JPH1014563A - シュードモナス属に属するセラミダーゼ生産菌 - Google Patents
シュードモナス属に属するセラミダーゼ生産菌Info
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- JPH1014563A JPH1014563A JP19406896A JP19406896A JPH1014563A JP H1014563 A JPH1014563 A JP H1014563A JP 19406896 A JP19406896 A JP 19406896A JP 19406896 A JP19406896 A JP 19406896A JP H1014563 A JPH1014563 A JP H1014563A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 アトピー性皮膚炎の増悪に関与するセラミダ
ーゼ生産性微生物、その検出方法、該微生物を用いるセ
ラミダーゼの製法を提供する。 【解決手段】 シュードモナス属に属し、８．０〜９．
０の至適ｐＨをもつセラミダーゼ生産菌。シュードモナ
ス属に属するセラミダーゼ生産能力のある微生物を培養
し、培養物よりセラミダーゼを採取するセラミダーゼの
製造方法。セラミダーゼ生産性のシュードモナス属細菌
を検出するアトピー性皮膚炎起炎菌の検出方法。
ーゼ生産性微生物、その検出方法、該微生物を用いるセ
ラミダーゼの製法を提供する。 【解決手段】 シュードモナス属に属し、８．０〜９．
０の至適ｐＨをもつセラミダーゼ生産菌。シュードモナ
ス属に属するセラミダーゼ生産能力のある微生物を培養
し、培養物よりセラミダーゼを採取するセラミダーゼの
製造方法。セラミダーゼ生産性のシュードモナス属細菌
を検出するアトピー性皮膚炎起炎菌の検出方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はセラミダーゼを生産
するシュードモナス属に属する細菌及び該細菌の用途に
関する。
するシュードモナス属に属する細菌及び該細菌の用途に
関する。
【０００２】
【従来の技術】セラミダーゼはスフィンゴ脂質の一種で
あるセラミドを長鎖塩基スフィンゴシンと脂肪酸に加水
分解する酵素である。これまでセラミダーゼ活性の存在
はラット脳、モルモット上皮細胞、ブタ上皮、ヒト脳、
腎臓、脾臓、繊維芽細胞、上皮等の哺乳動物組織のみに
おいて報告されている。しかし哺乳動物組織由来のセラ
ミダーゼは膜結合型酵素であり存在量も少なく精製が困
難であり大量の酵素を得ることはできなかった。セラミ
ドをセラミダーゼにより加水分解することにより得られ
る長鎖塩基スフィンゴシンはプロテインキナーゼＣの阻
害、ホスフォリパーゼＤの活性化、カルモジュリン依存
性の酵素の阻害等の活性を有しており、細胞の増殖や細
胞内情報伝達に関与することにより、細胞機能の調節に
働いていると考えられている重要な物質である。またセ
ラミドは角層に存在する角質細胞間脂質の５０％を占
め、皮膚の乾燥からの保護とバリア機能において重要な
働きを担っていると考えられている。アトピー性皮膚炎
患者の皮膚においてはセラミドの減少が見られ皮膚の易
乾燥性とバリア機能の低下の原因である可能性がこれま
でに示されている。一方、アトピー性皮膚炎の病変部に
黄色ブドウ球菌〔スタフィロコッカス アウレウス（St
aphyrococcus aureus)〕が存在することは広く知られて
おり、このほかカンジダ属、マラセチア属の真菌類が病
変部より単離されこれらの菌が病変部の増悪に関与して
いる可能性が示されている。しかしながら、緑膿菌〔シ
ュードモナス エルギノーザ（Pseudomonas aeruginos
a) 〕が病変部より単離された報告もなく、しかもこれ
らの菌がアトピー性皮膚炎患者のセラミド減少に関与す
るという報告も無い。アトピー性皮膚炎病変部にセラミ
ドを分解する酵素を生産する微生物が存在すればセラミ
ドの減少に関与すると考えられ、皮膚炎の増悪にも関与
すると考えられる。しかし、セラミドを加水分解しスフ
ィンゴシンと脂肪酸を生成する酵素セラミダーゼはこれ
までに微生物が生産することは知られておらず、アトピ
ー性皮膚炎病変部にセラミドを分解する酵素を生産する
微生物が存在することも知られていなかった。
あるセラミドを長鎖塩基スフィンゴシンと脂肪酸に加水
分解する酵素である。これまでセラミダーゼ活性の存在
はラット脳、モルモット上皮細胞、ブタ上皮、ヒト脳、
腎臓、脾臓、繊維芽細胞、上皮等の哺乳動物組織のみに
おいて報告されている。しかし哺乳動物組織由来のセラ
ミダーゼは膜結合型酵素であり存在量も少なく精製が困
難であり大量の酵素を得ることはできなかった。セラミ
