DE3912226C2 - Reagens für die Analyse von Triglyceriden und Analysenmethode für Triglyceride - Google Patents
Reagens für die Analyse von Triglyceriden und Analysenmethode für TriglycerideInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein nützliches Reagens
für die Analyse von Triglyceriden sowie eine Analysenmethode
für die Bestimmung von Triglyceriden.
Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf
ein Reagens, welches Lipasen in Kombination mit Monoglycerid
lipasen enthält, wobei eine Monoglyceridlipase verwendet wird, die
aus dem Mikroorganismus Bacillus stearothermophilus, Stamm H-165
(FERM-BP-1673) erhältlich ist,
und welches Reagens sich für die schnelle quantitati
ve Analyse von Triglyceriden eignet, insbesondere solchen, wel
che im Blutserum enthalten sind, und außerdem bezieht sich die
Erfindung auf eine Analysenmethode für die Bestimmung von Tri
glyceriden unter Verwendung dieses Reagens.
Das in Proben enthaltene Triglycerid, insbesondere in Körper
flüssigkeiten enthaltene Triglycerid, ist bisher derart analy
siert worden, daß man das Triglycerid unter Verwendung von
Lipasen hydrolytisch bis zum Glycerin und zur Fettsäure abbau
te, wobei als Zwischenprodukte das Diglycerid und dann das
Monoglycerid gebildet wurden. Anschließend hat man das
freigesetzte Glycerin oder die freigesetzte Fettsäure
mittels enzymatischer oder chemischer Reaktionen bestimmt.
Eine solche Bestimmung kann beispielsweise in einfacher
Weise unter Verwendung von Elektroden oder Indikatoren er
folgen.
Um eine wirksame Analyse von im Blutserum enthaltenem
Triglycerid durchführen zu können, hat man proteolytische
Enzyme, wie Proteasen und Lipoproteinlipasen verwendet,
um zunächst das Triglycerid von daran gebundenen Proteinen
zu befreien. Anschließend wurde dann das Triglycerid ana
lysiert. Die Japanische Patentveröffentlichung Nr. 9518/1979
(Japanische Patentanmeldung Nr.114493/1978) hat für diesen
Zweck sowohl Lipasen als auch Proteasen vorgeschlagen. Zu
sätzlich sind zwecks Förderung der Hydrolysereaktion der
Triglyceride unter Bildung von Glycerin eine Kombination
der verschiedensten Lipasen, welche unterschiedliche Eigen
schaften aufweisen, sowie ein Zusatz oberflächenaktiver
Mittel oder chemischer Reagenzien zu der Probelösung vor
geschlagen worden. Beispielsweise ist eine Hydrolyse un
ter Verwendung einer Kombination von Lipasen mit unter
schiedlichen Eigenschaften aus den folgenden Veröffentli
chungen bekannt: Japanische Offenlegungsschrift Nr. 25694/
1977, Japanische Patentveröffentlichung Nr. 29/1981 und
Japanische Patentveröffentlichung Nr. 28276/1982. Eine
Hydrolyse unter Verwendung einer Kombination aus Lipasen
und Cholesterinesterasen wird in der Japanischen Patent
veröffentlichung Nr. 46799/1981 beschrieben. Eine Hydroly
se unter Verwendung einer Kombination aus Lipasen und ober
flächenaktiven Mitteln ist aus der Japanischen Patent
veröffentlichung Nr. 39 158/1982 bekannt. Die Verwendung
einer Kombination aus Lipasen, oberflächenaktiven Mitteln
und Phenol- oder Anilinderivaten für die Hydrolysereaktion
ist aus der Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 5677/1983
bekannt. Die Hydrolyse unter Verwendung einer Kombination
aus Lipasen, Carboxyesterasen, welche aus Schweineleber
stammen, und Alkalimetall- oder Erdalkalimetallalkylsulfa
ten wird in der Japanischen offengelegten Patentanmel
dung Nr. 64 495/1974 beschrieben. Schließlich wird die Hydro
lyse gemäß der Japanischen offengelegten Patentanmeldung
Nr. 11987/1977 unter Verwendung einer Kombination aus
Lipasen, Pankreas-Lipasen und Salzen der Gallensäure
durchgeführt.
In der U.S.-Patentschrift 4 056 442 wird die Verwendung einer
aus zwei Triglyceridlipasen bestehenden Zusammensetzung im
Rahmen eines Triglyceridassays gelehrt. Im Rahmen der dort
offenbarten Zusammensetzung wirken zwei spezielle Triglyce
ridlipasen in synergistischer Weise zusammen.
Wie vorstehend bereits erläutert, werden die üblichen
analytischen Methoden derart durchgeführt, daß man zu
nächst das Triglycerid von daran gebundenen Proteinen
abtrennt und dann die hydrolytische Spaltung des Trigly
cerids unter Bildung von Glycerin in Gang setzt. Die
Hydrolysegeschwindigkeit ist jedoch relativ gering, so
daß für die Durchführung der Analyse eine beträchtliche
Zeitspanne erforderlich ist, denn obwohl fast alle in
solchen Analysenmethoden verwendeten Lipasen prinzipiell
dazu geeignet sind, um das Triglycerid bis zum Glycerin
zu hydrolysieren, sind sie nicht aktiv genug, um das
während der Hydrolyse des Triglycerids gebildete β-Mono
glycerid schnell weiter zu spalten und daher verläuft die Hydro
lyse dieses Monoglycerids bis zum Glycerin sehr langsam.
Es wäre daher sehr erwünscht, die Hydrolysereaktion des
Monoglycerids zu beschleunigen, um das Glycerin in kürzerer
Zeit zu bilden und dadurch die für die Analyse insgesamt
erforderliche Zeit zu verkürzen.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung isolierten nun
einen Mikroorganismus, welcher ein H-165-Stamm des Genus
Bacillus ist, aus dem Erdreich in der Nähe der heißen
Quelle des Badeorts Kirishima, Kagoshima-ken, Japan, welcher
überraschenderweise eine Monoglyceridlipase erzeugt, wel
che dazu geeignet ist, um die Hydrolyse eines Monoglycerids
bis zum Glycerin zu katalysieren. Die Monoglycerid-Lipase
wird gemäß der Japanischen Patentanmeldung Nr. 80299/1987
durch Züchtung dieses Bacillus-Stammes gewonnen. Die Er
finder haben weiterhin festgestellt, daß die so zugängliche
Monoglycerid-Lipase eine sehr starke Wirkung auf ein
α- oder β-Monoglycerid ausübt, ganz im Gegensatz zu
den bisher bekannten Lipasen, welche diesbezüglich nur
eine schwache Aktivität haben. Darüberhinaus wurde
gefunden, daß diese Monoglycerid-Lipase einen Optimum-
pH-Wert bei etwa 5 hat, einen isoelektrischen Punkt von
4,6 aufweist und ein niedriges Molekulargewicht von 27000
hat. Das Aktivitäts-Maximum liegt bei einer optimalen
Temperatur von 75°C und die Lipase zeigt eine ausgezeichne
te thermische Beständigkeit, so daß sie bei 70°C noch kaum
desaktiviert wird und selbst nach einer Behandlung bei 90°C
immer noch 20% ihrer ursprünglichen Aktivität beibehält.
Aufgrund weiterer intensiver Studien haben die Erfinder
festgestellt, daß es durch die kombinierte Anwendung die
ser neuen Monoglycerid-Lipase und anderen Lipasen möglich
ist, die für die Analyse von Triglycerid, welches in einer
Probelösung enthalten ist, erforderliche Zeit wesentlich
zu verkürzen, weil die Monoglycerid-Lipase spezifisch
auf das aus dem Triglycerid über das durch die Wirkung von
Lipase gebildete Diglycerid weiterhin gebildete Monoglycerid
sehr stark einwirkt. Hierdurch wird die gesamte Hydrolyse
reaktion, welche vom Triglycerid bis zum Glycerin führt,
sehr stark beschleunigt.
