JP2022553183A - アカルボースの改善された形成方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、アカルボースの改善された形成のための放線菌株に関する。ｄＴＤＰ－Ｄ－グルコース－４、６－デヒドラターゼ（ＡｃｂＢ）および／またはウリジルトランスフェラーゼ（ＧｔａＢ）を過剰発現するように操作された放線菌株を提供する。また、小炭水化物結合タンパク質（Ｃｇｔ）の減弱または消失した発現、および／またはカロテノイド合成に必須である遺伝子の減弱または消失した発現を有するように操作された放線菌株が提供される。また、これらの株を生成するためのツール、方法および手段も提供される。

Description

開示の分野
本発明は、アカルボースの改善された形成のための放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）株に関する。ｄＴＤＰ－Ｄ－グルコース－４，６－デヒドラターゼ（ＡｃｂＢ）および／またはウリジルトランスフェラーゼ（ＧｔａＢ）を過剰発現するように操作された放線菌株を提供する。また、低分子量炭水化物結合タンパク質（Ｃｇｔ）の発現の減少または欠如、および／またはカロテノイド合成に必須である遺伝子の発現の減少または欠如を有するように操作された放線菌株が提供される。また、これらの株を生成するためのツール、方法および手段も提供される。

背景
アカルボース（Ａｃａｒｂｏｓｅ）
治療薬アカルビオシル－マルトース（アカルボース）（ａｃａｒｖｉｏｓｙｌ－ｍａｌｔｏｓｅ（ａｃａｒｂｏｓｅ））は、糖尿病の内科的治療において１９９０年から使用されている（ＷｅｈｍｅｉｅｒおよびＰｉｅｐｅｒｓｂｅｒｇ ２００４；Ｗｅｈｍｅｉｅｒ ２００４）。患者の厳密な食事計画を支援し、高炭水化物食摂取時の糖ピークを防ぐものとする。経口投与後、アカルボースは腸内α－グルコシダーゼを阻害し、デンプンおよびスクロース含有食餌からの単糖類の放出を遅延させる。これにより、アカルボースは単糖類の血液系への吸収速度の制御を助け、心血管疾患死亡率との関連で極めて重要と想定される食後血糖値および血清糖値の低下をもたらす。

産業上の利用可能性
アカルボースは、Ｇｌｕｃｏｂａｙ（Ｂａｙｅｒ ＡＧ）としてヨーロッパおよび中国、Ｐｒｅｃｏｓｅ（Ｂａｙｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）として北米、およびＰｒａｎｄａｓｅ（Ｂａｙｅｒ ＡＧ）としてカナダで知られ、市販されている。糖尿病治療のための重要で高度に要求される薬剤であるため、高収率で高品質なアカルボースを提供する必要がある。ＩＩ型糖尿病の発生率が世界中で継続的に増加しているので、製品の収率および品質の最適化は、現在の懸念事項である。

アカルボース産生株
アカルボースは、ストレプトマイセス・コエリコフラバス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｆｌａｖｕｓ）ＺＧ０６５６（Ｇｅｎｇら、２００９）、ストレプトマイセス・グロセッセンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｌａｕｃｅｓｃｅｎｓ）ＧＬＡ．Ｏ（ＲｏｃｋｓｅｒおよびＷｅｈｍｅｉｅｒ ２００９；Ｏｒｔｓｅｉｆｅｎら、２０１５）、およびアクチノプラネス属種（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ）ＳＥ５０／１１０（ＷｅｈｍｅｉｅｒおよびＰｉｅｐｅｒｓｂｅｒｇ ２００４によって概説されている）のように、異なる放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）によって天然に産生され、後者は工業産生菌株の野生型である（Ｏｒｔｓｅｉｆｅｎ ２０１６；Ｍａｈｍｕｄら、１９９９）。アクチノプラネス属（ｇｅｎｕｓ Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）は、ミクロモノスポラセエ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）科、放線菌目（ｏｒｄｅｒ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）、放線菌門（ｐｈｙｌｕｍ Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）のメンバーとしてＣｏｕｃｈ（１９５０）によって最初に導入された。アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０（ＡＴＣＣ ３１０４４、ＣＢＳ ６７４．７３）は、ＳＥ５０の緩慢に成長する天然の誘導体（ＡＴＣＣ ３１０４２、ＣＢＳ ９６１．７０）（Ｆｒｏｍｍｅｒら、１９７３）である。ＳＥ５０はＫｅｎｉａのコーヒープランテーションに近い土壌サンプルからＢａｙｅｒ ＡＧによるスクリーニングプログラム中に１９７０年に単離された（Ｆｒｏｍｍｅｒら、１９７２）。ＳＥ５０／１１０は、マルトースが培地中に提供される場合、約１ｇ・Ｌ^－１のアカルボースを産生する（Ｗｅｎｄｌｅｒら、２０１４）。さらなる産生株は、例えば（ＥＰ２６０１２０９Ｂ１）および（ＣＮ１０３２９８８２８Ｂ）に記載されるように操作されている。

アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０については、アカルビオシル－糖の生合成が培養培地中の炭素源の供給に依存することが示された（Ｗｅｎｄｌｅｒら、２０１４）。グルコース上で成長すると、アカルビオシル－グルコースが主要な化合物として形成されたが、マルトース上で成長すると（Ｗｅｎｄｌｅｒら、２０１４）、主にアカルビオシル－マルトースが形成され、マルトトリオース上で成長すると（Ｏｒｔｓｅｉｆｅｎ ２０１６）、アカルビオシル－マルトトリオースが形成された。

産業用アカルボース産生株の野生型としての医学的および産業上の関連性のために、アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０は、ここ数年で広範囲に研究された：完全なゲノム（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋら、２０１２）、トランスクリプトーム（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋら、２０１３）およびプロテオーム（Ｗｅｎｄｌｅｒら、２０１５ｂ；Ｗｅｎｄｌｅｒら、２０１５ａ；Ｗｅｎｄｌｅｒら、２０１３）が包括的に分析された。これにより、精密なゲノム配列が得られ、２０１７年にアノテーションが改善された（ＧｅｎＢａｎｋ：ＬＴ８２７０１０．１）（Ｗｏｌｆら、２０１７ｂ）。また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（Ｗｏｌｆら、２０１６）の使用による高度なゲノム編集ツールと同様に、インタージェネリック接合系（ａｎ ｉｎｔｅｒｇｅｎｅｒｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（Ｇｒｅｎら、２０１６）が確立され、標的化された遺伝子工学が可能になった。それでも、アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０については、中程度から強力な遺伝子発現を可能にする信頼性の高い発現系が欠けている。特異的遺伝子の中程度の強力な過剰発現に適した系は以前には存在しなかったので、異なる戦略を本発明に従って試験し、評価したところ、ｐＳＥＴＴ４と呼ばれる新規な発現系が開発された。

アカルボース生合成
アカルボースの生合成経路は、単一工程を触媒する単機能酵素に基づく（図１）（ＷｅｈｍｅｉｅｒおよびＰｉｅｐｅｒｓｂｅｒｇ ２００９）。Ｚｈａｎｇら（２００２）のモデルによれば、生合成は中間体バリエノン－７Ｐを介して進行する。Ｗｅｈｍｅｉｅｒ（２００３）による改善では、段階的な還元と脱水が変化し、中間体としてバリオロール－７Ｐが得られた。ステップの順序は未知であるので、それらは括弧内に示されている。セド－ヘプツロース－７Ｐから２－エピ－５－エピ－バリオロンを形成するＡｃｂＣによる循環反応であるアカルボース生合成の最初の段階は、この図では欠けている。過去数十年間、研究の焦点となっているが、アカルボース生合成経路はまだ完全には解明されていない。生合成の最初の３つの段階のみが実験的に確認された。アカルボース生合成の最初の酵素であるＡｃｂＣ（ＡＣＳＰ５０＿３６０７）は環状反応を触媒して、セドヘプツロース７Ｐ７Ｐから２－エピ－５－エピ－バリオロンを生成する（Ｓｔｒａｔｍａｎｎら、１９９９）。２－エピ－５－エピ－バリオロン－７Ｐへのリン酸化は、ＡＴＰの存在下でキナーゼＡｃｂＭ（ＡＣＳＰ５０＿３６０３）によって触媒され（Ｚｈａｎｇら、２００２）、補因子非依存性エピメラーゼＡｃｂＯ（ＡＣＳＰ５０＿３６０６）によって５－エピ－バリオロン－７Ｐへのエピマー化が触媒される（Ｚｈａｎｇら、２００２；Ｚｈａｎｇら、２００３）。

タンパク質相同性および機能予測に基づくモデルの残りの工程（Ｚｈａｎｇら（２００２）、Ｗｅｈｍｅｉｅｒ（２００３）、ＷｅｈｍｅｉｅｒおよびＰｉｅｐｅｒｓｂｅｒｇ（２００４）、ＷｅｈｍｅｉｅｒおよびＰｉｅｐｅｒｓｂｅｒｇ（２００９）およびＷｅｎｄｌｅｒら（２０１３）：ＮＡＤＨ依存性（ポリオール）デヒドロゲナーゼ／レダクターゼＡｃｂＬ（ＡＣＳＰ５０＿３６０４）ならびにサイクリルトールデヒドロゲナーゼ／オキシドレダクターゼＡｃｂＮ（ＡＣＳＰ５０＿３６０５）は、１－エピ－バリエノール－７Ｐへの還元および５，６脱水を触媒することが示唆されている。１，７－ジホスホ－１－エピ－バリエノールへのリン酸化は、１－エピ－バリエノール－７－リン酸－１－キナーゼＡｃｂＵ（ＡＣＳＰ５０＿３５９５）および／またはヒドロラーゼＡｃｂＪ（ＡＣＳＰ５０＿３６００）によって触媒されると考えられる。ＮＤＰ－１－エピ－バリエノール－７Ｐへのヌクレオチジル化は、おそらくＧｌｇＣ関連ＮＤＰ－ポリオールシンターゼＡｃｂＲ（ＡＣＳＰ５０＿３５９７）（１－エピ－バリエノール－１，７－ビスリン酸－１－アデニリルトランスフェラーゼ）によって触媒され、活性化された中間体の活性化アミノ糖への転移は、グリコシルトランスフェラーゼＡｃｂＩ（ＡＣＳＰ５０＿３５９９）および／またはＡｃｂＳ（ＡＣＳＰ５０＿３５９６）によって媒介されてアカルビオシン－７Ｐが生成されると考えられる。

活性化アミノ糖は、Ｄ－グルコース－１－リン酸から３段階で合成されると考えられ（ＷｅｈｍｅｉｅｒおよびＰｉｅｐｅｒｓｂｅｒｇ ２００４；ＷｅｈｍｅｉｅｒおよびＰｉｅｐｅｒｓｂｅｒｇ ２００９；Ｚｈａｎｇら、２００２）、それは：（ｉ）ｄＴＤＰ－グルコース－シンターゼＡｃｂＡ（ＡＣＳＰ５０＿３６０９）によるｄＴＤＰ－Ｄ－グルコースへのヌクレオチド化、（ｉｉ）ｄＴＤＰ－Ｄ－グルコース－４，６－デヒドラターゼＡｃｂＢ（ＡＣＳＰ５０＿３６０８）によるｄＴＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－Ｄ－グルコースへの脱水、および（ｉｉｉ）ＧａｂＴ様アミノトランスフェラーゼＡｃｂＶ（ＡＣＳＰ５０＿３５９４）によるｄＴＤＰ－４－アミノ－４，６－ジデオキシ－Ｄ－グルコースへのアミノ化（Ｄｉａｚ－Ｇｕａｒｄａｍｉｎｏ Ｕｒｉｂｅ ２０００；Ｚｈａｎｇら、２０１９）である。

グルコース－１Ｐは、グリコーゲン代謝、ガラクトース代謝、および－グルコース－６Ｐへの変換後－解糖（Ｆｒｅｙ １９９６；Ｐｕｒｖｅｓ ２００６）のように、異なる経路において重要な役割を示す分岐代謝産物である。ＵＤＰ－グルコース－１ＰウリジルトランスフェラーゼＧｔａＢは、グルコース－１ＰとＵＤＰ－グルコースを互いに変換する反応を触媒する。

最後に、マルトースは潜在的にＡｃｂＳによって、一段階反応で転移される（Ｈｅｍｋｅｒら、２００１）。しかし、ＡｃｂＩまたはＡｃｂＪはまた、転移反応を触媒することが提案されている（ＷｅｈｍｅｉｅｒおよびＰｉｅｐｅｒｓｂｅｒｇ ２００４；Ｗｅｎｄｌｅｒら、２０１３）。この反応の別の候補は、アミロマルターゼＡｃｂＱ（ＡＣＳＰ５０＿３６０１）であり得る。

アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０において、生合成遺伝子は、アカルボース生合成遺伝子クラスター（ａｃｂ遺伝子クラスター）で組織化され、これはＳｔｒａｔｍａｎｎらにより１９９９年に最初に同定され、その後配列決定された（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｙ１８５２３．４）（Ｓｔｒａｔｍａｎｎら、１９９９；Ｔｈｏｍａｓ ２００１）。そのクラスターは、２２個の遺伝子を含む（図２）。

既に述べた生合成遺伝子（ａｃｂＣＭＯＬＮＵＪＲＳＩＶＢＡ）に加えて、クラスターは、細胞外デンプン分解（ＡｃｂＥＺ、ＡＣＳＰ５０＿３６１０およびＡＣＳＰ５０＿３５９０）、トランスグリコシル化（ＡｃｂＤ、ＡＣＳＰ５０＿３６１１）およびアカルボースの搬出（ＡｃｂＷＸＹ、ＡＣＳＰ５０＿３５９１－３）における機能をコードする。さらに、アカルボース－７－キナーゼ（ＡｃｂＫ、ＡＣＳＰ５０＿３６０２）および細胞内アミロマルターゼ（ＡｃｂＱ）がコードされ、これらはカルボフォア内の機能に割り当てられた（Ｗｅｎｄｌｅｒら、２０１５ｂ；Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋら、２０１２；ＷｅｈｍｅｉｅｒおよびＰｉｅｐｅｒｓｂｅｒｇ、２００９）。ＮＴＰ－ピロホスホヒドロラーゼとしてアノテーションされるＡｃｂＰ（ＡＣＳＰ５０＿３５９８）の機能は、未知である。

可能性のある代謝関連性のあるアクチノプラネス蛋白質
特異的ＣＢＭ－２０ドメインタンパク質Ｃｇｔは、アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０および誘導アカルボース産生株において最も強く発現される遺伝子の１つである（Ｏｒｔｓｅｉｆｅｎ ２０１６；Ｗｅｎｄｌｅｒら、２０１５ａ；Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋら、２０１３）。これは、ＳｉｇｎａｌＰ－分析（Ａｌｍａｇｒｏ Ａｒｍｅｎｔｅｒｏｓら、２０１９）に従ってＳｅｃ－経路を介して分泌され、この生物の全分泌プロテオームの８％を構成する（データは示さず）。Ｃｇｔは、１４９アミノ酸およびフォールドファミリー１のＣＢＭ－２０ドメイン、官能基Ａを含み、β－サンドイッチ構造を特徴とする（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋら、２０１３；Ｇｕｉｌｌｅｎら、２０１０〔ここで、「Ｇｕｉｌｌｅｎ」の「ｅ」は、正しくはｅにアキュート・アクセントを付した文字である。〕）。このファミリーのメンバーはデンプンに結合することが記載されている（Ｇｕｉｌｌｅｎら、２０１０）。

アクチノプラネスにおける遺伝子欠失の方法
インタージェネリック接合系（Ｇｒｅｎら、２０１６）およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術（Ｗｏｌｆら、２０１６）の確立は、アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０におけるゲノム編集を可能にする。

さらに、本発明によれば、本発明者らは、Ｚｈａｏら（２０１７）によって記載されているように、対抗選択のためにインテグラーゼを含まないベクターバックボーンおよびＣｏｄＡを使用する、相同組換えによる新規欠失系を首尾よく確立した。これにより、アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０の遺伝的ツールボックスをさらに拡張できた。原理の証拠として、新規欠失系を、実施例遺伝子ｃｇｔの欠失について首尾よく試験した。相同組換え（ＨＲ）は、放線菌における共通の過程であり、ダブルクロスオーバーにより欠失変異体を作成するために技術的に用いることができる。温度感受性レプリコンは、ｐＳＧ５レプリコンと同様に、このプロセスを支持し、強制することができる。（Ｄｕら、２０１５；ＧａｒｇおよびＰａｒｒｙ、２０１０；Ｍｙｒｏｎｏｖｓｋｙｙら、２００９；ＺｈａｎｇおよびＰａｒｒｙ、２００７）。さらなる方法、例えば、単一ヌクレオチドの交換のためのＣＲＩＳＰＲ－塩基編集系、Ｔｏｎｇら、２０１９によるＣＲＩＳＰＲ－ＢＥＳＴ、Ｑｉら、２０１３によるＣＲＩＳＰＲｉ／ｄＣａｓ９、ＲＮＡ干渉などが当技術分野に存在する。

アクチノプラネスにおける遺伝子過剰発現の方法
アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０は、過去数十年で広範囲に研究されてきた。適切な発現系を設計することは困難である（Ｓｃｈａｆｆｅｒｔら（２０１９）を参照のこと）。出版物の全内容、特にアクチノプラネスの遺伝子操作のための発現系およびプロモーターの記載は、それらの全体が本明細書に含まれる。

以前の研究は、Ａ．ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓにおけるｐＫＣ１１３９の使用による遺伝子の発現の成功を示している（Ｈｏｒｂａｌら，２０１２）。しかし、複製型ｐＳＧ５ベースのベクターｐＫＣ１１３９（Ｂｉｅｒｍａｎら（１９９２）によって構築された）は、相同組換えによる望ましくないベクター組込みが起こるので、アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０における相同遺伝子の発現には不適であることが判明した（Ｓｃｈａｆｆｅｒｔら、（２０１９）を参照のこと）。これは、ベクター複製の代謝コストが高いためと推定される、好ましいプロセスであると思われる。理論に束縛されるものではないが、ＳＥ５０／１１０においてＡＣＳＰ５０＿７１７０によってコードされ、リコンビナーゼＡ（ｒｅｃＡ）として予測されるタンパク質は、組換えプロセスを触媒し得る。興味深いことに、Ａ．ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓのゲノムにｒｅｃＡの相同体は認められなかった。ａ．ｓｐ．ＳＥ５０／１１０におけるｒｅｃＡの存在およびＡ．ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓにおける欠失は、Ａ．ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓに関してＨＲ媒介ベクター統合が以前に報告されていない理由について決定的な説明を提供する。したがって、アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０におけるリコンビナーゼ遺伝子ｒｅｃＡの欠失によって、ｐＳＧ５ベースの複製型発現系が実装される可能性がある。

ｐＫＣ１２１８（これは、ＳＣＰ２＊－レプリコン（Ｋｉｅｓｅｒら、２０００）に基づく）およびｐＳＯＫ１０１（これは、ｐＩＪ１０１－レプリコン（Ｚｏｔｃｈｅｖら、２０００）に基づく）のような、他の複製型ストレプトマイセス－大腸菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ－Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルプラスミドは、アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０を有する接合完了体を与えなかった（Ｇｒｅｎ、２０１７）。これらのレプリコンはおそらくＳＥ５０／１１０において不安定または不活性であり、これは、関連する種Ａ．ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ（Ｈｏｒｂａｌら、２０１２）からの知見に一致する。

組込み型ベクター系を用いることにより、ゲノム上の異なる位置に追加の遺伝子コピーを有する完全なベクターを組込むことにより、遺伝的重複を達成することができる。この過程はファージインテグラーゼによって媒介される。ファージインテグラーゼはプラスミド上に局在するａｔｔＰと、宿主染色体に局在するａｔｔＢという２つのアタッチメント・サイトの標的化された一方向の組換えを触媒する（ｔｅ Ｐｏｅｌｅら、２００８）。組込み後、ベクターは、ａｔｔＰ－ａｔｔＢ組換えに由来するアタッチメント・サイト左（ａｔｔＬ）および右（ａｔｔＲ）に隣接する（ｔｅ Ｐｏｅｌｅら、２００８）。

アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０（Ｇｒｅｎら、２０１６）について４つの異なる組込み型ベクターが記載されている：２つはファージφＣ３１（ｐＳＥＴ１５２およびｐＩＪ６９０２）の組込みメカニズムに基づく。ベクターｐＲＴ８０１／２およびｐＳＯＫ８０４は、ファージφＢＴ１およびＶＷＢファージの組込み機構に基づく。しかし、天然プロモーターの使用による相対転写量の倍加は達成されなかった（Ｓｃｈａｆｆｅｒｔら（２０１９）を参照のこと）。

組込み型ベクターのための相同および異種プロモーターの評価
その強度に関して相同および異種プロモーターを評価する方法はＳｃｈａｆｆｅｒｔら（２０１９）に提供されており、その全体が本明細書に組込まれる。簡単に述べると、組込み型φＣ３１ベースのベクターｐＳＥＴ１５２を、アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０（Ｇｒｅｎら、２０１６）におけるプロモータースクリーニングのために使用した。１３の相同および異種プロモーターのプロモーター強度をタンパク質レベルで分析し、これらのうち１２を転写レベルで分析した（表１、図３）。

戦略
本発明について、アカルビオシル－マルトース代謝は、遺伝子欠失および過剰発現によって研究され、アカルボースの改善された産生のために株を操作するための関連ツールおよび方法のセットを導いた。アカルビオース合成を改善するために、（ｉ）アカルボース生合成を介したフラックスを高めるためにａｃｂ遺伝子の遺伝子量を増やす、（ｉｉ）アカルボース生合成の前駆体を展開する、および（ｉｉｉ）代謝負荷を減らす、といった３つの異なる戦略に従った（図４）。これらの関連戦略の各々のアプローチは驚くべきことに、改善されたアカルボース形成をもたらした：ｄＴＤＰ－Ｄ－グルコース－４，６－デヒドラターゼＡｃｂＢの過剰発現によって、最終的なアカルボース濃度は、約５０％有意に増加した。ウリジルトランスフェラーゼＧｔａＢの過剰発現により、アカルボース収率は８．５％改善されたが、これはおそらく前駆体グルコース－１Ｐの供給が改善されたためであろう。小さな炭水化物結合タンパク質Ｃｇｔの機能的欠失によって、アカルボース形成は、おそらく代謝負荷がそれによって低減されるために、８～１６％有意に増強された。増強は、長期間にわたって、および異なる培養環境において強固であった。
さらに、光に暴露され、光から隠された野生型および調節因子変異体のΔｍｅｒＲの増殖実験を行い、アカルボース産生に対する光誘発ストレスおよびカロテノイド形成の負の影響を明らかにした。その結果、カロテノイド形成を減少させることによって、アカルボース産生をさらに改善することができる。

アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０におけるアカルビオシル－マルトースの生合成のモデル。２－エピ－５－エピ－バリオロンからのアカルボース生合成の１１段階を示す（Ｚｈａｎｇ（２００２））。 アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０（ＧｅｎＢａｎｋ：ＬＴ８２７０１０．１）（Ｓｃｈａｆｆｅｒｔら、２０１９）のゲノムにおけるアカルボース生合成遺伝子クラスターと遺伝子素因。 アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０株におけるタンパク質および転写物レベルに関するプロモータースクリーニング、表１を参照。左側に正規化グルクロニダーゼ活性（絶対値）および右側にＲＴ－ｑＰＣＲで算出したｇｕｓＡ遺伝子の相対転写量を示す。グルクロニダーゼアッセイについては、インジゴの吸収曲線の勾配を線形回帰によって計算し、細胞乾燥重量によって正規化した。正規化された活動は、両側ｔ検定（ｐ値：Ｐ_２４７５：０．８８８９、Ｐ_ｅｆｐ：３．０４８ｅ－０７、Ｐ_ｃｄａＲ：８．９６７ｅ－０７、Ｐ_ｒｐｓＬ：１．２９６ｅ－０８、Ｐ_ｒｐｓＪ：０．０００３６７７、Ｐ_ｃｇｔ：２．１８３ｅ－０６、Ｐ_ｔｉｐＡ：０．０００１６５１、Ｐ_ａｐｍ：０．０００１０７８、Ｐ_{ｅｒｍＥ＊}：０．００７４０６、Ｐ_ｋａｔＥ：０．００２５７７、Ｐ_{ｍｏｅＥ５}：０．００１８０９、Ｐ_{ｇａｐＤＨ}：０．０００５８２１、Ｐ_ａｃｔ：０．０２０４２）におけるｐＧＵＳと比較して、顕著な差異について試験された。ｇｕｓＡ遺伝子の相対的転写量を、ｐＧＵＳ－ベクター（１にセット）との関係で分析した。ａｃｔ－プロモーターについては、重篤な増殖欠損のためにＲＮＡを単離することができなかった。残りのプロモーターについては、相対転写量の有意な増大を測定した（両側ｔ検定のｐ値：Ｐ_２４７５：０．０００１１３３，Ｐ_ｅｆｐ：４．８７１ｅ－０５、Ｐ_ｃｄａＲ：０．００２５０９、Ｐ_ｒｐｓＬ：９．９２８ｅ－０６、Ｐ_ｒｐｓＪ：１．１６７ｅ－０８、Ｐ_ｃｇｔ：５．９１１ｅ－０８、Ｐ_ｔｉｐＡ：７．１５８ｅ－０６、Ｐ_ａｐｍ：４．５９６ｅ－０５、Ｐ_{ｅｒｍＥ＊}：０．０００９３６４、Ｐ_ｋａｔＥ：０．０００１３７３、Ｐ_{ｍｏｅＥ５}：０．０００２５１８、Ｐ_{ｇａｐＤＨ}：４．２０７ｅ－０６）。計算されたｐ値の有意水準はアスタリスク：^＊＜α＝５％、^＊＊＜α＝１％、^＊＊＊＜α＝０．１％で示されている。（Ｓｃｈａｆｆｅｒｔら、２０１９）に掲載された図。 改善されたアカルボース産生の戦略。３つの異なる戦略が、アカルボース産生を改善するために提供される：１．アカルボース生合成遺伝子の遺伝子量を増加させる、２．アカルボース生合成の前駆体の展開および３．遺伝子欠失による代謝負荷の減弱。本研究で評価した標的遺伝子を示す。さらに、単一遺伝子の過剰発現のためには、過剰発現系を実装しなければならなかった。 アカルボースの化学構造。アカルボースは、アカルビオース（ａｃａｒｖｉｏｓｅ）と呼ばれる偽二糖類（バリエナミニル－４－アミノ－４，６－ジデオキシグルコース）とマルトースから構成されるシクリトール含有アミノグリコシドである。両者はα－１，４－グリコシド結合によって連結されている。Ｗｏｌｆ ２０１７に掲載された図。 新規クローニング系ｐＳＥＴＴ４（配列番号１１０、配列番号１１１を参照）のベクターカード。Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ ｌｅｎｔａ由来の遺伝子ｇａｐＤＨの強力なプロモーターまたはｔｉｐＡプロモーターなどのプロモーターを、発現カセット、例えばｌａｃＺ－カセットの前にクローニングする。ｌａｃＺカセットは、制限酵素（例えば、ＢｓａＩ）の認識側に隣接する。制限部位は、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ、制限／連結クローニングまたはＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングによって目的の遺伝子によるｌａｃＺの交換を可能にする。ターミネーションには、クローニングサイドの前後にＴ４ターミネーターを導入する。クローニングサイドの背後では、２つの逆平行配向Ｔ４－ターミネーターが両方向からのリードスルーを防止する。プロモーター配列の交換のために、さらなる制限部位、例えば、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩ制限部位を導入した。さらに、ベクターは、ファージφＣ３１のインテグラーゼ遺伝子ｉｎｔおよびアタッチメント・サイトａｔｔＰ、伝達起点（ｎｃＰ）およびリラクソソーム遺伝子ｔｒａＪ、高コピー数ＣｏｌＥ１／ｐＭＢ１／ｐＢＲ３２２／ｐＵＣ複製起点および耐性遺伝子（ここではアプラマイシン耐性遺伝子ａａｃ（３）ＩＶ（ａｐｍＲ））を含む。 新しい欠失系のスキームおよび相同組換え（１回目と２回目のクロスオーバー）の過程。ベクター組込みのセレクションは、アプラマイシンまたはカナマイシン（最初のクロスオーバー、ａｐｍ^Ｒまたはｋａｎ^Ｒによって媒介される耐性）のいずれかの使用によって行われる。対抗選択は５－フルオロウラシル（２回目のクロスオーバー、ｃｏｄＡを介した感受性）を用いて行う。 相同組換えを用いた新規欠失系のワークフロー。 Ｃｇｔのアミノ酸配列のＢｌａｓｔＰ分析は、特異的ＣＢＭ－２０ドメインからなる１７の他のタンパク質の同定を導く。ＢｌａｓｔＰ （Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０）によって行われた多重配列アラインメントに基づいて、タンパク質樹を作製し、可視化した。タンパク質樹は、ＮＣＢＩ受託番号およびそれらの宿主によって同定された、１８個の特異的ＣＢＭ－２０ドメインタンパク質の距離を示す。括弧内には、ＢｌａｓｔＰ分析の配列同一性および陽性をパーセンテージで示す。 異なる炭素源（等Ｃモル量）を補充した最小培地中での野生型アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０の増殖。少なくとも３つの生物学的複製の細胞乾燥重量と標準偏差が示されている（ｎ_ｇｌｃ＝３、ｎ_ｍａｌ＝５、ｎ_ｃｅｌ＝４、ｎ_ｌａｃ＝３、ｎ_ａｒａ＝５、ｎ_{ｓｔａｒｃｈ}＝５）。 Ａ．炭素源としてデンプン、Ｃ－Ｐｕｒ、グルコース、ガラクトース、セロビオース、またはラクトースを補充した最小培地上で増殖させたアクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０におけるｃｇｔの相対転写量を、マルトース最小培地上で増殖させた培養物と比較する。両側ｔ検定における差異についての試験は、マルトースと比較して、炭素源グルコース（ｐ値＝０．００２８４８）、ガラクトース（ｐ値＝０．００２９４５）およびラクトース（ｐ値＝０．００１１４）におけるｃｇｔ遺伝子の有意な差次的遺伝子発現を示した。Ｂ．４．４０ｇ・Ｌ^－１マルトースを補足したマルトース最小培地で増殖させたアクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０におけるｃｇｔの相対転写量を、７２．０６ｇ・Ｌ^－１マルトースで増殖させた培養物と比較した。両側ｔ検定における差異についての試験は、減少した量のマルトースを含有する培地においてｃｇｔの有意な減少した遺伝子発現を示した（ｐ値＝０．０４１４１）。 異なる炭素源で補完した最小培地におけるアクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０の野生型および欠失変異体Δｃｇｔの増殖。細胞乾燥重量と経時的な標準偏差が示されている（野生型：ｎ_ｇｌｃ＝３、ｎ_ｍａｌ＝５、ｎ_ｃｅｌ＝４、ｎ_ｌａｃ＝３、ｎ_ａｒａ＝５、ｎ_{ｓｔａｒｃｈ}＝５、Δｃｇｔ：ｎ_ｇｌｃ＝２、ｎ_ｍａｌ＝５、ｎ_ｃｅｌ＝４、ｎ_ｌａｃ＝４、ｎ_ａｒａ＝５、ｎ_{ｓｔａｒｃｈ}＝５）。 ６つの異なる炭素源を補充した最小培地での野生型およびΔｃｇｔ変異体の培養で得られた最終細胞乾燥重量。エラーバーは標準偏差を示す。 炭素源として限られた量のデンプンの下でのΔｃｇｔと野生型の増殖。１ｇ・Ｌ^－１、２ｇ・Ｌ^－１、３ｇ・Ｌ^－１、４ｇ・Ｌ^－１、５ｇ・Ｌ^－１のデンプンで培地を補充し、ｍ２ｐ ｌａｂｓのＲｏｂｏＬｅｃｔｏｒ（登録商標）ｓｙｓｔｅｍで培養を行った。少なくとも３つの生物学的複製物の後方散乱シグナルを棒グラフおよび標準偏差で示す。増殖の抑制はΔｃｇｔでは観察されなかった。１ｇ・Ｌ^－１の増殖については、著しい強化さえ見出された（両側ｔ検定のｐ値：０．００６１４１、ｎ_ｗｔ＝３、ｎ_Δｃｇｔ＝４）。 マルトース最小培地におけるｐＨスクリーニング実験の最終細胞乾燥重量。アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０の野生型およびΔｃｇｔ変異体を、ｍ２ｐ－ｌａｂｓのＲｏｂｏＬｅｃｔｏｒ（登録商標）ｓｙｓｔｅｍの４８ウェルＦｌｏｗｅｒＰｌａｔｅｓで１ｍｌの反応体積で増殖させた。ｐＨ４～７の範囲では、最終的な細胞乾燥重量に有意差は観察されなかった（両側ｔ検定によって試験された、ｎ_ｗｔ＝３、ｎ_Δｃｇｔ＝４）。 ｍ２ｐ－ｌａｂｓのＲｏｂｏＬｅｃｔｏｒ（登録商標）ｓｙｓｔｅｍにおける浸透圧耐性スクリーニング：３．６～１０８．１ｇ・Ｌ^－１の範囲のマルトース一水和物濃度を有するマルトース最小培地における最終細胞乾燥重量。顕著な増殖差はみられなかった（両側ｔ検定によって試験された、ｎ_ｗｔ＝３、ｎ_Δｃｇｔ＝４）。 ｍ２ｐ－ｌａｂｓのＲｏｂｏＬｅｃｔｏｒ（登録商標）ｓｙｓｔｅｍにおける浸透圧耐性スクリーニング：マルトース最小培地における浸透圧スクリーニング実験の最終細胞乾燥重量。０ｍＭ～２８０ｍＭの範囲の濃度のイノシトールの添加によって、異なる浸透圧が達成された。野生型およびΔｃｇｔの間に有意な増殖差は見られなかった（両側ｔ検定によって試験された、ｎ_ｗｔ＝３、ｎ_Δｃｇｔ＝４）。 １１．０ｇ・Ｌ^－１マルトース－それぞれ１０．０ｇ・Ｌ^－１グルコース一水和物を補充した複合培地ＮＢＳ中でのアクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０野生型およびΔｃｇｔ変異体の増殖およびアカルボース産生。増殖の差は検出されなかった。増殖期に、有意なアカルボース濃度の増加が、Δｃｇｔで測定された（培養４９時間後のｔ試験の有意：ｐ値＝０．００６７７８、ｎ_{ｗｔ－ａｃｂ}＝３、ｎ_{Δｃｇｔ－ａｃｂ}＝３、ｎ_{ｗｔ－ｃｄｗＧｌｃ}＝４、ｎ_{Δｃｇｔ－ｃｄｗＧｌｃ}＝３、ｎ_{ｗｔ－ｃｄｗＭａｌ}＝４、ｎ_{Δｃｇｔ－ｃｄｗＭａｌ}＝４）。 Ａ．棒グラフの細胞乾燥重量に対するアカルボースの最終収率係数。誤差バーはガウス誤差伝搬により計算した。Ｂ．マルトース最小培地（ｎ_ｃｄｗ＝５、ｎ_ａｃｂ＝４）で培養中の上清中の細胞乾燥重量およびアカルボース濃度。 マルトース最小培地（ｎ＝３～６）で増殖したアクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０の野生型と比較した変異体Δｃｇｔの遺伝子ａｃｂＺ、ａｃｂＷ、ａｃｂＶ、ａｃｂＡ、ａｃｂＢ、ａｃｂＥおよびａｃｂＤの相対転写量。 アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０におけるカロチン生成の再構築。ＮＣＢＩデータベースに対するＢＬＡＳＴＸ解析によって同定されたアクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０における推定相同遺伝子が示されている。再構築は、Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓの助けを借りて行った（Ｋａｎｅｈｉｓａら（２０１４））。Ａ．イソプレノイド前駆体であるイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）およびジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）の生合成のためのメチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路、これは、メバロン酸経路の代替代謝経路としても知られる。Ｂ－Ｃ：カロチン生成。Ｂ．イソプレノイド前駆体からのリコペンの形成。Ｃ．サリノスポラ・トロピカ（Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ ｔｒｏｐｉｃａ）ＣＮＢ－４４０におけるグリコシル化カロテノイドシオキサンチンの合成（Ｒｉｃｈｔｅｒら（２０１５）の図１）。Ｄ．アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０において同定された遺伝子のゲノム構成。遺伝子クラスター２ｂは、細菌および真菌ゲノムにおける二次代謝産物生合成遺伝子クラスターのアノテーションおよび分析のための迅速なゲノムワイド同定ツール、ａｎｔｉＳＭＡＳＨによる分析に従い、Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ ｔｒｏｐｉｃａ ＣＮＢ－４４０由来のシオキサンチン遺伝子クラスターと相同性を示す（Ｗｅｂｅｒら、２０１５）。 光に曝露され、光から覆われたアクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０の増殖、アカルボースおよび色素形成。Ａ．電球光（２２～４４μＥ、１μＥ＝μｍｏｌ_{ｐｈｏｔｏｎｓ}ｍ^－２ｓ^－１）に曝露または電球光から覆われたマルトース最少培地における野生型アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０の培養。５つの生物学的複製物の細胞乾燥重量および３つの生物学的複製物の上清中のアカルボース濃度を示す。Ｂ．最終培養時間におけるペレットおよび上清。Ｃ．自然光に曝露されるか、または自然光から隠されたＳＦＭ寒天プレート上での固体培養における増殖および色素形成。 テルペンクラスター１におけるＭｅｒＲ調節因子をコードする遺伝子の位置およびアクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０のゲノムにおけるその配置（図２１および表Ｅ１２を参照）。クラスターの遺伝子は、ＭｅｒＲ様転写調節因子（ＡＣＳＰ５０＿０１４５）、イソペンテニル－二リン酸デルタ－イソメラーゼ（ｉｄｉ、ＡＣＳＰ５０＿０１４６）、フィトエンデヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ、ＡＣＳＰ５０＿０１４７）、ポリプレニルシンテターゼ（ｃｒｔＥ、ＡＣＳＰ５０＿０１４８）、フィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ、ＡＣＳＰ５０＿０１４９）、デオキシリボジピリミジンフォトリアーゼ（ＡＣＳＰ５０＿０１５０）、およびピリジンヌクレオチド－ジスルフィドオキシドレダクターゼ（ＡＣＳＰ５０＿０１５１）をコードする。 光に曝露され、光から覆われたアクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０および欠失変異体Δｍｅｒの増殖、アカルボースおよび色素形成。Ａ．電球光（２２～４４μＥ、１μＥ＝μｍｏｌ_{ｐｈｏｔｏｎｓ}ｍ^－２ｓ^－１）に曝露または電球光から覆われたマルトース最小培地中でのアクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０の野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）および欠失変異体ΔｍｅｒＲの培養。少なくとも４つの生物学的複製物の細胞乾燥重量および３つの生物学的複製物の上清中のアカルボース濃度を示す。Ｂ．最終培養時間におけるペレットおよび上清。Ｃ．固体培地（ＳＦＭ寒天プレート）上での増殖および色素形成。Ｄ．最大アカルボース濃度（両側ｔ検定のｐ値：ｗｔ 暗 対 ｗｔ 光：０．００３９７５、ｗｔ 暗 対 ΔｍｅｒＲ 暗：０．０９７１１、ｗｔ 暗 対 ΔｍｅｒＲ 光：０．００７０４３、ΔｍｅｒＲ 暗 対 ｗｔ 光：０．０２０８１、ΔｍｅｒＲ 暗 対 ΔｍｅｒＲ 光：０．０００２１３１）。Ｅ．暗条件下（両側ｔ検定のｐ値：ｃｒｔＥ：０．０４２４５、ｃｒｔＢ：０．０１０１７、ｃｒｔＩ：０．０７１６２、ｉｄｉ：０．００４３６６）で培養した場合の、野生型と比較した（値１に設定）、欠失変異体における遺伝子ｃｒｔＥ（ＡＣＳＰ５０＿０１４８）、ｃｒｔＢ（ＡＣＳＰ５０＿０１４９）、ｃｒｔＩ（ＡＣＳＰ５０＿０１４７）、ｉｄｉ（ＡＣＳＰ５０＿０１４６）およびｍｅｒＲ（ＡＣＳＰ５０＿０１４５）の相対転写量。アスタリスクは有意水準を示す：^＊ｐ値＜α＝５％、^＊＊ｐ値＜α＝１％、^＊＊＊ｐ値＜α＝０．１％。 暗所で増殖した培養と比較した、光に曝露したアクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０における差次的に転写された遺伝子の比／強度プロット。比（ｌｏｇ２（倍変化））を、マイクロアレイ実験の平均強度に対してプロットする。暗い点は、光にさらされた培養において、光から隠された培養と比較して、顕著な差次的転写レベルを有する遺伝子を表す。 ＲｅａｄＸｐｌｏｒｅｒ（Ｈｉｌｋｅｒら、２０１６；Ｈｉｌｋｅｒら、２０１４）は、ｐＳＥＴ１５２ベクター系における目的の遺伝子の背後にある推定アンチセンスプロモーターのＴＳＳを示す。ＴＳＳは、プールした一次転写物ライブラリーのシーケンシングによって決定した。ｐＧＵＳ：：Ｐａｐｍ：ｇｕｓＡの組込まれたベクター変異体にマッピングされた、例示的なスタックされたリードが示されている。２つのＴＳＳ（四角で囲まれている）は、アンチセンス配向（Ａ）の目的遺伝子の後ろに局在している。これらのＴＳＳは、ベクターバックボーン上の配列モチーフ（Ｂ）に割り当てることができ、これらはσＡ／ＲＮＡポリメラーゼ複合体によってプロモーター配列として認識されると推定される。－１０－および－３５－ヘキサマーの保存ヌクレオチドが強調されている。ＴＧ二量体は、存在する場合、太い黒文字で示される。ヘキサマー間の距離をｓ１で示し；－１０－モチーフからＴＳＳまでの距離をｓ２で示す。 マルトース最小培地におけるａｃｂＢ過剰発現株の増殖およびアカルボース産生。２つの独立した培養物（ＡおよびＢ）を示す。ＲＮＡ分離のサンプリング時間は、ｔ_１（「初期増殖期」）とｔ_２（「線形増殖期」）によって示される。 マルトース最小培地におけるａｃｂＢ過剰発現変異体の収率係数。異種ｔｉｐＡ－プロモーターの制御下で転写されたａｃｂＢを有する変異体は増強された収率係数（約５０％）を示したが、ｇａｐＤＨ－プロモーターを有する構築物についてはわずかな差しか観察されなかった。誤差は、ガウス誤差伝搬により計算した。全ての差異を、両側ｔ検定（写真に割り当てられた略語）によって有意について試験した。アスタリスクは有意水準を示す：^＊ｐ値＜α＝５％、^＊＊ｐ値＜α＝１％、^＊＊＊ｐ値＜α＝０．１％。 ＬＣ－ＭＳによるａｃｂＢ過剰発現変異体の細胞内代謝産物の解析。質量ｍ／ｚ＝５４５［Ｍ－Ｈ^＋］の正規化ピーク領域が表示される。Ａ．グルコース－１Ｐおよびガラクトース－１Ｐ（ｍ／ｚ＝２５９［Ｍ－Ｈ^＋］．Ｂ．グルコース－６Ｐ（ｍ／ｚ＝２５９［Ｍ－Ｈ^＋］）およびＣ．ＵＤＰ－グルコース（ｍ／ｚ＝５６５［Ｍ－Ｈ^＋］．Ｄ．空ベクター対照と比較した有意差が、ＵＤＰ－グルコースの正規化ピーク面積（両側ｔ検定のｐ値：Ｐｔｉｐ：０．０１０６８、Ｐｇａｐ：０．００１３５６）および質量ｍ／ｚ＝５４５［Ｍ－Ｈ^＋］（両側ｔ検定のｐ値：Ｐｔｉｐ：０．０４１２）について観察された。 初期増殖期のａｃｂＢ過剰発現変異体における遺伝子ａｃｂＢ、ａｃｂＡおよびａｃｂＶの相対的転写量。少なくとも３つの生物学的複製物の平均および標準偏差を示す。空ベクター対照（値１に設定）に対する差異を、両側ｔ検定（ｐＳＥＴＴ４ｇａｐ：：ａｃｂＢ、ｐＳＥＴＴ４ｔｉｐ：：ａｃｂＢ、ｐＳＥＴＴ４：：Ｐ_ａｃｂＢ：ａｃｂＢ、ｐＳＥＴ１５２：：Ｐ_ａｃｂＢ：ａｃｂＢに対応する左から右へのｐ値）によって試験した：ａｃｂＢ：４．３３２ｅ－０５、４．５６１ｅ－０６、０．３５１１、０．７０８２；ａｃｂＡ：０．３３８４、０．０００１１６４、０．５９６７、０．４２４６；ａｃｂＶ：０．３０３３、０．０４２３、０．７３、０．４６８７）。アスタリスクは有意水準を示す：^＊ｐ値＜α＝５％、^＊＊ｐ値＜α＝１％、^＊＊＊ｐ値＜α＝０．１％。 線形増殖期のａｃｂＢ過剰発現変異体における遺伝子ａｃｂＢの相対的転写量。少なくとも３つの生物学的複製物の平均および標準偏差を示す。ＲＴ－ｑＰＣＲは空ベクター対照（値１に設定）と比較して遺伝子発現の有意差を示し、これは、両側ｔ検定によって試験された（ｐＳＥＴＴ４ｇａｐ：：ａｃｂＢ、ｐＳＥＴＴ４ｔｉｐ：：ａｃｂＢ、ｐＳＥＴＴ４：：Ｐ_ａｃｂＢ：ａｃｂＢ、ｐＳＥＴ１５２：：Ｐ_ａｃｂＢ：ａｃｂＢに対応する左から右へのｐ値）：ａｃｂＢ：０．０２２１７、０．０２７７１、０．０３８９５、０．１５８２）。アスタリスクは有意水準を示す：^＊ｐ値＜α＝５％、^＊＊ｐ値＜α＝１％、^＊＊＊ｐ値＜α＝０．１％。 マルトース最小培地におけるｇｔａＢ過剰発現変異体の増殖およびアカルボース産生。ＲＮＡ単離のためのサンプリング時間を矢印で示す。 過剰発現変異体におけるｇｔａＢの相対的転写量。ＲＴ－ｑＰＣＲは、空ベクター対照（値１に設定）と比較してｇｔａＢ発現の有意な増加を示す（両側ｔ検定のｐ値：０．０１２９５）。アスタリスクは有意水準を示す：^＊ｐ値＜α＝５％、^＊＊ｐ値＜α＝１。 ＬＣ－ＭＳによるｇｔａＢ過剰発現変異体の細胞内代謝産物の解析。遺伝子ｇｔａＢの過剰発現株における質量ｍ／ｚ＝５４５［Ｍ－Ｈ^＋］（Ａ）、グルコース－１Ｐおよびガラクトース－１Ｐ（ｍ／ｚ＝２５９［Ｍ－Ｈ^＋］、Ｂ）、グルコース－６Ｐ（ｍ／ｚ＝２５９［Ｍ－Ｈ^＋］、Ｃ）およびＵＤＰ－グルコース（ｍ／ｚ＝５６５［Ｍ－Ｈ^＋］、Ｄ）のピーク面積を示す。空ベクター対照と比較して、質量ｍ／ｚ＝５４５［Ｍ－Ｈ^＋］（両側ｔ検定のｐ値：０．０１５３１）の正規化ピーク面積について有意差が観察された。他の全てのピーク面積は、両側ｔ検定によれば有意に異ならない。

配列ＩＤの簡単な説明
本出願に関連する配列表は、電子フォーマットで提出され、参照によりその全体が本明細書に組込まれる。

詳細な説明
定義
別段の定義がない限り、説明、図、および特許請求の範囲で使用されるすべての科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解されるそれらの通常の意味を有する。すべての出版物、特許出願、特許、並びにここで言及されている他の参考文献は、その全てが参考文献として取り入れられている。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先する。参照により援用された２以上の文書が、互いに矛盾するおよび／または矛盾する開示を含んでいる場合、後の発効日を有する文書が支配するものとする。材料、方法、および実施例は、例示にすぎず、限定を意図するものではない。特に断らない限り、本明細書および特許請求の範囲を含む本明細書で使用される以下の用語は、以下に与えられる定義を有する。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」等の用語は拡張的に、またはオープンエンドおよび限定無しで読み替えるものとする。「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」のような単数形には、文脈で明らかに示されない限り、複数の参照を含む。別段の指示がない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、一連の要素のすべての要素を指すものと理解されるべきである。用語「少なくとも１つ」および「少なくとも１つの」は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の要素を含む。

さらに、記載された範囲の上下のわずかな変動を使用して、範囲内の値と実質的に同じ結果を達成することができることを理解されたい。また、特に断らない限り、範囲の開示は、最小値と最大値との間のあらゆる値を含む連続範囲として意図される。

本出願を通してタンパク質またはアミノ酸配列が提供される場合、単一または複数のアミノ酸が、実質的に同じ効果、すなわち同等の結果を達成するために、類似の特性を有するアミノ酸によって交換され得ることもまた、当業者によって理解される。当業者はさらに、定義されたタンパク質またはアミノ酸配列が種々の核酸配列によってコードされ得ることを知っている。本明細書に定義される所与のアミノ酸配列について、特定のアミノ酸配列をコードする計数可能な核酸配列の各々は、本明細書に開示されるとみなされる。核酸配列が本出願を通して提供される場合、サイレント変異が導入され得ることがさらに理解される。

Ｏ－｛４，６－ジデオキシ－４［１Ｓ－（１，４，６／５）－４，５，６－トリヒドロキシ－３－ヒドロキシメチル－２－シクロヘキセン－１－イル］－アミノ－α－Ｄ－グルコ－ピラノシル｝－（１→４）－Ｏ－α－Ｄ－グルコピラノシル－（１→４）－Ｄ－グルコピラノースまたは「アカルボース（ａｃａｒｂｏｓｅ）」は、偽二糖類とα－１，４－グリコシド結合マルトースからなるシクリトール含有アミノグリコシドである（ＷｅｈｍｅｉｅｒおよびＰｉｅｐｅｒｓｂｅｒｇ、２００９）。アカルビオースと呼ばれる偽二糖は、バリエノールまたはバリエナミンとも呼ばれる不飽和Ｃ７－アミノシクリトールによって構築され、これは窒素結合によって４，６－ジデソキシ－Ｄ－グルコースのＣ４に連結される（図５を参照のこと）（ＷｅｈｍｅｉｅｒおよびＰｉｅｐｅｒｓｂｅｒｇ、２００９）。このＮ－グリコシド結合は、外来のα－１，４－グルコシドヒドロラーゼによって加水分解され得ず、ほとんど不可逆的な阻害効果をもたらす（ＷｅｈｍｅｉｅｒおよびＰｉｅｐｅｒｓｂｅｒｇ、２００９；Ｂｒａｙｅｒら、２０００）。

本明細書中に記載されるような遺伝子産物またはタンパク質の「過剰発現」は、野生型または特定の参照株と比較した発現の増加をいう。好ましくは、参照株または対照は、それぞれの遺伝子またはタンパク質の特異的過剰発現のために操作されていない株である。例えば、対照は、それぞれの遺伝子産物またはタンパク質の発現カセットを含むベクターを含まない。例えば、遺伝子産物の過剰発現は、初期増殖期中、線形増殖期中、静止期中の増加、または任意の他の時間中の増加であり得る。好ましくは、過剰発現は、対照と比較して、少なくとも１．５倍または少なくとも２倍の遺伝子産物またはタンパク質の増加である。転写量に関して、そして本明細書中で他に定義されない場合、強力な過剰発現は、ｌｏｇ２（倍変化）＞６をいう。転写量に関して、そして本明細書中で別に定義されない場合、弱い過剰発現は、ｌｏｇ２（倍変化）＜２をいう。転写量に関して、そして本明細書中で別に定義されない場合、中程度の強力な過剰発現は、ｌｏｇ２（倍変化）≧２および≦６をいう。

本明細書中に記載される遺伝子産物またはタンパク質の発現は、その遺伝子産物が全く発現されないか、または有意に減少した量（例えば、０．７５倍未満または０．５倍未満）で発現されるような様式で、それぞれの遺伝子が欠失または変異されている場合、「消失しているか、または減弱している（ａｂｓｅｎｔ ｏｒ ｒｅｄｕｃｅｄ）」。本明細書中に記載されるような遺伝子産物またはタンパク質の発現はまた、遺伝子産物またはタンパク質が例えば、一過性または永久的な様式で（例えば、変異またはノックダウンによって）機能性を失った場合、消失しているか、または減弱していると考えられる。遺伝子産物またはタンパク質の量および／または活性をモニターするための方法は当該分野で公知であり、そしてまた、例示的な様式で本明細書中に記載される。一般に、遺伝子産物の消失または減弱した発現を得るための適切な方法は、遺伝子発現の遺伝配列またはエレメントを変化させる方法（例えば、欠失または点突然変異により）および／または遺伝子の転写および翻訳、または遺伝子産物（タンパク質）の活性または半減期に負の影響を及ぼす方法である。

特に明記しない限り、記号「Δ」（デルタ）は、「欠失変異体（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ）」、すなわち、特定の遺伝子配列が少なくとも部分的に欠失している変異体を指す。

「初期増殖期（ｅａｒｌｙ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ）」は、アクチノプラネス株が培地に適応し、細胞乾燥重量が３ｇ・Ｌ^－1未満である時期である。環境への適応後、培養物は培地によって供給された栄養素を代謝し、増殖し始める。アクチノプラネスは球状菌糸体中で増殖しており、球体の外側にしか膨張できないので、中央の細胞は栄養から遮蔽され、細胞分裂のための限られた空間しか有さない。したがって、球状菌糸体の外層の細胞のみが分裂している。これにより、アクチノプラネスの増殖は、線形的であり指数関数的ではなく、単細胞で増殖している他の細菌とは対照的である。増殖期は、アクチノプラネス属種について「線形増殖期（ｌｉｎｅａｒ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ）」と呼ばれ、３ｇ・Ｌ^－１の細胞乾燥重量から始まる。「静止期（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅ）」は増殖期として定義され、細胞が（空間および栄養素の）容量限界にそれぞれ到達し、増殖が阻害性副産物の形成、または浸透圧モル濃度またはｐＨの変化などの他の化学的および物理的因子によって減少する。静止期は増殖期であり、死滅する細胞の数は分裂する細胞の数に等しい。この期は、通常、マルトース最小培地において１６～１８ｇ・Ｌ^－１の細胞乾燥重量で開始する。

用語「ベクター」は、本明細書中で使用される場合、それが連結される核酸分子を増殖し得る核酸分子をいう。

用語「発現カセット」は、本明細書中で使用される場合、発現のための少なくとも１つの遺伝子および調節配列（例えば、プロモーター）を含む核酸分子をいう。

「プロモーター」は、特定の遺伝子の転写の開始を導く核酸配列である。

本明細書で定義される「強力なプロモーター」とはプロモーターであり、これは、グルクロニダーゼアッセイにおいて少なくとも５・１０^－４［Ｌ・ｇ^－１・ｍｉｎ^－１］の正規化されたグルクロニダーゼ活性をもたらし、および／またはプロモーターの無いｐＧＵＳ対照ベクターと比較してｇｕｓＡ遺伝子の３５０倍の相対的な転写（ｌｏｇ２（倍変化））をもたらす。プロモーターの強度を特徴付けるための方法の詳細な説明は実施例および（Ｓｃｈａｆｆｅｒｔら、２０１９）において提供される。

例としては、以下のプロモーターが挙げられる
・ ａｐｍ：９．２・１０^－４［Ｌ・ｇ^－１・ｍｉｎ^－１］およびｌｏｇ２（倍変化）＝３６０．７８
・ ｅｒｍＥ^＊：９．７・１０^－４［Ｌ・ｇ^－１・ｍｉｎ^－１］およびｌｏｇ２（倍変化）＝２９１．０３
・ ｋａｔＥ：５．１・１０^－４［Ｌ・ｇ^－１・ｍｉｎ^－１］およびｌｏｇ２（倍変化）＝３４２．５１
・ ｍｏｅＥ５：９．７・１０^－４［Ｌ・ｇ^－１・ｍｉｎ^－１］およびｌｏｇ２（倍変化）＝３２９．３２
・ ｇａｐＤＨ：１１．５・１０^－４［Ｌ・ｇ^－１・ｍｉｎ^－１］およびｌｏｇ２（倍変化）＝９３１．４５、および
・ ａｃｔＰ：２２．９・１０^－４［Ｌ・ｇ^－１・ｍｉｎ^－１］。

「中程度の強力なプロモーター」はプロモーターとして定義され、これは、グルクロニダーゼアッセイにおいて少なくとも１・１０^－４［Ｌ・ｇ^－１・ｍｉｎ^－１］の正規化されたグルクロニダーゼ活性をもたらし、および／またはプロモーターの無いｐＧＵＳ対照ベクターと比較してｇｕｓＡ遺伝子の１０倍の相対的な転写（ｌｏｇ２（倍変化））をもたらす。例としては、以下のプロモーターが挙げられる
・ ｅｆｐ：３．１・１０－４［Ｌ・ｇ－１・ｍｉｎ－１］およびｌｏｇ２（倍変化）＝５３．０８
・ ｃｄａＲ：３．１・１０－４［Ｌ・ｇ－１・ｍｉｎ－１］およびｌｏｇ２（倍変化）＝８６．８２
・ ｒｐｓＬ：３．５・１０－４［Ｌ・ｇ－１・ｍｉｎ－１］およびｌｏｇ２（倍変化）＝９８．５３
・ ｒｐｓＪ：３．７・１０－４［Ｌ・ｇ－１・ｍｉｎ－１］およびｌｏｇ２（倍変化）＝１２３．９７
・ ｃｇｔ：２．５・１０－４ ［Ｌ・ｇ－１・ｍｉｎ－１］およびｌｏｇ２（倍変化）＝３４７．２９、および
・ ｔｉｐＡ：４．２・１０－４ ［Ｌ・ｇ－１・ｍｉｎ－１］およびｌｏｇ２（倍変化）＝１９１。

場合によっては、中程度の強力なプロモーターは、グルクロニダーゼアッセイにおいて少なくとも１・１０^－４［Ｌ・ｇ^－１・ｍｉｎ^－１］および５・１０^－４［Ｌ・ｇ^－１・ｍｉｎ^－１］の正規化されたグルクロニダーゼ活性をもたらす。

「弱いプロモーター」はプロモーターとして定義され、これは、１・１０^－４［Ｌ・ｇ^－１・ｍｉｎ^－１］未満の正規化されたグルクロニダーゼ活性をもたらし、および／またはプロモーターの無いｐＧＵＳ対照ベクターと比較してｇｕｓＡ遺伝子の１０倍未満の相対的な転写（ｌｏｇ２（倍変化））をもたらす。