ドをセラミダーゼにより加水分解することにより得られ
る長鎖塩基スフィンゴシンはプロテインキナーゼＣの阻
害、ホスフォリパーゼＤの活性化、カルモジュリン依存
性の酵素の阻害等の活性を有しており、細胞の増殖や細
胞内情報伝達に関与することにより、細胞機能の調節に
働いていると考えられている重要な物質である。またセ
ラミドは角層に存在する角質細胞間脂質の５０％を占
め、皮膚の乾燥からの保護とバリア機能において重要な
働きを担っていると考えられている。アトピー性皮膚炎
患者の皮膚においてはセラミドの減少が見られ皮膚の易
乾燥性とバリア機能の低下の原因である可能性がこれま
でに示されている。一方、アトピー性皮膚炎の病変部に
黄色ブドウ球菌〔スタフィロコッカス アウレウス（St
aphyrococcus aureus)〕が存在することは広く知られて
おり、このほかカンジダ属、マラセチア属の真菌類が病
変部より単離されこれらの菌が病変部の増悪に関与して
いる可能性が示されている。しかしながら、緑膿菌〔シ
ュードモナス エルギノーザ（Pseudomonas aeruginos
a) 〕が病変部より単離された報告もなく、しかもこれ
らの菌がアトピー性皮膚炎患者のセラミド減少に関与す
るという報告も無い。アトピー性皮膚炎病変部にセラミ
ドを分解する酵素を生産する微生物が存在すればセラミ
ドの減少に関与すると考えられ、皮膚炎の増悪にも関与
すると考えられる。しかし、セラミドを加水分解しスフ
ィンゴシンと脂肪酸を生成する酵素セラミダーゼはこれ
までに微生物が生産することは知られておらず、アトピ
ー性皮膚炎病変部にセラミドを分解する酵素を生産する
微生物が存在することも知られていなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、アト
ピー性皮膚炎の増悪に関与するセラミダーゼ生産性微生
物及びその検出方法を提供すること、また、該微生物が
生産するセラミダーゼを提供することにある。
ピー性皮膚炎の増悪に関与するセラミダーゼ生産性微生
物及びその検出方法を提供すること、また、該微生物が
生産するセラミダーゼを提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は、シュードモナス属に属し、８．０
〜９．０の至適ｐＨをもつセラミダーゼ生産菌に関す
る。本発明の第２の発明は、セラミダーゼの製造方法に
関する発明であって、シュードモナス属に属するセラミ
ダーゼ生産能力のある微生物を培養し、培養物よりセラ
ミダーゼを採取することを特徴とする。本発明の第３の
発明は、アトピー性皮膚炎起炎菌の検出方法に関する発
明であって、セラミダーゼ生産性のシュードモナス属細
菌を検出することを特徴とする。
発明の第１の発明は、シュードモナス属に属し、８．０
〜９．０の至適ｐＨをもつセラミダーゼ生産菌に関す
る。本発明の第２の発明は、セラミダーゼの製造方法に
関する発明であって、シュードモナス属に属するセラミ
ダーゼ生産能力のある微生物を培養し、培養物よりセラ
ミダーゼを採取することを特徴とする。本発明の第３の
発明は、アトピー性皮膚炎起炎菌の検出方法に関する発
明であって、セラミダーゼ生産性のシュードモナス属細
菌を検出することを特徴とする。
【０００５】本発明者らは、アトピー性皮膚炎の増悪に
関与するセラミダーゼを生産する微生物を見出すべく、
アトピー性皮膚炎患者の病変部表皮を採取し、スクリー
ニングに用いた。このスクリーニングの過程でこれまで
微生物においては知られていないセラミドをスフィンゴ
シンと脂肪酸に分解する活性を有する微生物を見出し
た。更に、本発明者らが、鋭意検討を行った結果、本発
明の酵素を生産する微生物を特定することができた。更
に該酵素の理化学的性質を明らかにし、また更に、該酵
素を用いてセラミドを処理することにより、スフィンゴ
シンを効率よく製造することに成功し、本発明を完成さ
せた。
関与するセラミダーゼを生産する微生物を見出すべく、
アトピー性皮膚炎患者の病変部表皮を採取し、スクリー
ニングに用いた。このスクリーニングの過程でこれまで
微生物においては知られていないセラミドをスフィンゴ
シンと脂肪酸に分解する活性を有する微生物を見出し
た。更に、本発明者らが、鋭意検討を行った結果、本発
明の酵素を生産する微生物を特定することができた。更
に該酵素の理化学的性質を明らかにし、また更に、該酵
素を用いてセラミドを処理することにより、スフィンゴ
シンを効率よく製造することに成功し、本発明を完成さ
せた。
【０００６】
【発明の実施の形態】以下、本発明について具体的に説
明する。本発明のセラミダーゼの製造方法は特に限定さ
れるものではなく、本発明のセラミダーゼを有するシュ
ードモナス属に属する微生物でよい。例えば、シュード