Aufgrund dieser Forschungsergebnisse wird erfindungsgemäß
ein Reagens für die Analyse von Triglycerid zur Verfügung ge
stellt, welches Lipase(n) in Kombination mit Monoglycerid-
Lipase(n) enthält, wobei eine Monoglyceridlipase verwendet wird,
die aus dem Mikroorganismus Bacillus stearothermophilus,
Stamm H-165 (FERM BP 1673) erhältlich ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ent
hält das erfindungsgemäße Reagens für die Analyse von Tri
glycerid außer Lipase(n) und Monoglycerid-Lipase(n) auch noch
Reagentien zur Bestimmung des freigesetzten Glycerins.
Die erfindungsgemäße Analysenmethode zur Bestimmung von Tri
glycerid besteht darin, daß man eine Probelösung, welche Tri
glycerid enthält, mit einem System in Berührung bringt, wel
ches die Monoglycerid-Lipase enthält, wodurch Glycerin und
Fettsäure freigesetzt wird und dann Komponenten, welche in
einer Reaktion zur meßtechnischen Bestimmung des Gehaltes
an Glycerin oder Fettsäuren verbraucht oder gebildet werden,
meßtechnisch auswertet.
Die Erfindung wird anhand der Zeichnungen kurz erläutert.
Fig. 1 zeigt eine graphische Darstellung für die benötigte
Reaktionszeit in Anwesenheit oder Abwesenheit der Mono
glycerid-Lipase (0,2 U/ml);
Fig. 2 zeigt eine Kurve für den optimalen pH-Wert der
erfindungsgemäß verwendeten Monoglycerid-Lipase.
Fig. 3 zeigt eine in graphischer Darstellung eine Kurve
für die optimale Temperatur des in Fig. 2 verwendeten En
zyms.
Fig. 4 zeigt in graphischer Darstellung eine pH-Stabili
tätskurve für das in Fig. 2 verwendete Enzym.
Fig. 5 zeigt eine thermische Stabilitätskurve für das
in Fig. 2 verwendete Enzym.
Fig. 6 zeigt eine bei der Reinigung des in Fig. 2 verwen
deten Enzyms sich ergebende Eluierungskurve.
Fig. 7 zeigt in graphischer Darstellung eine Eichkurve
für ein Monoglycerid.
Fig. 8 zeigt die Wirkung einer verkürzten Reaktionszeit
bei der Analyse von in Seren enthaltenem Triglycerid
in Anwesenheit der Monoglycerid-Lipase und
Fig. 9 zeigt den Unterschied in den Eichkurven für Tri
glycerid in Anwesenheit und Abwesenheit der Monoglycerid-
Lipase (0,2 U/ml).
Die Art der im Rahmen der Erfindung verwendeten Mono
glycerid-Lipase ist nicht besonders beschränkt, sofern
diese zumindestens die Reaktion in hohem Ausmaß kataly
siert, gemäß welcher Glycerin und Fettsäure aus einem
β-Monoglycerid gebildet wird, und welche gleichzeitig
praktisch nicht oder nur sehr schwach auf das Triglycerid
und das Diglycerid einwirkt.
Eine der erfindungsgemäß eingesetzten Monoglycerid-Lipasen ist
erhältlich, wenn man den Mikroorganismus Bacillus
stearothermophilus H-165 (FERM BP-1673) in einem geeigne
ten Nährmedium züchtet.
Die Erfindung wird nachstehend im einzelnen unter Be
zugnahme auf die Monoglycerid-Lipase erläutert, welche
unter Verwendung des Bacillus stearothermophilus H-165-
Stamm (FERM BP-1673) erhältlich ist.
Monoglycerid + H₂O → Glycerin + Fettsäure
(bei dem Monoglycerid kann es sich entweder um
ein α- oder um ein β-Monoglycerid handeln).
27 000 ± 2700 (bestimmt unter
Verwendung einer Säule mit einer
Füllung aus einem Polyvinylgel
"TSK 3000 SW" (Handelsbezeichnung;
Produkt der Toyo Soda Manufac
turing Co.Ltd.), unter Verwen
dung eines 50 mM Phosphatpuffers
(pH 6,5), welcher 0,2 M NaCl ent
hält, als mobile Phase).
Es wird die nachstehend beschriebene Meßmethode für
die enzymatische Aktivität verwendet. Man läßt Mono
laurin und das Enzym 10 Minuten lang miteinander re
agieren, wobei man getrennt einmal ein Dimethylglutarat
puffer (pH 4-7; Kurve -⚫-,
Fig. 2) und zum anderen einen Tris-HCl-Puffer(pH 7-9,5;
Kurve -∆- in Fig. 2) verwendet. Die Reaktionsmi
schung wird jeweils 2 Minuten gekocht, um das Enzym
zu inaktivieren und dadurch die Reaktion abzubrechen.
Die Reaktionsmischung wird anschließend bei 37°C in
kubiert und dann erfolgt eine enzymatische Bestimmung
der Menge an gebildetem Glycerin. Die Ergebnisse sind
in Fig. 2 wiedergegeben. Der optimale pH-Wert liegt
demgemäß bei etwa 5.
Unter Verwendung eines PIPES-NaOH-Puffers (pH 7,3) wer
den einzelne Reaktionen bei den in Fig. 3 angegebenen
Temperaturen durchgeführt. Die Reaktionsmischungen wer
den im Anschluß an die entsprechenden Reaktionen gekocht.
Entsprechend der nachstehend beschriebenen Meßmethode
werden die Mengen an gebildetem Glycerin getrennt be
stimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 angegeben, und
danach liegt die maximale Aktivität bei einer Tempera
tur von 75°C.
Es werden Lösungen (1,0 U/ml) des Enzyms getrennt her
gestellt unter Verwendung von 10 mM-Dimethylglutar
säure-NaOH-Puffer(pH 4-7; Kurve -○- in Fig. 4),
in Tris-HCl-Puffer(pH 8-9; Kurve -⚫- in Fig. 4)
und in Glycin-NaOH-Puffer (pH 9 - 10; Kurve -∆- in
Fig. 4). Nachdem man die einzelnen Lösungen 10 Minuten
lang bei 75°C inkubiert hat, wird die Restaktivität
gemäß der nachstehend beschriebenen Meßmethode zur
Bestimmung der enzymatischen Aktivität festgestellt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 4 wiedergegeben. Die enzyma
tische Aktivität bleibt danach in einem pH-Wert-Bereich
von 7 bis 8 stabil.
Es wird eine Lösung des betreffenden Enzyms (1,0 U/ml)
in 10 mM Tris-HCl-Puffer(pH 7,5) hergestellt. Nachdem
man die Lösung 10 Minuten lang bei den in Fig. 5 angege
benen einzelnen Temperaturen inkubiert hat, wird die
Restaktivität gemäß der nachstehend beschriebenen Be
stimmungsmethode für die enzymatische Aktivität fest
gestellt. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 wiedergegeben,
danach bleibt die enzymatische Akivität bis zu Tempera
turen von 70°C stabil.
Der isoelektrische Punkt liegt bei einem pH-Wert von
4,6 ± 0,4 (nachdem man einen Strom bei einer konstanten
Spannung von 700 V 40 Stunden lang bei 4°C unter Verwen
dung eines Ampholyts als Trägermaterial im Rahmen einer
isoelektrischen Fokussierungselektrophorese zur Einwir
kung gebracht hat, wird die enzymatische Aktivität jeder
Fraktion bestimmt).
Die Substratspezifität der Monoglycerid-Lipase wird unter
den Bedingungen festgestellt, wie sie nachstehend für die
Bestimmungsmethode der enzymatischen Aktivität der Mono
glycerid-Lipase beschrieben sind. Das Ergebnis dieser Mes
sungen ist in Tabelle I zusammengestellt. Danach wird die
maximale Aktivität bei dem Monoglycerid α- Monolaurin
festgestellt. Die Monoglycerid-Lipase zeigt keine Wirkung
bei Verwendung eines Diglycerids oder Triglycerids als
Substrat, weil in Anwesenheit der Monoglycerid-Lipase
dann kein Glycerin aufgefunden wird, welches durch Hydro
lyse aus den betreffenden Substraten gebildet werden könn
te. Die betreffenden Diglyceride stammen aus Eigelb-Leci
thin bzw. es handelt sich um 1,2-Dilinolein und 1,3-Dilino
lein. Als Triglyceridsubstrat wird Triolein eingesetzt.