用語「Ｃｇｔ」（ＡＣＳＰ５０＿５０２４、以前：ＡＣＰＬ＿５０９１）は、細胞外小炭水化物結合タンパク質を指し、アクチノプラネス属種（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．）（例えば、株ＡＴＣＣ ３１０４４／ＣＢＳ ６７４．７３／ＳＥ５０／１１０）から得られるシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼのＣ末端ドメインとの高い類似性のため、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼとして以前記載されていた。Ｃｇｔタンパク質は、遺伝子ｃｇｔによってコードされている。配列は、本明細書中に記載されるか（配列番号２０）、またはＵｎｉＰｒｏｔ識別子Ｇ８Ｓ１５５（Ｇ８Ｓ１５５＿ＡＣＴＳ５）を介してアクセス可能である。異なる株に対して異なるアイソフォームおよびバリアントが存在する可能性があり、これらはすべてこの用語によって構成される。初期配列の記載された触媒特性を変化させることなく特定の突然変異が交換され得る場合、このような機能的にサイレントな突然変異を有する配列が初期配列に関して同等であることは明らかである。さらに、このタンパク質は種々の修飾（例えば、合成的な修飾または天然に存在する修飾）を受け得る。

用語「ＡｃｂＢ」（ＡＣＳＰ５０＿３６０８、以前はＡＣＰＬ＿３６８１）は、アクチノプラネス属種（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．）、例えば株ＡＴＣＣ ３１０４４／ＣＢＳ ６７４．７３／ＳＥ５０／１１０から得られるｄＴＤＰ－Ｄ－グルコース－４，６－デヒドラターゼを指し、これはおそらくアカルボースのアカルビオース部分の生合成に関与する。ＡｃｂＢタンパク質は、ａｃｂＢ遺伝子によってコードされている。配列は、本明細書中に記載されるか（配列番号１３）、またはＵｎｉＰｒｏｔ識別子Ｑ９ＺＡＥ８（ＲＭＬＢ＿ＡＣＴＳ５）を介してアクセス可能である。異なる株に対して異なるアイソフォームおよびバリアントが存在する可能性があり、これらはすべてこの用語によって構成される。初期配列の記載された触媒特性を変化させることなく特定の突然変異が交換され得る場合、このような機能的にサイレントな突然変異を有する配列が初期配列に関して同等であることは明らかである。さらに、このタンパク質は種々の修飾（例えば、合成的な修飾または天然に存在する修飾）を受け得る。

用語「ＧｔａＢ」もまた「ＧａｌＵ」（ＡＣＳＰ５０＿７８２０、以前はＡＣＰＬ＿７８１１）は、アクチノプラネス属種（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．）、例えばＡＴＣＣ ３１０４４／ＣＢＳ ６７４．７３／ＳＥ５０／１１０株から得られるＵＴＰ－グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼを指す。ＧｔａＢは、グルコース－１ＰとＵＤＰ－グルコースの相互への変換を触媒し、アカルボースの前駆体供給に関与すると考えられる。ＧｔａＢタンパク質はｇｔａＢ遺伝子によってコードされている。配列は、本明細書中に記載されるか（配列番号１９）、またはＵｎｉＰｒｏｔ識別子Ｇ８Ｓ６０８（ＡＣＰＬ＿７８１１）を介してアクセス可能である。異なる株に対して異なるアイソフォームおよびバリアントが存在する可能性があり、これらはすべてこの用語によって構成される。初期配列の記載された触媒特性を変化させることなく特定の突然変異が交換され得る場合、このような機能的にサイレントな突然変異を有する配列が初期配列に関して同等であることは明らかである。さらに、このタンパク質は種々の修飾（例えば、合成的な修飾または天然に存在する修飾）を受け得る。

本明細書で定義されるように、「カロテノイド合成に必須である遺伝子」は、カロテノイドの合成に積極的に必要とされる遺伝子として定義される。アクチノプラネスは、カロテノイド類の黄色、橙色およびピンク色の色素を含む種々の可溶性色素を生成することが知られている。アクチノプラネスにおいて、カロテノイド合成に必須な遺伝子のセットにはＭＥＰ／ＤＯＸＰ経路由来の遺伝子、テルペンクラスター１の遺伝子、テルペンクラスター２ａの遺伝子、テルペンクラスター２ｂの遺伝子およびカンフェン様モノテルペン生合成テルペンクラスター３の遺伝子が含まれる。ＭＥＰ／ＤＯＸＰ経路の遺伝子は以下を含む
ｉ． １－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ遺伝子ｄｘｓ（ＡＣＳＰ５０＿７０９６、配列番号２３）、
ｉｉ． ４－ヒドロキシ－３－メチルブタ－２－エン－１－イル二リン酸シンターゼ遺伝子ｉｓｐＧ（ＡＣＳＰ５０＿７２４８、配列番号２４）、
ｉｉｉ． １－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸レダクトイソメラーゼ遺伝子ｄｘｒ（ＡＣＳＰ５０＿７２５０、配列番号２５）、
ｉｖ． ４－ヒドロキシ－３－メチルブタ－２－エニル二リン酸レダクターゼ遺伝子ｉｓｐＨ（ＡＣＳＰ５０＿７７０７、配列番号２６）、
ｖ． ４－（シチジン５’－ジホスホ）－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトールキナーゼ遺伝子ｉｓｐＥ（ＡＣＳＰ５０＿７８０２、配列番号２７）、
ｖｉ． ２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール２；４－シクロ二リン酸シンターゼ遺伝子ｉｓｐＦ、ＡＣＳＰ５０＿８０４６、配列番号２８）、および／または
ｖｉｉ． ２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール４－リン酸シチジリルトランスフェラーゼ遺伝子ｉｓｐＤ（ＡＣＳＰ５０＿８０４７、配列番号２９）。

テルペンクラスター１の遺伝子は以下を含む
ｉ． イソペンテニル－二リン酸デルタ－イソメラーゼ遺伝子ｉｄｉ（ＡＣＳＰ５０＿０１４６、配列番号３０）、
ｉｉ． ゼータ－フィトエンデサチュラーゼ遺伝子ｃｒｔＩ（ＡＣＳＰ５０＿０１４７、配列番号１０）、
ｉｉｉ． ポリプレニルシンターゼ遺伝子ｃｒｔＥ／ｌｄｓＡ（ＡＣＳＰ５０＿０１４８、配列番号３１）、
ｉｖ フィトエンシンターゼ遺伝子ｃｒｔＢ（ＡＣＳＰ５０＿０１４９、配列番号３２）、
ｖ． デオキシリボジピリミジンフォトリアーゼ遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿０１５０、配列番号３３）、または
ｖｉ． ピリジンヌクレオチド－ジスルフィドオキシドレダクターゼ遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿０１５１、配列番号３４）。

テルペンクラスター２ａの遺伝子は以下を含む
ｉ． 転写調節因子遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１６３１、配列番号３５）、
ｉｉ． リコペンシクラーゼ遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１６３２、配列番号３６）、
ｉｉｉ． リコペンシクラーゼ遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１６３３、配列番号３７）、
ｉｖ． ポリプレニルシンテターゼ（ファルネシルピロリン酸シンテターゼ２遺伝子ｆｐｓ２／ｃｒｔＥ（ＡＣＳＰ５０＿１６３４、配列番号３８）、および
ｖ． メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＮＡＤＰＨ）遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１６３５、配列番号３９）。

テルペンクラスター２ｂの遺伝子は以下を含む
ｉ． ＬｙｓＲ－ファミリー転写調節因子遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１６５０、配列番号４０）、
ｉｉ． メチルトランスフェラーゼ１１型遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１６５１、配列番号４１）、
ｉｉｉ． ＣＤＰ－アルコールホスファチジルトランスフェラーゼｐｇｓＡ（ＡＣＳＰ５０＿１６５２、配列番号４２）、
ｉｖ． ゼータ－フィトエンデサチュラーゼ（ｃｒｔＩ－ファミリー）遺伝子ｃｒｔＤ（ＡＣＳＰ５０＿１６５３、配列番号４３）、
ｖ． グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子ｃｒｕＣ（ＡＣＳＰ５０＿１６５４、配列番号４４）、
ｖｉ． 仮想タンパク質（ｐｕｔ．ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔ，）遺伝子ｃｒｕＦ、（ＡＣＳＰ５０＿１６５５、配列番号４５）、
ｖｉｉ． ＧＣＮ５ファミリーアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１６５６、配列番号４６）、
ｖｉｉｉ． モノオキシゲナーゼ遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１６５７、配列番号４７）、および
ｉｘ． 短鎖デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１６５８、配列番号４８）。

カロテノイド合成に必須である別の遺伝子は、ポリプレニルシンターゼ遺伝子ｃｒｔＥ（ＡＣＳＰ５０＿３８７３、配列番号４９）である。

カンフェン様モノテルペン生合成テルペンクラスター３の遺伝子は以下を含む
ｉ． 転写調節因子（Ｃｒｐ／Ｆｎｒファミリー）遺伝子ｅｓｈＡ（ＡＣＳＰ５０＿１９４９、配列番号１０４）、
ｉｉ． カンフェンシンターゼ遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１９５０、配列番号５０）、
ｉｉｉ． メチルトランスフェラーゼ（ＳＡＭ－依存性）１１型遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１９５１、配列番号１０５）、
ｉｖ． グリコシル－ヒドロラーゼ遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１９５２、配列番号１０６）、および
ｖ． オキシドレダクターゼ／アルド／ケトレダクターゼ（ＡＣＳＰ５０＿１９５３、配列番号１０７）。

実施形態
放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）株アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０を本発明のモデル株として使用したが、一般的なメカニズムおよび発見は、アカルボースの商業生産に現在使用されている株などの他のアカルボース産生株にも適用できることは当業者には明らかである。いくつかの実施形態によれば、放線菌株は、ミクロモノスポラセエ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）株である。いくつかの実施形態によれば、放線菌株は、アクチノプラネス株である。いくつかの実施形態によれば、放線菌株はアクチノプラネスＳＥ５０（ＡＴＣＣ ３１０４２、ＣＢＳ ９６１．７０）（Ｆｒｏｍｍｅｒら、１９７３）、アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０（ＡＴＣＣ ３１０４４、ＣＢＳ ６７４．７３）またはそれらに由来するアクチノプラネス株である。いくつかの実施形態において、放線菌株は、アカルボース産生のために商業的に使用されるアクチノプラネス株である。いくつかの実施形態において、放線菌株は例えば、ＥＰ２６０１２０９Ｂ１およびＣＮ１０３２９８８２８Ｂに開示されるような、ＳＮ２２３－２９－４７、Ｃ４４５－Ｐ４７、ＳＮ１２７５５－３８、ＳＣ３６８７－１８－４３、ＳＣ７１７７－４０－１７またはＳＮ１９９１０－３７－２１のような、アクチノプラネス産生のために商業的に使用されるアクチノプラネス株、またはその由来の株である。

アカルボース生産の改善は、特定の時間にわたるアカルボースの収率の増加（全部または細胞増殖に対する）および／またはアカルボースの純度の改善、例えば、成分Ｃのような副産物および／またはアカルボース類似体の減少を指す。アクチノプラネス株の培養は、当技術分野で知られているように、または本明細書に記載されているように起こり得る。いくつかの実施形態では、アクチノプラネス株の培養がマルトース最小培地で行われる。

本発明の第１の態様によれば、アクチノプラネス株のような放線菌株を、アカルボースの改善された産生のために操作する方法が提供される。

第１の態様によるいくつかの第１の実施形態によれば、第１の態様による方法は、細胞外小炭水化物結合タンパク質Ｃｇｔ（配列番号２０）の発現の消失または減弱のために、放線菌株を操作することを含む。

驚くべきことに、炭水化物結合タンパク質Ｃｇｔ（配列番号２０）の消失は、アカルボースの産生の改善をもたらした。８．３～１６．６％の最終アカルボース収率の増加は、３つの独立した振盪フラスコ培養において達成された（実施例「Δｃｇｔがマルトース最小培地で改善されたアカルボース形成を示す」、図１８、図１９、表Ｅ１０、表Ｅ１１を参照）。

さらに、野生型と比較すると、遺伝子欠失変異体Δｃｇｔは、異なる炭素源を試験するスクリーニング実験において、または炭素制限条件下（実施例「異なる炭素源上での増殖中のｃｇｔ発現の分析」、「異なる炭素源上または炭素制限条件下でのｃｇｔ発現の分析」、図１２、図１３、図１４を参照）、またはｐＨストレスおよびオスモライトストレス（実施例「ｃｇｔは浸透圧耐性またはｐＨ耐性に影響を及ぼさない」、図１５、図１６、図１７を参照）でのスクリーニング実験において、明らかな増殖表現型を示さなかった。本発明者らはさらに、ｃｇｔの欠失がアカルボース生合成遺伝子の発現に負の影響を及ぼさなかったことを示すことができた（実施例「Δｃｇｔは、アカルボース生合成遺伝子の発現に影響を及ぼさない」、図２０を参照）。

理論に束縛されるものではないが、Ｃｇｔは、細胞外プロテオーム（Ｗｅｎｄｌｅｒら、２０１３；Ｏｒｔｓｅｉｆｅｎ、２０１６）およびトランスクリプトーム（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋら、２０１３）の包括的な研究に従って、アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０において高度に発現されることが見出された。その遺伝子産物は、分泌されたプロテオーム全体の約８％を占める細胞外空間に搬出される。本発明者らは、ＢｌａｓｔＰ分析によって、原核生物の世界におけるＣＢＭ－２０単一ドメインタンパク質の分布を分析した。興味深いことに、特異的ＣＢＭ－２０ドメインタンパク質は、ほんの１７の他の種において見出された（例「真正細菌世界における単一ドメインＣＢＭ－２０タンパク質の分布」を参照）。これらの大部分は、たとえば放線菌目の種、たとえばアクチノプラネス属のすべての株に見られる。理論に束縛されることなく、ｃｇｔの欠失や発現の低下によって、ＡＴＰやアミノ酸などのエネルギーや資源は緩和される。次いで、これらの資源は、増殖関連産物であるアカルボース生合成に向け直され得る。

第１の態様によるいくつかの実施形態によれば、本方法は、細胞外小炭水化物結合タンパク質Ｃｇｔ（配列番号２０）をコードする遺伝子の欠失または突然変異を含む。インタージェネリック接合系（Ｇｒｅｎら、２０１６）およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術（Ｗｏｌｆら、２０１６）の確立は、アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０におけるゲノム編集を可能にする。第１の態様によるいくつかの実施形態では、発現の消失または減弱のための放線菌株の操作がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いて行うことができる。いくつかの実施形態では、発現の消失または減弱のために放線菌株を操作することは（Ｗｏｌｆら、２０１６）によって記載されるように起こり得る。いくつかの実施形態において、発現の消失または減弱のために放線菌株を操作することは、例えば、実施例「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術による遺伝子ｃｇｔの欠失」または「シトシンデアミナーゼＣｏｄＡとの相同組換えおよび対抗選択に基づく欠失系」に記載されるように、本明細書に記載されるように起こり得る。

例えば、本発明者らは、相同組換えによる新規欠失系を首尾よく確立し、これは、Ｚｈａｏら（２０１７）によって記載されるように、対抗選択のためにインテグラーゼを含まないベクターバックボーンおよびＣｏｄＡを使用する。

第１の態様によるいくつかの第２の実施形態によれば、第１の態様による方法は、カロテノイド合成に必須である少なくとも１つの遺伝子の発現の消失または減弱のために、放線菌株を操作することを含む。いくつかの実施形態では、カロテノイドがアクチノプラネスまたはその派生物のオレンジ色の色素である。いくつかの異なるまたは同じ実施形態において、カロテノイドは、Ｃ４０－カロテノイドである。

発現の消失または減弱のための放線菌株の操作は、本態様について以前に記載されたように起こり得る。第１の態様によるいくつかの実施形態によれば、本方法は、カロテノイド合成に必須である遺伝子の欠失または突然変異を含む。

アクチノプラネスは、カロテノイド類の黄色、橙色およびピンク色の色素を含む種々の可溶性色素を生成することが知られている（ＰａｒｅｎｔｉおよびＣｏｒｏｎｅｌｌｉ、１９７９）。本発明者らは、強力な色素沈着がアカルボース産生損失と関連していることを観察した。これは光に曝露された培養物と、光から覆われた培養物の増殖およびアカルボース収率を比較することによって確認された（実施例「光依存性カロテノイド形成および酸化ストレスはアクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０におけるアカルボース産生を減少させる」、図２２を参照）。カロテノイド形成が誘導されたが、アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０のアカルボース産生および増殖は電球光に曝露された場合、強く減少した（図２２）。全体として、最終アカルボース濃度の３９％の損失がモニターされた。

これらの知見から、産生された色素が必須ではない（例えば、商業的アカルボース製造のための技術的設定において）だけでなく、アクチノプラネスにおけるカロテノイド合成を減少または枯渇することを利用して、アカルボース形成を改善することができることが妥当である。この目的のために、第１の態様に従う方法は、カロテノイド合成に必須である少なくとも１つの遺伝子の発現を減少させるかまたは枯渇させることを包含する。

本発明者らは、アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０におけるカロチン生成をさらに再構築することができた（実施例「カロテノイド形成の機能的関連性の分析」、図２１を参照）。アクチノプラネスにおけるカロテノイド合成に必須な遺伝子のセットには、ＭＥＰ／ＤＯＸＰ経路由来の遺伝子、テルペンクラスター１の遺伝子、テルペンクラスター２ａの遺伝子、テルペンクラスター２ｂの遺伝子、カンフェン様モノテルペン生合成テルペンクラスター３の遺伝子が含まれる。

本態様および実施形態によるいくつかの実施形態によれば、カロテノイド合成に必須の少なくとも１つの遺伝子は、以下のようなＭＥＰ／ＤＯＸＰ経路の遺伝子である
ｉ． １－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ遺伝子ｄｘｓ（ＡＣＳＰ５０＿７０９６、配列番号２３）、
ｉｉ． ４－ヒドロキシ－３－メチルブタ－２－エン－１－イル二リン酸シンターゼ遺伝子ｉｓｐＧ（ＡＣＳＰ５０＿７２４８、配列番号２４）、
ｉｉｉ． １－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸レダクトイソメラーゼ遺伝子ｄｘｒ（ＡＣＳＰ５０＿７２５０、配列番号２５）、
ｉｖ． ４－ヒドロキシ－３－メチルブタ－２－エニル二リン酸レダクターゼ遺伝子ｉｓｐＨ（ＡＣＳＰ５０＿７７０７、配列番号２６）、
ｖ． ４－（シチジン５’－ジホスホ）－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトールキナーゼ遺伝子ｉｓｐＥ（ＡＣＳＰ５０＿７８０２、配列番号２７）、
ｖｉ． ２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール２；４－シクロ二リン酸シンターゼ遺伝子ｉｓｐＦ、ＡＣＳＰ５０＿８０４６、配列番号２８）、および／または
ｖｉｉ． ２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール４－リン酸シチジリルトランスフェラーゼ遺伝子ｉｓｐＤ（ＡＣＳＰ５０＿８０４７、配列番号２９）。

本態様および実施形態によるいくつかの実施形態によれば、カロテノイド合成に必須の少なくとも１つの遺伝子は、以下のようなテルペンクラスター１の遺伝子である
ｉ． イソペンテニル－二リン酸デルタ－イソメラーゼ遺伝子ｉｄｉ（ＡＣＳＰ５０＿０１４６、配列番号３０）、
ｉｉ． ゼータ－フィトエンデサチュラーゼ遺伝子ｃｒｔＩ（ＡＣＳＰ５０＿０１４７、配列番号１０）、
ｉｉｉ． ポリプレニルシンテターゼ遺伝子ｃｒｔＥ／ｌｄｓＡ（ＡＣＳＰ５０＿０１４８、配列番号３１）、
ｉｖ． フィトエンシンターゼ遺伝子ｃｒｔＢ（ＡＣＳＰ５０＿０１４９、配列番号３２）、
ｖ． デオキシリボジピリミジンフォトリアーゼ遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿０１５０、配列番号３３）、または
ｖｉ． ピリジンヌクレオチド－ジスルフィドオキシドレダクターゼ遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿０１５１、配列番号３４）。

本態様および実施形態によるいくつかの実施形態によれば、カロテノイド合成に必須の少なくとも１つの遺伝子は、ゼータ－フィトエンデサチュラーゼ遺伝子ｃｒｔＩ（ＡＣＳＰ５０＿０１４７、配列番号１０）である。前述のように、カロテノイド形成は、実験室条件下では不要である。アカルボース産生を改善するために、特に中央遺伝子ｃｒｔＩの欠失により、同時発生するカロテノイド生合成経路のスイッチをオフにすることが、菌株開発に使用できる。

本態様および実施形態によるいくつかの実施形態によれば、カロテノイド合成に必須の少なくとも１つの遺伝子は、以下のようなテルペンクラスター２ａの遺伝子である
ｉ． 転写調節因子遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１６３１、配列番号３５）、
ｉｉ． リコペンシクラーゼ遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１６３２、配列番号３６）、
ｉｉｉ． リコペンシクラーゼ遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１６３３、配列番号３７）、
ｉｖ． ポリプレニルシンテターゼ（ファルネシルピロリン酸シンテターゼ２遺伝子ｆｐｓ２／ｃｒｔＥ（ＡＣＳＰ５０＿１６３４、配列番号３８）、または、
ｖ． メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＮＡＤＰＨ）遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１６３５、配列番号３９）。

現在の局面および実施形態によるいくつかの実施形態によれば、カロテノイド合成に必須の少なくとも１つの遺伝子は、以下のようなテルペンクラスター２ｂの遺伝子である
ｉ． ＬｙｓＲ－ファミリー転写調節因子遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１６５０、配列番号４０）、
ｉｉ． メチルトランスフェラーゼ１１型遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１６５１、配列番号４１）、
ｉｉｉ． ＣＤＰ－アルコールホスファチジルトランスフェラーゼｐｇｓＡ（ＡＣＳＰ５０＿１６５２、配列番号４２）、
ｉｖ． ゼータ－フィトエンデサチュラーゼ（ｃｒｔＩ－ファミリー）遺伝子ｃｒｔＤ（ＡＣＳＰ５０＿１６５３、配列番号４３）、
ｖ． グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子ｃｒｕＣ（ＡＣＳＰ５０＿１６５４、配列番号４４）、
ｖｉ． 仮想タンパク質（ｐｕｔ．ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔ，）遺伝子ｃｒｕＦ、（ＡＣＳＰ５０＿１６５５、配列番号４５）、
ｖｉｉ． ＧＣＮ５ファミリーアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１６５６、配列番号４６）、
ｖｉｉｉ． モノオキシゲナーゼ遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１６５７、配列番号４７）、または
ｉｘ． 短鎖デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１６５８、配列番号４８）。

本態様および実施形態によるいくつかの実施形態によれば、カロテノイド合成に必須の少なくとも１つの遺伝子は、ポリプレニルシンテターゼ遺伝子ｃｒｔＥ（ＡＣＳＰ５０＿３８７３、配列番号４９）である。

本態様および実施形態によるいくつかの実施形態によれば、カロテノイド合成に必須の少なくとも１つの遺伝子は、以下のようなカンフェン様モノテルペン生合成テルペンクラスター３の遺伝子である
ｉ． 転写調節因子（Ｃｒｐ／Ｆｎｒファミリー）遺伝子ｅｓｈＡ（ＡＣＳＰ５０＿１９４９、配列番号１０４）、
ｉｉ． カンフェンシンターゼ遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１９５０、配列番号５０）、
ｉｉｉ． メチルトランスフェラーゼ（ＳＡＭ－依存性）１１型遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１９５１、配列番号１０５）、
ｉｖ． グリコシル－ヒドロラーゼ遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１９５２、配列番号１０６）、または
ｖ． オキシドレダクターゼ／アルド／ケトレダクターゼ（ＡＣＳＰ５０＿１９５３、配列番号１０７）。

カロテノイドは膜の流動性に影響を及ぼすので、カロテノイドの欠如、特にＣ４０－カロテノイドの欠如は、アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０の表面および菌糸構造にも影響を及ぼし得る。生産に関して、菌糸体塊の分解は、菌糸体表面および生化学的に利用可能な細胞の数を増加させるのに有利である。

いくつかのさらなる実施形態によれば、第１の態様による方法は、ＭｅｒＲ－／ＨＴＨ転写調節因子遺伝子ｍｅｒＲ（ＡＣＳＰ５０＿０１４５、配列番号１１）の過剰発現のために放線菌株を操作することを含む。過剰発現のための放線菌株の操作は、本明細書中の他の箇所に記載されるように起こり得る。

カロテノイド合成に必須である上記の遺伝子に加えて、本発明者らは驚くべきことに、テルペンクラスター１の遺伝子のうちのカロテノイド合成のための転写リプレッサーを同定した：ＡＣＳＰ５０＿０１４５（配列番号１１、ＭｅｒＲ－／ＨＴＨ転写調節因子遺伝子ｍｅｒＲ）（実施例「ＳＥ５０／１１０におけるｍｅｒＲの欠失は、光への暴露なしにカロテノイド形成を誘導する」、図２４を参照）。ＳＥ５０／１１０における対応する遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９欠失によって、カロテノイド形成は、光への暴露なしに強く誘導された（図２４ＢおよびＣ）。これと一致して、アカルボース産生が減少することが見出された。照射された場合、野生型およびΔｍｅｒＲの両方が強く色素沈着し、最終的なアカルボース濃度は両方の株について同様であり、約０．５２ｇ・Ｌ^－１に達した（図２４ＢおよびＤ）。これは、暗条件下（０．８３ｇ・Ｌ^－１に達する）での野生型と比較して、約３８％のアカルボース形成の減少に相当する。これは、野生型の以前の増殖実験と一致する。暗条件下では、ΔｍｅｒＲは、野生型（０．７０ｇ・Ｌ^－１）より約１５％少ないアカルボースを産生する（図２４Ｄ）。理論に束縛されるものではないが、これらの産生損失は欠失変異体におけるカロテノイド形成による資源の浪費によって引き起こされると考えられる（図２４Ｃ）。結論として、光条件下での産生損失（３８～３９％）は、欠失変異体と野生型の両方でさらなる光誘導ストレスに帰属される可能性がある。

第１の態様によるいくつかの第３の実施形態によれば、本方法は、ｄＴＤＰ－Ｄ－グルコース－４，６－デヒドラターゼＡｃｂＢ（配列番号１３）の過剰発現のために放線菌株を操作することを含む。

本発明によれば、驚くべきことに、ｄＴＤＰ－Ｄ－グルコース－４，６－デヒドラターゼＡｃｂＢをコードするａｃｂ遺伝子の過剰発現が、最終アカルボース濃度を約５０％有意に増加させることが見出された。ＡｃｂＣのようなＡｃｂクラスターの他の遺伝子は、アカルボースの形成の改善をもたらさなかったので、これは特に驚くべきことであった。さらに、観察された増加は、Ｚｈａｏら（Ｚｈａｏ、Ｘｉｅら、２０１７）によって記載されているように、完全なＡｃｂクラスターの過剰発現について観察された増加と比較して優れていた。

いくつかの実施形態によれば、株は、ＡｃｂＡを除くＡｃｂクラスターの他の遺伝子の過剰発現のために放線菌株を操作することを含まない。

ｄＴＤＰ－Ｄ－グルコース－４，６－デヒドラターゼＡｃｂＢは、アカルボース生合成の供給経路であるＤ－グルコース－１Ｐからの活性化アミノ糖の生成に関与しているようである（図１）：理論に束縛されるものではないが、増加したＡｃｂＢ活性は、驚くべきことに修飾された前駆体の供給も改善することが見出された。

本明細書に記載のＡｃｂＢの過剰発現は、野生型または特定の参照株／対照と比較したＡｃｂＢの発現の増加を指す。例えば、遺伝子産物の過剰発現は、初期増殖期中、線形増殖期中、静止期中の増加、または任意の他の時間中の増加であり得る。

好ましくは、本明細書中に記載されるように、ＡｃｂＢの過剰発現は対照と比較して、少なくとも１．５の係数または少なくとも２の係数によるＡｃｂＢ転写物および／またはタンパク質の増加をいう。ＡｃｂＢ転写物量に関して、そして本明細書中で別に定義されない場合、強力な過剰発現は、ｌｏｇ２（倍変化）＞６を指す。ＡｃｂＢ転写量に関して、本明細書中で別段に定義されない場合、中程度の強力な過剰発現は、ｌｏｇ２（倍変化）≧２および≦６を指す。

いくつかの実施形態によれば、ｄＴＤＰ－Ｄ－グルコース－４，６－デヒドラターゼＡｃｂＢ（配列番号１３）の過剰発現は、初期増殖期中、線形増殖期中、静止期中の、少なくとも１．５または少なくとも２のｌｏｇ２（倍変化）の係数によるＡｃｂＢ転写物および／またはタンパク質の発現の増加、または任意の他の時間中の増加である。

いくつかの実施形態によれば、ｄＴＤＰ－Ｄ－グルコース－４，６－デヒドラターゼＡｃｂＢ（配列番号１３）の過剰発現は、初期増殖期中、線形増殖期中、静止期中の、ｌｏｇ２（倍変化）≧２および≦６によるＡｃｂＢ転写物および／またはタンパク質の発現の増加、または初期増殖期中および／または線形増殖期中などの任意の他の時間中の増加である。

いくつかの実施形態によれば、ｄＴＤＰ－Ｄ－グルコース－４，６－デヒドラターゼＡｃｂＢ（配列番号１３）の過剰発現は、初期増殖期中、線形増殖期中、静止期中の、ｌｏｇ２（倍変化）＞３および＜５によるＡｃｂＢ転写物および／またはタンパク質の発現の増加、または任意の他の時間中の増加である。