モナス エルギノーザ ＡＮ−１７（Pseudomonas aeru
ginosa AN-17）が挙げられる。本菌株は、本発明者らが
アトピー性皮膚炎患者の落屑中より新たに検索して得た
菌株で、その菌学的性質は以下のとおりである。
明する。本発明のセラミダーゼの製造方法は特に限定さ
れるものではなく、本発明のセラミダーゼを有するシュ
ードモナス属に属する微生物でよい。例えば、シュード
モナス エルギノーザ ＡＮ−１７（Pseudomonas aeru
ginosa AN-17）が挙げられる。本菌株は、本発明者らが
アトピー性皮膚炎患者の落屑中より新たに検索して得た
菌株で、その菌学的性質は以下のとおりである。
【０００７】（１）グラム染色：陰性 （２）形態：桿菌 （３）運動性：陽性 （４）酸素に対する態度：好気性 （５）カタラーゼ：陽性 （６）オキシダーゼ：陽性 （７）Ｏ−Ｆテスト：Ｏ （８）集落の色調：特徴的集落色素を生成せず （９）蛍光色素の生成：＋ （10）自動細菌検査装置 ＡＴＢ Expression（ビオメ
リュー）によりグラム陰性桿菌同定キットＩＤ３２ＧＮ
（ビオメリュー）を用いた試験結果 資化性 ラムノース − Ｎ−アセチルグルコサミン ＋ Ｄ−リボース − イノシトール − スクロース − マルトース − イタコン酸 ＋ スベリン酸 − マロン酸ナトリウム ＋ 酢酸ナトリウム ＋ 乳糖 ＋ Ｌ−アラニン ＋ Ｄ−マンニトール ＋ グルコース ＋ サリシン − Ｄ−メリビオース − Ｌ−フコース − Ｄ−ソルビトール − Ｌ−アラビノース − プロピオン酸 ＋ ｎ−カプリン酸 ＋ ｎ−吉草酸 ＋ クエン酸ナトリウム ＋ Ｌ−ヒスチジン塩酸塩 ＋ ５−ケトグルコン酸 − グリコーゲン − ｍ−ヒドロキシ安息香酸 − ２−ケトグルコン酸 ＋ ３−ヒドロキシ酪酸 ＋ ｐ−ヒドロキシ安息香酸 ＋ Ｌ−セリン − Ｌ−プロリン ＋
リュー）によりグラム陰性桿菌同定キットＩＤ３２ＧＮ
（ビオメリュー）を用いた試験結果 資化性 ラムノース − Ｎ−アセチルグルコサミン ＋ Ｄ−リボース − イノシトール − スクロース − マルトース − イタコン酸 ＋ スベリン酸 − マロン酸ナトリウム ＋ 酢酸ナトリウム ＋ 乳糖 ＋ Ｌ−アラニン ＋ Ｄ−マンニトール ＋ グルコース ＋ サリシン − Ｄ−メリビオース − Ｌ−フコース − Ｄ−ソルビトール − Ｌ−アラビノース − プロピオン酸 ＋ ｎ−カプリン酸 ＋ ｎ−吉草酸 ＋ クエン酸ナトリウム ＋ Ｌ−ヒスチジン塩酸塩 ＋ ５−ケトグルコン酸 − グリコーゲン − ｍ−ヒドロキシ安息香酸 − ２−ケトグルコン酸 ＋ ３−ヒドロキシ酪酸 ＋ ｐ−ヒドロキシ安息香酸 ＋ Ｌ−セリン − Ｌ−プロリン ＋
【０００８】以上の特徴から本菌株はシュードモナス
エルギノーザに属する菌株と同定され、本菌株は Pseud
omonas aeruginosa ＡＮ−１７と命名し、ＡＮ−１７と
表示され工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ
Ｐ−１５６９９として寄託されている。該菌株は、セ
ラミダーゼ及びスフィンゴミエリナーゼを生産するとい
う新菌株である。
エルギノーザに属する菌株と同定され、本菌株は Pseud
omonas aeruginosa ＡＮ−１７と命名し、ＡＮ−１７と
表示され工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ
Ｐ−１５６９９として寄託されている。該菌株は、セ
ラミダーゼ及びスフィンゴミエリナーゼを生産するとい
う新菌株である。
【０００９】本発明の酵素は、例えば上述した菌株を栄
養培地中で培養し、培養後の培養物から酵素を分離する
ことによって得られる。培地に加える栄養源は、該菌株
が利用し本発明の酵素を生産するものであればよく、炭
素源として例えば、グリセロール、グルコース、スクロ
ース、糖蜜等が利用でき、窒素源としては例えば、酵母
エキス、ペプトン、コーンスティープリカー、肉エキ
ス、脱脂大豆、硫安、硝酸アンモニウム等が適当であ
る。その他、ナトリウム塩、カリウム塩、リン酸塩、マ
グネシウム塩、亜鉛塩等の無機質及び金属塩を加えても
よい。また培地中にスフィンゴミエリンなどの脂質を
０．０１〜０．５％添加して本発明の酵素の生産性を高
めることができる。本発明の酵素の生産菌を培養するに
当り、酵素の生産量は培養条件によって大きく変動する
が、一般的に培養温度は２０〜３７℃、培地のｐＨ５〜
８が良く、１日から７日の通気かくはん培養で本発明の
酵素が生産される。培養条件は使用する菌株、培地組成
等に応じて本発明の酵素の生産量が最大になるように設
定するのは当然である。上述した菌株によって生産され