Die Wirkung der Monoglycerid-Lipase auf ein β-Monoglycerid-
Substrat zeigt eine hohe Spezifität, wie sie sich aus
dem Folgenden ergibt:
- 1) Bestätigung, daß Fettsäure aus α-Linoleoyl-β- oleoyl
diglycerid als Substrat freigesetzt wird,mittels Hoch
leistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC):
- i) 50 µl Pankreas-Lipase werden zu 1,0 ml einer Reak
tionsmischung der folgenden Zusammensetzung hinzu
gesetzt: 0,5 mg α-Linoleoyl-β-oleoyl-Diglycerid,
1 ,8 mg eines nicht-ionischen oberflächenaktiven
Mittels ("Triton X-100", Handelsbezeichnung; ein
Produkt der Sigma Chemical Co), 3,8 mg Desoxycholin
säure, 20 U Colipase, 0,15 mg Calciumchlorid und
200 µl einer 0,1 M N-Tri(hydroxymethyl)methyl-3-ami
no-propansulfonsäure(TAPS)-NaOH (pH 8,3). Man läßt
diese Reaktionsmischung 10 Minuten lang bei 37°C
reagieren, worauf die Reaktion beendet wird. Eine
Anteilsmenge von 15 µl dieser Reaktionsmischung
wird auf eine Kolonne aufgegeben und dann wird ei
ne Hochleistungs-Flüssigchromatographie unter den
folgenden Bedingungen durchgeführt:
Säule: "Zorbox ODS" (Handelsbezeichnung; 4,6 mm⌀ × 25 cm).
Lösungsmittel: Acetonitril : H₂O (96 : 4)
Erkennungsmethode: Ultraviolettabsorption bei 205 nm Durchflußgeschwin digkeit: 1,2 ml/min.
Es konnte keine Oleinsäure aufgefunden werden, aber nach einer Retentionszeit von 23 Minuten wurde Linol säure festgestellt. Dieses Feststellen des Vorkommens von Linolsäure, welche an die f-Stellung gebunden war, bestätigt ,daß Pankreas-Lipase nur auf die α-Stellung eines α,β-Diglycerid-Substrats einwirkt und dieses unter Bildung eines β-Oleoyl-Monoglycerids hydrolysiert. - ii) Zu einer Reaktionslösung der gleichen Zusammensetzung, wie vorstehend angegeben, werden 0,5 U Monoglycerid-Li pase zugesetzt und man läßt die enzymatische Reaktion in der entsprechenden Weise ablaufen, wie vorstehend angegeben. Auch in diesem Fall erfolgt die Analyse der freigesetzten Fettsäuren mittels Hochleistungs- Flüssigchromatographie und in diesem Fall wurden Linol säure und Ölsäure nach Retentionszeiten von 23 Minu ten bzw. 31 Minuten aufgefunden. Dieses Ergebnis be stätigt, daß die Monoglycerid-Lipase auf das β- Monoglycerid-Substrat einwirkt, welches aus dem α,β- Diglycerid durch die Pankreas-Lipase gebildet worden war, wobei die in der α-Position gebundene Linolsäure frei gesetzt worden war. Außerdem wird das aus dem α,β-Digly cerid gebildete Glycerin aufgefunden.
- i) 50 µl Pankreas-Lipase werden zu 1,0 ml einer Reak
tionsmischung der folgenden Zusammensetzung hinzu
gesetzt: 0,5 mg α-Linoleoyl-β-oleoyl-Diglycerid,
1 ,8 mg eines nicht-ionischen oberflächenaktiven
Mittels ("Triton X-100", Handelsbezeichnung; ein
Produkt der Sigma Chemical Co), 3,8 mg Desoxycholin
säure, 20 U Colipase, 0,15 mg Calciumchlorid und
200 µl einer 0,1 M N-Tri(hydroxymethyl)methyl-3-ami
no-propansulfonsäure(TAPS)-NaOH (pH 8,3). Man läßt
diese Reaktionsmischung 10 Minuten lang bei 37°C
reagieren, worauf die Reaktion beendet wird. Eine
Anteilsmenge von 15 µl dieser Reaktionsmischung
wird auf eine Kolonne aufgegeben und dann wird ei
ne Hochleistungs-Flüssigchromatographie unter den
folgenden Bedingungen durchgeführt:
- 2) Substratspezifität der Monoglycerid-Lipase bei Verwen
dung eines α,β-Diglycerids als Substrat:
- i) Pankreas-Lipase und die Monoglycerid-Lipase läßt man auf die nachstehend beschriebenen α,β-Diglycerid-Sub strate einwirken. Deren α-Stellungen werden durch die Pankreas-Lipase hydrolysiert und dann kann die Mono glycerid-Lipase auf die gebildeten β-Monoglyceride zur Einwirkung kommen, worauf schließlich das so freige setzte Glycerin analysiert wird. Glycerid wird dabei im Hinblick auf die nachstehenden Substrate aufgefunden: α-Oleyl-β-palmitoyl-diglycerid, α-palmitoyl-β-oleoyldi glycerid und α,β-Dilinoleylglycerid. Im Gegensatz hierzu wird jedoch kein Glycerin festgestellt, wenn die Reaktions mischung nur Pankreas-Lipase enthält.
Aus Tabelle II ist ersichtlich, daß die Aktivität in
hibiert wird, wenn ein oberflächenaktives Mittel wie
"Triton X-100"(Handelsbezeichnung) und Cholsäure in ho
hen Konzentrationen zugesetzt werden. Die Aktivität der
Monoglycerid-Lipase wird jedoch nicht durch den Zusatz
zweiwertiger Metallionen, wie Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺, beeinträch
tigt.
Zu 0,4 ml einer Lösung der vorstehend angegebenen Zusammen
setzung setzt man 50 µl einer 10mM-Lösung von Monolaurin
(0,5prozentige wäßrige Lösung von "Triton X-100") hinzu.
Diese Mischung unterwirft man 2 bis 3 Minuten lang bei 37°C
einer Vorinkubation und setzt dann 50 µl einer Enzymlösung
hinzu, um die Reaktion in Gang zu setzen. Genau 10 Minuten
später setzt man 2,5 ml einer 5prozentigen Lösung von
Natriumdodecylsulfat hinzu, um die Reaktion abzubrechen.
Anschließend mißt man die Extinktion der Lösung bei 550 nm.
Bezüglich der enzymatischen Aktivität wird diese für die Er
zeugung von 1 µMol Glycerin je Minute als eine Einheit (1 U)
definiert. Die nachstehende Gleichung wird zur Berechnung der
enzymatischen Aktivität verwendet:
in welcher
ΔA 550: die Extinktion bei einer Wellenlänge von 500 nm,
2.95: das Gesamtvolumen der Reaktionsmischung (ml),
18.0: den millimolaren Extinktionskoeffizient von Wasser stoffperoxid (cm²/µMol),
50: das Volumen der verwendeten Enzymlösung (µl) und
10: die Reaktionszeit (min)
bedeutet.
ΔA 550: die Extinktion bei einer Wellenlänge von 500 nm,
2.95: das Gesamtvolumen der Reaktionsmischung (ml),
18.0: den millimolaren Extinktionskoeffizient von Wasser stoffperoxid (cm²/µMol),
50: das Volumen der verwendeten Enzymlösung (µl) und
10: die Reaktionszeit (min)
bedeutet.