いくつかの実施形態によれば、ｄＴＤＰ－Ｄ－グルコース－４，６－デヒドラターゼＡｃｂＢ（配列番号１３）の過剰発現は、初期増殖期中、線形増殖期中、静止期中の、ｌｏｇ２（倍変化）＞６によるＡｃｂＢ転写物および／またはタンパク質の発現の増加、または任意の他の時間中の増加である。

異種プロモーターを含む発現ベクターを有する過剰発現変異体において、ａｃｂＢの相対転写は、ｐＳＥＴＴ４ｔｉｐ：：ａｃｂＢ（中程度の強力なプロモーター）における２つのサンプリング時間中で４．０６倍から３．３３倍（ｌｏｇ２（倍変化））に、およびｐＳＥＴＴ４ｇａｐ：：ａｃｂＢ（強力なプロモーター）における６．５４から２．０５倍に減速した（実施例「ａｃｂＢの中程度の過剰発現は、改善されたアカルボース形成を導く」を参照）。

いくつかの実施形態によれば、第１の態様による遺伝子の過剰発現のための放線菌株の操作は、当該分野で公知のまたは本明細書中に記載される任意の方法によって生じ得る。

「ａｃｂＢの中程度の過剰発現はアカルボース形成の改善を導く」という実施例の中で述べたように、２つのｐＳＥＴＴ４に基づく過剰発現変異体が作られ、この変異体ではａｃｂＢが中程度の強力なｔｉｐＡ－プロモーターまたは強力なｇａｐＤＨ－プロモーターの制御下で転写される。天然プロモーターを、対照としてｐＳＥＴ１５２－およびｐＳＥＴＴ４－ベクターバックグラウンドの両方で使用した。特に、異種ｔｉｐＡ－プロモーターの制御下で転写されたａｃｂＢを有する変異体は、対照株と比較してアカルボース産生を増強した（図２７、図２８）。収率係数は、空ベクター対照と比較して４８．６および５１．９％に増加した。強力なｇａｐＤＨプロモーターの使用により、アカルボース収率係数はわずかに増加することが見出された（図２８）。

いくつかの実施形態によれば、第１の態様による遺伝子の過剰発現のための放線菌株の操作は、放線菌株にＡｃｂＢ（配列番号１３）の発現カセットを含むベクターを導入することによって行うことができる。いくつかの実施形態では、発現ベクターはｐＳＥＴ１５２に由来する。いくつかの実施形態では、発現ベクターはｐＳＥＴＴ４に由来する。ベクターは、第２のベクターの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つの要素を含む場合、別のベクターから導出される。

いくつかの実施形態によれば、第１の態様による遺伝子の過剰発現のための放線菌株の操作は、放線菌株にＡｃｂＢ（配列番号１３）の発現カセットを含むベクターを導入することによって行うことができる。これらの実施形態または他の実施形態のいくつかにおいて、発現カセットは中程度の強力なプロモーターの制御下にあり、グルクロニダーゼアッセイにおいて、例えば本明細書の他の箇所に記載されるように、少なくとも１ｘ１０^－４、好ましくは１ｘ１０^－４～５×１０^－４［Ｌ・ｇ^－１・ｍｉｎ^－１］の正規化グルクロニダーゼ活性を特徴とする。いくつかの実施形態では、前記プロモーターは、ｅｆｐプロモーター（配列番号９２）、ｃｄａＲプロモーター（配列番号９７）、ｒｐｓＬプロモーター（配列番号９９）、ｒｐｓＪプロモーター（配列番号９３）、ｃｇｔプロモーター（配列番号９１）、またはｔｉｐＡプロモーター（配列番号８１）から選択される。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ｔｉｐＡプロモーター（配列番号８１）である。ｐＳＥＴＴ４ｔｉｐ：：ａｃｂＢを用いて、アカルボース産生についての優れた結果が得られた。図２７、図２８を参照。

いくつかの態様において、発現カセットは強力なプロモーターの制御下にあり、グルクロニダーゼアッセイにおいて、例えば本明細書の他の箇所に記載されるように、少なくとも５×１０^－５［Ｌ・ｇ^－１・ｍｉｎ^－１］の正規化グルクロニダーゼ活性を特徴とする。いくつかの実施形態では、前記プロモーターは、ａｐｍプロモーター（配列番号９６）、ｅｒｍＥ^＊プロモーター（配列番号９８）、ｋａｔＥプロモーター（配列番号９４）、ｍｏｅＥ５プロモーター（配列番号９５）またはｇａｐＤＨプロモーター（配列番号８２）から選択される。

いくつかの実施形態によれば、第１の態様による方法はｄＴＤＰ－Ｄ－グルコース－４，６－デヒドラターゼＡｃｂＢ（配列番号１３）および任意にＡｃｂＡ（配列番号１２）の中程度の過剰発現のために、放線菌株を操作することを含む。いくつかの実施形態において、それは、特に明記しない場合、本明細書中に記載される全ての他の実施形態とも適合性であり、遺伝子操作は、ＡｃｂＢおよびＡｃｂＡ以外のＡｃｂ遺伝子について、ｌｏｇ２（倍変化）≧２による転写物および／またはタンパク質の増加をもたらさない。本明細書中に記載される全ての他の実施形態とも適合性であるいくつかの実施形態において、遺伝子操作は、ＡｃｂＣについてｌｏｇ２（倍変化）≧２による転写物および／またはタンパク質の増加をもたらさない。

ＡｃｂＢの過剰発現により、ａｃｂ遺伝子クラスターのさらなる遺伝子は、例えば初期増殖期において、ａｃｂＡおよびａｃｂＶに示されるように、有意に影響されなかった（図３０）。唯一の例外は、ｐＳＥＴＴ４ｔｉｐ：：ａｃｂＢにおけるａｃｂＡのわずかに高い転写量である（ｌｏｇ２（倍変化）＝１．８７）。

いくつかの実施形態によれば、第１の態様による方法は、ＡｃｂＢ（配列番号１３）およびＡｃｂＳ（ＡＣＳＰ５０＿３５９６）および／またはＡｃｂＩ（ＡＣＳＰ５０＿３５９９）の過剰発現のために放線菌株を操作することを含む。

ＡｃｂＳおよび／またはＡｃｂＩの（追加の）過剰発現によって、アミノ糖のサイクリトール前駆体への転移反応を強化することができる。本モデル（図１を参照）によれば、この反応は、ＡｃｂＳ（ＡＣＳＰ５０＿３５９６）またはＡｃｂＩ（ＡＣＳＰ５０＿３５９９）によって触媒される。

いくつかの実施形態によれば、第１の態様による方法は、ＡｃｂＢ（配列番号１３）およびＡｃｂＣＵＪ（ＡｃｂＣ（ＡＣＳＰ５０＿３６０７）および／またはＡｃｂＵ（ＡＣＳＰ５０＿３５９５）および／またはＡｃｂＪ（ＡＣＳＰ５０＿３６００））および／またはＡｃｂＳＩ（ＡｃｂＳ（ＡＣＳＰ５０＿３５９６）および／またはＡｃｂＩ（ＡＣＳＰ５０＿３５９９））の過剰発現のために放線菌株を操作することを含む。理論に束縛されるものではないが、この組み合わせは、おそらく両方のアカルボース合成鎖を強化することができる。

第１の態様によるいくつかの第４の実施形態によれば、この方法は、ＵＤＰ－グルコース－１ＰウリジルトランスフェラーゼＧｔａＢ（配列番号１９）の過剰発現のために放線菌株を操作することを含む。

ｇｔａＢの中程度の過剰発現によって、最終アカルボース濃度の８．５％の増加が観察された（実施例「ｇｔａＢの中程度の過剰発現は改善されたアカルボース形成を導く」、図３２、図３３を参照）。興味深いことに、アカルボース形成は特に、後期線形増殖期から静止増殖期において増加する（図３２）。理論に束縛されるものではないが、これは前駆体グルコース－１Ｐの改善された展開から生じ得る（図３４を参照）。

本明細書中に記載されるようなＧｔａＢ（配列番号１９）の過剰発現は、野生型または特定の参照株／対照と比較して、ＧｔａＢ転写物および／またはタンパク質についての発現の増加を指す。例えば、遺伝子産物の過剰発現は、初期増殖期中および／または線形増殖期中および／または静止期中の増加、および／または任意の他の時間中の増加であり得る。

好ましくは、過剰発現は、対照と比較して、少なくとも１．５または少なくとも２の係数によるＧｔａＢ転写物および／またはタンパク質の増加である。ＧｔａＢ転写量に関して、そして本明細書中で他に定義されない場合、強力な過剰発現は、ｌｏｇ２（倍変化）＞６を指す。ＧｔａＢ転写量に関して、そして本明細書中で別に定義されない場合、中程度の強力な過剰発現は、ｌｏｇ２（倍変化）≧２および≦６を指す。

いくつかの実施形態によれば、ＵＤＰ－グルコース－１ＰウリジルトランスフェラーゼＧｔａＢの過剰発現は、初期増殖期中および／または線形増殖期中および／または静止期中の少なくとも１．５または少なくとも２のｌｏｇ２（倍変化）の係数によるＧｔａＢの発現の増加、および／または任意の他の時間中の増加である。

本明細書に記載の過剰発現変異体の１つにおいて、遺伝子ｇｔａＢの相対転写量は、２．６４倍増加している（ｌｏｇ２（倍変化））（図３３）。

いくつかの実施形態によれば、ＵＤＰ－グルコース－１ＰウリジルトランスフェラーゼＧｔａＢの過剰発現は、初期増殖期中および／または線形増殖期中および／または固定期中のｌｏｇ２（倍数変化）≧２および≦６によるＧｔａＢ転写物および／またはタンパク質の発現の増加、および／または任意の他の時間中の増加である。いくつかの実施形態によれば、ＵＤＰ－グルコース－１ＰウリジルトランスフェラーゼＧｔａＢの過剰発現は、初期増殖期中および／または線形増殖期中および／または静止期中のｌｏｇ２（倍数変化）≧３および≦５によるＧｔａＢの発現の増加、および／または任意の他の時間中の増加である。

いくつかの実施形態によれば、ＵＤＰ－グルコース－１ＰウリジルトランスフェラーゼＧｔａＢの過剰発現は、初期増殖期中および／または線形増殖期中および／または静止期中に、ｌｏｇ２（倍変化）≧６によるＧｔａＢの発現の増加である。

いくつかの実施形態によれば、第１の態様による遺伝子の過剰発現のための放線菌株の操作は、ＧｔａＢ（配列番号１９）の発現カセットを含むベクターを放線菌株に導入することによって行うことができる。いくつかの実施形態では、発現ベクターはｐＳＥＴ１５２に由来する。いくつかの実施形態では、発現ベクターはｐＳＥＴＴ４に由来する。ベクターは、第２のベクターの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つの要素を含む場合、別のベクターから導出される。

いくつかの実施形態によれば、第１の態様による遺伝子の過剰発現のための放線菌株の操作は、ＧｔａＢ（配列番号１９）の発現カセットを含むベクターを放線菌株に導入することによって行うことができる。

これらの実施形態または他の実施形態のいくつかにおいて、発現カセットは中程度の強力なプロモーターの制御下にあり、例えば本明細書の他の箇所に記載されるように、グルクロニダーゼアッセイにおいて、１ｘ１０^－４～５×１０^－５［Ｌ・ｇ^－１・ｍｉｎ^－１］の正規化グルクロニダーゼ活性を特徴とする。いくつかの実施形態では、前記プロモーターは、ｅｆｐプロモーター（配列番号９２）、ｃｄａＲプロモーター（配列番号９７）、ｒｐｓＬプロモーター（配列番号９９）、ｒｐｓＪプロモーター（配列番号９３）、ｃｇｔプロモーター（配列番号９１）、またはｔｉｐＡプロモーター（配列番号８１）から選択される。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ｔｉｐＡプロモーター（配列番号８１）である。アカルボース産生についての良好な結果は、例えばｐＳＥＴＴ４ｔｉｐ：：ｇｔａＢを用いて得られた。図３２、図３３を参照。

いくつかの態様において、発現カセットは強力なプロモーターの制御下にあり、例えば本明細書の他の箇所に記載されるように、グルクロニダーゼアッセイにおいて、少なくとも５×１０^－５［Ｌ・ｇ^－１・ｍｉｎ^－１］の正規化グルクロニダーゼ活性を特徴とする。いくつかの実施形態では、前記プロモーターは、ａｐｍプロモーター（配列番号９６）、ｅｒｍＥ^＊プロモーター（配列番号９８）、ｋａｔＥプロモーター（配列番号９４）、ｍｏｅＥ５プロモーター（配列番号９５）またはｇａｐＤＨプロモーター（配列番号８２）から選択される。

第１の態様のいくつかのさらなる実施形態または同じ実施形態によれば、その方法は、ｄＴＤＰ－Ｄ－グルコース－４，６－デヒドラターゼＡｃｂＢ（配列番号１３）およびＧｔａＢ（配列番号１９）の中程度の過剰発現のために、放線菌株を操作することを含む。

ＧｔａＢの過剰発現が改善されたアカルボース形成を誘発することは驚くべきことであった。ａｃｂＢの中程度の過剰発現（例えば、ｔｉｐＡ－プロモーターの使用による）によって、アカルボース産生に対する正の効果が観察され、２つの独立した培養において、約５０％以上のアカルボースを産生した。したがって、特異的ａｃｂ遺伝子ＡｃｂＢの過剰発現によるアカルボース生合成の改善が達成された。さらに、ｇｔａＢの中程度の過剰発現により、最終アカルボース濃度の８．５％の増加が観察された。ａｃｂＢとｇｔａＢの組み合わされた過剰発現により、アミノ糖生合成を介する代謝流束（ｆｌｕｘ）が改善され、アカルボース産生がさらに増強されると考えられる。

理論に束縛されることなく、ＡｃｂＢの強力な過剰発現は、ＡｃｂＢの中程度の強力な過剰発現と比較して、アカルボース産生のわずかな増加のみを誘導した。これは、ＡｃｂＢの大量の過剰発現時に起こるグルコース－リン酸代謝の不均衡によるものと考えられる。ｇｔａＢの過剰発現は、この不均衡を治癒させる可能性があり、ａｃｂＢとｇｔａＢの両方の組み合わされた過剰発現はアカルボース産生のさらなる増加につながると考えられる。

興味深いことに、質量Ｍ／ｚ＝５４５［Ｍ－Ｈ＋］の有意な減少量がｐＳＥＴＴ４ｔｉｐ：：ｇｔａＢで見出され（約４８％の減少）、これはＡｃｂＢの提案された生成物であるｄＴＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－Ｄ－グルコースに対応する可能性がある。これは、この代謝産物の蓄積が空ベクター対照およびＡｃｂＢ－過剰発現変異体と比較して減少するので、合成鎖を介した代謝流束がよりバランスが取れていることを示し得る（図３４）。

いくつかの実施形態によれば、第１の態様による方法は、
（ｉ） 細胞外小型炭水化物結合タンパク質Ｃｇｔ（配列番号２０）の消失または減弱した発現のために、および／または
（ｉｉ） カロテノイド合成に関与する少なくとも１つの遺伝子の消失または減弱した発現のために、および／または
（ｉｉｉ） ｄＴＤＰ－Ｄ－グルコース－４，６－デヒドラターゼＡｃｂＢ（配列番号１３）の過剰発現のために、および／または
（ｉｖ） ＵＤＰ－グルコース－１ＰウリジルトランスフェラーゼＧｔａＢ（配列番号１９）の過剰発現のために、
放線菌株を操作することを含む。

いくつかの実施形態によれば、第１の態様による方法は、ｔｒｅＹの消失または減弱した発現のために放線菌株を操作することをさらに含む。

いくつかの実施形態によれば、第１の態様による方法はさらに、
（ｉ） 細胞外小炭水化物結合タンパク質Ｃｇｔ（配列番号２０）をコードする遺伝子の欠失または突然変異、および／または、
（ｉｉ） カロテノイド合成に関与する少なくとも１つの遺伝子の欠失または突然変異、および／または、
（ｉｉｉ） ＡｃｂＢ（配列番号１３）の発現カセットを含むベクターを放線菌株に導入すること、および／または、
（ｉｖ） ＧｔａＢ（配列番号１９）の発現カセットを含むベクターを放線菌株に導入すること、
を含む。

いくつかの実施形態によれば、（ｉｉｉ）および／または（ｉｖ）による発現カセットは中程度の強力なプロモーターの制御下にあり、グルクロニダーゼアッセイにおいて、１ｘ１０^－４～５×１０^－５［Ｌ・ｇ^－１・ｍｉｎ^－１］の正規化グルクロニダーゼ活性を特徴とする。

第２の態様によれば、アカルボースの製造のための、アクチノプラネス株のような、放線菌株が提供される。いくつかの実施形態によれば、放線菌株は、第１の態様による方法によって生成された株である。いくつかの他の実施形態によれば、放線菌株は、細胞外小炭水化物結合タンパク質Ｃｇｔ（配列番号２０）の発現の消失または減弱のために遺伝子操作される。いくつかの実施形態によれば、放線菌株は、Δｃｇｔ変異体である。Δｃｇｔ変異体は、遺伝子Ｃｇｔ（配列番号２０）が少なくとも部分的に欠失または逆位されている放線菌株の変異体である。

これらまたは他の実施形態のいくつかによれば、放線菌株は、カロテノイド合成に必須である少なくとも１つの遺伝子の消失したまたは減弱した発現のために遺伝子操作される。いくつかの実施形態によれば、カロテノイド合成に必須である少なくとも１つの遺伝子は、少なくとも部分的に欠失または逆位されている。これらの実施形態のいくつかによれば、カロテノイド合成に必須である少なくとも１つの遺伝子は、以下のいずれかから選択される少なくとも１つの遺伝子を含む
ａ． ＭＥＰ／ＤＯＸＰ経路の遺伝子、例えば、
ｉ １－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ遺伝子ｄｘｓ（ＡＣＳＰ５０＿７０９６、配列番号２３）、
ｉｉ． ４－ヒドロキシ－３－メチルブタ－２－エン－１－イル二リン酸シンターゼ遺伝子ｉｓｐＧ（ＡＣＳＰ５０＿７２４８、配列番号２４）、
ｉｉｉ． １－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸レダクトイソメラーゼ遺伝子ｄｘｒ（ＡＣＳＰ５０＿７２５０、配列番号２５）、
ｉｖ． ４－ヒドロキシ－３－メチルブタ－２－エニル二リン酸レダクターゼ遺伝子ｉｓｐＨ（ＡＣＳＰ５０＿７７０７、配列番号２６）、
ｖ． ４－（シチジン５’－ジホスホ）－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトールキナーゼ遺伝子ｉｓｐＥ（ＡＣＳＰ５０＿７８０２、配列番号２７）、
ｖｉ． ２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール２；４－シクロ二リン酸シンターゼ遺伝子ｉｓｐＦ、ＡＣＳＰ５０＿８０４６、配列番号２８）、および／または
ｖｉｉ． ２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール４－リン酸シチジリルトランスフェラーゼ遺伝子ｉｓｐＤ（ＡＣＳＰ５０＿８０４７、配列番号２９）、
ｂ． テルペンクラスター１の遺伝子、例えば、
ｉ． イソペンテニル－二リン酸デルタ－イソメラーゼ遺伝子ｉｄｉ（ＡＣＳＰ５０＿０１４６、配列番号３０）、
ｉｉ． ゼータ－フィトエンデサチュラーゼ遺伝子ｃｒｔＩ（ＡＣＳＰ５０＿０１４７、配列番号１０）、
ｉｉｉ． ポリプレニルシンテターゼ遺伝子ｃｒｔＥ／ｌｄｓＡ（ＡＣＳＰ５０＿０１４８、配列番号３１）、
ｉｖ． フィトエンシンターゼ遺伝子ｃｒｔＢ（ＡＣＳＰ５０＿０１４９、配列番号３２）、
ｖ． デオキシリボジピリミジンフォトリアーゼ遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿０１５０、配列番号３３）、または
ｖｉ． ピリジンヌクレオチド－ジスルフィドオキシドレダクターゼ遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿０１５１、配列番号３４）、
ｃ． テルペンクラスター２ａの遺伝子、例えば、
ｉ． 転写調節因子遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１６３１、配列番号３５）、
ｉｉ． リコペンシクラーゼ遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１６３２、配列番号３６）、
ｉｉｉ． リコペンシクラーゼ遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１６３３、配列番号３７）、
ｉｖ． ポリプレニルシンテターゼ（ファルネシルピロリン酸シンテターゼ２遺伝子ｆｐｓ２／ｃｒｔＥ（ＡＣＳＰ５０＿１６３４、配列番号３８）、または、
ｖ． メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＮＡＤＰＨ）遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１６３５、配列番号３９）、
ｄ． テルペンクラスター２ｂの遺伝子、例えば、
ｉ． ＬｙｓＲ－ファミリー転写調節因子遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１６５０、配列番号４０）、
ｉｉ． メチルトランスフェラーゼ１１型遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１６５１、配列番号４１）、
ｉｉｉ． ＣＤＰ－アルコールホスファチジルトランスフェラーゼｐｇｓＡ（ＡＣＳＰ５０＿１６５２、配列番号４２）、
ｉｖ． ゼータ－フィトエンデサチュラーゼ（ｃｒｔＩ－ファミリー）遺伝子ｃｒｔＤ（ＡＣＳＰ５０＿１６５３、配列番号４３）、
ｖ． グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子ｃｒｕＣ（ＡＣＳＰ５０＿１６５４、配列番号４４）、
ｖｉ． 仮想タンパク質（ｐｕｔ．ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔ，）遺伝子ｃｒｕＦ、（ＡＣＳＰ５０＿１６５５、配列番号４５）、
ｖｉｉ． ＧＣＮ５ファミリーアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１６５６、配列番号４６）、
ｖｉｉｉ． モノオキシゲナーゼ遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１６５７、配列番号４７）、
ｉｘ． 短鎖デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１６５８、配列番号４８）、
ｅ． ポリプレニルシンテターゼ遺伝子ｃｒｔＥ（ＡＣＳＰ５０＿３８７３、配列番号４９）、または
ｆ． カンフェン様モノテルペン生合成テルペンクラスター３の遺伝子、例えば、
ｉ． 転写調節因子（Ｃｒｐ／Ｆｎｒファミリー）遺伝子ｅｓｈＡ（ＡＣＳＰ５０＿１９４９、配列番号１０４）、
ｉｉ． カンフェンシンターゼ遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１９５０、配列番号５０）、
ｉｉｉ． メチルトランスフェラーゼ（ＳＡＭ－依存性）１１型遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１９５１、配列番号１０５）、
ｉｖ． グリコシル－ヒドロラーゼ遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿１９５２、配列番号１０６）、
ｖ． オキシドレダクターゼ／アルド／ケトレダクターゼ（ＡＣＳＰ５０＿１９５３、配列番号１０７）。

これらまたは他の実施形態のいくつかによれば、放線菌株は、ＭｅｒＲ－／ＨＴＨ転写調節因子遺伝子ｍｅｒＲ（ＡＣＳＰ５０＿０１４５、配列番号１１）の過剰発現のために遺伝子操作される。

これらまたは他の実施形態のいくつかによれば、放線菌株は、ｄＴＤＰ－Ｄ－グルコース－４，６－デヒドラターゼＡｃｂＢ（配列番号１３）の過剰発現のために遺伝子操作される。

本明細書の他の箇所に記載されるように、ＡｃｂＢの過剰発現は、対照と比較して、少なくとも１．５の係数または少なくとも２係数によるＡｃｂＢの増加を指す。好ましくは、対照は、ｄＴＤＰ－Ｄ－グルコース－４，６－デヒドラターゼＡｃｂＢ（配列番号１３）の特異的過剰発現のために操作されていない株である。例えば、対照は、ＡｃｂＢの発現カセットを含むベクターを含まない。

例えば、遺伝子産物の過剰発現は、初期増殖期中、線形増殖期中、静止期中の増加、または任意の他の時間中の増加であり得る。

いくつかの実施形態によれば、ｄＴＤＰ－Ｄ－グルコース－４，６－デヒドラターゼＡｃｂＢ（配列番号１３）の過剰発現は、初期増殖期中、線形増殖期中、静止期中の、少なくとも１．５または少なくとも２のｌｏｇ２（倍変化）の係数によるＡｃｂＢ転写物および／またはタンパク質の発現の増加であり、または任意の他の時間中の増加である。

いくつかの実施形態によれば、ｄＴＤＰ－Ｄ－グルコース－４，６－デヒドラターゼＡｃｂＢ（配列番号１３）の過剰発現は、初期増殖期中、線形増殖期中、静止期中、ｌｏｇ２（倍変化）≧２および≦６によるＡｃｂＢ転写物および／またはタンパク質の発現の増加であり、または初期増殖期中および／または線形増殖期中などの、任意の他の時間中の増加である。

いくつかの実施形態によれば、ｄＴＤＰ－Ｄ－グルコース－４，６－デヒドラターゼＡｃｂＢ（配列番号１３）の過剰発現は、初期増殖期、線形増殖期、静止期中の、ｌｏｇ２（倍変化）＞３および＜５によるＡｃｂＢ転写物および／またはタンパク質の発現の増加であり、または任意の他の時間中の増加である。

いくつかの実施形態によれば、ｄＴＤＰ－Ｄ－グルコース－４，６－デヒドラターゼＡｃｂＢ（配列番号１３）の過剰発現は、初期増殖期中、線形増殖期中、静止期中、ｌｏｇ２（倍数変化）＞６によるＡｃｂＢ転写物および／またはタンパク質の発現の増加であり、または任意の他の時間中の増加である。

いくつかの実施形態によれば、ｄＴＤＰ－Ｄ－グルコース－４，６－デヒドラターゼＡｃｂＢ（配列番号１３）の過剰発現のために遺伝子操作された放線菌株は、ＡｃｂＢの過剰発現のためのベクターを含む。これらの実施形態のいくつかによれば、ベクターは本明細書に記載のベクターであり、好ましくは、本明細書に記載の態様による。

いくつかの実施形態によれば、ｄＴＤＰ－Ｄ－グルコース－４，６－デヒドラターゼＡｃｂＢ（配列番号１３）の過剰発現のために遺伝子操作された放線菌株は、中程度の強力なプロモーターの制御下でのＡｃｂＢ（配列番号１３）のための発現カセットを含む。

いくつかの実施形態によれば、ｄＴＤＰ－Ｄ－グルコース－４，６－デヒドラターゼＡｃｂＢ（配列番号１３）の過剰発現のために遺伝子操作された放線菌株は、強力なプロモーターの制御下でのＡｃｂＢ（配列番号１３）のための発現カセットを含む。好ましくは、そのプロモーターはＡｃｂＢの天然プロモーターではない。

これらまたは他の実施形態のいくつかによれば、放線菌株は、ＵＤＰ－グルコース－１ＰウリジルトランスフェラーゼＧｔａＢ（配列番号１９）の過剰発現のために遺伝子操作される。

本明細書の他の箇所に記載されるＧｔａＢ（配列番号１９）の過剰発現は、野生型または特定の参照株／対照と比較したＧｔａＢの発現の増加を指す。好ましくは、対照が、ＧｔａＢ（配列番号１９）の特異的過剰発現のために操作されていない株である。例えば、対照は、ＧｔａＢ（配列番号１９）の発現カセットを含むベクターを含まない。例えば、遺伝子産物の過剰発現は、初期増殖期中および／または線形増殖期中および／または静止期中の増加、および／または任意の他の時間中の増加であり得る。

いくつかの実施形態によれば、ＧｔａＢの過剰発現は、初期増殖期中、線形増殖期中、静止期中の、少なくとも１．５、または少なくとも２のｌｏｇ２（倍数変化）の係数によるＧｔａＢ転写物および／またはタンパク質の発現の増加であり、または任意の他の時間中の増加である。

いくつかの実施形態によれば、ＧｔａＢの過剰発現は、初期増殖期中、線形増殖期中、静止期中の、ｌｏｇ２（倍変化）≧２および≦６によるＧｔａＢ転写物および／またはタンパク質の発現の増加であり、または初期増殖期中および／または線形増殖期中などの、任意の他の時間中の増加である。

いくつかの実施形態によれば、ＧｔａＢの過剰発現は、初期増殖期中、線形増殖期中、静止期中、ｌｏｇ２（倍変化）＞３および＜５によるＧｔａＢ転写物および／またはタンパク質の発現の増加であり、または任意の他の時間中の増加である。

いくつかの実施形態によれば、ＧｔａＢの過剰発現は、初期増殖期中、線形増殖期中、静止期中の、ｌｏｇ２（倍変化）＞６によるＧｔａＢ転写物および／またはタンパク質の発現の増加であり、または任意の他の時間中の増加である。

いくつかの実施形態によれば、ＧｔａＢの過剰発現のために遺伝子操作された放線菌株は、ＧｔａＢの過剰発現のためのベクターを含む。これらの実施形態のいくつかによれば、ベクターは本明細書に記載のベクターであり、好ましくは、本明細書に記載の態様による。

いくつかの実施形態によれば、ＧｔａＢ（配列番号１９）の過剰発現のために遺伝子操作された放線菌株は、中程度の強力なプロモーターの制御下でのＧｔａＢ（配列番号１９）のための発現カセットを含む。

いくつかの実施形態によれば、ＧｔａＢ（配列番号１９）の過剰発現のために遺伝子操作された放線菌株は、強力なプロモーターの制御下でのＧｔａＢ（配列番号１９）のための発現カセットを含む。好ましくは、プロモーターはＧｔａＢの天然プロモーターではない。