た本発明の酵素は主に菌体外に存在するので、培養物を
固液分離し、得られた上清から通常用いられる精製手段
により精製酵素標品を得ることができる。例えば、塩
析、有機溶媒沈殿、イオン交換カラムクロマト、ハイド
ロキシアパタイトカラムクロマト、ゲルろ過カラムクロ
マト、疎水クロマト等により精製することができる。酵
素の純度は例えば、ポリアクリルアミドゲルディスク電
気泳動法等によって検定することができる。
養培地中で培養し、培養後の培養物から酵素を分離する
ことによって得られる。培地に加える栄養源は、該菌株
が利用し本発明の酵素を生産するものであればよく、炭
素源として例えば、グリセロール、グルコース、スクロ
ース、糖蜜等が利用でき、窒素源としては例えば、酵母
エキス、ペプトン、コーンスティープリカー、肉エキ
ス、脱脂大豆、硫安、硝酸アンモニウム等が適当であ
る。その他、ナトリウム塩、カリウム塩、リン酸塩、マ
グネシウム塩、亜鉛塩等の無機質及び金属塩を加えても
よい。また培地中にスフィンゴミエリンなどの脂質を
０．０１〜０．５％添加して本発明の酵素の生産性を高
めることができる。本発明の酵素の生産菌を培養するに
当り、酵素の生産量は培養条件によって大きく変動する
が、一般的に培養温度は２０〜３７℃、培地のｐＨ５〜
８が良く、１日から７日の通気かくはん培養で本発明の
酵素が生産される。培養条件は使用する菌株、培地組成
等に応じて本発明の酵素の生産量が最大になるように設
定するのは当然である。上述した菌株によって生産され
た本発明の酵素は主に菌体外に存在するので、培養物を
固液分離し、得られた上清から通常用いられる精製手段
により精製酵素標品を得ることができる。例えば、塩
析、有機溶媒沈殿、イオン交換カラムクロマト、ハイド
ロキシアパタイトカラムクロマト、ゲルろ過カラムクロ
マト、疎水クロマト等により精製することができる。酵
素の純度は例えば、ポリアクリルアミドゲルディスク電
気泳動法等によって検定することができる。
【００１０】本発明により得られるセラミダーゼの酵素
化学的及び理化学的性質は次のとおりである。 （１）作用 セラミドに作用して、スフィンゴシンと脂肪酸とに加水
分解する。 （２）基質特異性 本酵素はセラミドに作用し、炭素数１２の脂肪酸を持つ
セラミド（Ｃ１２セラミド）及びＣ１８セラミドに比べ
Ｃ１６セラミドを良く分解する（図１） （３）至適ｐＨ 本酵素の至適ｐＨはｐＨ８．０〜ｐＨ９．０であり、ｐ
Ｈ７．５〜ｐＨ１０．５で比較的高い活性を示す。（図
２） （４）温度安定性 本酵素をｐＨ６．０、２５ｍＭ酢酸緩衝液中、０℃、２
４℃、３７℃の各温度で１２時間保存した場合、本酵素
は３７℃で約２０％の活性の低下が見られるが２４℃で
はほとんど活性の低下は見られない。（図３） （５）界面活性剤の影響 本酵素をｐＨ８．５、２５ｍＭトリス緩衝液中、各種濃
度トリトン（Triton)Ｘ−１００でセラミドに作用させ
たところトリトンＸ−１００が０．２５％で活性が最大
となった。（図４）
化学的及び理化学的性質は次のとおりである。 （１）作用 セラミドに作用して、スフィンゴシンと脂肪酸とに加水
分解する。 （２）基質特異性 本酵素はセラミドに作用し、炭素数１２の脂肪酸を持つ
セラミド（Ｃ１２セラミド）及びＣ１８セラミドに比べ
Ｃ１６セラミドを良く分解する（図１） （３）至適ｐＨ 本酵素の至適ｐＨはｐＨ８．０〜ｐＨ９．０であり、ｐ
Ｈ７．５〜ｐＨ１０．５で比較的高い活性を示す。（図
２） （４）温度安定性 本酵素をｐＨ６．０、２５ｍＭ酢酸緩衝液中、０℃、２
４℃、３７℃の各温度で１２時間保存した場合、本酵素
は３７℃で約２０％の活性の低下が見られるが２４℃で
はほとんど活性の低下は見られない。（図３） （５）界面活性剤の影響 本酵素をｐＨ８．５、２５ｍＭトリス緩衝液中、各種濃
度トリトン（Triton)Ｘ−１００でセラミドに作用させ
たところトリトンＸ−１００が０．２５％で活性が最大
となった。（図４）
【００１１】本発明の細菌をアトピー性皮膚炎患者から
検出するには患部から得た各種試料、例えば患部を拭っ
た滅菌綿球、滅菌ガーゼ、滅菌綿棒や皮膚の一部、表皮
の落屑等を用い各種選択分離培地で培養することにより
検出することが可能である。また、本発明により単離さ
れた菌株を抗原とする抗体を用いて免疫学的に検出する
ことも可能である。更には本菌株の遺伝子の配列の一部
をプローブあるいはプライマーとして遺伝子工学的に、
例えばポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣ
Ｒ）法等を用いて検出することができる。このようにし
て本発明の細菌を患部から検出することによりアトピー
性皮膚炎の起炎菌を同定することができる。更にアトピ