Die vorstehende Erläuterung bestätigt, daß das durch Züch
ten des Bacillus stearothermophilus Stamm H-165 (FERM BP
1673) erhältliche Enzym eine hohe Substratspezifität für
ein Monoglycerid aufweist und in der Lage ist, die nach
stehende Reaktion zu katalysieren:
Monoglyceride + H₂O → Glycerin + Fettsäuren
Der Mikroorganismus Bacillus stearothermophilus Stamm H-165
ist ein Beispiel für Mikroorganismen, welche in der Lage
sind, Monoglyceridlipase zu erzeugen. Er weist die nachstehen
den mycologischen Eigenschaften auf:
- (1) Nähragar-Schrägkultur:
Es zeigt sich ein grau-weißliches Wachstum mit gelblichem Farbeinschlag. Das Wachstum ist faserförmig. Das Wachstum ist gut und es wird kein lösliches Pigment erzeugt. - (2) Nähragar-Flachkultur:
Es zeigt sich ein graues Wachstum mit gelblichem Farbein schlag. Es wird eine kreisförmige vollständige flache Kolonie gebildet, aber kein lösliches Pigment erzeugt. - (3) Flüssiges Nährmedium:
Es wird ein gutes Wachstum beobachtet. Das Nährmedium trübt sich gleichmäßig. - (4) BCP-Milchmedium:
Das Medium bleibt unverändert.
- (1) Form und Gestaltung:
Es handelt sich bei dem Stamm um einen zylindrischen Bazil lus, der entweder stäbchenförmig ausgebildet ist oder an einem oder beiden Enden eine leichte Krümmung zeigt. Es handelt sich um einzelne Zellen oder diese sind je zu Zweien miteinander verbunden. Gelegentlich werden auch kurze Ketten gebildet. - (2) Größe;
0,6 bis 0,8 × 2,5 bis 4,0 µm. - (3) Mobilität:
Keine. - (4) Spore:
In einem zentralen Teil jeder Zelle oder an einer Stelle in der Nähe der Zellwandung befindet sich eine Spore in Form eines Eis oder eines länglichen Kreises. Seine Größe beträgt 0,8 bis 1,2 × 1,5 bis 2,0 µm. Die Zelle wird durch die Spore ausgeweitet. - (5) Polymorphismus:
Keiner.
Aufgrund der vorstehend beschriebenen mykologischen Eigen
schaften kann der Stamm H-165 als ein thermophiles aerobisches
Bakterium beschrieben werden, welches in Form eines nicht be
weglichen zylindrischen Bazillus von Stäbchenform oder mit
leicht gekrümmten Enden vorkommt, welcher gramposi
tiv ist, eine Größe von 0.6 bis 0.8 × 2.5 bis 4.0 µm aufweist,
eine einzige Spore ausbildet und dadurch eine Zellerweiterung
erfährt, welcher Glucose oxidativ zersetzt und eine Säure er
zeugt und bezüglich der Katalase- und Oxidaseproduktivität sich
positiv verhält. Ein Stamm mit diesen verschiedenen Eigenschaf
ten sollte daher zur Familie Bacillus gehören, weil es sich
um ein sporenförmiges, grampositives, aerobisches und stäbchen
förmiges Bakterium handelt. Andere Mikroorganismenstämme,
welche die gleichen Eigenschaften wie vorstehend angegeben
aufweisen, und zwar bezüglich der Acetoinproduktivität, der
Indolproduktivität, der Gasproduktivität aus Glucose und der
Wachstumsmöglichkeit unter anaerobischen Bedingungen sind
(A) Bacillus stearothermophilus, (B) Bacillus alcalophilus,
(C) Bacillus badius und (D) Bacillus firmus. Die mykologi
schen Eigenschaften dieser Bakterinstämme und derjenigen des
Stammes H-165 werden nachstehend miteinander verglichen.
[+: positiv, -: negativ, d: unterschiedlich in Abhängigkeit
vom jeweiligen Stamm, ND: keine Daten vorhanden].
Aus dem vorstehenden Vergleich ergibt sich, daß die Eigen
schaften des Stammes H-165 denjenigen von Bacillus stearo
thermophilus außerordentlich nahekommen, mit Ausnahme der
Abbaufähigkeit für Gelatine. Daher wurde der Stamm H-165 als
zu Bacillus stearothermophilus gehörig eingeordnet und als
Bacillus stearothermophilus H-165 benannt. Die Hinterlegung
erfolgte unter der Nr. FERM BP-1673 beim Fermentation Research
Institute, Agency of Industrial Science and Technology,
Ministry of International Trade and Industry, the Government
of Japan.
Ein Monoglyceridlipase bildender Mikroorganismus des Stamms H-165 (FERM BP-1673) wird unter
Bedingungen gezüchtet, wie sie für Antibiotika, Enzyme und
dergleichen allgemein bekannt sind und angewendet werden. Die
Züchtung kann entweder in einem flüssigen oder in einem festen
Nährmedium erfolgen. Für die industrielle Anwendung ist es vor
teilhaft, zunächst ein Medium mit Zellen eines Monoglycerid
lipase erzeugenden Mikroorganismus zu beimpfen und dann diese
Zellen unter Bedingungen einer belüfteten Submerskultur und un
ter Rühren weiter zu züchten.
Als Nährstoffquellen für das Nährmedium eignen sich alle Nähr
stoffquellen, wie sie üblicherweise für die Züchtung von Mikro
organismen eingesetzt werden. Als Quelle für Kohlenstoff kann
jede kohlenstoffhaltige Verbindung verwendet werden, solange
sie assimilierbar ist. Es ist daher beispielsweise möglich,
Kohlehydrate, wie Glucose, Succhrose, Lactose, Galactose,
Maltose, Mannit, Sorbit, Dextrin und Stärke zu verwenden. Außer
dem eigenen sich die verschiedensten organischen Säuren,
pflanzliche Öle, wie Sojabohnenöl und Olivenöl, tierische Öle
und Fette, wie Speck und Hühneröl. Als Stickstoffquelle kann
jede assimilierbare Stickstoffverbindung eingesetzt werden,
beispielsweise eignen sich Pepton, gepulverter Hefeextrakt,
Fleischextrakt, Sojabohnenmehl, Kasein, entfettetes Baumwoll
saatmehl, und dergleichen. Außerdem können auch ein oder
mehrere der verschiedensten Salze mitverwendet werden, wie
Phosphate, Magnesiumsalze, Kalziumsalze, Kaliumsalze, Natrium
salze, Zinksalze, Eisensalze, Mangansalze, Salze der Halogene,
Maisweichwasser, die verschiedensten Vitamine und andere be
kannte Zusatzstoffe.
Die Züchtungstemperatur kann an die Bedingungen angepaßt werden,
welche der Mikroorganismus der Monoglyceridlipase erzeugt,
zu seinem Wachstum und zur Bildung des gewünschten Enzyms benö
tigt. Bevorzugte Züchtungstemperaturen liegen jedoch im Be
reich von 40 bis 65°C und insbesondere im Bereich von 45 bis
50°C. Auch die Züchtungsdauer variiert in Abhändigkeit von den
Züchtungsbedingungen und es ist daher nur erforderlich, die
Züchtung zu einem geeigneten Zeitpunkt abzubrechen, indem man
den Zeitverlauf beobachtet, zu welchem das Enzym seine maximale
Aktivität erreicht. Bevorzugte Züchtungszeiten liegen zwischen
10 und 22 Stunden.
Aus dem so erhaltenen Züchtungsmedium des Monoglyceridlipase
erzeugenden Mikroorganismus wird dann die gewünschte Monogly
ceridlipase erhalten. Da das Enzym in den Zellen des Mikro
organismus erzeugt wird, werden diese Zellen durch eine ge
geeignete Methode, wie Filtrieren oder Zentrifugieren, aus dem
Züchtungsmedium abgetrennt. Diese Zellen werden kann aufgebro
chen, indem man die verschiedenen bekannten Zellaufbrechmetho
den anwendet oder auch kombiniert zur Einwirkung bringt, bei
spielsweise mechanische Aufbrechmethoden, wie Ultrabeschallung,
Bearbeitung in einer Mahlvorrichtung (French Press) und Behand
lung mittels Glasperlen, wobei ferner enzymatische Aufbrechme
thoden in Betracht kommen, wie eine Lysozymbehandlung, wodurch
schließlich eine die Monoglyceridlipase enthaltende rohe Lö
sung erhalten wird. Erforderlichenfalls kann dabei auch ein
oberflächenaktives Mittel, wie "Triton X-100" (Handelsbezeich
nung) mitverwendet werden.