第３の態様によれば、アカルボースの製造に使用するためのアカルボースの製造のために、アクチノプラネス株などの、放線菌株が提供される。

いくつかの実施形態によれば、アカルボースの製造方法が提供され、この方法は、第２の態様に従う放線菌株の使用を含む。

アクチノプラネスの遺伝子操作には、単数あるいは複数の遺伝子の過剰発現のために発現系が必要である。第４の態様によれば、アクチノプラネスのための発現ベクターが提供される。

いくつかの実施形態によれば、第４の態様によるベクターは、グルクロニダーゼアッセイにおける少なくとも１ｘ１０－４［Ｌ・ｇ－１・ｍｉｎ－１］の正規化グルクロニダーゼ活性を特徴とする中程度の強力なプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、中程度の強力なプロモーターは、配列番号９２のｅｆｐ、配列番号９７のｃｄａＲ、配列番号９９のｒｐｓＬ、配列番号９３のｒｐｓＪ、配列番号９１のｃｇｔ、または配列番号８１のｔｉｐＡから選択される。

いくつかの実施形態によれば、第４の態様によるベクターは、グルクロニダーゼアッセイにおける少なくとも５ｘ１０－４［Ｌ・ｇ－１・ｍｉｎ－１］の正規化グルクロニダーゼ活性を特徴とする強力なプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、強力なプロモーターが、配列番号９６のａｐｍ、配列番号９８のｅｒｍＥ＊、配列番号９４のｋａｔＥ、配列番号９５のｍｏｅＥ５、または配列番号８２のｇａｐＤＨから選択される。

中程度から強力な遺伝子発現を可能にするさらなる好適なプロモーターを見出すために、プロモータースクリーニングはＨｏｒｂａｌら（２０１３）およびＭｙｒｏｎｏｖｓｋｙｉら（２０１１）のスクリーニング系の使用によって実施され得、これはｐＳＥＴ１５２ベクター系においてクローニングされたレポーターＧｕｓＡに基づく（図３、表１を参照）。

いくつかの実施形態では、第１の態様によるベクターが発現カセットを含む。好ましくは、ベクターが、ＡｃｂＢの発現カセット（配列番号１３）および／またはＧｔａＢの発現カセット（配列番号１９）および／またはＭｅｒＲの発現カセットを含む。

いくつかの実施形態において、発現カセットは、ｌａｃ－プロモーターの制御下にあるｌａｃＺα－遺伝子をさらに含み得る。ｌａｃＺα－遺伝子はβ－ガラクトシダーゼの触媒ドメインをコードし、クローニング株大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５αＭＣＲ（ＮＣ＿０１７６３８．１）における青白選択による標的配列の組込みの迅速な選択を可能にする（Ｇｒａｎｔら１９９０）。

理論に束縛されるものではないが、本態様によるベクターは、ベクター複製、伝達、維持および選択のためのエレメントを含む。いくつかの実施形態において、これらのエレメントの少なくとも１つは、ｐＳＥＴ１５２に由来する。

いくつかの実施形態では、本態様によるベクターが、Ｂｉｅｒｍａｎら（１９９２）のｐＳＥＴ１５２ベクターの配列の一部を含む。

好ましくは、ベクターが、配列番号１０８および／または配列番号１０９による推定アンチセンスプロモーターを含まない。これらのアンチセンスプロモーターは、５’－一次転写ライブラリーのシーケンシングによって本発明者らによって同定され、そしてベクターｐＳＥＴ１５２の適合性を損なう。簡潔には、同定は、濃縮された一次転写物ライブラリーのシーケンシングによって行われた。２つの推定プロモーターは、アンチセンス配向の目的遺伝子の後ろに同定された（図２６）。これら２つの擬似プロモーターは、アンチセンス転写を防ぐために除去された。

さらに、Ｔ４－ターミネーターを反対方向で発現カセットの後ろに導入して、さらなる推定アンチセンス読み取りを防止した（例えば、図６を参照のこと）。いくつかの実施形態では、ベクターが、少なくとも１つのＴ４－ターミネーター（バクテリオファージＴ４に由来する）を含む。Ｔ４－ターミネーターは、転写を効率よく阻害し、インテグラーゼ遺伝子から目的の遺伝子へのリードスルーを妨げることができる。いくつかの実施形態では、ベクターが、さらなる推定アンチセンス読み取りを防ぐために、反対方向で発現カセットの背後にＴ４－ターミネーターを含む。例えば、ベクターは、発現カセットの前に少なくとも１つのＴ４－ターミネーターおよび／または発現カセットの後に少なくとも１つのＴ４－ターミネーターを含み得る。いくつかの実施形態において、ベクターは、３つのターミネーター、発現カセットの前に１つおよび後に２つ、を含み得る。

いくつかの実施形態では、ベクターはφＣ３１インテグラーゼ遺伝子ｉｎｔを含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、φＣ３１インテグラーゼ遺伝子ｉｎｔは、ｐＳＥＴ１５２に由来する。いくつかの実施形態では、第１の態様によるベクターが、アタッチメント・サイトａｔｔＰをさらに含む。φＣ３１インテグラーゼ遺伝子ｉｎｔのインテグラーゼは、遺伝子ＡＣＳＰ５０＿６５８９（以前：ＡＣＰＬ＿６６０２）（ｔｅ Ｐｏｅｌｅら、２００８；Ｇｒｅｎら、２０１６）の宿主染色体に局在する２つのアタッチメント・サイト：ベクター上に局在するａｔｔＰとａｔｔＢ、の標的および一方向の組換えを触媒することにより、異なるゲノム位置での宿主染色体へのベクターの組込みを媒介する。理論に束縛されるものではないが、組込み後、ベクターは、ａｔｔＰ－ａｔｔＢ組換えに由来するアタッチメント・サイト左（ａｔｔＬ）および右（ａｔｔＲ）に隣接する（ｔｅ Ｐｏｅｌｅ、ＢｏｌｈｕｉｓおよびＤｉｊｋｈｕｉｚｅｎ、２００８）。

いくつかの実施形態では、ベクターが伝達起点（ｉｎｃＰ）などの伝達起点、および／またはリラクソソーム遺伝子ｔｒａＪなどのリラクソソーム遺伝子を含む。これらの実施形態のいくつかでは、伝達起点（ｉｎｃＰ）などの伝達起点および／またはｔｒａＪなどのリラクソソーム遺伝子がｐＳＥＴ１５２に由来する。伝達起点およびリラクソソーム遺伝子は、ドナー菌株からのプラスミドの伝達を可能にする（例えば、大腸菌ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２（Ｋｉｅｓｅｒら、２０００））。

いくつかの実施形態では、第１の態様によるベクターが高コピー数ＣｏｌＥ１／ｐＭＢ１／ｐＢＲ３２２／ｐＵＣ複製起点（ｏｒｉ）などの複製起点を含む。これらの実施形態のいくつかでは、高コピー数ＣｏｌＥ１／ｐＭＢ１／ｐＢＲ３２２／ｐＵＣ複製起点（ｏｒｉ）などの複製起点がｐＳＥＴ１５２に由来する。高コピー数ＣｏｌＥ１／ｐＭＢ１／ｐＢＲ３２２／ｐＵＣ複製起点（ｏｒｉ）などの複製起点は、クローニング株（大腸菌ＤＨ５αＭＣＲ）およびドナー株（大腸菌ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２）におけるプラスミドの複製を可能にする。

いくつかの実施形態では、第１の態様によるベクターが、少なくとも１つの耐性マーカー、例えば、アプラマイシン耐性を媒介する耐性マーカー（ａａｃ（３）ＩＶ、ａｐｍＲ）を含む。アプラマイシン耐性を媒介する耐性マーカー（ａａｃ（３）ＩＶ、ａｐｍＲ）は、選択のために使用され得る。

第４の態様によるいくつかの実施形態によれば、発現ベクターは、（ａ）配列番号８５によるφＣ３１インテグラーゼ遺伝子ｉｎｔ、（ｂ）配列番号８７による伝達起点（ｉｎｃＰ）、（ｃ）配列番号８８によるリラクソソーム遺伝子ｔｒａＪ、または（ｄ）配列番号８９による高コピー数ＣｏｌＥ１／ｐＭＢ１／ｐＢＲ３２２／ｐＵＣなどのｐＳＥＴ１５２の少なくとも１つのエレメントを含み、さらに、配列番号１０８および配列番号１０９による推定アンチセンスプロモーターを含まない。

第４の態様によるいくつかの実施形態によれば、発現ベクターは、（ａ）配列番号８５によるφＣ３１インテグラーゼ遺伝子ｉｎｔ、および（ｂ）配列番号８７による伝達起点（ｉｎｃＰ）、および（ｃ）配列番号８８によるリラクソソーム遺伝子ｔｒａＪ、および（ｄ）高コピー数ＣｏｌＥ１／ｐＭＢ１／ｐＢＲ３２２／ｐＵＣなどの複製起点、配列番号８９による複製起点（ｏｒｉ）、および（ｅ）配列番号９０によるａａｃ（３）ＩＶ、ａｐｍＲなどの、アプラマイシン耐性を媒介する耐性マーカーなどの、任意に少なくとも１つの耐性マーカー、および（ｆ）任意に少なくとも１つのＴ４－ターミネーター、および（ｇ）任意に、ここで、そのベクターは、配列番号１０８および／または配列番号１０９による推定アンチセンスプロモーターを含まない、を含む。

いくつかの実施形態によれば、ベクターは、配列番号１１０または配列番号１１１に記載の配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクターは、配列番号１１０または配列番号１１１に記載の配列、またはそのフラグメントを含む。

いくつかの実施形態では、ベクターが、異なるプロモーターの組込みを可能にする容易なクローニングメカニズムによって優れている。これにより、系を、さらなる種、例えばアカルボースの産生株に迅速に適合させることができる。

一般的なツールと方法
菌株およびプラスミド
この研究で使用した全ての株を表Ｅ１に列挙する。この研究で使用または作成された組換え株を、表Ｅ２、表Ｅ３および表Ｅ４に挙げる（表Ｅ２にプラスミドベースの発現系、表Ｅ３に大腸菌ＤＨ５αＭＣＲ中でクローン化および保存された欠失および組込み構築物、表Ｅ４にアクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０の欠失および組込み変異体）。

培地・培養条件
特に明記しない限り、すべての化学物質および培地成分は、Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）、ＳＥＲＶＡ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ＧｍｂＨ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＵＳＡ）から得られた。

アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０のグリセロールストックの調製
グリセロールストックの調製のために、アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０（ＡＴＣＣ ３１０４４）を複合培地ＮＢＳ（１１ｇ・Ｌ^－１ グルコース・１Ｈ_２Ｏ、４ｇ・Ｌ^－１ ペプトン、４ｇ・Ｌ^－１ 酵母抽出物、１ｇ・Ｌ^－１ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、２ｇ・Ｌ^－１ ＫＨ_２ＰＯ_４、４ｇ・Ｌ^－１ Ｋ_２ＨＰＯ_４）中で増殖させ、滅菌８６％（ｖ／ｖ）グリセロールと２：３で混合した。グリセロールストックを－８０℃で保存する。

固形培地上での増殖および胞子溶液の調製
胞子形成のために、２００～３００μＬのグリセロールストックを、大豆粉培地（ＳＦＭ－寒天）（２０ｇ・Ｌ^－１大豆粉（ＳＯＢＯ（登録商標）Ｎａｔｕｒｋｏｓｔ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ））、２０ｇ・Ｌ^－１ Ｄ－マンニトール、２０ｇ・Ｌ^－１ Ｂａｃｔｏ（商標）寒天（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、水道水中１６７μＬの１０Ｎ ＮａＯＨ）の寒天プレート上で増殖させた。胞子は、Ｗｏｌｆら（２０１６）によって記載されているように、２８℃で５～７日間インキュベートした後に、綿棒を用いて３ｍｌのｄｄＨ_２Ｏに洗い流すことによって、収穫することができた。

最小培地の調製
マルトース最小培地（７２．０６ｇ・Ｌ^－１ マルトース・１Ｈ_２Ｏ、５ｇ・Ｌ^－１ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１８４ｇ・Ｌ^－１ ＦｅＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ、５．７ｇ・Ｌ^－１ Ｎａ_３Ｃ_６Ｈ_５Ｏ_７・２Ｈ_２Ｏ、１ｇ・Ｌ^－１ ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、２ｇ・Ｌ^－１ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、微量元素（最終濃度：１μＭ ＣｕＣｌ_２、５０μＭ ＺｎＣｌ_２、１ＭＨＣｌに溶解された７．５μＭ ＭｎＣｌ_２）およびｄｄＨ_２Ｏ中に各Ｋ_２ＨＰＯ_４とＫＨ_２ＰＯ_４を５ｇ・Ｌ^－１からなるリン酸緩衝液）を調製し、Ｗｅｎｄｌｅｒら（２０１３年）のプロトコールに従い、フィルター滅菌を行った。

炭素供給源マルトースの代わりについては、マルトース－一水和物に代えて、７９．２ｇ・Ｌ^－１ グルコース・１Ｈ_２Ｏ、７２．０ｇ・Ｌ^－１ Ｃ－ｐｕｒ（Ｃｅｒｅｓｔａｒ ０１９０８、Ｃｅｒｅｓｔａｒ ＧｍｂＨ、Ｋｒｅｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、７１．９ｇ・Ｌ^－１ ガラクトース、６８．４ｇ・Ｌ^－１ セロビオース、７１．９ｇ・Ｌ^－１ Ｄ－アラビノース、７２．０ｇ・Ｌ^－１ Ｄ－ラクトースをそれぞれ用いた。マルトースとグルコースとの混合物を、９０：１０、８０：２０および５０：５０（ｖ／ｖ）の比で調製した。

デンプン培地については、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部、Ｇｅｅｌ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）からの「デンプン可溶性（ｓｔａｒｃｈ ｓｏｌｕｂｌｅ）」の４％（ｗ／ｖ）乳白色溶液を生成した。このために、滅菌水を水浴中で９０℃に予熱し、デンプンの秤量部分を撹拌しながら加えた。その後、残留培地成分を添加した。デンプン培養との比較を可能にするために、同等のＣモル濃度（ここでは４４．４ｇ・Ｌ^－１ マルトース・１Ｈ_２Ｏの正味重量）のマルトース最小培地を作製した。修正剤（ＨＣｌまたはＮａＯＨ）を添加することによって、我々の研究によれば、代謝されないイノシトールを添加することによって、それぞれ炭素供給源マルトースの濃度を変化させることによって、様々なｐＨおよび浸透圧の培地を作製した（データは示さず）。

さらに、１ｇ・Ｌ^－１、２ｇ・Ｌ^－１、３ｇ・Ｌ^－１、４ｇ・Ｌ^－１および５ｇ・Ｌ^－１のＡｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓからの「デンプン可溶性（ｓｔａｒｃｈ ｓｏｌｕｂｌｅ）」を有する最小培地は、限られた炭素供給源での培養のために、作成された。

すべての培地のｐＨおよび浸透圧は、Ｋｎｉｃｋ ＧｍｂＨ（Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のｐＨメーターＣａｌｉｍａｔｉｃおよびＧｏｎｏｔｅｃ ＧｍｂＨ（Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＯｓｍｏｍａｔ ３０００によって、製造業者の説明書に従って決定した。

振盪フラスコ培養
培養は、２５０ｍＬのＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒバッフル付き細胞培養フラスコ中、２８℃および１４０ｒｐｍで７日間、ＧＦＬ振盪インキュベーター３０３２または３０３３（Ｂｕｒｇｗｅｄｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で行った。５０ｍＬ培地の接種には、ＯＤ＝３～５の胞子溶液１ｍＬを使用した。細胞乾燥重量を、Ｗｏｌｆら（２０１７ａ）によって記載されるように決定した。上清を、後の分析のために－２０℃で保存した。

ｍ２ｐ－ｌａｂｓ ＧｍｂＨ（Ｂａｅｓｗｅｉｌｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＢｉｏＬｅｃｔｏｒシステムにおける小型培養
比較増殖実験はガス透過性密封箔（ｍ２ｐ－ｌａｂｓ ＧｍｂＨ、Ｂａｅｓｗｅｉｌｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で覆われた４８ウェルＦｌｏｗｅｒＰｌａｔｅ中で１ｍｌの容積で行い、ｍ２ｐ－ｌａｂｓのＲｏｂｏＬｅｃｔｏｒ（登録商標）で２８℃および８００ｒｐｍで１週間インキュベートした。増殖は、後方散乱シグナルによって記録した。最終細胞乾燥重量の測定のために、各ウェル８００μＬを秤量した反応チューブ（１４，０００ｇ、２分）にサンプリングし、脱イオン水で洗浄し、６０～７０℃で１日間乾燥した。上清を、後の分析のために－２０℃で保存した。

組換えＤＮＡ研究
特に明記しない限り、プラスミド構築およびアセンブリは、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｇｉｂｓｏｎら、２００９）によって行った。フラグメントはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ ｖａｐｏ．ｐｒｏｔｅｃｔ（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）においてＰＣＲ（Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ、ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）によって増幅され、必要に応じて、ＤｐｎＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）で処理された。ＰＣＲ産物およびゲル抽出物の精製を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＧｅｌおよびＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｅｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の使用によって行った。等モル量のＤＮＡフラグメントを、１：４の比でＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘに添加した。マスターミックスは、０．６４μＬのＴ５エキソヌクレアーゼ（１０Ｕ・μＬ^－１、ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）、２０μＬのＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ・μＬ^－１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳ）、１６０μＬのＴａｑ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）、６９９．３６μＬの蒸留水および３２０μＬの等温反応緩衝液（２５％ ＰＥＧ－８０００、１ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００μＬの１Ｍ ＭｇＣｌ_２、１００μＬの１Ｍ ＤＴＴ、２０μＬの各１ｍＭ ｄＮＴＰ、２００μＬのＮＡＤ）からなる。サンプルを５０℃で少なくとも１時間インキュベートし、続いて、Ｂｅｙｅｒら（２０１５）のプロトコールに従って化学的形質転換によって大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５αＭＣＲに移した。大腸菌の選択は、１５ｇ・Ｌ^－１寒天培地（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および５０ｍｇ・Ｌ^－１のアプラマイシン硫酸塩を含むＬｕｒｉａ／Ｍｉｌｌｅｒブロス培地で行った。陽性コロニーを、ＰＣＲおよびゲル電気泳動、ならびに我々の社内シーケンシングコア施設によるＳａｎｇｅｒシーケンシングによって試験した。

ｇｕｓＡレポーター系のためのプラスミドの構築
ｇｕｓＡレポーター系のためのプラスミドの構築については、Ｓｃｈａｆｆｅｒｔら（２０１９）を参照のこと。

新規ｐＳＥＴＴ４発現系の構築
新規ｐＳＥＴＴ４発現系のクローニングのために、Ｂｉｅｒｍａｎら（１９９２）のｐＳＥＴ１５２ベクターをテンプレートとして使用した。ベクターバックボーンをＰＣＲによって線状化した（表Ｅ５）。

ｇａｐＤＨ－プロモーター、ｌａｃ－プロモーターの制御下にあるｌａｃＺ－遺伝子、３つのＴ４ターミネーターに挟まれたいくつかの制限部位からなるクローニングカセットを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｏｗａ、ＵＳＡ）で、ストリングＤＮＡとして並べた。複雑な構造のために、カセットを３つの部分に順序付け、表Ｅ５のプライマーを使用してＧｅｎｅＳＯＥｉｎｇ（Ｈｏｒｔｏｎ、１９９５）によって組み立てた。最後に、バックボーンおよびインサートをＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｇｉｂｓｏｎら、２００９）によって組み立てた。新規ベクター系をｐＳＥＴＴ４ｇａｐと命名した。

ｔｉｐＡプロモーターによるｇａｐＤＨプロモーターの交換のために、供給者の指示に従って、ｐＳＥＴＴ４ｇａｐをＮｄｅＩおよびＫｐｎＩで消化し、エビアルカリホスファターゼで処理した。全ての酵素は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。ｔｉｐＡプロモーターを、プライマーｔｉｐＡ＿ＧＡＦおよびｔｉｐＡ＿ＧＡＲを使用することによってｐＳＥＴＧＵＳ（Ｍｙｒｏｎｏｖｓｋｙｉら、２０１１）から増幅し、Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙによって線状化バックボーンとアセンブリした（Ｇｉｂｓｏｎら、２００９）。ベクターをｐＳＥＴＴ４ｔｉｐと命名した（図６参照）。

新規ｐＳＥＴＴ４発現系における単一遺伝子の過剰発現
単一遺伝子の過剰発現については、インサートをＰＣＲによって増幅した（表Ｅ６）。ベクター（ｐＳＥＴＴ４ｇａｐまたはｐＳＥＴＴ４ｔｉｐ）をＢｓａＩ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）で消化し、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｇｉｂｓｏｎら、２００９）によってインサートとアセンブリした。天然プロモーターの制御下でのａｃｂＢ遺伝子の発現のために、ベクターバックボーンｐＳＥＴ４ｇａｐをＢｓａＩおよびＮｄｅＩで消化し、プロモーターの除去下でのベクターの線状化を導いた。目的の遺伝子および天然のプロモーターを、表Ｅ６のプライマーの使用によって増幅し、そしてＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｇｉｂｓｏｎら、２００９）によってベクターバックボーンとアセンブリした。

ｐＣＲＩＳＰｏｍｙｃｅｓ－２欠失および組込みベクターの構築
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術による欠失および組込み変異体の構築のために、プラスミドｐＣＲＩＳＰｏｍｙｃｅｓ－２（Ｃｏｂｂら、２０１５）を、Ｗｏｌｆら（２０１６）のプロトコールに従って使用した。スペーサーおよびその逆相補体は、メタビオン（ｍｅｔａｂｉｏｎ）ＧｍｂＨ（Ｓｔｅｉｎｋｉｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）またはシグマ－アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に、オーバーラップを有するオリゴヌクレオチドとして注文された（表Ｅ７）。

オリゴヌクレオチドを二本鎖にアニーリングし、Ｃｏｂｂら（２０１５）のプロトコールに従ってＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｅｎｇｌｅｒら、２００８）によってプラスミドとアセンブリした。Ｃａｓ９誘導二本鎖切断の修復のために、ＤＮＡテンプレートをＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｇｉｂｓｏｎら、２００９）によってベクターバックボーンにクローニングした。ＤＮＡテンプレートとして、標的遺伝子の上流および下流（各ラウンド約１ｋＢ）のフランキング配列を、ゲノムＤＮＡからＰＣＲ（表Ｅ８）により増幅した。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術による遺伝子ｃｇｔの欠失
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ９）によるΔｃｇｔ（ΔＡＣＳＰ５０＿５０２４）欠失変異体の構築には、プラスミドｐＣＲＩＳＰｏｍｙｃｅｓ－２を用いた（Ｃｏｂｂら、２０１５）。スペーサー配列は、Ｗｏｌｆら（２０１６）に従って選択し、メタビオンＧｍｂＨ（Ｓｔｅｉｎｋｉｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）（ｓｐａｃｅｒ＿１：５’－ａｃｇｃＡＧＣＧＴＣＧＣＣＣＧＣＴＧＧＧＡＧＡＡ－３’、ｓｐａｃｅｒ＿２：５’－ａａａｃＴＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＧＧＣＧＡＣＧＣＴ－３’）に、その逆相補体と共にオリゴヌクレオチドとして注文された。オリゴヌクレオチドを二本鎖にアニーリングし、Ｃｏｂｂら（２０１５）（Ｃｏｂｂら、２０１５）のプロトコールに従って、ＢｓａＩ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用することにより、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｅｎｇｌｅｒら、２００８）によってプラスミドとアセンブリした。Ｃａｓ９誘導二本鎖切断の修復のために、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）テンプレートを、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｇｉｂｓｏｎら、２００９）によってＸｂａＩ線状化ベクターにクローニングした。ＤＮＡテンプレートとして、標的遺伝子の上流および下流（各ラウンド約１ｋＢ）のフランキング配列を、ＧＣバッファーを有するＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）（プライマー配列：ｃｇｔ＿ｆｌａｎｋ１＿ｆｗ：５’－ｔｃｇｇｔｔｇｃｃｇｃｃｇｇｇｃｇｔｔｔｔｔｔａｔＣＣＧＧＴＡＣＣＣＴＧＣＴＣＣＴＣＧＴＣ－３’、ｃｇｔ＿ｆｌａｎｋ１＿ｒｖ：５’－ｇｔｇａｃｇｃａｔｔｇａｃｇｃａｇｇｔｃＧＡＧＧＧＡＴＡＴＧＧＣＴＣＡＧＡＴＡＣ－３’、ｃｇｔ＿ｆｌａｎｋ２＿ｆｗ：５’－ｇｔａｔｃｔｇａｇｃｃａｔａｔｃｃｃｔｃＧＡＣＣＴＧＣＧＴＣＡＡＴＧＣＧＴＣＡＣ－３’、ｃｇｔ＿ｆｌａｎｋ２＿ｒｖ：５’－ｇｃｇｇｃｃｔｔｔｔｔａｃｇｇｔｔｃｃｔｇｇｃｃｔＡＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＴＧＧ－３’）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙの場合、ＤＮＡフラグメント（ｆｌａｎｋ＿１：１１０１ｂｐおよびｆｌａｎｋ＿２：９８２ｂｐ）を、０．６４μＬのＴ５エキソヌクレアーゼ（１０ Ｕ／μＬ、ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）、２０μＬのＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μＬ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳ）および１６０μＬのＴａｑ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（４０ Ｕ／μＬ ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）、６９９．３６μＬの蒸留水および３２０μＬの等温反応緩衝液（２５％ ＰＥＧ－８０００、１ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００μＬの１Ｍ ＭｇＣｌ_２、１００μＬの１Ｍ ＤＴＴ、２０μＬの各１ｍＭ ｄＮＴＰ、２００μＬ ＮＡＤ）からなるＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘに１：４の比率で等モル添加した。５０℃で少なくとも１時間インキュベートした後、反応混合物を、大腸菌ＤＨ５αＭＣＲに、（Ｂｅｙｅｒら、２０１５）のプロトコールに従って化学的形質転換によって移した。大腸菌の増殖および選択は、５０ｍｇ・Ｌ^－１のアプラマイシン硫酸塩を補充した１５ｇ・Ｌ^－１寒天培地ＫｏｂｅＩ（両方：Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含むＬｕｒｉａ／Ｍｉｌｌｅｒブロス（ＬＢ培地）上にそれらをプレーティングすることによって行った。プレートを３７℃で１０～１４時間インキュベートした。アプラマイシン耐性コロニーをＰＣＲ法およびゲル電気泳動法により１回目、２回目を我々の社内シーケンスコア施設によるＳａｎｇｅｒシーケンスによって試験した（ＰＣＲ用プライマー配列：ｆｏｒ：５’－ＧＧＣＧＴＴＣＣＴＧＣＡＡＴＴＣＴＴＡＧ－３’、ｒｅｖ：５’－ＴＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＧＡＣＴＴＧＡＧＣ－３’、シークエンシング用ウォーキングプライマー：ｗ１：５’－ＣＧＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣ－３’、ｗ２：５’－ＧＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧ－３’、ｗ３：５’－ＴＣＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＣＣＧＧＡＧ－３’））。

アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０への接合伝達
コンピテントアクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０細胞を、新たに増殖させたＮＢＳ培養物から調製した（上記を参照のこと）。細胞を１０％（ｗ／ｖ）氷冷スクロースで２回、氷冷１５％（ｖ／ｖ）グリセロールで２回洗浄した。最後に、細胞を１５％（ｖ／ｖ）氷冷グリセロール（約４倍容量の細胞ペレットを添加することにより）に取り、反応管中で１００μＬに等分し、液体窒素中で急速凍結した。コンピテントアクチノプラネス細胞は－８０℃で保存される。

接合のために、大腸菌ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２（Ｋｉｅｓｅｒら、２０００）を使用した。所望の構築物を大腸菌ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２にＢｅｙｅｒら（２０１５）に従って移し、そして５０ｍｇ・Ｌ^－１のアプラマイシン－硫酸塩、５０ｍｇ・Ｌ^－１のカナマイシン－硫酸塩および１５ｍｇＬ^－１のクロラムフェニコールを補充したＬＢ寒天プレート上で選択した後、細胞を液状培養物（同じ補充物を含むＬＢ－培地）中で増殖させ、そして０．４～０．６の光学濃度で回収した。細胞を氷冷ＬＢ培地で２回洗浄し、アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０のコンピテント細胞と混合した。細胞懸濁液をＳＦＭ寒天プレート上にプレーティングした。２８℃で２０～２４時間インキュベートした後、ｄｄＨ_２Ｏに溶解した５００ｍｇ・Ｌ^－１のアプラマイシン硫酸塩１ｍＬを滅菌綿棒で平板上に分配した。アクチノプラネス属種（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．）ＳＥ５０／１１０の最初の接合完了体（ｅｘｃｏｎｊｕｇａｎｔｓ）は、１週間後に観察することができる。接合完了体を、５０ｍｇ・Ｌ^－１のアプラマイシン－硫酸塩を補充したＳＦＭ寒天平板に移した。大腸菌由来のアクチノプラネス接合完了体を精製するために、何回か繰り返しストリーキングを行う。この過程を促進するために、５０ｍｇ・Ｌ^－１のホスホマイシンまたはトリメトプリムを培地に補充してドナー株を除去することができる。

アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０のマーカーフリーＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９欠失／組込み変異体を得るためのプラスミド硬化
プラスミド硬化を、Ｗｏｌｆら（２０１６）のプロトコールに従って、高温での複合培地ＮＢＳ中での培養によって行った。コロニーを、アプラマイシン含有およびアプラマイシン不含ＳＦＭプレート上での並列のストリーキングによって、プラスミドの存在について試験した。アプラマイシン感受性エキソ接合完了体を、ＰＣＲによって欠失について試験した（プライマー配列データは示さず）。ＰＣＲフラグメントをゲルから切り出し、我々の社内Ｓａｎｇｅｒシーケンシングコア施設によってシーケンスした。