ー性皮膚炎の検出を行うことができる。
検出するには患部から得た各種試料、例えば患部を拭っ
た滅菌綿球、滅菌ガーゼ、滅菌綿棒や皮膚の一部、表皮
の落屑等を用い各種選択分離培地で培養することにより
検出することが可能である。また、本発明により単離さ
れた菌株を抗原とする抗体を用いて免疫学的に検出する
ことも可能である。更には本菌株の遺伝子の配列の一部
をプローブあるいはプライマーとして遺伝子工学的に、
例えばポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣ
Ｒ）法等を用いて検出することができる。このようにし
て本発明の細菌を患部から検出することによりアトピー
性皮膚炎の起炎菌を同定することができる。更にアトピ
ー性皮膚炎の検出を行うことができる。
【００１２】以上、詳細に説明したように、本発明によ
りセラミダーゼを生産するシュードモナス属細菌が提供
され、更にはその微生物によるセラミダーゼの製造法が
提供され、更には、アトピー性皮膚炎起炎菌の検出方法
が提供される。
りセラミダーゼを生産するシュードモナス属細菌が提供
され、更にはその微生物によるセラミダーゼの製造法が
提供され、更には、アトピー性皮膚炎起炎菌の検出方法
が提供される。
【００１３】
【実施例】次に実施例により本発明を更に具体的に説明
するが、これらの実施例は本発明の一例を示すものであ
り、本発明はこれらになんら限定されるものではない。
するが、これらの実施例は本発明の一例を示すものであ
り、本発明はこれらになんら限定されるものではない。
【００１４】実施例１ アトピー性皮膚炎患者の皮膚からのセラミダーゼ生産菌
の単離 少量のアトピー性皮膚炎患者の落屑（表皮のはがれ落ち
た物）を１００μｌのＳＭ合成培地（０．０５％リン酸
水素二カリウム、０．０５％塩化アンモニウム、０．０
５％スフィンゴミエリン、０．０５％タウロデオキシコ
ール酸ナトリウム、０．５％塩化ナトリウム、ｐＨ７．
２）に取り、２５℃で３日間培養を行う。その培養液か
ら５μｌを取り出し、１００μｌのＳＭ合成培地に植え
継いだ。同じ培養操作をもう一度行った後、培養液をＳ
Ｍ含有トリプトソーヤ寒天培地（０．０５％スフィンゴ
ミエリン、０．０５％タウロデオキシコール酸ナトリウ
ムを含むトリプトソーヤ寒天培地）にまき、培養後得ら
れたコロニーを１００μｌのＳＭ合成培地で培養した。
この培養液中のスフィンゴミエリンの分解物を薄層クロ
マトグラフにより分析し、分解活性の強いコロニーの選
択を行った。薄層クロマトグラフは培養液２０μｌを蒸
発乾固した試料を２０μｌのクロロホルム／メタノール
（２：１）液に溶解し、遠心分離により不要物を除いた
上清１０μｌをＴＬＣプレート（メルク社シリカゲル６
０）にのせ、クロロホルム／メタノール／アンモニア水
溶液（９０：２０：０．５）で展開した。展開されたＴ
ＬＣプレートはオルシノール−硫酸で焼き付けた後、ク
マシーブリリアントブルー染色液によって染色を行っ
た。選択されたコロニーは以上の操作を繰り返し行いス
フィンゴミエリンをスフィンゴシンまで分解する菌株の
単離を行った。以上の操作により、スフィンゴミエリン
を分解する活性を持つＡＮ−１７株が単離された。本菌
株のＳＭ合成培地培養上清中にはスフィンゴミエリンの
分解産物であるセラミドとセラミドの分解産物であるス
フィンゴシンが薄層クロマトグラフィーにより検出され
た。またＴＬＣプレートをニンヒドリンにより染色した
結果からもスフィンゴシンが生成していることが確認さ
れた。この結果は本菌株がスフィンゴミエリナーゼ及び
セラミダーゼを生産することを示している。
の単離 少量のアトピー性皮膚炎患者の落屑（表皮のはがれ落ち
た物）を１００μｌのＳＭ合成培地（０．０５％リン酸
水素二カリウム、０．０５％塩化アンモニウム、０．０
５％スフィンゴミエリン、０．０５％タウロデオキシコ
ール酸ナトリウム、０．５％塩化ナトリウム、ｐＨ７．
２）に取り、２５℃で３日間培養を行う。その培養液か
ら５μｌを取り出し、１００μｌのＳＭ合成培地に植え
継いだ。同じ培養操作をもう一度行った後、培養液をＳ
Ｍ含有トリプトソーヤ寒天培地（０．０５％スフィンゴ
ミエリン、０．０５％タウロデオキシコール酸ナトリウ
ムを含むトリプトソーヤ寒天培地）にまき、培養後得ら
れたコロニーを１００μｌのＳＭ合成培地で培養した。
この培養液中のスフィンゴミエリンの分解物を薄層クロ
マトグラフにより分析し、分解活性の強いコロニーの選
択を行った。薄層クロマトグラフは培養液２０μｌを蒸
発乾固した試料を２０μｌのクロロホルム／メタノール
（２：１）液に溶解し、遠心分離により不要物を除いた
上清１０μｌをＴＬＣプレート（メルク社シリカゲル６
０）にのせ、クロロホルム／メタノール／アンモニア水