Aus dieser Rohlösung wird die Monoglyceridlipase in gereinigter
Form erhalten, indem man eine bekannte und für Proteine, Enzyme
und dergleichen angewendete Isolierungs- und Reinigungsmethode
anwendet. Das Enzym kann beispielsweise durch fraktionierte
Fällung oder durch eine Ausfällung mittels Salzen isoliert
werden. Die zuerst genannte Methode wird durchgeführt, indem
man ein organisches Lösungsmittel, beispielsweise Aceton, Metha
nol, Äthanol oder Isopropanol, zu der die Monoglyceridlipase
enthaltenden Enzymrohlösung zusetzt, während bei der zuletzt
genannten Methode zu der rohen Enzymlösung ein Salz, wie
Ammoniumsulfat, Natriumchlorid oder Natriumsulfat, zugesetzt
wird. Der gebildete Niederschlag kann dann durch eine oder
mehrere unterschiedliche chromatographische Methoden gereinigt
werden, beispielsweise mittels Molekularsiebchromatographie
und/oder Elektrophorese oder durch Ultrazentrifugierung, bis
schließlich ein Produkt mit einem einzelnen Peak erhalten wird.
Es ist zweckmäßig, für die erforderliche Reinigung solche Metho
den zu verwenden, welche von den Eigenschaften der Monoglyce
ridlipase Gebrauch machen. Beispielsweise löst man den Nieder
schlag in Wasser oder einer Pufferlösung auf und dialysiert
diese Lösung gegebenenfalls durch eine semipermeable Membran.
Die Lösung oder das Dialysat wird dann einer Ionenaustausch
chromatographie auf einem Anionen austauschenden Harz unterwor
fen, beispielsweise DEAE-Cellulose, DEAE-"Sephacel" (Waren
zeichen), DEAE-"Sepharose" (Warenzeichen), DEAE-"Sephadex A-50"
(Handelsbezeichnung) oder DEAE-"Toyo Pearl" (Warenzeichen),
oder an einem Gelfiltrationsmedium, wie "Sephadex G-100" (Han
delsbezeichnung), "Sephadex G-75" (Handelsbezeichnung) oder
"Sephacryl S-200" (Handelsbezeichnung). Im Anschluß an die An
wendung von zwei oder mehreren dieser Methoden in Kombination
wird die Monoglyceridlipase durch Elektrophorese, durch Ultra
zentrifugieren oder dergleichen, weitergereinigt, bis schließ
lich ein Material mit einem einzelnen Peak erhalten wird.
Dann setzt man einen Stabilisator zu, beispielsweise einen
Zucker, wie Mannit, Succhrose oder Sorbit, oder man setzt eine
Aminosäure, wie Glutaminsäure oder Glycin, zu oder ein Peptid
oder ein Protein, wie Rinderserumalbumin. Schließlich wird
das Produkt lyophilisiert, wodurch man das Enzym in gereinig
ter Form als Pulver erhält.
Eine Monoglyceridlipase mit den vorstehend angegebenen physi
kalischen und chemischen Eigenschaften dient nur als Beispiel.
Eine eingehende Beschreibung dieser Monoglyceridlipase be
züglich ihrer physikalischen und chemischen Eigenschaften,
ihrer mykologischen Eigenschaften der Identifizierung und
Bezeichnung des Mikroorganismus, aus welchem die Lipase er
halten wird, ist der Beschreibung der japanischen Patentanmel
dung Nr. 80 299/1987 zu entnehmen.
Die zusammen mit der vorstehend beschriebenen Monoglycerid
lipase in den erfindungsgemäßen Reagenzien für die Analyse von
Triglycerid einsetzbaren Lipasen werden nachstehend näher erläu
tert.
Im Rahmen der Erfindung kann jede Lipase verwendet werden, wie
sie üblicherweise für die quantitative Analyse von Triglyceri
den eingesetzt wird, sofern sie zumindest in der Lage ist, die
Hydrolysereaktion von Triglyceriden unter Erzeugung von Di
glyceriden und Fettsäuren und die Hydrolyse der Diglyceride
zu Monoglyceriden und Fettsäuren zu katalysieren. Beispiele von
Mikroorganismen, welche solche Lipasen erzeugen, sind Rhizopus
delemar (ATCC 4858, ATCC 9374, ATCC 20134 und ATCC 24864),
Rhizopus arrhizus (ATCC 10260, ATCC 24563 und ATCC 24865),
Chromobacterium viscosum (ATCC 12472, ATCC 6918, NRRL B-3673
und FERM P-137), Aspergillus niger (ATCC 10864, ATCC 1004 und
ATCC 1018), Aspergillus flavus oryzae (ATCC 9376, ATCC 11495 und
ATCC 12891), Candida lipolytica (ATCC 8661, ATCC 20287 und
ATCC 20363), Candida cylindracea (ATCC 14830), Mucor miehei
(ATCC 16457 und ATCC 26282) sowie Mucor pusillus (ATCC 16458
und ATCC 16459). Für den gleichen Zweck können auch Lipasen
verwendet werden, welche aus Tieren zugänglich sind, beispiels
weise Rindviehpankreas. Außerdem können Lipasen Verwendung fin
den, welche durch andere bekannte Lipase erzeugende Mikroorga
nismen gebildet werden, beispielsweise solche der nachstehen
den Mikroorganismen: Pseudomonas [Y. Kosugi, J. Ferment. Tech
nol., Vol. 49, 968-980 (1971)], Corynebacterium [K. Weaber,
Appl. Microb., Vol. 21, 639-642 (1971)], Staphilococcus [J.A.
Troller, Appl. Microb., Vol. 20, 480-484 (1970)], Propioni
bacterium [A. Oterholm, Appl. Microb., Vol.20, 16-22 (1970)],
Alcaligenes [Y. Kokusho, Agric. Biol. Chem., Vol. 46, No.5,
1159-1164 (1982)]. Es gibt viele Veröffentlichungen bezüglich
Lipasen, welche von Lipase erzeugenden Mikroorganismen des
Genus Pseudomonas abstammen und diese werden beispielsweise
in den nachstehenden japanischen Patentveröffentlichungen be
schrieben:Nos. 7836/1966, 28516/1981, 28517/1981, 42312/1982,
42313/1982, 52835/1982 und 59753/1982. Darüber hinaus können
Enzyme anstelle der vorstehend beschriebenen Lipasen eingesetzt
werden, die unter der Bezeichnung Cbolesterinesterasen bekannt
sind und die gleiche Wirkungsrichtung haben. Die im Rahmen der
Erfindung einsetzbaren Lipasen sind nicht auf die vorstehend
beschriebenen speziellen Vertreter beschränkt und sie umfassen
andere bekannte Lipasen sowie solche, die durch ein geninge
nieurmäßiges Verfahren zugänglich sind.
Nachstehend wird die Methode zur Bestimmung der Aktivität von
Lipasen beschrieben.
Zusammensetzung der Reaktionsmischung | |
(ml) | |
0.2 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7.5) | |
0.2 | |
27.5 mM Dilinoleoylglycerid (15%iges Triton X-100) | 0.05 |
50 mM CaCl₂ | 0.01 |
200 mM ATP | 0.005 |
100 mM CoASH | 0.005 |
Acyl-CoA · Synthetase (50 U/ml) | 0.01 |
Wasser | Restmenge bis zum Gesamtvolumen von 0.5 ml |
0.5 ml der Lösung mit der vorstehend angegebenen Zusammen
setzung werden in ein Reagenzglas eingefüllt und 2 bis 3 Minu
ten lang bei 37°C vorinkubiert. Anschließend setzt man 50 µl
einer Enzymlösung hinzu, welche 10 mM PIPES-NaOH-Puffer (pH
7,3) und 0.1% Rinderserumalbumin enthält. Diese Mischung läßt
man 10 Minuten lang bei 37°C reagieren. Anschließend werden
nacheinander 10 mM N-Äthylmaleinsäureimid (0.5 ml) und ein
Reagenz (R-2) in einer Menge von 0.5 ml zugesetzt, dessen
Zusammensetzung nachstehend angegeben ist. Diese Reaktions
mischung läßt man weitere 5 Minuten bei 37°C reagieren. An
schließend wird die Reaktion durch Zusatz von 1.5 ml einer
0. 5%igen Natriumdodecylsulfatlösung abgebrochen. Dann wird
die Reaktionsmischung bei einer Wellenlänge von 550 nm kolo
rimetrisch untersucht. Eine Aktivität, welche 0.1 µMol Linol
säure je Minute freisetzt, wird als eine Einheit (1 U) defi
niert.