さらに、オフターゲット効果を排除するために、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ技術（Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）により、欠失または組込み変異体のゲノムＤＮＡもシーケンスした。このために、ＮＢＳ増殖培養物のゲノムＤＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ＤＮＡキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｅｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて単離した。ライブラリーを、ライゲーションキット（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）による１ＤゲノムＤＮＡの助けを借りて調製した。

シトシンデアミナーゼＣｏｄＡとの相同組換えと対抗選択に基づく欠失系
ａｃｂ遺伝子クラスターの遺伝子へのベクター組込みは、複製ベクターｐＫＣ１１３９の使用によって起こっている。この観察に基づいて、相同組換えを使用する新規欠失系を開発し、遺伝子ｃｇｔ（ＡＣＳＰ５０＿５０２４）の例によって試験した。

伝達起点（ｎｃＰ）とリラクソソーム遺伝子ｔｒａＪを備えたベクターバックボーンを用いて、アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０への接合を可能にした。本研究では、アプラマイシンとカナマイシン耐性を媒介する２つの異なった抗菌薬耐性マーカー：すなわちａｐｈ（３’）ＩＩ（ｋａｎ^Ｒ、カナマイシン）とａａｃ（３）ＩＶ（ａｐｍ^Ｒ、アプラマイシン）を選択するために試験した。さらに、高コピー数ＣｏｌＥ１／ｐＭＢ１／ｐＢＲ３２２／ｐＵＣ複製起点を組込み、ドナー株Ｅ．ｃｏｌｉでの複製を可能にした。ｏｒｉ、ｏｒｉＴ_ｎｃＰ、ｔｒａ遺伝子および耐性カセットを、ｐＲＴ８０２、ｐＲＴ８０１（Ｇｒｅｇｏｒｙら、２００３）からそれぞれ採取した。アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０では複製のためのレプリコンも、付着部位をもつインテグラーゼ遺伝子のどちらも新しい欠失システムには含まれていないので、ベクターは相同組換えによってゲノムに組込まれたときにのみアクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０で維持することができる（図７）。このために、遺伝子ｃｇｔに隣接する２ｋＢの相同配列が組込まれた。アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０における接合伝達後、最初のクロスオーバーが起こった変異体をアプラマイシンまたはカナマイシン耐性によって選択することができる。ベクターバックボーンの脱組込み（第２のクロスオーバー）を強制するために、５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）を添加し、これをシトシンデアミナーゼＣｏｄＡによって毒性産物５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）に変換する。この研究では、ストレプトマイセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｓｐ）についてコドン最適化されたｃｏｄＡを使用する（Ｄｕｂｅａｕら、２００９）。２回目のクロスオーバーの後、野生型の遺伝子型か欠失変異体の遺伝子型のどちらかが存在する。

新規欠失系は、コロニーＰＣＲおよびＯＮＴ－シーケンシングにより示された遺伝子ｃｇｔの試験に成功した。２回目のクロスオーバーが成功した後の欠失変異体の割合は２５～３２％であった。ワークフローを図８に示す。

分析方法
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による上清からのアカルボース定量
アクチノプラネス属種のマルトース増殖培養物の上清を、遠心分離し（２０，０００ｇ、２分）、ボルテックスによりメタノールと１：５で混合し、再び遠心分離して沈殿を除去した（２０，０００ｇ、２分）。サンプルをＨＰＬＣバイアルに移し、ＨＰＬＣシステム１１００シリーズのＡｇｉｌｅｎｔ（Ｇ１３１２Ａ Ｂｉｎａｒｙ Ｐｕｍｐ Ｓｅｒｉａｌ＃ＤＥ４３６１６３５７、Ｇ１３２９Ａ ＡＬＳオートサンプラーＳｅｒｉａｌ＃ＤＥ４３６１３／１０、Ｇ１３１５Ａダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）Ｓｅｒｉａｌ＃ＤＥ７２００２４６９）で分析した。固定相として、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）のＨｙｐｅｒｓｉｌ ＡＰＳ－２カラム（１２５×４ｍｍ、３μｍ粒径）を使用し、４０℃に加熱した。移動相として、１ｍＬ・ｍｉｎ^－１の６８％アセトニトリル（溶媒Ｂ）および３２％リン酸緩衝液（０．６２ｇ・Ｌ^－１ＫＨ_２ＰＯ_４および０．３８ｇ・Ｌ^－１Ｎａ_２ＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ）（溶媒Ａ）の定組成流を適用した。４０μＬの各サンプルを注入し、１０分間の操作で分離した。アカルボースの検出はＤＡＤ検出器を用いて２１０ｎｍ（参照３６０ｎｍ）で行い、検量線のピーク面積から定量した。

液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）
細胞内代謝物の分析用サンプルの調製
アクチノプラネス種ＳＥ５０／１１０株の３連を、マルトース最小培地中で少なくとも４日間増殖させた。１０ｍＬの培養物をブフナーロートでろ紙を通して迅速にろ過し、２．６３ｇ・Ｌ^－１のＮａＣｌ水溶液で洗浄した。細胞を予め秤量した丸底スクリューキャップチューブに移し、液体窒素中で急速凍結し、－８０℃で保存した。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ （Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）の遠心分離エバポレーター（ＳｐｅｅｄＶａｃ）で細胞を一晩乾燥させ、４ｍｇの乾燥細胞を、サイズ０．１ｍｍ、０．０５ｍｍおよび０．０１ｍｍのジルコニア／シリカマイクロビーズの混合物（約５００μＬ）を含む丸い２ｍＬスクリューキャップチューブ（Ｂｉｏ Ｓｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．、Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、ＵＳＡ）に移し、７００μＬの８０％ＭｅＯＨを細胞およびビーズに添加した。ホモジナイザー（ＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１２０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）中で、速度設定６．５で３０秒間３回細胞破壊を行った。サンプルをその間に氷上で５分間冷却した。細胞懸濁液を１３，０００ｇおよび４℃で５分間遠心分離した。５００μＬの上清をＨＰＬＣバイアルに移し、窒素流下で乾燥させ、５０μＬの蒸留水に取った。

細胞外アカルビオシル代謝物の分析用サンプル調製
サンプル調製は、Ｏｒｔｓｅｉｆｅｎ（２０１６）によって記載されたプロトコールに従って行った。Ｃｈｒｏｍａｂｏｎｄ（登録商標）Ｅａｓｙカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｅｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、ＲＥＦ ７３０７５３）を用いた固相抽出によって、上清１０ｍＬから糖および偽糖を濃縮した。カラムを３ｍＬのメタノールで平衡化し、その後、３ｍＬの蒸留水で洗浄した後、サンプルを充填した。非特異的結合代謝産物を３ｍＬの９５％（ｖ／ｖ）メタノールで洗浄した。溶出は、３ｍＬのメタノールで行った。

細胞内および細胞外代謝物のＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ
ＬＣ－ＭＳのために、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源を備えたマイクロＴＯＦ－Ｑハイブリッド四重極／飛行時間型質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に連結されたＬａＣｈｒｏｍＵｌｔｒａ（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．、ＵＫ）ＨＰＬＣシステムを使用した。

細胞内代謝産物の分析のために、２μＬのサンプルを、ＳｅＱｕａｎｔ（登録商標）ＺＩＣ（登録商標）－ｐＨＩＬＩＣ ５μｍポリメリックカラム（１５０×２．１ｍｍ）（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で分離した。溶出液Ａ（２０ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３、ｐＨ９．３、アンモニア水溶液で調整）および溶出液Ｂ（アセトニトリル）を、以下の勾配を用いて０．２ｍＬ・分^－１の流速で適用した：０分 Ｂ：９０％、３０分 Ｂ：２５％、３７．５分 Ｂ：２５％、４０．０分 Ｂ：８０％。

ピーク同定のための標準として、２μＬの１０μＭのＵＤＰ－グルコース、グルコース－１－リン酸、ガラクトース－１－リン酸、グルコース－６－リン酸およびｄＴＤＰ－グルコースを注射した。

細胞外アカルビオシル代謝産物の分析のために、１０μＬのサンプルをＣｏｇｅｎｔ Ｄｉａｍｏｎｄ Ｈｙｄｒｉｄｅ（商標）ＨＰＬＣカラム（ＭｉｃｒｏＳｏｌｖ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；１５０ｍｍ×２．１ｍｍ；３μＬ粒径）で分離した。溶出液Ａ（５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、５０％（ｖ／ｖ）Ｈ_２Ｏおよび０．１％（ｖ／ｖ）蟻酸）および溶出液Ｂ（９０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、１０％（ｖ／ｖ）Ｈ_２Ｏおよび０．１％（ｖ／ｖ）蟻酸）を、以下の勾配を用いて０．４ｍＬ・分^－１の流速で適用した：０分 Ｂ：１００％、８分 Ｂ：０％、１３分 Ｂ：０％、１５．５分 Ｂ：１００％、１８分 Ｂ：１００％。

ＥＳＩ源は、細胞内代謝産物の分析のために負イオン化モードで操作され、細胞外アカルビオシル代謝産物の分析のために正イオン化モードで操作された。乾燥ガスおよびキャピラリーの温度を１８０℃に設定した。ＭＳのスキャン範囲は、２００～１，０００ｍ／ｚ（細胞内代謝物）、それぞれ５０～３，０００ｍ／ｚ（細胞外アカルビオシル代謝物）に設定した。

特定質量のピーク面積は、ソフトウェアＣｏｍｐａｓｓ（商標）（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて統合した。ピークは、乾燥細胞（細胞内代謝産物）の秤量量、それぞれサンプリング時の細胞乾燥重量（細胞外アカルビオシル代謝産物）で標準化した。

カロテノイドの抽出と分析
抽出
アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０由来の細胞ペレットを、サイズ０．１ｍｍ、０．０５ｍｍおよび０．０１ｍｍのジルコニア／シリカマイクロビーズの混合物（Ｂｉｏ Ｓｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ、Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、ＵＳＡ）約５００μＬと共に２ｍＬスクリューキャップチューブに移した。抽出溶媒として１ｍＬのアセトンまたはメタノールを加えた。ホモジナイザー（ＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１２０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）中で、速度設定６．５で３回４５秒間、細胞破壊を行った。サンプルをその間に氷上で５分間冷却した。ホモジナイズした細胞懸濁液を、１３，０００ｇおよび４℃で２０分間遠心分離した。上清をガラスバイアルに移した。ＨＰＬＣ分析のために、アセトン抽出物とメタノール抽出物の混合物を７：３の比率で生成し、新規なガラスバイアルに移した。

薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）およびスペクトル分析
５０μＬの抽出されたカロテノイドを、シリカゲルマトリックス（ＨＰＴＬＣ－ＨＬ、Ｃａｔ．５８０７７、Ａｎａｌｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗａｒｋ、ＵＳＡ）上に５μＬステップで適用し、１００ｍＬの石油、１１ｍＬのイソプロパノールおよび５０μＬの水で満たされたＴＬＣチャンバー中でインキュベートした。操作は暗所で行った。ＴＬＣプレートを乾燥させた後、バンドをメスで剥ぎ取り、新しいチューブに移した。１ｍＬのエタノールを添加した後、吸収スペクトルを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）のＧｅｎｅｓｙｓ １０Ｓ ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計を使用して分析した。

吸光度スキャンによるカロテノイドのＨＰＬＣ分析
ＵＶ－Ｖｉｓスペクトルのためのダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）を含むＡｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ、Ｂｏｅｂｌｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、Ｈｅｎｋｅら（２０１７）およびＨｅｉｄｅｒら（２０１４）に従って、逆相ＨＰＬＣによってカロテノイドを分離した。２０μＬのサンプル体積を０．５ｍＬ・分^－１の流量に適用した。固定相として、前に記載したように（Ｈｅｉｄｅｒら、２０１４；Ｈｅｎｋｅら、２０１７）、ＣＳ ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｅＳｅｒｖｉｃｅ ＧｍｂＨ（Ｌａｎｇｅｒｗｅｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からのプレカラム（１０×４ｍｍ ＭｕｌｔｏＨｉｇｈ １００ ＲＰ１８－５）およびメインカラム（ＰｒｏｎｔｏＳＩＬ ２００－５ Ｃ３０、２５０×４ｍｍ）を使用した。

以下の勾配を適用した：０分 Ａ：１００％、３２分 Ａ：７５％、４７分 Ａ：０％、７０分 Ａ：０％、７５分 Ａ：１００％、溶出液Ａは、１５：８５（ｖ／ｖ）の比の脱イオン水中の０．１Ｍ酢酸アンモニウムおよびメタノールからなる。溶出液Ｂは、４４：４３：１３（ｖ／ｖ）の比のメタノール、アセトニトリルおよびアセトンの混合物からなる。カロテノイドの検出は４７０ｎｍで行った。加えて、３６０ｎｍ～７００ｎｍの間の波長走査が、操作中に毎秒実施された。

アッセイ
グルクロニダーゼ活性の分光光度測定によるプロモータースクリーニング実験
２つの異なるタイプのグルクロニダーゼアッセイを行った：１つはタンパク質生抽出物を用い、１つは細胞全体を用いた。Ｈｏｒｂａｌら（２０１３）およびＳｉｅｇｌら（２０１３）によって記載されたプロトコールは、アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０に適合された。基質ｐ－ニトロフェニル－Ｄ－グルクロニドが我々のアッセイ条件下で解離することが判明したので、基質５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－グルクロニド（Ｘ－Ｇｌｕｃ、ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を選択した。

増殖条件およびサンプル調製
ｇｕｓＡ遺伝子を有するプロモーター構築物を有するアクチノプラネス変異体を、上記のように、マルトース最小培地中で１週間培養した。アッセイは、増殖期の間に行った。５００μＬの各培養物を、細胞全体を用いたアッセイのためにサンプリングした。タンパク質生抽出物を用いたアッセイのために１ｍＬをサンプリングし、０．１ｍｍおよび０．０５ｍｍのサイズのジルコニア／シリカマイクロビーズ（Ｂｉｏ Ｓｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．、Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、ＵＳＡ）を含有するスクリューキャップチューブに移した。ホモジナイザー（ＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１２０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）中で、速度設定６．５および３０秒間で２回（その間の氷上で５分）、細胞を破壊した。遠心分離後、溶解物を新しい反応管に移し、遠心分離した。上清を無細胞アッセイに使用した。総タンパク質定量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（上記参照）によって行った。

グルクロニダーゼ（ｇｕｓ）アッセイ
ｇｕｓアッセイは、黒色マイクロタイタープレート（９６ウェルＰＳ Ｆ－ｂｏｔｔｏｍ μＣＬＥＡＲ、黒色、ｍｅｄ．ｂｉｎｄｉｎｇ、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、Ｋｒｅｍｓｍｕｅｎｓｔｅｒ、Ｏｅｓｔｅｒｒｅｉｃｈ、ＲＥＦ ６５５０９６）中で実施した。１００μＬの各サンプル（細胞懸濁液または溶解物のいずれか）を３つのウェルにピペットで移し、そのうちの１つを陰性対照とし、２つを技術的反復試験とした。ｇｕｓ緩衝液（５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０（５．１３６ｇ・Ｌ^－１Ｎａ_２ＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、３．２９９ｇ・Ｌ^－１ＮａＨ_２ＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ）、５ｍＭ ＤＴＴおよび０，１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００と共に）は、２ｍＭ基質Ｘ－Ｇｌｕｃ（ストックソリューション：ＤＭＦ中で０．２Ｍ）で補完された。１００μＬがサンプルの１００μＬに追加された。陰性対照については、基質を含まない１００μＬのｇｕｓ緩衝液を添加した。各試料の個々の陰性対照の他に、培地および基質対照も調製した。

マイクロタイタープレートを、予め温めたＴｅｃａｎリーダーＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００（Ｒｅｆ ３００１６０５６、Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ ＡＧ、Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）（３７℃）中で、それぞれ３時間（全細胞を用いたアッセイ）、２時間（溶解物を用いたアッセイ）測定した。インジゴの吸収極大を６１０および６６０ｎｍで測定した。全ての対照の吸収値を割り引いた後、各吸収曲線の勾配を線形回帰により計算し、細胞乾燥重量（細胞全体でのアッセイ）または全タンパク質量（溶解物でのアッセイ）のいずれかで正規化した。正規化勾配を用いて、異なる変異体におけるβ－グルクロニダーゼ活性を比較した。
Ｂｉｏｌｏｇ（登録商標）ＯｍｎｉＬｏｇ表現型マイクロアレイシステムにおけるスクリーニング実験
異なる炭素源（パネルＰＭ１およびＰＭ２）での呼吸を評価するために、Ｂｉｏｌｏｇ（登録商標）ＯｍｎｉＬｏｇ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）においてプレスクリーニング実験を行った。アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０野生型および欠失変異体Δｃｇｔを、本明細書の他の箇所に記載されるように、ＳＦＭ寒天プレート上で増殖させた。細胞を、滅菌綿棒の使用によって収集し、そしてＰＭ１およびＰＭ２について接種流体ＩＦ－０ａで希釈した。製造者のプロトコールに従って、Ｂｉｏｌｏｇ（登録商標）の濁度計において８０％の透過率を達成するために、細胞懸濁液の濁度をチェックした。２．３２ｍＬの細胞懸濁液を、製造者のプロトコールに従って、２０ｍＬのＩＦ－０ａ、０．２４ｍＬの０．５Ｍ ＭｇＣｌ_２、０．２４ｍＬの０．５Ｍ Ｎａ_２ＳＯ_４、０．２４ｍＬの０．５Ｍ ＮＨ_４Ｃｌ、０．２４ｍＬの１．０Ｍ Ｎａ_３ＰＯ_４、０．２４ｍＬの蒸留水、０．２４ｍＬのＢｉｏｌｏｇ ｒｅｄｏｘ ｄｙｅ ｍｉｘ Ｇ、および０．２４ｍＬのメタルイオンカクテル（それぞれ５．０ｍＭ：ＺｎＣｌ_２・７Ｈ_２Ｏ、ＦｅＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ）に添加した。ＰＭパネルに、調製した溶液１００μＬ／ウェルを接種し、ＯｍｎｉＬｏｇシステム（Ｍｏｄｅ ７１０００ Ｓｅｒｉａｌ＃４０６）中で２８～３０℃で１週間インキュベートした。データ評価は、製造業者のソフトウェア（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｂｉｏｌｏｇ ａｎｄ Ｏｍｎｉｌｏｇ ２．３、Ｂｉｏｌｏｇ）を用いて行った。

ＲＮＡ研究
サンプリングとＲＮＡ単離
トランスクリプトーム分析のために、２×１ｍＬ培養物を増殖期の間に採取し、遠心分離（１０秒）によって上清から分離し、液体窒素中で急速凍結した。ペレットを、さらなる処理まで－８０℃で保存した。

リボ核酸（ＲＮＡ）の単離のために、凍結細胞ペレットを５００μＬのＬＢ緩衝液（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ Ｐｌｕｓ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｅｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に再懸濁し、２ｍＬの溶解マトリックスチューブ（０．１ｍｍ球状シリカビーズ、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｓａｎｔａ Ａｎａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）に移した。ホモジナイザー（ＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１２０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）中で、速度設定６．５で２０秒間３回（その間の氷上で５分）、細胞破壊を行った。続いて、細胞懸濁液を１３，０００ｇおよび４℃で５分間遠心分離した。上清を、オンカラムＤＮＡ消化のために、ｒＤＮａｓｅ Ｓｅｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｅｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と組み合わせたＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ Ｐｌｕｓキットを使用するＲＮＡ抽出のために使用した。製造業者のプロトコールに従って洗浄および溶出を行った後、ＤＮＡ消化を（溶液中で）繰り返し、同じキットを使用してサンプルを再び洗浄した。アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０のゲノムＤＮＡに結合し、約２００～３００ｎｔで小さいフラグメントを増幅する２つのプライマー対を用いて、サンプルを残留ＤＮＡについて試験した。必要であれば、ＤＮＡ消化とＲＮＡクリーンアップを繰り返した。ＲＮＡの量をＮａｎｏＤｒｏｐ １０００分光計（Ｐｅｑｌａｂ、Ｅｒｌａｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で分析した。

逆転写定量ＰＣＲ
逆転写定量ＰＣＲを、ＳｅｎｓｉＦａｓｔ ＳＹＢＲ Ｎｏ－Ｒｏｘ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐキット（Ｂｉｏｌｉｎｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）および９６ウェルライトサイクラープレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｎｕｅｍｂｒｅｃｈｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ９６ Ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｒｏｃｈｅ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において、Ｗｏｌｆら（２０１７ａ）のプロトコールに従って行った。総ＲＮＡ（１００ｎｇ）に対して相対ＲＮＡ量を正規化し、２^－ΔＣｑとして計算した。ΔＣｑは、対照株と比較した突然変異株における平均Ｃｑの差である。表Ｅ９のプライマーを、遺伝子の相対転写の決定に使用した。

全ゲノムオリゴヌクレオチドマイクロアレイ
全ゲノムオリゴヌクレオチドマイクロアレイを、Ｗｏｌｆら（２０１７ａ）のプロトコールに従って実施し、このプロトコールは、ハイブリダイゼーション手順をアクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０の高いＧ＋Ｃ含量に適合させた。

３連のＲＮＡを単離し、等モルプールした（１２μＬ中の５μｇプールＲＮＡの総量）。ｃＤＮＡ合成、標識、およびマイクロアレイハイブリダイゼーションのために、Ｗｏｌｆら（２０１７ａ）によって記載される実用的な調整を伴う製造業者の指示に従って、Ｔｗｏ－Ｃｏｌｏｒ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ－Ｂａｓｅｄ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＦａｉｒＰｌａｙ ＩＩＩラベリングキット（Ｖｅｒｓｉｏｎ １．４、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用した。Ａｍｅｒｓｈａｍ ＣｙＤｙｅモノ反応性染料パック（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）をラベリングに用いた。アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０のコードシーケンスを表すカスタム全ゲノムオリゴヌクレオチドマイクロアレイが使用され、これは、Ｗｏｌｆら（２０１７ａ）によって設計された（４ｘ４４Ｋフォーマット、８，２３８個の遺伝子および１，４１７個のコントロールスポットを表す４３，８０３個の機能、供給者：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）。ハイブリダイゼーションオーブンおよびスキャナーを含む全てのマイクロアレイ特異的試薬およびデバイスは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）から使用された。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．７．３．１（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を特徴抽出に使用した（プロトコールＧＥ２＿１０７＿Ｓｅｐ０９）。ＬＯＷＥＳＳ正規化および統計解析を含むその後のデータ解析は、マイクロアレイおよび遺伝子発現（ＭＡＧＥ）準拠システムＥＭＭＡ ２（Ｄｏｎｄｒｕｐら２００９）の使用により実施した。０．０５のｐ値を有意のカットオフとして使用した。０．０１の誤検出率についてのＭ値カットオフは、Ｗｏｌｆら（２０１７ａ）によって行われた以前の「黄色実験（ｙｅｌｌｏｗ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）」に従って、１．１および－１．１と決定された。

Ｃｇｔの機能的関連性の分析
真正細菌世界におけるシングルドメインＣＢＭ－２０タンパク質の分布
本発明者らは、ＢｌａｓｔＰ分析によって、原核生物の世界におけるＣＢＭ－２０単一ドメインタンパク質の分布を分析した。

簡単に述べると、特異的ＣＢＭ－２０ドメインタンパク質の分布を、ＮＣＢＩ非冗長性タンパク質データベースを使用するＢｌａｓｔＰ分析によって分析した（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、２００５；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０）。ＣＢＭ－２０ドメインは種々の異なるタンパク質および酵素中に存在するので、データフィルタリングを実施しなければならなかった：最初の３，３１６ ＢｌａｓｔＰヒットのうち、真核生物起源のすべておよび機能特異的アノテーションを有するか、または３５０アミノ酸を超えるサイズを有するすべての酵素を除外した。残りの８０のＢｌａｓｔＰヒットのドメイン構造を分析した（Ｍａｒｃｈｌｅｒ－Ｂａｕｅｒら、２０１７；Ｍａｒｃｈｌｅｒ－ＢａｕｅｒおよびＢｒｙａｎｔ、２００４；Ｍａｒｃｈｌｅｒ－Ｂａｕｅｒら、２０１５；Ｍａｒｃｈｌｅｒ－Ｂａｕｅｒら、２０１０）。これらの大部分、合計５３のタンパク質は、グリコ－ヒドロ－７７－スーパーファミリー４－アルファ－グルカノトランスフェラーゼとして記述されるより高いドメインによって横断される２つのＣＢＭ－２０ドメインを含む。１０個は異なる追加ドメインを含む：それらのうち５個はアルファ－アミラーゼ阻害剤ドメイン、２個はそれぞれＣＢＭ－２５、Ｎ末端のＣＢＭ－２６結合ドメイン、おそらく調節機能を有するＩＰＴスーパーファミリーの２個のＮ末端ドメイン、および１個はいくつかのアルファ－アミラーゼで起こることが記載されているＤＵＦ１３９３ドメインである（ＮＣＢＩデータベースから得られた情報）。これらの候補も除外した。１８の候補（アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０由来のＣｇｔを含む）のみが、特異的ＣＢＭ－２０ドメインを示した。ＢｌａｓｔＰ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、２００５）によって行われた多重シーケンスアラインメントに基づいて、ＮＣＢＩデータベース（ＮＣＢＩデータベース）のＢｌａｓｔ ｔｒｅｅ ｖｉｅｗ １．１７．５によってタンパク質ツリーを作成した。

興味深いことに、特異的ＣＢＭ－２０ドメインタンパク質は、１７の他の種においてのみ見出された（図９）。これらの大部分は、放線菌目の種、たとえばアクチノプラネス属のすべての株に見られる。１７種の大部分は元々土壌および環境サンプルから分離され、すなわち、Ａ．ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ（ＰａｒｅｎｔｉおよびＣｏｒｏｎｅｌｌｉ、１９７９により記載）、Ａ．ｕｔａｈｅｎｓｉｓ（ＰａｒｅｎｔｉおよびＣｏｒｏｎｅｌｌｉによって記載された（１９７９）、ならびにＣｏｕｃｈによって初めて単離された（１９６３））、Ａ．ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ（Ｗｉｎｋら、２００６年）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．９４（Ｃｈｕら、１９９６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＯＫ８８５（根から分離、Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ、ＵＳＡ、ＮＣＢＩ（ＮＣＢＩデータベース）のＧｅｎＢａｎｋ（Ｂｅｎｓｏｎら、２０１３）から取った情報）、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ（Ｎｏｌａｎら、２０１０年）、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｓｃｌｅｒｏｔｉａｌｕｓ（ｓｙｎ．Ｃｈａｉｎｉａ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃａ）（Ｔｈｉｒｕｍａｌａｃｈａｒ、１９５５年）、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐＢ６（Ｐｉｃｃｉｎｎｉら、２０１６年）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐＰ２２（Ｈａｎａｋら、２０１４）、蒸留所廃棄物処理場の汚泥から分離されたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐＤＭＨＣ １０（Ｋａｍａｌａｓｋａｒら、２０１０）である。ＣＢＭ－２０タンパク質は、サンプル採取位置が報告されていないＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＤＩ１６６や、シュードモナス科（ｆａｍｉｌｙ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）の複数種にも存在する。それらは、土壌に生息する構成員を含むことが知られている属に属する。

土壌または環境との直接的な関連なしに特異的ＣＢＭ－２０タンパク質を保有する株は、ヒト病原体Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（Ｔｈｏｍｓｏｎら、２００８）およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ（ＲｙａｎおよびＢｙｒｄ、２０１８；ＭｏｏｒｅおよびＦｒｅｒｉｃｈｓ、１９５３）の特異的分離株と同様に、まれにしか発生しない。

イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）アッセイによるデンプン結合機能の確認
ＣＢＭ－２０ドメインは、デンプン結合機能を有することが記載されており、本発明者らは、これをイン・ビトロアッセイによって試験することを望んだ。小さな炭水化物結合タンパク質ＣｇｔはＮ末端シグナルペプチド（Ｗｅｎｄｌｅｒら、２０１５ａ）のために細胞外空間において高度に発現され、濃縮されるので、タンパク質は、濾過によって上清から直接濃縮され得る。デンプン結合アッセイを、異なる濃度のジャガイモ由来のデンプンを用いて行った。デンプン画分および上清の両方を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。すべてのデンプン画分（デンプンの１～１０％（ｗ／ｖ）の範囲）において、約１５ｋＤＡのタンパク質バンドが検出され、これはＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによってＣｇｔとして明確に同定された。対照的に、上清画分は、Ｃｇｔによってほぼ完全に枯渇した。上清中の残留Ｃｇｔが見出され、添加されたデンプンがＣｇｔによって完全に飽和されたことを示した。デンプンを含まない陰性対照では、Ｃｇｔの大部分が上清画分に残存する。Ｃｇｔに加えて、未知の機能の別の小さな細胞外タンパク質、ＡＣＳＰ５０＿６２５３、がデンプン結合アッセイによって同定された（データは示さず）。