溶液（９０：２０：０．５）で展開した。展開されたＴ
ＬＣプレートはオルシノール−硫酸で焼き付けた後、ク
マシーブリリアントブルー染色液によって染色を行っ
た。選択されたコロニーは以上の操作を繰り返し行いス
フィンゴミエリンをスフィンゴシンまで分解する菌株の
単離を行った。以上の操作により、スフィンゴミエリン
を分解する活性を持つＡＮ−１７株が単離された。本菌
株のＳＭ合成培地培養上清中にはスフィンゴミエリンの
分解産物であるセラミドとセラミドの分解産物であるス
フィンゴシンが薄層クロマトグラフィーにより検出され
た。またＴＬＣプレートをニンヒドリンにより染色した
結果からもスフィンゴシンが生成していることが確認さ
れた。この結果は本菌株がスフィンゴミエリナーゼ及び
セラミダーゼを生産することを示している。
【００１５】実施例２ 酵素活性測定 セラミダーゼ活性の測定は次のようにして行う。基質溶
液（炭素数１６の脂肪酸を持つ14Ｃ放射性同位元素ラベ
ルされたセラミド（Ｃ１６−14Ｃ−Ｃｅｒ）２５ｐｍｏ
ｌ、０．２５％トリトンＸ−１００を含む５０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液ｐＨ８．５）１５μｌに酵素液１５μｌを
加え３７℃で１．５時間反応させる。１５０μｌのクロ
ロホルム／メタノール（２：１）を加え反応を止め、濃
縮遠心機で反応液を濃縮し、これをＴＬＣプレート（シ
リカゲル６０、メルク社製）にのせ、クロロホルム／メ
タノール／アンモニア（９０：２０：０．５）で展開し
た後、イメージングアナライザーＢａｓ１０００（富士
写真フィルム社製）を用いセラミドの量を定量する。活
性は１ｎｍｏｌのセラミドを１分間に分解する量を１Ｕ
とすると本菌株は培養上精１ｍｌ中に１．６ｍＵのセラ
ミダーゼを生産する。
液（炭素数１６の脂肪酸を持つ14Ｃ放射性同位元素ラベ
ルされたセラミド（Ｃ１６−14Ｃ−Ｃｅｒ）２５ｐｍｏ
ｌ、０．２５％トリトンＸ−１００を含む５０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液ｐＨ８．５）１５μｌに酵素液１５μｌを
加え３７℃で１．５時間反応させる。１５０μｌのクロ
ロホルム／メタノール（２：１）を加え反応を止め、濃
縮遠心機で反応液を濃縮し、これをＴＬＣプレート（シ
リカゲル６０、メルク社製）にのせ、クロロホルム／メ
タノール／アンモニア（９０：２０：０．５）で展開し
た後、イメージングアナライザーＢａｓ１０００（富士
写真フィルム社製）を用いセラミドの量を定量する。活
性は１ｎｍｏｌのセラミドを１分間に分解する量を１Ｕ
とすると本菌株は培養上精１ｍｌ中に１．６ｍＵのセラ
ミダーゼを生産する。
【００１６】実施例３ 基質特異性 ０．１％ルブロール（Lubrol) を含む２０ｍＭ酢酸緩衝
液ｐＨ６．０中で脂肪酸鎖長の異なる３種の14Ｃ−セラ
ミド（Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８）に対して酵素を３７
℃、２時間あるいは１９時間反応させたところ図１に示
したようにＣ１６の14Ｃ−セラミドを最も良く分解し
た。図１の縦軸は分解率（％）、横軸は時間（ｈ）を示
す。
液ｐＨ６．０中で脂肪酸鎖長の異なる３種の14Ｃ−セラ
ミド（Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８）に対して酵素を３７
℃、２時間あるいは１９時間反応させたところ図１に示
したようにＣ１６の14Ｃ−セラミドを最も良く分解し
た。図１の縦軸は分解率（％）、横軸は時間（ｈ）を示
す。
【００１７】実施例４ 至適ｐＨ 本発明の酵素の至適ｐＨは図２に示すようにｐＨ８．０
〜ｐＨ９．０であり、ｐＨ７．５〜１０．５付近で比較
的高い活性を示す。活性測定に用いる緩衝液はｐＨ４．
０〜６．０においては２５ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０
〜７．５においては２５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５
〜９．０においてはトリス塩酸緩衝液、ｐＨ９．０〜１
０．５においては２５ｍＭグリシン緩衝液を使用する。
図２は本発明の酵素の至適ｐＨを示す図であり、縦軸は
分解率（％）、横軸は反応ｐＨを示す。図中白丸印は酢
酸緩衝液を、黒丸印はリン酸緩衝液を、白四角印はトリ
ス塩酸緩衝液を、黒四角印はグリシン緩衝液を示す。
〜ｐＨ９．０であり、ｐＨ７．５〜１０．５付近で比較
的高い活性を示す。活性測定に用いる緩衝液はｐＨ４．
０〜６．０においては２５ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０