Zusammensetzung des Reagenz R-2 | |
(ml) | |
0.2 M PIPES-NaOH-Pufferlösung (pH 7.3) | |
0.05 | |
0.3% 4-Aminoantipyrin | 0.05 |
0.3% TOOS | 0.05 |
Peroxidase (45 U/ml) | 0.05 |
Acyl-CoA · Oxidase (500 U/ml) | 0.02 |
0.2 M ATP | 0.01 |
Wasser | 0.27 |
Die Lipase und die Monoglyceridlipase, die zur Herstellung
des erfindungsgemäßen Reagenz zur Analyse von Triglycerid ver
wendet werden, werden in solchen Mengen eingesetzt, daß sie
ausreichen, um die betreffende Reaktion gut ablaufen zu las
sen. Es ist daher nur erforderlich, die benötigten Mengen zu
bestimmen, welche von dem Gehalt an zu analysierendem Trigly
cerid abhängen. Üblicherweise kann die Monoglyceridlipase in
einer Menge von 0.05 U/ml oder mehr, vorzugsweise in einer
Menge von 0.1 bis 0.5 U/ml je Analysetest verwendet werden. Die
Lipasen werden in Mengen von 50 bis 1000 U/ml, vorzugsweise in
Mengen entsprechend 100 bis 500 U/ml verwendet. Jedes der ein
gesetzten Enzyme kann 50 wie es ist oder als Lösung in einer
Pufferlösung oder aber in gefriergetrockneter Form verwendet
werden.
Nachstehend wird das Reagenz zur Bestimmung des gebildeten Gly
cerins näher erläutert.
Ein solches Reagenz umfaßt Systeme, wie sie üblicherweise zur
Bestimmung von Glycerin eingesetzt werden, wobei ein auf das
erzeugte Glycerin einwirkendes Enzym verwendet wird. Bevorzugt
handelt es sich dabei um ein System unter Verwendung einer
Glycerokinase-Glycerophosphatoxidase, wobei das in Anwesenheit
von ATP unter Verwendung von Glycerokinase aus dem Glycerin
gebildete Glycero-3-phosphat durch die Einwirkung der Glycero
phosphatoxidase oxidiert wird. Gemäß einer anderen Ausführungs
form kann auch eine Bestimmung unter Verwendung einer Glycerin
oxidase verwendet werden. In diesen Meßmethoden sind geeignete
Parameter für die quantitative Bestimmung das Wasserstoffper
oxid, welches ein Endprodukt der Umsetzung darstellt, oder der
dabei verbrauchte Sauerstoff oder das dabei neu gebildete Di
hydroxyacetonphosphat oder das dabei gebildete Dihydroxyaceton.
Bei der Glycerokinase-Glycerophosphatoxidase-Methode werden
beispielsweise 0.1 bis 2 U/ml Glycerokinase, 3 bis 30 U/ml
Glycerophosphatoxidase, 1 bis 10 mM ATP und Magnesiumionen er
zeugende Salze, wie Magnesiumchlorid in einer Menge von 1 bis
10 mM, welches die enzymatische Aktivität von Glycerokinase
erhöht, zu dem Glycerin zugesetzt, welches aus dem zu analysie
renden Triglycerid entstanden ist. Unter Verbrauch von Sauer
stoff wird in einer solchen Reaktion Wasserstoffperoxid und
Dihydroxyacetonphosphat erzeugt. Anschließend kann der ver
brauchte Sauerstoff mittels Sauerstoffelektroden oder einer
Meßvorrichtung für gelösten Sauerstoff quantitativ bestimmt
werden. Eine andere Möglichkeit besteht darin, das erzeugte
Dihydroxyacetonphosphat mittels einer bekannten Methode quan
titativ zu bestimmen (vgl. Method of Enzymatic Analysis, Vol. 3,
Seiten 1314-1319). Die quantitative Bestimmung von Wasserstoff
peroxid, welches in der Reaktion erzeugt wird, kann durchge
führt werden mittels einer elektrochemischen Methode unter
Verwendung von Wasserstoffperoxidelektroden. Eine andere Mög
lichkeit besteht darin, das erzeugte Wasserstoffperoxid einer
Umsetzung mit Peroxidase, 4-Aminoantipyrin und einem färbenden
Reagenz, wie einer Phenolverbindung der nachstehenden allge
meinen Formel (I) oder einer Anilinverbindung der nachstehen
den allgemeinen Formel (II) zu unterwerfen und dann das ge
bildete färbende Material zu messen (vgl. japanische Patent
veröffentlichung Nr. 3480/1985).
in welcher X ein Halogen, Y Wasserstoff, ein Halogen, eine
niedere Alkyl- oder niedere Alkoxygruppe und Z Wasserstoff
oder eine Sulfonyl- oder Carboxylgruppe bedeutet.
in welcher R₁ Wasserstoff oder eine niedere Alkyl- oder nie
dere Alkoxygruppe ist, R₂ und R₃ jeweils eine niedere Alkyl-,
niedere Alkoxy-, acetylamidhaltige niedere Alkyl- oder sulfohal
tige niedere Alkylgruppe bedeutet.
Beispiele für geeignete Phenolverbindungen der allgemeinen
Formel (I) sind die folgenden: p-Chlorphenol, p-Bromphenol,
2,4-Dichlorphenol, 2,4-Dibromphenol und 2,4-Dichlorphenolsulfo
nat. Beispiele für geeignete Anilinverbindungen der vorstehen
den allgemeinen Formel (II) sind die folgenden: Diäthylanilin,
N,N-Diäthyl-m-toluidin, m-Methoxy-N,N-dimethylanilin, N-Äthyl-
N-(3-methylphenyl)-N-acetyläthylendiamin, Natrium-N-Äthyl-N-
(3-sulfopropyl)-m-toluidin und Natrium-N-Äthyl-N-(2-hydroxy-
3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyanilin.
Eine andere Möglichkeit zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid
besteht in der Verwendung einer Indikatorzusammensetzung, die
durch Umsetzung mit Wasserstoffperoxid ein Nachweisprodukt bil
det. Bei der Indikatorzusammensetzung kann es sich um eine
solche handeln, welche in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid
einen Farbumschlag erleidet. Hierzu gehören färbende Reagen
zien, Fluoreszenzreagenzien und Luminiszenzreagenzien. Als
färbende Reagenzien, welche innerhalb des sichtbaren Bereichs
eine Farbänderung bewirken, kann eine Mischung aus einer Sub
stanz mit Peroxidasewirkung und einem Färbe-Präkursor verwen
det werden. Als Peroxidase wird üblicherweise eine solche ver
wendet, welche aus Rettich gewonnen wird. Eine Kombination aus
4-Amino-antipyrin und der Phenolverbindung der Formel (I) wird
üblicherweise als Färbe-Präkursor eingesetzt. Eine Kombination
aus 4-Aminoantipyrin und einer Anilinverbindung der allgemei
nen Formel (II) kann aber gleichfalls als ein solcher Färbe-
Präkursor verwendet werden. Beispielsweise gibt es eine Meß
methode für Wasserstoffperoxid, in der die Menge an gefärbtem
Material durch die Farbintensität bestimmt wird, wobei dieses
Material aus der Umsetzung von 4-Aminoantipyrin, Peroxidase
und N-Äthyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin (TOOS) ent
standen ist. Es gibt aber auch Nachweismethoden zur Bestimmung
der Menge an gefärbtem Material mittels der Farbintensität,
wobei dieses gefärbte Material durch eine Umsetzung zwischen
Diäthylanilin oder Dimethylanilin und 3-Methyl-2-benzothiazoli
nonhydrazon oder durch eine Reaktion zwischen Xylenol-Orange und
einer vierwertigen Titanverbindung gebildet worden ist, die
dazu fähig ist, ein stabiles rotgefärbtes Material mit Wasser
stoffperoxid zu bilden. Es gibt außerdem Meßmethoden, in wel
chen eine Kombination aus 2,6-Dichlorphenolindophenol und
Peroxidase oder eine Kombination aus Guaiacum und Peroxidase
und dergleichen eingesetzt werden. Diese Indikatoren können
als eine gemischte Lösung verwendet werden, welche im voraus
je nach dem gewünschten Zweck hergestellt worden ist.
