhibitora * AE** w którym* oznacza sie w stosunku do substancji suchej i ** we wsadzie tej samej serii bez inhibi¬ tora, odczytuje sie z krzywej punkt, w którym nastepuje hamowanie aktywnosci w 50% i prze¬ licza sie na zawartosc inhibitora w AIE/mg.Test sacharazy. Jednostka inhibitora sacharazy (SIE) jeist ilosc inhibitora, która hamuje o* 50% aktywnosc, dwóch jednostek sacharazy. Jednostka saciiar^zy^SE) jest ilosc enizymu, która w jednej mifritóe w podlanych warunkach testowych roz¬ szczepia^J»^JBiPi^^cJxaTOzy na glikoze i fruktoze, przl ^frWJS J^oJl Stworzonej sacharozy oznacza sie Ilosciowo za pomoda ok&ydazy glikozy w wa¬ runkach, w których aie nastepuje dalsze roz- szcA^i4!fi^^^2^^jrt trzy przeprowadzaniu testu Q,Qgii^lLo^l^u^S^l^razy *) o zawartosci 0,12 SE traktuje sie 0—20 ^g i/nhibitora lub - 0—20 jj.1 testowanego roztworu i dopelnia sie do 0,1 ml 0,1 m maleinianu sodu jako buforu o wartosci pH=6,0. Utrzymuje sie przez 10 minut w tempera¬ turze 35°C i nastepnie traktuje sie 0,1 ml ogrza¬ nego wstepnie do temperatury 35°C 0,05 m roz¬ tworu sacharozy w 0,1 m maleinianie sodowym jako buforze o wartosci pH = 6,0.Utrzymuje sie przez 20 minut w temperaturze °C, po czym zatrzymuje sie reakcje sacharozy przez dodanie 1 ml preparatu oksydazy glikozy2) i utrzymuje sie jeszcze przez 30 minut w tempe¬ raturze 35°C. Nastepnie dodaje sie 1 ml 50% H2SO4 i mierzy sie przy 545 mm w stosunku do odpo¬ wiedniej wartosci slepej. Przy obliczaniu oblicza sie procentowe hamowanie aktywnosci wprowa¬ dzanej sacharazy i z punktu 50% hamowania przelicza sie na SIE/g wzglednie SIE/litr za po- n*oca krzywej wzorcowej glikozy. 1. Solufedllizowana saeharaza z miukozy cienkiego jelita swin wg: B. Borgsfcrom, A. Dahlauist, Acta Chem.-Scand. 12, 1958 (strona 1997), rozcienczona do odpowiedniej zawartosci SE 0,1 m maleinianem sodu jako buforem o wartosci pH=6. 2. Preparat oksydazy glikozy otrzymuje sie przez rozpuszczenie 2 mg oksydazy glikozy (Fe. Boehrin- ger Nr 15423 ESAB) w 100 ml 0,565 m buforem Tris-HCl o pH=7 i nastepnie dodanie roztworu detergentu (2 g Tritonru 100 + 8 g 95% etanolu p.a), 1 ml roztworu dianizydyny (260 mg o-dianizy- dyny, 2 HC1 w 20 ml H2O i 0,5 ml 0,1% wodnego roztworu peroksydazy (Fe. Boehrkiger Nr 15302 EPAP). fri#feztalfcen,ie inhibitorów amylazy w inhibi¬ tory ssrtiharazy zachodzi na drodze odszczepdenia inall&^taijaeego elementu czasteczki (prcewaznie ifcómoy twu- lut* tr&jfettd-har^iu) z czasteczek inhi- t$fora. ' PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób otrzymywania inhibitora sacharazy z in¬ hibitora amylazy, nalezacego do klasy oligo- lub polisacharydów, który jest wytwarzany przez mikroorganizmy rzedu Actinomycetales^ znamien¬ ny tym, ze (inhibitor aimylazy hyidrolizuje sie kwasami lub hydirolizujacymi enzymami, glikoizy^ dohydrolazarni i otrzymany inhibitor sacharazy wyodrebnia sie znana metoda i ewentualnie oczyszcza. 200 i 160 *xl*H 3 30 l \ / / S 20 10 l M I » 20 40 eo eo 100 FIG. 192 400 50} na 292 400 80 70 eof 50l 40l 301 »l ¦104 60 120 180 240 FIC, 3 -czyteTni* PL PL