〜７．５においては２５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５
〜９．０においてはトリス塩酸緩衝液、ｐＨ９．０〜１
０．５においては２５ｍＭグリシン緩衝液を使用する。
図２は本発明の酵素の至適ｐＨを示す図であり、縦軸は
分解率（％）、横軸は反応ｐＨを示す。図中白丸印は酢
酸緩衝液を、黒丸印はリン酸緩衝液を、白四角印はトリ
ス塩酸緩衝液を、黒四角印はグリシン緩衝液を示す。
【００１８】実施例５ 温度安定性 酵素液を氷上、２４℃、３７℃で１２時間放置した後、
０．０５％ブロール、０．２５％トリトンＸ−１００を
含む５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ６．０中で14Ｃ−セラミド
（Ｃ１６）に対して各酵素を３７℃、１．５時間あるい
は１３．５時間反応させた時の相対活性を図３に示し
た。図３の縦軸は相対活性（％）、横軸は時間（ｈ）を
示す。図３に示されたように本酵素は３７℃で約２０％
の活性の低下が見られるが２４℃ではほとんど活性の低
下は見られない。
０．０５％ブロール、０．２５％トリトンＸ−１００を
含む５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ６．０中で14Ｃ−セラミド
（Ｃ１６）に対して各酵素を３７℃、１．５時間あるい
は１３．５時間反応させた時の相対活性を図３に示し
た。図３の縦軸は相対活性（％）、横軸は時間（ｈ）を
示す。図３に示されたように本酵素は３７℃で約２０％
の活性の低下が見られるが２４℃ではほとんど活性の低
下は見られない。
【００１９】実施例６ 本発明の酵素をｐＨ８．５、２５ｍＭトリス緩衝液中、
各種濃度トリトンＸ−１００でＣ１６−14Ｃ−セラミド
に３７℃、１．５時間作用させた結果を図４に示す。本
発明の酵素はトリトンＸ−１００が０．２５％で活性が
最大となった。図４の縦軸は分解率（％）を、横軸はト
リトンＸ−１００の濃度（％）を示す。
各種濃度トリトンＸ−１００でＣ１６−14Ｃ−セラミド
に３７℃、１．５時間作用させた結果を図４に示す。本
発明の酵素はトリトンＸ−１００が０．２５％で活性が
最大となった。図４の縦軸は分解率（％）を、横軸はト
リトンＸ−１００の濃度（％）を示す。
【００２０】
【発明の効果】本発明によって、アトピー性皮膚炎増悪
に関与すると考えられる、セラミドを分解する酵素を生
産する微生物が単離され提供された。この微生物が純粋
培養できるようになったことにより、この微生物を駆除
することによるアトピー性皮膚炎の治療あるいは症状の
軽減作用を持つ薬剤の新たな開発が容易になった。また
この微生物の検出法の開発が可能となりアトピー性皮膚
炎の患者における起炎菌の同定が容易になった。更にこ
の微生物の生産するセラミダーゼが得られたことによ
り、この酵素を不活化することによりアトピー性皮膚炎
の治療あるいは症状の軽減作用を持つ薬剤の開発が可能
となった。またこの微生物によりセラミダーゼが安価に
大量に生産できるようになった。
に関与すると考えられる、セラミドを分解する酵素を生
産する微生物が単離され提供された。この微生物が純粋
培養できるようになったことにより、この微生物を駆除
することによるアトピー性皮膚炎の治療あるいは症状の
軽減作用を持つ薬剤の新たな開発が容易になった。また
この微生物の検出法の開発が可能となりアトピー性皮膚
炎の患者における起炎菌の同定が容易になった。更にこ
の微生物の生産するセラミダーゼが得られたことによ
り、この酵素を不活化することによりアトピー性皮膚炎
の治療あるいは症状の軽減作用を持つ薬剤の開発が可能
となった。またこの微生物によりセラミダーゼが安価に
大量に生産できるようになった。
【図１】本発明による酵素の基質特異性を示すグラフで
ある。
ある。
【図２】本発明による酵素の至適ｐＨを示すグラフであ
る。
る。
【図３】本発明による酵素の温度安定性を示すグラフで
ある。
ある。
【図４】本発明による酵素に対する界面活性剤の影響を
示すグラフである。
示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｒ 1:385） (Ｃ１２Ｑ 1/34 Ｃ１２Ｒ 1:385）
Claims (3)
- 【請求項１】 シュードモナス属に属し、８．０〜９．
０の至適ｐＨをもつセラミダーゼ生産菌。 - 【請求項２】 シュードモナス属に属するセラミダーゼ
生産能力のある微生物を培養し、培養物よりセラミダー
ゼを採取することを特徴とするセラミダーゼの製造方
法。 - 【請求項３】 セラミダーゼ生産性のシュードモナス属
細菌を検出することを特徴とするアトピー性皮膚炎起炎