In den vorstehend angegebenen Reaktionen unter Verwendung von
Phenol- oder Anilinverbindungen, 4-Aminoantipyrin und Peroxi
dase kann beispielsweise ein Phenol oder TOOS in einer Menge
von etwa 0.01 bis etwa 0.1%, das 4-Aminoantipyrin in einer
Menge von 0.01 bis 0.05%, vorzugsweise 0.0,3%, und die Pero
xidase in einer Menge von 3 bis 30 U/ml, vorzugsweise von 4
bis 6 U/ml, jeweils bezogen auf die gesamte Reaktionsmischung,
zur Anwendung kommen.
Anstelle der vorstehend beschriebenen färbenden Reagenzzusam
mensetzungen können auch andere Reagenzien verwendet werden,
bei denen die Veränderung spektrophotometrisch bestimmt wird,
beispielsweise unter Einsatz von fluoreszierenden Reagen
zien, wie Homo-Vanillinsäure, welche unter dem Einfluß einer
Bestrahlung mit Ultraviolettlicht eine Fluoreszenz erzeugen,
oder es können statt dessen luminiszierende Reagenzien verwen
det werden.
In der Bestimmungsmethode, bei der Glycerinoxidase verwendet
wird, läßt man 5 bis 50 U/ml Glycerinoxidase auf das Glyce
rin einwirken, welches aus dem Triglycerid entstanden ist,
wobei unter Verbrauch von Sauerstoff Dihydroxyaceton und Was
serstoffperoxid erzeugt werden, und dann wird die Menge an
verbrauchtem Sauerstoff oder die Menge an erzeugten Dihydro
xyaceton oder die Menge anerzeugtem Wasserstoffperoxid quanti
tativ bestimmt. Bevorzugt wird dabei die Menge an erzeugtem
Wasserstoffperoxid bestimmt, wobei die gleiche Art von Reagen
zien zur Anwendung kommt wie bei der Bestimmung des Wasser
stoffperoxids mittels der Glycerokinase-Glycerophosphatoxidase-
Methode. Im Fall der Bestimmung des verbrauchten Sauerstoffs
können hierfür Sauerstoffelektroden oder Meßgeräte zur Bestim
mung des gelösten Sauerstoffs verwendet werden, wie bereits
vorstehend beschrieben. Zusätzlich kann auch gebildetes Dihy
droxyaceton in an sich bekannter Weise quantitativ bestimmt
werden (vgl. Method of Enzymatic Analysis, Vol. 3, Seiten
1442-1445).
Gemäß weiteren Ausführungsformen kann die quantitative Bestim
mung von Glycerin auch mittels der nachstehenden Arbeitswei
sen erfolgen: Glycerophosphat-Dehydrogenase und NAD werden
anstelle der vorstehend erwähnten Glycerophosphatoxidase ver
wendet, wobei dann die reduzierte Menge an NAD mittels bekann
ter Reagenzien bestimmt wird. Eine andere Bestimmungsmethode
für Glycerin, welches erzeugt worden ist, besteht darin, die
ses einer Umsetzung mit ATP und Glycerokinase zu unterwerfen,
wobei dann das aus dem ATP gebildete ADP unter Verwendung
eines Reagenz in an sich bekannter Weise gemessen wird (vgl.
Method of Enzymatic Analysis, Vol. 4, Seiten 2127 bis 2129).
Für diesen Zweck können die verschiedensten bekannten Reagen
zien verwendet werden, wie sie dem Fachmann für die Glycerin
bestimmung bekannt sind.
Um die Nachweismethode für Triglyceride zu erleichtern, kön
nen nicht-ionische oberflächenaktive Mittel, Zusatzstoffe zur
Förderung der Reaktion der Bildung von Glycerin und Fettsäuren
aus den Monoglyceriden und andere Zusatzstoffe zur Förderung
der Enzymaktivitäten verwendet werden, so daß das gebildete
Glycerin in wirkungsvoller Weise bestimmt werden kann. Bei
spielsweise kann Triton X-100 (ein Handelsprodukt der Firma
Rohm & Haas) als nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel in
einer Menge von 0.05 bis 1% verwendet werden. Magnesiumchlo
rid dient als Mittel zur Förderung der Glycerokinaseaktivität
in einer Menge von 1 bis 10 mM und eine PIPES-NaOH-Pufferlö
sung als Mittel, um den pH-Wert der Reaktionsmischung auf
einem bestimmten Wert zu halten, beispielsweise im Bereich von
6 bis 8, vorzugsweise bei 7.3, wobei der Puffer in einer Kon
zentration von 20 bis 500 mM verwendet wird.
Das erfindungsgemäße Reagenz zur Durchführung einer Analyse
auf Triglyceride kann hergestellt werden, indem man die Lipa
sen und die Monoglyceridlipase zusammen mit vorbestimmten
Mengen an Zusatzstoffen, die aus den vorstehend genannten Zu
satzstoffen in geeigneter Weise ausgewählt worden sind, sowie
mit Enzymen zur Bestimmung des erzeugten Glycerins und ge
wünschtenfalls Indikatoren für die Bestimmung des gebildeten
Wasserstoffperoxids miteinander vermischt. Das erfindungsgemäße
Reagenz kann in der Form verwendet werden, wie es für die be
treffende Nachweismethode geeignet ist, beispielsweise in
Form einer fertigen Packung, bei der ein fester Film mit dem
Reagenz beschichtet worden ist.
Bei der Analyse der in einer Probelösung enthaltenen Triglyce
ride können die zugleich mit dem Glycerin gebildeten Fettsäu
ren quantitativ bestimmt werden anstelle der vorstehend genann
ten Meßmethoden für Glycerin, welches nur eine Komponente der
Monoglyceride darstellt. In diesem Fall kann dann ein Reagenz
zur Bestimmung von Fettsäuren anstelle des Reagenz zur Bestim
mung von Glycerin verwendet werden (vgl. japanische Offenle
gungsschrift Nr. 8797/1982). Es kann jede beliebige Probenlö
sung verwendet werden, solange diese Triglyceride als Substrat
für Lipasen enthält. Beispiele hierfür sind Körperflüssigkeiten
und Blutserum. Für eine Analyse werden diese Lösungen üblicher
weise in einer Menge von 0.01 bis 5 ml eingesetzt. Die erfin
dungsgemäße Analysenmethode läuft bei Einsatz eines Glycero
kinase-Glycerophosphatoxidase-Systems in der nachstehend
schematisch dargestellten Weise ab:
Eine Triglycerid enthaltende Probelösung und eine vorherbe
stimmte Menge des Reagenz für die Triglyceridanalyse werden
inkubiert und dann werden die gemäß der vorstehend angegebenen
Reaktion verbrauchten oder erzeugten Komponenten quantitativ
bestimmt. Wenn die zu bestimmende Komponente beispielsweise
der Sauerstoff ist, dann wird diese meßtechnische Bestim
mung unter Verwendung von Sauerstoffelektroden oder Meßvorrich
tungen für gelösten Sauerstoff durchgeführt. In diesem Fall
ist kein Indikator für das gebildete Wasserstoffperoxid erfor
derlich. Das gleiche gilt für die Bestimmung des erzeugten
Dihydroxyacetonphosphats. Unter den zu bestimmenden Komponen
ten wird jedoch Wasserstoffperoxid bevorzugt. Die Bestimmung
des gebildeten Wasserstoffperoxids erfolgt kolorimetrisch, fluo
rimetrisch oder luminometrisch unter Verwendung eines Indika
tors für Wasserstoffperoxid. Gemäß einer anderen Ausführungs
form kann auch ein Elektrodenmeßgerät für Wasserstoffperoxid
verwendet werden, beispielsweise ein Oxidase-Meter, welches
durch YSI in den Handel gebracht wird.