異なる炭素源での増殖中のｃｇｔ発現の分析
遺伝子ｃｇｔは、グルコースおよびマルトースについてのトランスクリプトームおよびプロテオーム分析によって決定されるように、異なる炭素源の存在下で差次的に発現されることが報告されている（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋら、２０１３；Ｗｅｎｄｌｅｒら、２０１５ａ；Ｏｒｔｓｅｉｆｅｎ、２０１６）。本発明者らは、逆転写定量ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）によって転写量を測定することによって、ｃｇｔ遺伝子の発現に対するいくつかの炭素源の効果を試験した。この目的のために、アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０の野生型株を、マルトース、グルコース、デンプン、ガラクトース、セロビオース、ラクトースおよびＣ－Ｐｕｒ（Ｃｅｒｅｓｔａｒ ０１９０８）を補充した最小培地上で増殖させた（図１０）。後者は、主にマルトースおよびマルトトリオースからなるデンプンの分解からの糖含有生成物である。全ての炭素源は、同等のＣモル量で補充された。唯一の例外はデンプンであった：低い溶解度のため、ここでは、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓからの「デンプン可溶性（ｓｔａｒｃｈ ｓｏｌｕｂｌｅ）」の４％（ｗ／ｖ）乳白色溶液が生成された。対照的に、マルトースの量を減少させたマルトース最小培地（ここでは４４．４０ｇ・Ｌ^－１マルトース一水和物）を調製し、ここでＣモル濃度はデンプン培地中のものに近似すべきである。

ほとんどの試験された炭素源について、ｃｇｔ遺伝子の転写はマルトース増殖培養物と比較して、類似しているか、またはほんのわずかであり、有意に減少していなかった（図１１Ａ）。差次的転写は、ガラクトースについてわずかな程度で観察された（３．４少ない転写、ｌｏｇ_２（倍変化）＝０．２９１）。ｃｇｔ転写物の有意な減少を、炭素源グルコース（１４２倍少ない転写、ｌｏｇ_２（倍変化）＝０．００７）およびラクトース（６２倍少ない転写、ｌｏｇ_２（倍変化）＝０．０１６）について測定した。細胞を、マルトースを減少させたマルトース最小培地（ここでは、７２．０６ｇ・Ｌ^－１の代わりに４４．４ｇ・Ｌ^－１）上で増殖させた場合、ｃｇｔ遺伝子の２．９倍減少した転写が観察された（ｌｏｇ_２（倍変化）＝０．３４５）（図１１Ｂ）。

遺伝子欠失変異Δｃｇｔの解析
様々な炭素源や炭素制限条件下でのΔｃｇｔ
炭素源に依存するｃｇｔの差次的転写プロフィールは、以前に推定されたように（Ｏｒｔｓｅｉｆｅｎ、２０１６）、糖代謝内の機能を示した。Ｏｒｔｓｅｉｆｅｎ（２０１６）（Ｏｒｔｓｅｉｆｅｎ ２０１６）は、Ｃｇｔがカーボフォアモデルの文脈において、エネルギー源としての炭素の保持に関与することを示唆した。野生型およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９欠失変異体Δｃｇｔの増殖を、液体培養中の異なる炭素源で試験した。

以前に、ＯｍｎｉＬｏｇ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｌｏｇ Ｉｎｃ、Ｈａｙｗａｒｄ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）においてプレスクリーニング実験を実施し、これにより、マルチウェルプレート中の合計１９０個の異なる炭素源での細胞呼吸活性の測定による迅速な表現型スクリーニングが可能になった。これらのうち、アクチノプラネスは１０３の炭素源に呼吸を示した。アラビノースおよびラクトースを除いて、残りの１０１個の炭素源ではΔｃｇｔの差次的呼吸プロフィールは観察されなかった。増殖のレベルに関するこれらの結果を検証するために、炭素源アラビノースおよびラクトースを、振盪フラスコ培養においてさらに試験した。また、生息地土壌の天然炭素源を模倣するために、標準的な実験室用糖マルトースおよびグルコース、ならびに複合炭素源デンプンならびに二糖類セロビオースを試験した。増殖の拘束はΔｃｇｔ（図１２および図１３）では認められなかった。

さらに、炭素制限条件下（ここでは：１ｇ・Ｌ^－１、２ｇ・Ｌ^－１、３ｇ・Ｌ^－１、４ｇ・Ｌ^－１、５ｇ・Ｌ^－１デンプン）での増殖をｍ２ｐ－ｌａｂｓのＲｏｂｏＬｅｃｔｏｒ（登録商標）－ｓｙｓｔｅｍで試験した。野生型と比較した炭素源の制約の場合、ｃｇｔ変異体の増殖不利益は観察されなかった（図１４）。
Δｃｇｔは浸透圧耐性またはｐＨ耐性に影響を与えない
Ｃｇｔ多量体は多量体化によって表面層を形成することが提案されている（Ｗｅｎｄｌｅｒら、２０１５ａ）。このことは、干ばつ、ｐＨおよび浸透圧のような環境変化に対する防御における潜在的な役割を示唆するかもしれない。
ＲｏｂｏＬｅｃｔｏｒ（登録商標）ｓｙｓｔｅｍの培養液中と同様に固形培地上でｐＨスクリーニングを行った。固体培地上でのスクリーニングのために、ｐＨ４～１１（１ステップで）の範囲のｐＨのＳＦＭ－寒天プレートを調製し、野生型および欠失変異体Δｃｇｔの胞子の希釈系列の液滴を適用した。突然変異型および野生型の両方がｐＨ５～１１で増殖することができた。寒天プレート上での増殖または胞子形成における差異は観察されなかった。

干ばつ耐性の影響を評価することは困難であるため、本発明者らは、菌叢の表面上のコロニーおよび胞子形成を分析したところ、野生型とΔｃｇｔとの間に差異は見られなかった。

液体培養におけるｐＨスクリーニングのために、４～７の範囲のｐＨのマルトース最小培地を調製した。培地成分が沈殿する傾向があるので、より高いｐＨ値は、液体培養において試験することができなかった。両方の株はｐＨ４．５から７で増殖した（図１５）。最終的な細胞乾燥重量に関して、差異は観察されなかった。

浸透圧スクリーニングのために、３．６～１０８．１ｇ・Ｌ^－１マルトース一水和物の範囲のマルトースの種々の濃度および３２３．５～６８１．０ ｍＯｓｍｏｌ・ｋｇ^－１の範囲の浸透圧を有するマルトース最小培地を調製した（表Ｅ１１）。野生型と欠失変異体Δｃｇｔとの間に有意な増殖差は認められなかった（図１６）。

また、イノシトールは、アクチノプラネスによって消費されないため、浸透圧調節物質として試験された。ここで、浸透圧は３８８．５～６９５．０ｍＯｓｍｏｌ・ｋｇ^－１の範囲であったが、増殖差は観察されなかった（図１７）。
１５９～１９０ｍＯｓｍｏｌ・ｋｇ^－１の間のより低い浸透圧を、複合培地ＮＢＳの使用によって試験した（図１９、表Ｅ１０）。ここでも、野生型株と欠失変異体Δｃｇｔとの間で増殖の有意差は観察されなかった。

Δｃｇｔは、マルトース最小培地上で改善されたアカルボース生成を示す
試験条件下では明確な増殖表現型は観察できなかったが、高発現Ｃｇｔ蛋白質の欠如はＡＴＰやアミノ酸のような細胞の代謝資源を節約すると思われる。これらは、細胞増殖または他の同化プロセスのために使用され得る。実験において、Δｃｇｔは有意な成長の利点を示さなかった。しかし、野生型と比較して、著しく高い最終アカルボース濃度が、欠失変異体のΔｃｇｔについて検出された（表Ｅ１０）。複合培地での培養では、これは増殖期の間に最も顕著であった（図１８）。

改善されたアカルボース産生表現型は、マルトース最小培地中での３つの独立した振盪フラスコ培養によって確認された（図１９および表Ｅ１１）。上清からのアカルボースの定量は、野生型と比較して、欠失変異体の向上したアカルボース収率係数を示した。最終アカルボース収率の差は有意であった（両側ｔ検定により検定、ｐ値＝０．０４６０８）。これにより、Δｃｇｔにおいて、最終アカルボース濃度の８．３～１６．６％の増加が達成された（表Ｅ１１参照）。

Δｃｇｔはアカルボース生合成遺伝子の発現に影響を及ぼさない
高度に発現された遺伝子ｃｇｔの欠失は種々の条件下での生物の成長または生存性に負の影響を及ぼさないが、増強されたアカルボース産生表現型への収量が得られるという知見は驚くべきものであった。これにより、またアカルボース生合成（ａｃｂ）遺伝子の調節への直接的影響を除外するために、代表的ａｃｂ遺伝子のＲＴ－ｑＰＣＲを行った。このために、野生型およびΔｃｇｔをマルトース最小培地上で増殖させ、ＲＮＡを初期増殖期のサンプルから単離した。アカルボース生合成クラスター遺伝子ａｃｂＺ、ａｃｂＷ、ａｃｂＶ、ａｃｂＡ、ａｃｂＢ、ａｃｂＤおよびａｃｂＥの相対転写量を、野生型に比べてΔｃｇｔについて算出した（図２０）。ａｃｂＶ遺伝子は、アカルボース生合成遺伝子クラスターの主要オペロン内のいくつかの多シストロン転写遺伝子の最初である（Ｗｏｌｆら２０１７ｂ）。細胞外アカルボース代謝のタンパク質をコードするモノシストロン転写遺伝子ａｃｂＤおよびａｃｂＥはアカルボース調節因子ＡｃｒＣによって強く調節されることが示されている（Ｗｏｌｆら、２０１７ａ）。遺伝子ａｃｂＡ、ａｃｂＢおよびａｃｂＺもモノシストロン転写され、それぞれアカルボース生合成（ａｃｂＡＢ）およびその細胞外代謝（ａｃｂＺ）の酵素としてアノテーションされる。ＡｃｂＷはａｃｂＷＸＹ－オペロンの最初の遺伝子であり、ＡＢＣトランスポーターをコードしていると推定される。選択されたすべての転写物について、野生型と比較して欠失変異体Δｃｇｔにおいて、相対的転写物濃度の有意な変化は測定されなかった（図２０）。

ディスカッション
炭水化物代謝とアカルボース生合成の関連は非常に興味深い。最近の研究は野生型におけるアカルボースおよびさらなるアカルビオシル代謝産物の生合成の文脈における炭素利用の重要性を指摘している（Ｗｅｎｄｌｅｒら、２０１４）。

これに関連して、デンプン結合タンパク質Ｃｇｔは顕著である。それは、分泌プロテオーム全体の約８％を構成するアクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋら、２０１３）において最も強く発現される遺伝子の１つである（本発明者らの未公開データ）。その遺伝子産物は細胞外に輸送される（Ｗｅｎｄｌｅｒら、２０１３）。過剰な産生および輸送は細胞のための高いコストを意味する：翻訳プロセスのためにのみ、ペプチド結合あたり４つのＡＴＰが必要とされる（ＣａｍｐｂｅｌｌおよびＲｅｅｃｅ、２０１１；Ｐｕｒｖｅｓ、２００６）、すなわち、ＲＮＡ合成、アミノ酸産生、タンパク質フォールディングおよび輸送のための追加のコストを含まない。従って、本発明者らは、Ｃｇｔがアクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０生理学において有意な役割を有すると結論した。Ｃｇｔの２つの異なる機能：糖代謝における役割および表面タンパク質としての役割が、本明細書において提案され、分析される。

デンプン結合ドメインのために、Ｏｒｔｓｅｉｆｅｎ（２０１６）（Ｏｒｔｓｅｉｆｅｎ、２０１６）は、Ｃｇｔがカルボフォアモデル（Ｗｅｈｍｅｉｅｒ、２００３）の文脈において、エネルギー源の結合および保持に関与し得ることを示唆した。マルトース、より高いマルトデキストリンおよびセロビオースで増殖させた培養物と比較して、グルコース、ガラクトースおよびラクトースで増殖させた培養物において遺伝子ｃｇｔの差次的発現を示したＲＴ－ｑＰＣＲによっても証拠が与えられた。これは、炭素源マルトースおよびグルコースについての差次的プロテオーム分析に従う（Ｗｅｎｄｌｅｒら、２０１５ａ；Ｗｅｎｄｌｅｒら、２０１５ｂ）。これらの結果は、ｃｇｔの炭素依存性発現を示す。調節メカニズムを解明することは興味深いだろう。しかし、アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０では９００以上の遺伝子が転写調節に関与していると推定され、そのうち６９７はＷｏｌｆら（２０１７ｂ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＬＴ８２７０１０．１）のアノテーションに従って転写調節因子としてアノテーションされている。

ｃｇｔの糖依存性発現は、マルトース、より高いマルトデキストリン、および潜在的にセロビオースの利用内での機能を示し得る。しかし、欠失変異体Δｃｇｔの我々の研究は、カーボン利用に関する表現型の違いを明らかにしていない。これは、合計１０５の異なる炭素源について試験され、そのうち１０３がＯｍｎｉＬｏｇスクリーニングシステムで分析され、６が液体培養で分析された。

Ｃｇｔの機能は過剰の炭素源の下では無視できるが、限定された炭素源の条件下で増殖する場合には必須であるので、本発明者らは低濃度のデンプンを含む最小培地上での欠失変異体Δｃｇｔおよび野生型の増殖を試験した。デンプンは炭素源として選択され、Ｃｇｔのデンプン結合活性のために、これはここでのデンプン結合アッセイにおいて確認された。それにもかかわらず、変異体の増殖表現型は、限定された炭素源条件下で観察され得なかった。

糖代謝内の別の機能は不溶性結晶性基質の結合にあり得、これは構造変化をもたらし得、これは基質接近性を増加させ、そしてアミラーゼのような他の加水分解酵素の活性を増強する。このようなメカニズムはキチン分解のための土壌細菌セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）（Ｖａａｊｅ－Ｋｏｌｓｔａｄら、２００５）およびセルリシス（ｃｅｌｌｕｌｙｓｉｓ）のためのサーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ）（Ｍｏｓｅｒら、２００８）に既に記載されている。アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０のゲノムでは、いくつかの遺伝子が推定α－グリオシド機能でコードされており、そのうちの３つ、α－アミラーゼ／プルラナーゼＡｃｂＥ、ＡｃｂＺ及びＰｕｌＡは、細胞外空間に蓄積することが示された（Ｗｅｎｄｌｅｒら２０１５ａ）。さらに、未知の機能およびデンプン結合能の別の小細胞外タンパク質（ＡＣＳＰ５０＿６２５３）を、デンプン結合アッセイにおいて同定した。細胞外アミラーゼの異種発現および－ＣｇｔおよびＡＣＳＰ５０＿６２５３－の両方の存在下および非存在下での酵素アッセイにより、デンプン分解の間の支持機能が、将来の実験において検出され得る。

糖代謝とは別に、表面層タンパク質としての機能も考えられ、これは、Ｃｇｔが多量体を形成するという事実によって支持される（Ｏｒｔｓｅｉｆｅｎ、２０１６；Ｗｅｎｄｌｅｒら、２０１３）。Ｗｅｎｄｌｅｒら（２０１５）（Ｗｅｎｄｌｅｒら、２０１５ａ）はＣｇｔタンパク質における２つの膜貫通ドメインを同定し、そのうちの１つはリーダーペプチドの一部としてＳｅｃ経路による転座に関与し、第２のものは多量体化に必要であると仮定される。Ｃｇｔは膜中に物理的に固定される可能性は低いが（Ｗｅｎｄｌｅｒら、２０１５ａ）、Ｃｇｔタンパク質は、減少した流体流のために、菌糸体のメッシュ中に多量体として残存し得る。この文脈において、デンプン結合ドメインはまた、アンカーとして役立ち得る。

推定表面タンパク質としての役割において、本発明者らは最初に、ｐＨおよびオスモライトストレスまたは干ばつの状況において保護機能を仮定した。しかし、スクリーニング実験は、ｃｇｔ遺伝子の欠失が液体培養物中の異なるｐＨで有意な増殖阻害をもたらさなかったことを示した。固体培地上でのスクリーニング実験から、ＣｇｔがｐＨまたは干ばつの場合に保護機能を有するかもしれないという兆候はなかった。

浸透圧調節との関連で推定される機能のヒントが、異なる量のマルトースで増殖させた野生型の逆転写定量ＰＣＲによって与えられた。ここで、本発明者らは、モル浸透圧の影響であり得る７２ｇ・Ｌ^－１と比較して、４４．４ｇ・Ｌ^－１マルトース上で増殖する場合、遺伝子ｃｇｔの２．９倍減少した転写を観察した。本発明者らは、１５９～６８１ｍＯｓｍｏｌ・ｋｇ^－１の範囲の培地を用いた液状培養におけるいくつかのスクリーニング実験において、欠失変異体Δｃｇｔの増殖を分析した。すべての試験条件下で、野生型と比較して、欠失変異体Δｃｇｔの増殖および生存率に差は観察されなかった。

驚くべきことに、異なるｐＨ条件下でも浸透圧条件下でも、過剰にも限定的にも、異なる炭素源の利用においてｃｇｔ遺伝子の欠失によって明らかな生理学的影響は観察されなかったので、Ｃｇｔの機能は、その自然環境において、および他の土壌生物との可能な競合においてのみ明らかになる可能性がある。興味深いことに、本発明者らは、１７の他の原核生物種（その大部分は放線菌目に属する）において、類似の独立した特異的ＣＢＭ－２０ドメインタンパク質を見出した。まれではあるが、これは少なくとも一定の分布を示し、Ｃｇｔが株特異的タンパク質ではないことを示す。単一ドメインＣＢＭ－２０タンパク質を保有する種の大部分は土壌生息地と関連していた。ｃｇｔがアクチノプラネス属ＳＥ５０／１１０で高度に発現するという事実とともに、これはＣｇｔのようなタンパク質がこの生息場所内に生息する細菌において極めて重要な機能を果たすという仮説を支持する。Ｃｇｔの機能は、将来、他の微生物競合体と直接接触させた共培養によって試験することができる。

驚くべきことに、Ｃｇｔが試験した実験室条件下で不要であることが判明したが、本発明者らはアカルボース産生に関して陽性の表現型を観察した。ｃｇｔの欠失により、８．３～１６．６％のアカルボース収率の増加が達成された。最終産物の収率はバッチ培養間でわずかに異なるが、ｃｇｔ変異体は常に有意に良好に機能した。これは、マルトース最小培地において行われた３つの独立した振盪フラスコおよびいくつかのマイクロスケール培養において数ヶ月の期間にわたって示された（データは示さず）。したがって、改善された産生は、長期間にわたって、および異なる培養環境において、堅調であった。

これは、野生型におけるｃｇｔ遺伝子の発現による代謝的負担によるものであり、Δｃｇｔにおいてエネルギーと自由資源の緩和をもたらすと仮定する。これらの資源は、おそらく、増殖関連産物であるアカルボース生合成に向け直される。ａｃｂ遺伝子の発現に対するｃｇｔの欠失による直接的な調節効果は観察されなかった。

カロテノイド形成の機能的関連性の解析
光依存性カロテノイド形成および酸化ストレスはアクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０におけるアカルボース産生を減少させる
アクチノプラネスは、カロテノイド類の黄色、オレンジ色およびピンク色の色素を含む種々の可溶性色素を生成することが知られている（ＰａｒｅｎｔｉおよびＣｏｒｏｎｅｌｌｉ、１９７９）。アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０の色素はオレンジ色である。その形成は、光に暴露して培養すると増強される。色素は同様に上清中に見出されたので、それは水性溶液中に可溶性であるように思われる。細胞抽出および薄層クロマトグラフィーによる分離の後、スペクトル分析は４５０、４７５および５０５－５１０に吸収極大を示し、これは、ＨＰＬＣ分離の間に行われた吸光度スキャンによって確認された。インシリコ再構築が示すこれらの発見と一致して、アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０は、サリノスポラ・トロピカ（Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ ｔｒｏｐｉｃａ）ＣＮＢ－４４０由来のシオキサンチンと類似性を有するＣ４０－カロテノイドを産生するための完全な遺伝的装置を有することが示されている（Ｒｉｃｈｔｅｒら、２０１５；Ｗｏｌｆら、２０１７ｂ）（図２１および表Ｅ１２）。

Ｃ４０－カロテノイド生合成の遺伝子は、３つの遺伝子クラスター：テルペンクラスター１、２ａおよび２ｂ、で構成されている（図２１Ｄ参照）。

Ｓ．ｔｒｏｐｉｃａとは対照的に、シクラーゼとデサチュラーゼをコードするｃｒｔＹとｃｒｔＵの相同体は、アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０（Ｗｏｌｆら２０１７ｂ）では同定できなかった。代わりに、ＣａｒＲ－ドメインスーパーファミリーの２つのシクラーゼが、この研究において見出された。それらはテルペンクラスター２ｂに局在する（図２１）。ＣａｒＲ－ドメインシクラーゼは真菌ゲノム、古細菌ゲノムおよび細菌ゲノムにおいて一般的である（ＮＣＢＩのＣＤＤ検索から得られた情報（Ｍａｒｃｈｌｅｒ－Ｂａｕｅｒら、２０１７））。ＳＥ５０／１１０の色素はオレンジ色であるので、赤色前駆体リコピンの末端サイクリングは高い可能性があり、ＣａｒＲ－ドメインシクラーゼの一方または両方によって触媒され得る。Ｓ．ｔｒｏｐｉｃａと同様に、ＳＥ５０／１１０のカロテノイド遺伝子クラスターは、グリコシルトランスフェラーゼＣｒｕＣを含む（図２１、表Ｅ１２）。これはグリコシル化カロテノイドについて強く示し、これは観察によれば、色素が上清中に見出されたので、色素が極性特徴を有するようである（図２２Ｂ）。

ソフトウェアプラットフォームＥＤＧＡＲ ２．０（Ｂｌｏｍら、２０１６）による比較ゲノム分析は、アクチノプラネス属の関連種において同様のテルペンクラスター配列を示すが、ストレプトマイセスにおいては異なる組織が見出された（データは示さず）。これにより、ＳＥ５０／１１０およびＣＮＢ－４４０（Ｒｉｃｈｔｅｒら、２０１５；Ｗｏｌｆら、２０１７ｂ）において見出される遺伝子配置は、ミクロモノスポラ科（ｆａｍｉｌｙ Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）について特徴的であるよう。

さらに、ＭＥＰ／ＤＯＸＰ－経路（表Ｅ１２）を介した形成ブロックＩＰＰおよびＤＭＡＰＰの合成のための遺伝子、カンフェン様モノテルペンシンターゼ（テルペンクラスター３、表Ｅ１２）、ならびにカロテノイド切断ジオキシゲナーゼ（ＡＣＳＰ５０＿５５２２、表Ｅ１２）をコードする遺伝子が、ＳＥ５０／１１０のゲノム中に見出された。後者の２つは、臭気物質の形成に関与する可能性がある（Ｙａｍａｄａら、２０１５）。本発明者らは、強い色素沈着が生産損失と関連していることを観察した。これは、光に曝露された培養物および光から覆われた培養物の増殖収率およびアカルボース収率を比較することによって確認された（図２２）。カロテノイド生成が誘導されたが、アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０のアカルボース産生および増殖は、電球光（３６Ｗ、Ｏｓｒａｍ ８３０Ｕ）に２２～４４μＥ（１μｍｏｌＥ＝μｍｏｌ_{ｐｈｏｔｏｎｓ}ｍ^－２ｓ^－１）の強さで暴露した場合、強く減少した。全体として、最終アカルボース濃度の３９％の損失をモニターした。

ＳＥ５０／１１０におけるｍｅｒＲの欠失は、光への暴露なしにカロテノイド形成を誘導する
天然光または電球光はカロテノイド形成を誘導することができたので（図２２Ｂ、Ｃ）、この研究は、ＳＥ５０／１１０において可能性のある調節因子遺伝子を検索した。ＭｅｒＲ調節因子がテルペンクラスター１内に見出された（ＡＣＳＰ５０＿０１４５、図２３）。

ＭｅｒＲ－ファミリーは主に、酸化ストレス、重金属または抗生物質のような環境刺激に応答することができるアクチベーターからなる（Ｂｒｏｗｎら、２００３）。実際、ＭｅｒＲ－ファミリーのいくつかのメンバーは、非光合成細菌において、カロテノイド生合成の光依存性アクチベーターまたはリプレッサー、例えば、関連する放線菌Ｓ．セリカラー（ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（Ｔａｋａｎｏら、２００５；Ｔａｋａｎｏら、２００６）、グラム陰性サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）ＨＢ２７（Ｔａｋａｎｏら、２０１１）およびグラム陽性バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＱＭ Ｂ１５５１（Ｔａｋａｎｏら、２０１５）におけるＬｉｔＲの両方として記載されている。ここで、コバラミン（ビタミンＢ１２）は、紫外線および青色光を吸収することができるので、光感受性を媒介する補因子として作用する：調節因子に共有結合的に結合するか、または光励起後に脱落することによって、調節因子のコンホメーションおよび活性を調節することができる（ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｏｒｓｔら、２００７）。調節機構および結合部位は全く異なる：Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓおよびＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍにおいて、ＬｉｔＲ／ｃｒｔＢ（Ｔａｋａｎｏら、２０１１）またはＬｉｔＲおよびｃｒｔＩ（Ｔａｋａｎｏら、２０１５）のプロモーター領域は暗所で抑制され、照射後に軽減されるが、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒにおけるｌｉｔＲは、ＥＣＦシグマ因子をコードし、カロテノイド生合成遺伝子の転写を指示する、隣接する局在化ｌｉｔＳの必須の光誘導転写アクチベーターであると思われる（Ｔａｋａｎｏら、２００５）。ＥＣＦシグマ因子をコードする遺伝子は、ＳＥ５０／１１０の遺伝子クラスター内では生じない。グラム陰性細菌ミキソコッカス・ザンサス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓ）において、Ｂ１２－依存性ＭｅｒＲ調節因子は、８つのさらなる調節因子遺伝子を含む複雑な調節カスケードの一部である（Ｆｏｎｔｅｓら、２００３；Ｇａｌｂｉｓ－Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２０１２〔ここで、「Ｍａｒｔｉｎｅｚ」の「ｉ」は、正しくはｉにアキュート・アクセントを付した文字である。〕）。実際、ＢＬＡＳＴＰ－解析により、ＳＥ５０／１１０のゲノムにＭ．ｘａｎｔｈｕｓ由来の調節ネットワークの相同体は同定されなかった（データは示さず）。

アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０のＭｅｒＲ－ファミリー調節因子ＡＣＳＰ５０＿０１４５はＮ－末端ＨＴＨ－モチーフおよびＣ－末端Ｂ１２－結合ドメインを含む（ＢＬＡＳＴＰ分析およびＣＤＤ検索（Ｍａｒｃｈｌｅｒ－Ｂａｕｅｒら、２０１５；Ｍａｒｃｈｌｅｒ－Ｂａｕｅｒら、２０１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、２００５））。ＨＴＨ－ドメインの位置は、転写リプレッサーを説明する（Ｐｅｒｅｚ－ＲｕｅｄａおよびＣｏｌｌａｄｏ－Ｖｉｄｅｓ ２０００〔ここで、「Ｐｅｒｅｚ」の「Ｐ」に隣接する「ｅ」は、正しくはｉにアキュート・アクセントを付した文字である。〕）。

ＳＥ５０／１１０における対応する遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９欠失によって、カロテノイド形成は、光への暴露なしに強く誘導された（図２４Ｂ、Ｃ）。このことから、転写リプレッサーとしての機能が確認される。

実際、リプレッサー／オペレーター系は、典型的なオレンジ色が光に曝されることなく野生型でも産生されるので、漏出性であることに留意しなければならない。これによれば、遺伝子ｃｒｔＥＢＩおよびｉｄｉ（ＡＣＳＰ５０＿０１４６－０１４９）の転写は、暗条件下で野生型と比較して、ΔｍｅｒＲにおいて２倍のみであった（図２４Ｅ）。これらの差は、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢおよびｉｄｉについて有意であった。ａｃｂ遺伝子の転写に対する影響は認められなかった。

しかし、この研究の文脈では、ΔｍｅｒＲにおける色素形成が微細化学アカルボースの形成に影響を及ぼすかどうかという疑問が調べられた。再び、より高いカロテノイド形成は、より低いアカルボース形成と関連した（図２４Ａ、Ｄ）。照射された場合、野生型およびΔｍｅｒＲの両方が強く色素沈着し、最終的なアカルボース濃度は両方の株について同様であり、約０．５２ｇ・Ｌ^－１に達した（図２４Ｂ、Ｄ）。これは、暗条件下での野生型と比較して、約３８％のアカルボース生成の減少に相当する（０．８３ｇ・Ｌ^－１に達する）。これは、本明細書中に記載されるような野生型の以前の増殖実験に従う。
暗条件下では、ΔｍｅｒＲは野生型（０．７０ｇ・Ｌ^－１）よりも約１５％少ないアカルボースを産生する（図２４Ｄ）。これらの産生損失は、欠失変異体におけるカロテノイド形成による資源の浪費に帰属されることが示唆される（図２４Ｃ）。結論として、光条件下での産生損失（３８～３９％）は、欠失変異体と野生型の両方でさらなる光誘導ストレスに起因する可能性がある。

マイクロアレイ技術を用いて、暗条件下および明条件下で培養した野生型の比較トランスクリプトーム解析を行うと、様々な遺伝子に影響を及ぼす転写物レベルで複雑な応答が示される（図２５参照）。差次的に発現する遺伝子のいくつかは、酸化ストレスと闘うための細胞応答を示す。酸化ストレスは、エネルギー移動（一重項酸素に導く）または電子移動（スーパーオキシド、過酸化水素およびヒドロキシルラジカルに導く）によって形成される活性酸素種（ＲＯＳ）によって引き起こされる（ＺｉｅｇｅｌｈｏｆｆｅｒおよびＤｏｎｏｈｕｅ、２００９）。高濃度では、ＲＯＳは毒性であり、タンパク質および膜の酸化およびＤＮＡ損傷を引き起こす（ＺｉｅｇｅｌｈｏｆｆｅｒおよびＤｏｎｏｈｕｅ、２００９；Ｇｏｕｔ、２０１９）。