菌の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19406896A JP3729468B2 (ja) | 1996-07-05 | 1996-07-05 | シュードモナス属に属するセラミダーゼ生産菌 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19406896A JP3729468B2 (ja) | 1996-07-05 | 1996-07-05 | シュードモナス属に属するセラミダーゼ生産菌 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1014563A true JPH1014563A (ja) | 1998-01-20 |
| JP3729468B2 JP3729468B2 (ja) | 2005-12-21 |
Family
ID=16318433
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19406896A Expired - Fee Related JP3729468B2 (ja) | 1996-07-05 | 1996-07-05 | シュードモナス属に属するセラミダーゼ生産菌 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3729468B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0980912A1 (en) * | 1998-08-20 | 2000-02-23 | Takara Shuzo Co. Ltd. | Alkaline ceramidase (E.C. 3.5.1.23) gene from Pseudomonas aeruginosa |
| EP1287815A1 (en) * | 2001-08-31 | 2003-03-05 | Cosmoferm B.V. | Use of a sphingoid base for inhibiting ceramidase activity |
| US7045322B1 (en) | 1998-03-31 | 2006-05-16 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Process for producing lysosphingolipids |
-
1996
- 1996-07-05 JP JP19406896A patent/JP3729468B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7045322B1 (en) | 1998-03-31 | 2006-05-16 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Process for producing lysosphingolipids |
| EP0980912A1 (en) * | 1998-08-20 | 2000-02-23 | Takara Shuzo Co. Ltd. | Alkaline ceramidase (E.C. 3.5.1.23) gene from Pseudomonas aeruginosa |
| US6258581B1 (en) | 1998-08-20 | 2001-07-10 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Ceramidase gene |
| US6489117B2 (en) | 1998-08-20 | 2002-12-03 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Ceramidase gene |
| USRE38689E1 (en) | 1998-08-20 | 2005-01-25 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Ceramidase gene |
| EP1287815A1 (en) * | 2001-08-31 | 2003-03-05 | Cosmoferm B.V. | Use of a sphingoid base for inhibiting ceramidase activity |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3729468B2 (ja) | 2005-12-21 |
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