Die Umsetzung zwischen dem erfindungsgemäßen Nachweisreagenz
und der das Triglycerid enthaltenden Probelösung wird bei
einer vorbestimmten Temperatur während einer vorbestimmten
Zeitspanne durchgeführt, beispielsweise bei Temperaturen zwi
schen 25 und 40°C,und dann wird eine der verbrauchten oder
erzeugten Komponenten quantitativ bestimmt.
Nachdem der verbrauchte Sauerstoff oder das erzeugte Wasser
stoffperoxid mittels irgendeiner der vorstehend beschriebenen
Methoden quantitativ bestimmt worden ist, wird die Menge an
Triglycerid unter Verwendung einer entsprechenden Eichkurve
quantitativ bestimmt bzw. berechnet. Bei der quantitativen Be
stimmung von Wasserstoffperoxid unter Verwendung eines Indi
kators wird die Extinktion bei einer geeigneten Wellenlänge
für die Kolometrie des betreffenden Indikators bestimmt, bei
spielsweise bei einer Wellenlänge von 600 nm oder bei einer
Wellenlänge, wie sie für fluorimetrische Messungen geeignet ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung enthält das Reagenz für die
Analyse von Triglycerid Lipasen und eine Monoglyceridlipase
und mittels dieses Reagenz können die verschiedensten Analy
senmethoden wirksam durchgeführt werden. Beispielsweise eignen
sich diese Analysenmethoden für das Gebiet der klinischen Dia
gnostik, in welcher die Triglyceridanalyse unter Verwendung
automatisch arbeitender Analysiervorrichtungen erfolgt. Es
ist dabei möglich, die Analyse innerhalb einer sehr kurzen Zeit
mit ausgezeichneter Genauigkeit durchzuführen, selbst wenn die
betreffende Probe ein Triglycerid in hoher Konzentration ent
hält.
Zu je 20 µl Blutserum als Probelösung werden 3,0 ml der be
treffenden Triglyceridanalysereagenzien mit der vorstehend
angegebenen Zusammensetzung hinzugesetzt (Lipasegehalt: 300
U/ml) und zwar mit oder ohne Zusatz von Monoglyceridlipase
(0.2 U/ml) und man läßt die betreffende Mischung jeweils bei
37°C reagieren. Nach einem entsprechenden Zeitablauf wird die
Extinktion bei 600 nm bestimmt.
Wie sich aus Fig. 1 ergibt, ist im Fall eines fehlenden Zu
satzes von Monoglyceridlipase (Kurve -○-) der Endpunkt der
Reaktion unklar, scheint aber bei etwa 3.5 Minuten zu liegen,
während bei Zusatz von 0.2 U/ml Monoglyceridlipase (vgl.
Kurve -⚫-) die Reaktion bereits nach 2 Minuten ihr Gleichge
wicht erreicht hat und beendet ist.
Zu jeweils 20 µl Blutserum als Probelösung werden 3.0 ml
des betreffenden Triglycerid-Analysereagenz der vorstehend
angegebenen Zusammensetzung hinzugesetzt (Lipasegehalt:
233 U/ml), wobei der Gehalt an Monoglyceridlipase im Bereich
von 0 bis 0.2 U/ml variiert wird. Jede Mischung läßt man bei
37°C reagieren. Es wird die Zeit bestimmt, welche für den
vollständigen Ablauf der Farbreaktion erforderlich ist.
Wie sich aus Fig. 8 ergibt (vgl. Kurve -○-), verändert sich
der Effekt einer verkürzten Reaktionszeit nicht, solange die
Monoglyceridlipase in Mengen von 0.05 U/ml oder mehr, vorzugs
weise in Mengen von 0.1 U/ml mitverwendet wird.
Jeweils 20 µl einer verdünnten Lösung eines hochneutralen
Fettserums werden zu dem entsprechenden Triglycerid-Analyse
reagenz zugesetzt, welches die vorstehend angegebene Zusam
mensetzung hat (Lipasegehalt: 300 U/ml) und entweder keine
Monoglyceridlipase (Kurve -○- von Fig. 9) oder 0.2 U/ml
Monoglyceridlipase (vgl. Kurve -⚫- in Fig. 9) enthält. Man
läßt jede Mischung 3 Minuten lang bei 37°C reagieren. Anschlie
ßend wird die Extinktion bei 600 nm gemessen.
Aus Fig. 9 ergibt sich, daß eine lineare Konzentrationsabhängig
keit an Triglycerid bis zu einer Menge von 1500 mg/dl besteht,
falls das Reagenz 0.2 U/ml Monoglyceridlipase enthält.
Claims (11)
1. Reagenz für die Analyse von Triglyceriden,
dadurch gekennzeichnet, daß es Lipase(n)
in Kombination mit Monoglyceridlipase(n) enthält, wobei eine
Monoglyceridlipase verwendet wird, die aus dem Mikroorganis
mus Bacillus stearothermophilus, Stamm H-165 (FERM BP-1673)
erhältlich ist.
2. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß es eine Monoglyceridlipase enthält, welche die durch das
nachstehende Reaktionsschema wiedergegebene enzymatische
Reaktion zu katalysieren vermag und gleichzeitig mit Sub
stratspezifität auf ein Monoglycerid einwirkt:
Monoglycerid + H₂O → Glycerin + Fettsäure
3. Reagenz nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeich
net, daß es außer Lipase(n) und Monoglyceridlipase(n) auch
Reagenzien zur Bestimmung von Glycerin enthält.
4. Reagenz nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß es als Reagenzien zur Glycerinbestimmung Glycerinoxidase
oder eine Kombination aus Glycerokinase, Glycerophosphat
oxidase und Adenosintriphosphat (ATP) enthält.
5. Reagenz nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß es als Reagenzien zur Glycerinbestimmung mindestens einen
Indikator enthält, welcher in Anwesenheit von Wasserstoff
peroxid als Endprodukt der Glycerinbestimmung eine Farb
änderung erfährt.
6. Reagenz nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß der/(die) Indikator/(en) farbbildende Reagenzien,
fluoreszierende Reagenzien oder lumineszierende Reagenzien
sind.
7. Reagenz nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß die farbbildenden Reagenzien 4-Aminoantipyrin, n-Äthyl-N-
(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin, Phenol und Peroixidase
enthalten.
8. Analysenmethode für Triglycerid, bei der man eine
Probelösung, welche Triglycerid(e) enthält, mit Lipase(n)
kontaktiert und das freigesetzte Glycerin oder die freige
setzte(n) Fettsäure(n) quantitativ bestimmt, dadurch ge
kennzeichnet, daß man für das Kontaktieren mit der Probe
lösung ein System verwendet, welches Monoglyceridlipase(n)
enthält, wobei eine Monoglyceridlipase verwendet wird, die
aus dem Mikroorganismus Bacillus stearothermophilus, Stamm
H-165 (FERM BP-1673) erhältlich ist, und daß man anschließend
eine bei der Bestimmungsmethode für freigesetztes Glycerin
bzw. freigesetzte Fettsäure verbrauchte oder gebildete
Komponente mißt.
9. Analysenmethode nach Anspruch 8, dadurch gekenn
zeichnet, daß man ein System mit einer Monoglyceridlipase
verwendet, welche die durch das nachstehende Reaktionsschema
wiedergegebene enzymatische Reaktion zu katalysieren vermag
und gleichzeitig mit Substratspezifität auf ein Monoglycerid
einwirkt
Monoglycerid + H₂O → Glycerin + Fettsäure
10. Analysenmethode nach Anspruch 8 und 9, dadurch ge
kennzeichnet, daß man ein System verwendet, welches außer der
Monoglyceridlipase noch andere Lipase(n) enthält.
11. Analysenmethode nach Anspruch 10, dadurch gekenn
zeichnet, daß man ein System verwendet, welches außer Mono
glyceridlipase(n) und Lipase(n) zusätzlich Reagenzien für die
Bestimmung von Glycerin enthält.
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