ＳＥ５０／１１０において、チロシナーゼＭｅｌＣ（ＡＣＳＰ５０＿４９５０、以前：ＡＣＰＬ＿５０１７）、褐色色素ユーメラニンの形成に関与する光保護剤（Ｗｏｌｆら、２０１６）、およびリボフラビン生合成の遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿６４３７－４０）は、光に暴露されるとより強く転写される（図２５）。リボフラビンは３７４および４４５ｎｍで吸収する水溶性光酸化増感剤である（Ｓｉｌｖａら、１９９９；Ｋｉｍら、１９９３）。それは、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）およびフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）の前駆体である。これらは、細胞の酸化還元代謝、光感知、ＤＮＡ修復、およびさらなる機能に関与するタンパク質の補因子である（Ｇａｒｃｉａ－Ａｎｇｕｌｏ（２０１７）で概説〔ここで、「Ｇａｒｃｉａ」の「ｉ」は、正しくはｉにアキュート・アクセントを付した文字である。〕）。これにより、リボフラビンおよびその誘導体は細胞が酸化ストレスを克服することを可能にする重要な微量栄養素である（Ｃｈｅｎら、２０１３）。

これによると、光にさらされると、いくつかのフラビン－依存性オキシゲナーゼもより強く転写される。それらの１つは、タウリンジオキシゲナーゼとしてアノテーションされ、この基質はシステインの分解産物である。システインのような硫黄含有アミノ酸は、低分子量チオール（ＬＭＷチオール）の群に属し、ＲＯＳを捕捉し、酸化還元緩衝液として機能することができる（Ｇｏｕｔ、２０１９）。これに対応して、おそらくシステインとメチオニンの代謝と輸送に関与するさらなる遺伝子は、光にさらされた細胞でより強く転写される。

注目すべきことに、いくつかの転写調節因子遺伝子とシグマ因子ＳｉｇＥをコードする遺伝子（ＡＣＳＰ５０＿５５８）もより強力に転写される（図２５）。ＳｉｇＥは、光合成細菌ロドコッカス・スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）（ＺｉｅｇｅｌｈｏｆｆｅｒおよびＤｏｎｏｈｕｅ（２００９）でレビュー）における酸化ストレス応答と、関連種Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ（Ｈｕｔｃｈｉｎｇｓら、２００６）とＣ．グルタミカム（ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）（Ｐａｒｋら、２００８）におけるエンベロープストレス応答と関連していた。ＳｉｇＥがＳＥ５０／１１０における酸化ストレス応答に関与している可能性がある。

興味深いことに、光に曝された野生型では、光に隠された野生型に比べて、カロテノイド生合成の遺伝子や調節因子ＭｅｒＲの遺伝子が有意に強く転写されることはない。これは、野生型においてカロテノイド形成に対する光の明確な効果が観察され得るため、注目に値する。カロテノイド合成は暗所でも明所でも行われており、調節因子変異体（前述参照）では相対的な転写物量の増強はかなり中程度であるので、転写物レベルへの影響は目立たないかもしれない。例えば、カロテノイド切断ジオキシゲナーゼ（ＡＣＳＰ５０＿５５２２）によるカロテノイドまたはテルペノイド前駆体の分解によって、タンパク質レベルまたはメタボロームレベルでのカロテノイド合成のさらなる調節が存在し得ることが想定される。しかし、野生型のマイクロアレイから得られた結果によれば、ｃｒｔ遺伝子発現は、ロドコッカス・スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）（ＺｉｅｇｅｌｈｏｆｆｅｒおよびＤｏｎｏｈｕｅ（２００９）でレビューされた）からの知見と同様に、全体的な酸化ストレス応答の主要な標的ではないと思われる。

まとめると、照明は酸化ストレス応答を誘発し、増殖、カロテノイドおよびアカルボース形成に向けた代謝資源の分布に重要な影響を及ぼすと思われる。カロテノイド生合成の調節は、酸化ストレスに対する全体的な応答から切り離されているよい、さらなる研究が必要である。代謝フラックスをアカルボースの産生に向ける観点から、これらのプロセスを将来より良く理解することが望ましい。シグマ因子ＳｉｇＥは、光に曝されるとより高度に転写されるので、酸化ストレス応答に関与している可能性がある。

光ストレスとは別に、この研究は、産生損失の大部分がカロテノイド形成に直接割り当てられ得ることを実証する。非光合成細菌のカロテノイドは、光力学的殺傷から保護することが示されているので（ＭａｔｈｅｗｓおよびＳｉｓｔｒｏｍ、１９５９）、光保護剤としての機能を有すると考えられる（ＬｅｅおよびＳｃｈｍｉｄｔ－Ｄａｎｎｅｒｔ、２００２）。光の影響は単純な構造的手段によって排除され得るので、カロテノイド形成は実験室条件下で分配可能であると仮定される。アカルボース産生を改善するために、カロテノイド生合成経路のスイッチを切ること、例えば、中央遺伝子ｃｒｔＩの欠失により、菌株開発に使用することができる。カロテノイドは膜の流動性に影響を及ぼすので（ＧｒｕｓｚｅｃｋｉおよびＳｔｒｚａｌｋａ、２００５〔ここで、「Ｓｔｒｚａｌｋａ」の「ｌ」は、正しくはｌにストロークを付した文字である。〕）、Ｃ４０－カロテノイドの欠乏はアクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０の表層および菌糸体組織にも影響を及ぼす可能性がある。産生に関しては、菌糸体塊の分解が菌糸体表面および生化学的に利用可能な細胞の数を増加させるのに有利である。

ａｃｂＢおよびｇｔａＢの過剰発現
発現ベクターｐＳＥＴＴ４を、ａｃｂＢおよびｇｔａＢ遺伝子について試験した。ａｃｂＢとｇｔａＢの両遺伝子は、おそらくアカルボース生合成の摂食枝（ｆｅｅｄｉｎｇ ｂｒａｎｃｈ）であるアミノ糖合成に関与している：ＡｃｂＢはｄＴＤＰ－Ｄ－グルコースのｄＴＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－Ｄ－グルコースへの脱水を触媒し、ＧｔａＢは前駆体グルコース－１Ｐの供給に関与していると想定される。興味深いことに、どちらのタンパク質もアカルボース生産菌の細胞質ゾルでタンパク質量の増加を示す。

単一遺伝子の過剰発現のためのｐＳＥＴＴ４ｇａｐおよびｐＳＥＴＴ４ｔｉｐベクター
アクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０のようなアクチノプラネス菌株における特異的遺伝子の容易なクローニングおよび過剰発現を可能にする新規クローニングシステムを実装した。このために、エガセラ・レンタ（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ ｌｅｎｔａ）由来の遺伝子ｇａｐＤＨの強力なプロモーターを、ｐＳＥＴ１５２－バックボーンのｌａｃＺ－カセットの前でクローニングした。遺伝子ｌａｃＺは、ｌａｃ－プロモーターの制御下で転写され、制限酵素ＢｓａＩの認識側に隣接しており、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｇｉｂｓｏｎら、２００９）、制限／連結クローニングまたはＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニング（Ｅｎｇｌｅｒら、２００８）により、目的の遺伝子によるｌａｃＺの交換を可能にする。強力な発現には強い終結が必要であるため、新規発現系のクローニング側の前後にＴ４－ターミネーターを導入した。Ｍｙｒｏｎｏｖｓｋｙｉら（２０１１）が開発したｐＧＵＳ－クローニングシステムでは、すでにＴ４－ターミネーターの使用が成功している。ここで実施したｐＧＵＳ－組込み変異体の全トラックＲＮＡｓｅｑ分析は、Ｔ４－ターミネーターが転写を効率的にブロックし、インテグラーゼ遺伝子から目的の遺伝子へのリードスルーを妨げることを示した。予備実験によって示されるように、Ｔ４－ターミネーターは、ｐＳＥＴ１５２－組込みを介してアクチノプラネス属種ＳＥ５０／１１０に導入された場合、ａｃｂ遺伝子の転写にいかなる副作用も有さない。

その上、プロモーター－スクリーニング実験に由来する濃縮された一次転写物ライブラリーのシーケンシングにより、アンチセンス配向において目的の遺伝子の後ろに２つの推定上のプロモーターが同定された（図２６）。これら２つの擬似プロモーター（ｐｓｅｕｄｏ－ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）を、アンチセンス転写を防止するために新規発現系で除去した。さらに、さらなる（第３の）Ｔ４－ターミネーターを、クローニング側の背後に反対の向きで導入して、さらなる推定アンチセンス読み取りを防止した。

プロモーター配列の交換を可能にするために、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩ制限部位を導入した。本研究では、強力なｇａｐＤＨ－プロモーターをＳ．リビダンス（ｌｉｖｉｄａｎｓ）由来の中程度の強力なｔｉｐＡ－プロモーターと交換した。これにより、このシステムは容易に改変され得ること、例えば、放線菌目の他の種に対してそれを調節することが示された。ベクター（ｐＳＥＴＴ４ｇａｐおよびｐＳＥＴＴ４ｔｉｐと名付けた）を、遺伝子ａｃｂＢおよびｇｔａＢの強力なおよび中程度の強力な過剰発現について検査した。

ａｃｂＢの中程度の過剰発現はアカルボース形成の改善につながる
ｄＴＤＰ－Ｄ－グルコース－４，６－デヒドラターゼＡｃｂＢは、アカルボース生合成の摂食経路（ｆｅｅｄｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ）であるＤ－グルコース－１Ｐからの活性化アミノ糖の生成に関与していると思われる（図１）：ＡｃｂＢ－活性の上昇により、修飾前駆体の供給が改善されることがわかった：
簡潔には、本明細書の他の箇所に記載される発現ベクターｐＳＥＴＴ４に基づいて、２つの過剰発現変異体を作製した。これらの変異体では、ａｃｂＢは、中程度の強力なｔｉｐＡ－プロモーターまたは強力なｇａｐＤＨ－プロモーターの制御下で転写される。以前に（Ｓｃｈａｆｆｅｒｔら、２０１９）発表されたように、天然プロモーターを用いた発現ベクターは、Ａｃｂ遺伝子クラスターの遺伝子の有意な過剰発現につながらなかった。したがって、天然プロモーターを、対照としてｐＳＥＴ１５２－およびｐＳＥＴＴ４－ベクターバックグラウンドの両方で使用した。増殖およびアカルボース形成を、マルトース最小培地中での２つの振盪フラスコ培養においてモニターした（図２７）。

異種ｔｉｐＡ－プロモーターの制御下で転写されたａｃｂＢを有する変異体は、対照株と比較してアカルボース産生の増強を示した：収率係数が２つの独立した培養において、空のベクター対照と比較して、４８．６および５１．９％に増加した（図２８）。強力なｇａｐＤＨ－プロモーターの使用により、アカルボース収率係数はわずかに増加した（図２８）。

ｐＳＥＴＴ４ｔｉｐ：：ａｃｂＢでは、リン酸化グルコース／ガラクトースおよびＵＤＰ－グルコースの正規化ピーク面積が、空のベクター対照と比較して類似しているか、またはわずかに増加さえしていた（図２９）。従って、活性化されたグルコース部分の供給は保証されていると思われる。この変異体では、質量Ｍ／ｚ＝５４５［Ｍ－Ｈ^＋］の増加量が見出された（図２９、約４１％）。理論に拘束されることなく、この中間体は、例えばｐＳＥＴＴ４ｔｉｐ：：ａｃｂＢを使用して、中程度のＡｃｂＢ－過剰発現によって蓄積する。

増殖期の開始時に、ａｃｂＢの増強された発現が予想された範囲で観察された：最も強力な過剰発現は、ｇａｐＤＨ－プロモーター（ｌｏｇ_２（倍変化）＝６．５４）の使用、続いてｔｉｐＡ－プロモーター（ｌｏｇ_２（倍変化）＝４．０６）の使用によって達成された（図３０）。天然プロモーターの使用は、ａｃｂＢの相対的転写量の有意な増加をもたらさない。これを、ｐＳＥＴ１５２－ベクターバックグラウンドおよびｐＳＥＴＴ４－ベクターバックグラウンドの両方で試験した（図３０）。ａｃｂＡとａｃｂＶに示されているように、ａｃｂ遺伝子クラスターのさらなる遺伝子には有意な影響がなかった（図３０）。ただし、ｐＳＥＴＴ４ｔｉｐ：：ａｃｂＢ（ｌｏｇ_２（倍変化）＝１．８７）におけるａｃｂＡの転写量がわずかに多い。

注目すべきことに、線形増殖期における転写プロファイルは初期増殖期とは異なる：ここではｇａｐＤＨ－プロモーターの使用によって転写量の倍加のみに到達し（ｌｏｇ_２（倍変化）＝２．０５）、一方、ｔｉｐＡ－プロモーターの使用によって、ａｃｂＢの過剰発現は維持されたが、より少ない程度（ｌｏｇ_２（倍変化）＝３．３３）であった（図３０、図３１）。

異種プロモーターを含む過剰発現変異体において、ａｃｂＢの相対転写はｐＳＥＴＴ４ｔｉｐ：：ａｃｂＢにおいて２つの試料採取時間の間で４．０６倍から３．３３倍（ｌｏｇ_２（倍変化））に、およびｐＳＥＴＴ４ｇａｐ：：ａｃｂＢにおいて６．５４倍から２．０５倍に減少する。これらの変異体では染色体ａｃｂＢコピーの転写はダウンレギュレートされているが、ベクターコピーの転写は異種プロモーターによって維持されていると考えられる。異なるサンプリング時間でのａｃｂＢ－転写の差異はさらに、ａｃｂ遺伝子転写のダウンレギュレーションが、ｐＳＥＴＴ４ｔｉｐ：：ａｃｂＢと比較して、ｐＳＥＴＴ４ｇａｐ：：ａｃｂＢにおいてそれぞれより早くより強く起こることを示唆する。ａｃｂＢ（ｐＳＥＴＴ４ｇａｐ：：ａｃｂＢおよびｐＳＥＴＴ４ｔｉｐ：：ａｃｂＢ）の過剰発現は、線形増殖期中に減速すると思われる。

要約すると、特にｔｉｐＡ－プロモーターの使用によるａｃｂＢの中程度の過剰発現は、アカルボース産生に有益であると思われるが、ｇａｐＤＨ－プロモーターの使用による強力な過剰発現は、アカルボース形成に対してより小さな効果しか持たないと思われる。アカルボース形成のさらなる改善は、ａｃｂＢの発現レベルの変化、例えば、プロモータースクリーニングからの選択的プロモーターの使用、または複数の遺伝子コピーの導入によって達成され得る。

要約すると、この研究は、おそらく改善されたアミノ糖供給に起因して、ＡｃｂＢの中程度の過剰発現がアカルボース収率を増加させることを実証する。ａｃｂＢの中程度の過剰発現（例えば、ｔｉｐＡ－プロモーターの使用による）によって、アカルボース産生に対する正の効果が観察され、２つの独立した培養において約５０％以上のアカルボースが得られた。したがって、特異的ａｃｂ遺伝子の過剰発現によるアカルボース生合成の改善が達成された。

ｇｔａＢの中程度の過剰発現は改善されたアカルボース形成につながる
ＧｔａＢは、ＵＤＰ－グルコースとグルコース－１Ｐの互いの変換を触媒すると考えられる。驚くべきことに、ＧｔａＢの過剰発現がアカルボース形成を誘発することがわかった。理論に束縛されるものではないが、これは前駆体グルコース－１Ｐの改善された展開によって起こり得る。マルトース最小培地中での振盪フラスコ培養によって示されるように（図３２）、ｐＳＥＴＴ４ｔｉｐに導入されたｇｔａＢの過剰発現変異体のアカルボースの最終収率係数は、８．５６％に増加する。
興味深いことに、アカルボース形成は特に、後期の線形増殖期から静止期において増加する。過剰発現変異体において、遺伝子ｇｔａＢの相対転写量は、２．６４倍増加している（ｌｏｇ_２（倍変化））（図３３）。
活性化された糖の代謝は他の代謝経路に結びついたり、方向を変えたりするので、蓄積されるとは考えられない。しかし、以前の実験で示されたように、供給は深刻に妨害されることがある。細胞内メタボロームの解析では、リン酸化されたヘキソースおよび／またはＵＤＰ－グルコースの量は同程度である（図３４）。したがって、活性化されたＣ６－糖のプールは、ｇｔａＢの過剰発現によって有意に影響されない。

興味深いことに、質量Ｍ／ｚ＝５４５［Ｍ－Ｈ^＋］の有意な減少量が、ｐＳＥＴＴ４ｔｉｐ：：ｇｔａＢにおいて見出され（約４８％の減少）、これは、ＡｃｂＢの提案された生成物であるｄＴＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－Ｄ－グルコースに対応し得る。これは、この代謝産物の蓄積が空のベクター対照およびＡｃｂＢ過剰発現変異体と比較して減少するので、合成鎖を通る流れがよりバランスが取れていることを示し得る（図３４）。まとめると、ｇｔａＢの第２の遺伝子コピーの導入は、細胞財（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｏｏｄｓ）の分布に対するｇｔａＢ過剰発現の影響は依然として不明であるが、アカルボース生産にプラスの影響を及ぼす。
このコンストラクトをアクチノプラネスの生産菌株に移すと、有益な効果が増大する可能性がある。なぜなら、ここでは前駆体に対する需要が野生型に比べて高くなるからである。ＡｃｂＢの強力な過剰発現は、グルコース－リン酸代謝に複合されたａｃｂＢとｇｔａＢの過剰発現における不均衡をもたらすので、おそらく、単一の過剰発現について観察された効果を超えて、アカルボース産生をさらに改善するであろう。

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Claims (15)

1. アカルボースの改善された産生のための、放線菌株、好ましくはアクチノプラネス株を操作する方法であって、該方法が、放線菌株を
   （ｉ） 配列番号２０による細胞外小炭水化物結合タンパク質Ｃｇｔの発現が消失または減弱するように、および／または、
   （ｉｉ） カロテノイド合成に不可欠な少なくとも１つの遺伝子の発現が消失または減弱するように、および／または、
   （ｉｉｉ） 配列番号１３によるｄＴＤＰ－Ｄ－グルコース－４，６－デヒドラターゼＡｃｂＢが過剰発現するように、および／または
   （ｉｖ） 配列番号１９によるＵＤＰ－グルコース－１ＰウリジルトランスフェラーゼＧｔａＢが過剰発現するように
   操作することを含む、前記方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、前記方法が、
   （ｉ） 配列番号２０による細胞外小炭水化物結合タンパク質Ｃｇｔをコードする遺伝子の欠失または変異、および／または、
   （ｉｉ） カロテノイド合成に不可欠な少なくとも１つの遺伝子の欠失または変異、および／または、
   （ｉｉｉ） 放線菌株へのＡｃｂＢの発現カセットを含むベクターの導入、および／または
   （ｉｖ） 放線菌株へのＧｔａＢの発現カセットを含むベクターの導入
   を含む、前記方法。
3. 請求項２に記載の方法であって、ここで、（ｉｉｉ）および／または（ｉｖ）による発現カセットが、グルクロニダーゼアッセイにおいて少なくとも１×１０^－４［Ｌ・ｇ^－１・分^－１］の正規化グルクロニダーゼ活性を特徴とする中程度の強力なプロモーター、またはグルクロニダーゼアッセイにおいて少なくとも５×１０^－４［Ｌ・ｇ^－１・分^－１］の正規化グルクロニダーゼ活性を特徴とする強力なプロモーターの制御下にある、前記方法。
4. アカルボースを産生するための、放線菌株、好ましくはアクチノプラネス株であって、ここで、該放線菌株が、配列番号２０による細胞外小炭水化物結合タンパク質Ｃｇｔの消失または減弱した発現のために遺伝子操作されている、前記放線菌株。
5. 放線菌株がｃｇｔ欠失変異体である、請求項４記載の放線菌株。
6. アカルボースの産生のための、放線菌株、好ましくはアクチノプラネス株であって、ここで、該放線菌株が、カロテノイド合成に必須である少なくとも１つの遺伝子の消失または減弱した発現のために遺伝子操作されている、前記放線菌株。
7. アカルボースの産生のための、放線菌株、好ましくはアクチノプラネス株であって、ここで、該放線菌株が、配列番号１３によるｄＴＤＰ－Ｄ－グルコース－４，６－デヒドラターゼＡｃｂＢの過剰発現のために遺伝子操作されている、前記放線菌株。
8. アカルボースの産生のための、放線菌株、好ましくはアクチノプラネス株であって、ここで、該放線菌株が、配列番号１９によるＵＤＰ－グルコース－１ＰウリジルトランスフェラーゼＧｔａＢの過剰発現のために遺伝子操作されている、前記放線菌株。
9. カロテノイド合成に必須である少なくとも１つの遺伝子が、
   ａ．ＭＥＰ／ＤＯＸＰ経路の遺伝子
   ｉ．１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ遺伝子ｄｘｓ、配列番号２３によるＡＣＳＰ５０＿７０９６、
   ｉｉ．４－ヒドロキシ－３－メチルブタ－２－エン－１－イル二リン酸シンターゼ遺伝子ｉｓｐＧ、配列番号２４によるＡＣＳＰ５０＿７２４８、
   ｉｉｉ．１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸レダクトイソメラーゼ遺伝子ｄｘｒ、配列番号２５によるＡＣＳＰ５０＿７２５０、
   ｉｖ．４－ヒドロキシ－３－メチルブタ－２－エニル二リン酸レダクターゼ遺伝子ｉｓｐＨ、配列番号２６によるＡＣＳＰ５０＿７７０７、
   ｖ．４－（シチジン５’－ジホスホ）－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトールキナーゼ遺伝子ｉｓｐＥ、配列番号２７によるＡＣＳＰ５０＿７８０２、
   ｖｉ．２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール２；４－シクロ二リン酸シンターゼ遺伝子ｉｓｐＦ、配列番号２８によるＡＣＳＰ５０＿８０４６、および／または
   ｖｉｉ．２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール４－リン酸シチジルイルトランスフェラーゼ遺伝子ｉｓｐＤ、配列番号２９によるＡＣＳＰ５０＿８０４７、
   ｂ．テルペンクラスター１の遺伝子
   ｉ．イソペンテニル－二リン酸デルタ－イソメラーゼ遺伝子ｉｄｉ、配列番号３０によるＡＣＳＰ５０＿０１４６、
   ｉｉ．ゼータ－フィトエンデサチュラーゼ遺伝子ｃｒｔＩ、配列番号１０によるＡＣＳＰ５０＿０１４７、
   ｉｉｉ．ポリプレニルシンテターゼ遺伝子ｃｒｔＥ／ｌｄｓＡ、配列番号３１によるＡＣＳＰ５０＿０１４８、
   ｉｖ．フィトエンシンターゼ遺伝子ｃｒｔＢ、配列番号３２によるＡＣＳＰ５０＿０１４９、
   ｖ．デオキシリボジピリミジンフォトリアーゼ遺伝子、配列番号３３によるＡＣＳＰ５０＿０１５０、または
   ｖｉ．ピリジンヌクレオチド－ジスルフィドオキシドレダクターゼ遺伝子、配列番号３４によるＡＣＳＰ５０＿０１５１、
   ｃ．テルペンクラスター２ａの遺伝子
   ｉ．配列番号３５による転写調節因子遺伝子ＡＣＳＰ５０＿１６３１、
   ｉｉ．配列番号３６によるリコペンシクラーゼ遺伝子ＡＣＳＰ５０＿１６３２、
   ｉｉｉ．配列番号３７によるリコペンシクラーゼ遺伝子ＡＣＳＰ５０＿１６３３、
   ｉｖ．ポリプレニルシンテターゼ、ファルネシルピロリン酸シンテターゼ２遺伝子ｆｐｓ２／ｃｒｔＥ、配列番号３８によるＡＣＳＰ５０＿１６３４、または
   ｖ．メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＮＡＤＰＨ）遺伝子、配列番号３９によるＡＣＳＰ５０＿１６３５、
   ｄ．テルペンクラスター２ｂの遺伝子
   ｉ．ＬｙｓＲ－ファミリー転写調節因子遺伝子、配列番号４０によるＡＣＳＰ５０＿１６５０、
   ｉｉ．メチルトランスフェラーゼ１１型遺伝子、配列番号４１によるＡＣＳＰ５０＿１６５１、
   ｉｉｉ．ＣＤＰ－アルコールホスファチジルトランスフェラーゼｐｇｓＡ、配列番号４２によるＡＣＳＰ５０＿１６５２、
   ｉｖ．ゼータ－フィトエンデサチュラーゼ（ｃｒｔＩ－ファミリー）遺伝子ｃｒｔＤ、配列番号４３によるＡＣＳＰ５０＿１６５３、
   ｖ．グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子ｃｒｕＣ、配列番号４４によるＡＣＳＰ５０＿１６５４、
   ｖｉ．仮想タンパク質（ｐｕｔ．ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔ，）遺伝子ｃｒｕＦ、配列番号４５によるＡＣＳＰ５０＿１６５５、
   ｖｉｉ．ＧＣＮ５ファミリーアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、配列番号４６によるＡＣＳＰ５０＿１６５６、
   ｖｉｉｉ．モノオキシゲナーゼ遺伝子、配列番号４７によるＡＣＳＰ５０＿１６５７、または
   ｉｘ．短鎖デヒドロゲナーゼ遺伝子、配列番号４８によるＡＣＳＰ５０＿１６５８、
   ｅ．ポリプレニルシンテターゼ遺伝子ｃｒｔＥ、配列番号４９によるＡＣＳＰ５０＿３８７３、または
   ｆ．カンフェン様モノテルペン生合成テルペンクラスター３の遺伝子
   ｉ．転写調節因子（Ｃｒｐ／Ｆｎｒファミリー）遺伝子ｅｓｈＡ、配列番号１０４によるＡＣＳＰ５０＿１９４９、
   ｉｉ．カンフェンシンターゼ遺伝子、配列番号５０によるＡＣＳＰ５０＿１９５０、
   ｉｉｉ．メチルトランスフェラーゼ（ＳＡＭ－依存性）１１型遺伝子、配列番号１０５によるＡＣＳＰ５０＿１９５１、
   ｉｖ．グリコシル－ヒドロラーゼ遺伝子、配列番号１０６によるＡＣＳＰ５０＿１９５２、または
   ｖ．オキシドレダクターゼ／アルド／ケトレダクターゼ、配列番号１０７によるＡＣＳＰ５０＿１９５３
   のいずれかから選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項６に記載のアカルボースの産生のための放線菌株または請求項１、２または３に記載の方法。
10. 配列番号１３によるＡｃｂＢのための発現カセットおよび／または配列番号１９によるＧｔａＢのための発現カセット、および／または配列番号２２によるＭｅｒＲのための発現カセットを含むアクチノプラネスのための発現ベクター。
11. さらに、グルクロニダーゼアッセイにおいて少なくとも１×１０^－４［Ｌ・ｇ^－１・分^－１］の正規化グルクロニダーゼ活性を特徴とする中程度の強力なプロモーター、またはグルクロニダーゼアッセイにおいて少なくとも５×１０^－４［Ｌ・ｇ^－１・分^－１］の正規化グルクロニダーゼ活性を特徴とする強力なプロモーターを含む、請求項１０に記載の発現ベクター。
12. 請求項１０または１１に記載の発現ベクターであって、さらに、
    ａ．配列番号８５によるφＣ３１インテグラーゼ遺伝子ｉｎｔ、および
    ｂ．配列番号８７による伝達起点（ｉｎｃＰ）、および
    ｃ．配列番号８８によるリラクソソーム遺伝子ｔｒａＪ、および
    ｄ．複製起点、
    好ましくは、高コピー数ＣｏｌＥ１／ｐＭＢ１／ｐＢＲ３２２／ｐＵＣ、配列番号８９による複製起点（ｏｒｉ）および
    ｅ．任意に、少なくとも１つの耐性マーカー
    好ましくは、アプラマイシン耐性を媒介する耐性マーカー、より好ましくは配列番号９０によるａａｃ（３）ＩＶ、ａｐｍＲ、および
    ｆ．任意に、少なくとも１つのＴ４－ターミネーター、
    を含み、
    および、任意に、ここで、前記ベクターは、配列番号１０８および／または配列番号１０９による推定アンチセンスプロモーターを含まない、前記発現ベクター。
13. 請求項１１または１２に記載の発現ベクターであって、前記強力なプロモーターが、
    ａ．配列番号９６によるａｐｍ、
    ｂ．配列番号９８によるｅｒｍＥ^＊、
    ｃ．配列番号９４によるｋａｔＥ、
    ｄ．配列番号９５によるｍｏｅＥ５、または
    ｅ．配列番号８２によるｇａｐＤＨ
    からなる群より選択され、
    および／または前記中程度の強力なプロモーターが、
    ｆ．配列番号９２によるｅｆｐ、
    ｇ．配列番号９７によるｃｄａＲ、
    ｈ．配列番号９９によるｒｐｓＬ、
    ｉ．配列番号９３によるｒｐｓＪ、
    ｊ．配列番号９１によるｃｇｔ、または
    ｋ．配列番号８１によるｔｉｐＡ
    からなる群より選択される、前記発現ベクター。
14. 請求項４～９のいずれかに記載のアカルボースの産生のための放線菌株であって、前記株が、請求項１０～１３のいずれかに記載のベクターを含む、前記放線菌株。
15. アカルボースの産生における、先の請求項のいずれかに記載の放線菌株の使用。

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